핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

요약

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

초록

상업 공급업체의 다양한 변형 합성 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있게 됨에 따라 모든 표준 분자 생물학 실험실에서 실행할 수 있는 핵산 대사 효소의 다양한 특성을 특성화할 수 있는 정교한 분석을 개발할 수 있었습니다. 형광 라벨을 사용함으로써 연구자들은 방사성 물질을 사용하거나 방사성 물질의 저장 및 준비를 위해 설계된 실험실(예: Hot Lab)을 필요로 하지 않고 표준 PAGE 전기영동 장비와 형광 지원 이미저를 사용하여 이러한 방법에 액세스할 수 있게 되었습니다. 인산화(phosphorylation)와 같은 표준 변형을 선택적으로 추가하면 분석 설정을 단순화할 수 있으며, DNA 손상 또는 중간체를 모방하는 변형된 뉴클레오티드의 특정 통합을 사용하여 효소 행동의 특정 측면을 조사할 수 있습니다. 여기에서는 상업적으로 이용 가능한 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 효소에 의한 DNA 처리의 여러 측면을 조사하기 위한 분석의 설계 및 실행을 보여줍니다. 여기에는 서로 다른 DNA 및 RNA 하이브리드 구조를 분해하는 리가아제의 결합 능력 또는 뉴클레아제의 능력, DNA 리가아제에 의한 차별적 보조인자 사용, 효소의 DNA 결합 능력 평가가 포함됩니다. 합성 뉴클레오티드 기질을 설계할 때 고려해야 할 요인에 대해 논의하고, 다양한 핵산 리가아제, 중합효소 및 뉴클레아제 효소 분석에 사용할 수 있는 기본 올리고뉴클레오티드 세트를 제공합니다.

서론

모든 생명체는 복제, 전사 및 DNA 복구를 포함한 기본적인 생물학적 과정을 수행하기 위해 핵산 처리 효소를 필요로 합니다. 이러한 경로에 대한 주요 효소 기능은 RNA/DNA 분자의 복사본을 생성하는 중합효소, 폴리뉴클레오티드 기질을 결합하는 리가아제, 이를 분해하는 뉴클레아제, 핵산 이중체를 녹이거나 토폴로지를 변경하는 헬리카제 및 토포이소머라제입니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 또한, 이러한 효소의 대부분은 클로닝, 진단 및 고처리량 시퀀싱 11,12,13,14,15와 같은 응용 분야에 필수적인 분자 도구를 제공합니다.

이러한 효소의 기능적 특성, 반응 속도 및 기질 특이성은 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성된 표지된 DNA/RNA 기질을 사용하여 결정할 수 있습니다. 기판 및 제품 추적은 전통적으로 5' 가닥 말단에 방사성 라벨(^32P)을 도입하여 달성되었으며, 이는 사진 필름 또는 형광체 이미징 시스템^(16,17)으로 감지할 수 있습니다. 방사성 표지된 기질은 실험 감도를 높이는 이점을 제공하고 뉴클레오티드의 화학적 특성을 변경하지 않지만, 방사성 동위원소 작업으로 인한 잠재적인 건강 위험으로 인해 DNA 및 RNA 검출을 위한 보다 안전한 대안을 제공하기 위해 비방사성 핵산 표지의 개발이 촉진되었습니다 18,19,20. 이 중 직접 형광 검출, 시간 분해 형광 및 에너지 전달/형광 소멸 분석을 포함한 형광 검출은 가장 다재다능한 것으로 두드러집니다 21,22,23,24. 광범위한 형광단 어레이는 각 올리고뉴클레오티드²⁵에 고유한 리포터를 특징으로 하는 다양한 DNA/RNA 기질 설계를 가능하게 합니다. 또한, 방사성 동위원소와 비교할 때 형광단의 안정성으로 인해 사용자는 상당한 양의 형광 표지된 DNA 기판을 생산하고 보존할 수 있습니다¹⁹. 이러한 형광단 표지 기질은 금속 및 뉴클레오티드 보조 인자의 다양한 조합과 함께 관심 단백질과 함께 배양하여 결합 및/또는 효소 활성을 분석할 수 있습니다. 결합 또는 활성의 시각화는 겔 이미징 시스템과 함께 다양한 형광단 염료 채널을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 형광으로 표지된 올리고뉴클레오티드만 볼 수 있으므로 표지된 올리고뉴클레오티드의 크기 증가 또는 감소를 쉽게 추적할 수 있습니다. 겔은 나중에 핵산 염색 염료를 사용하여 겔에 존재하는 모든 DNA 밴드를 시각화할 수도 있습니다.

폴리핵산 리가아제는 DNA/RNA 단편을 결합하는 효소로, 5' 인산화된 DNA 말단과 DNA의 3' OH 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하여 절단의 밀봉을 촉진합니다. 이들은 뉴클레오티드 기질 요구 사항에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 고도로 보존된 NAD-의존성 리가아제는 모든 박테리아에서 발견되며(²⁶), 구조적으로 다양한 ATP-의존성 효소는 생명의 모든 영역에서 식별될 수 있다 ^8,27. DNA 리가아제는 복제 중 오카자키 단편 처리에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 복구 후 남은 자발적인 흠집과 흠집의 밀봉을 통해 뉴클레오티드 및 염기 절제 복구와 같은 다양한 DNA 복구 경로에 관여합니다 ^8,10. 상이한 DNA 리가아제는 RNA 및 DNA 하이브리드(28,29,30)뿐만 아니라 듀플렉스(duplex)의 흠집(nicks), 이중 가닥 단절(double-stranded breaks), 불일치 및 갭(gaps)을 포함하여 DNA 절단의 다양한 형태에 결합할 수 있는 다양한 능력을 나타낸다(^28,29,30). 다양한 범위의 ligatable 기질은 핵산 듀플렉스 31,32,33에서 병치된 5' 및 3' 말단을 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드를 5' 인산염으로 어닐링함으로써 조립할 수 있습니다. 가장 일반적인 분석 방법은 end-point assay 형식의 urea PAGE에 의한 분리능입니다. 그러나, 최근의 혁신에는 고처리량³⁴, 질량 분석 프로파일링⁽³⁵), 그리고 시간 분해 모니터링⁽³⁶)을 가능하게 하는 균질한 분자 비콘 분석(homogenous molecular beacon assay)을 허용하는 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis)의 사용이 포함되었다.

결찰 반응의 첫 번째 단계는 아데노신 삼인산(ATP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)에 의한 리가아제 효소의 아데닐화로, 공유 효소 중간체를 생성합니다. 반응의 두 번째 단계는 nick site의 5' 말단에서 핵산 기질의 아데닐화(adenylation)이며, 그 후 핵산 nick 가닥의 ligation이 뒤따릅니다. E. coli 에서 재조합 발현되는 많은 리가아제 효소는 아데닐화된 형태로 정제되므로 뉴클레오티드 보조인자를 추가하지 않고도 핵산을 성공적으로 결찰할 수 있습니다. 이로 인해 핵산의 결찰에 필요한 특정 유형의 뉴클레오티드 보조인자를 결정하기 어렵습니다. DNA 리가아제 활성을 평가하기 위한 분석을 설명하는 것 외에도, 표지되지 않은 기질을 사용하여 효소를 탈아데닐화하여 보조 인자 사용을 신뢰성 있게 결정하는 방법도 제시됩니다.

뉴클레아제는 핵산 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 DNA/RNA 변형 효소 및 촉매 RNA의 크고 다양한 그룹입니다(³⁷). 뉴클레아제 효소 기능은 DNA 복제, 복구 및 RNA 처리에 필요하며 DNA, RNA 또는 둘 다에 대한 당 특이성에 따라 분류할 수 있습니다. 엔도뉴클레아제는 DNA/RNA 가닥 내의 포스포디에스터 결합을 가수분해하는 반면, 엑소뉴클레아제는 DNA/RNA 가닥을 3' 또는 5' 말단에서 한 번에 하나의 뉴클레오티드를 가수분해하고 DNA의 3'에서 5' 또는 5'에서 3' 말단에서 그렇게 할 수 있습니다(³⁸).

많은 뉴클레아제 단백질이 비특이적이며 여러 과정에 관여할 수 있는 반면, 다른 단백질은 특정 염기서열 또는 DNA 손상에 대해 매우 특이적입니다 ^6,39,40. 염기서열 특이적 뉴클레아제는 클로닝(cloning), 돌연변이 유발(mutagenesis), 게놈 편집(genome editing)과 같은 광범위한 생명공학 응용 분야에서 사용됩니다. 이러한 응용 분야에서 널리 사용되는 뉴클레아제는 제한 뉴클레아제⁴¹, 징크-핑거 뉴클레아제⁴², 전사 활성제 유사 효과기 뉴클레아제, 그리고 가장 최근에는 RNA 유도 엔지니어링 CRISPR 뉴클레아제⁴³입니다. 최근에는 EndoMS 뉴클레아제와 같은 손상 특이적 뉴클레아제가 확인되었는데, 이 뉴클레아제는 미스매치 특이적 RecB 유사 뉴클레아제 도메인 ^5,44를 통해 DNA의 미스매치에 대한 특이성을 가지고 있습니다. 뉴클레아제 활성 분석은 역사적으로 방사성 표지된 기질을 사용한 불연속 분석으로 수행되었습니다. 그러나, 그들의 다른 단점 외에도, 이들은 뉴클레아제 단백질에 의해 절단된 부위의 식별을 허용하지 않으며, 이는 형광 표지된 기질^(45,46)을 사용할 때 가능하다. 보다 최근에는 서로 다른 상태의 DNA와 상호 작용하는 다양한 DNA 염료를 사용하여 작동하는 연속 뉴클레아제 분석이 개발되었습니다. 예를 들어, dsDNA와 상호 작용할 때 결합되지 않은 상태보다 더 높은 형광 신호를 방출하거나 짧은 RNA에 특이적으로 결합하는^{것 47}. 다른 연속 뉴클레아제 분석은 5'에 형광단이 있고 3' 말단에 소광기가 있는 DNA 헤어핀을 사용하여 형광단과 소광체(⁴⁸)의 분리로 인해 올리고뉴클레오티드가 분해됨에 따라 형광이 증가합니다. 이러한 분석을 통해 DNA 분해 단백질의 동역학을 특성화할 수 있지만 효소의 기능과 기질에 대한 사전 지식이 필요하며 DNA 구조를 변경하여 염료 결합에 차이를 일으키는 효소로 제한됩니다. 이러한 이유로, 단백질 활성으로 인한 DNA 변형에 대한 통찰력을 제공하기 위해 개별 뉴클레아제 산물을 분해하는 종말점 분석이 여전히 바람직합니다.

여기에서는 새로운 뉴클레아제, 중합효소 및 리가아제 효소의 활성을 테스트하기 위한 기질을 생성하기 위해 혼합 및 일치시킬 수 있는 형광 표지된 DNA/RNA 올리고뉴클레오티드의 설계를 위한 자세한 절차를 제시합니다. 이 기본 올리고뉴클레오티드 염기서열 세트의 검증은 실험 설계를 단순화하고 많은 수의 맞춤형 기질을 구매할 필요 없이 광범위한 효소 기능의 경제적인 프로파일링을 용이하게 합니다. DNA 리가아제 활성의 예를 사용하여 이러한 기질로 표준 DNA 처리 효소 분석을 실행하기 위한 자세한 절차가 제공되며, 뉴클레아제 및 중합효소 효소의 분석 및 분석을 위한 변형이 설명됩니다. 또한 DNA 리가아제 효소의 보조인자 특이성을 높은 정확도로 측정하기 위한 수정된 분석법이 제공되며, 이중 표지 프로브를 사용하여 다중 구성 요소 접합의 조립을 평가합니다. 마지막으로, 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)에 의해 동일한 기질과의 단백질-DNA 상호 작용을 결정하는 데 사용할 수 있도록 기본 분석 형식에 대한 수정에 대해 논의합니다.

프로토콜

1. 올리고뉴클레오티드의 설계 및 구매

참고: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 설계하여 원하는 듀플렉스로 조립하고 어닐링합니다. 듀플렉스에 있는 하나 이상의 가닥은 관심 효소에 의한 올리고뉴클레오티드 처리를 추적하기 위해 형광 부분을 가져야 합니다. 다양한 활동을 위해 조립할 수 있는 단일 가닥 서열의 기본 세트가 표 1에 나와 있습니다.

1. 아래에 설명된 대로 관심 효소에 필요한 특정 변형을 통합합니다.
   1. DNA 리가아제 기질의 경우(그림 1): 5' 인산화 공여체 가닥(NL2), 5' FAM 표지 수용체 가닥(NL1) 및 둘을 연결하는 보체(NL3)의 세 가지 올리고뉴클레오티드에서 가장 간단한 기질을 조립합니다.
      1. ligatable nick의 5' 말단을 제공하는 가닥이 2단계에서 기판 마스터 믹스를 조립하기 전에 인산화되었는지 확인합니다. 이것을 NL2에 대한 변형으로 주문하거나( 표 1에 제시된 대로) 올리고뉴클레오티드를 재현탁한 후 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 함께 효소 인산화를 사용하십시오.
      2. 그림 1A(NL6/NL7 및 NL8/NL9)에 표시된 이중 가닥 절단의 보체를 구성하는 NL6 및 NL8의 5'-말단 인산화를 포함하며, 이는 제한 엔도뉴클레아제에서 생성된 자연 기질과 가장 유사합니다. dual-labeled substrate를 사용하여 multi-part assembly에 대한 ligation의 상대적 범위를 결정합니다(단계 6 참조).
      3. 미스매치(NL10)와 갭(NL11)을 생성하도록 보수 가닥을 변경합니다.
         참고: 단순 흠집이 난 기판의 변형은 그림 1A에 표시되어 있습니다. 다른 시퀀스를 사용하여 밑줄이 그어진 위치를 변경하여 훨씬 더 넓은 범위의 불일치 또는 더 긴 간격을 생성할 수 있습니다.
      4. RNA 올리고뉴클레오티드를 DNA 올리고뉴클레오티드로 대체합니다.
         참고: 단순 흠집이 있는 기판의 변형은 그림 1B에 표시되어 있습니다. 예를 들어, RNA와 DNA를 모두 포함하는 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 여기에 제공된 기본 세트의 추가 조합에 의해 더 넓은 범위의 DNA/RNA 듀플렉스를 생성할 수 있습니다. 이 변형의 예는 아래 6단계에 나와 있으며, 여기서 이중 레이블 전략이 사용됩니다.
   2. DNA 중합효소 기질의 경우: 표 1 에 나열된 올리고뉴클레오티드 NL1 및 NL3을 조립하여 간단한 프라이머 확장 분석을 제공합니다. NL1(프라이머) 또는 NL3(템플릿) 가닥에 변형을 도입하여 중합효소 활성의 추가 측면을 조사합니다.
      1. 템플릿 가닥의 손상된 병변을 우회할 수 있는 능력을 결정하기 위해 위치 20 이전에 손상된 염기 유사체를 NL3 올리고뉴클레오티드에 통합합니다.
      2. 손상된 염기 유사체를 위치 20의 NL1 올리고뉴클레오티드에 통합하여 손상된 프라이머를 확장할 수 있는 능력을 결정합니다.
      3. 듀플렉스에서 RNL1 또는 RNL3을 사용하여 RNA 프라이머의 확장 또는 RNA 템플릿의 사용을 조사합니다.
   3. 뉴클레아제 기질의 경우(그림 2): 올리고뉴클레오티드를 조립하여 이중 및 단일 가닥 기질(그림 2Ai)과 다양한 플랩 및 스플레이 접합부(그림 2Aii) 및 손상된 기질(그림 2B)을 제공합니다.
      1. 리보핵분해효소 활성을 조사하기 위해 NL1, NL2 및 NL3을 RNL1, RNL2 및 RNL3로 반복적으로 대체합니다. HJ5 및 HJ6의 추가 RNA 버전을 사용하여 이 세트를 더욱 확장하십시오.
      2. 올리고뉴클레오티드 MD5, MD6 및 MD9는 산화 손상, 비염기성 복구 중간체 또는 탈아미네이션 산물을 모방한 중앙에 배치된 변형을 사용합니다(그림 2B). 기판은 이 위치에서 가닥의 절단을 감지합니다. 보체 NL3 가닥에 TAMRA와 같은 직교 형광단을 라벨링하여 이중 가닥 절단을 감지합니다(6단계 참조).
      3. 보형의 직교 라벨링을 사용하여 프로브(NL5 및 ND9) 및 보체(MD10 및 NL10) 스트랜드 모두의 일치하지 않는 위치에서 이중 가닥 절단을 감지합니다.
2. 관련 fluorophores 및 기타 변형을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 상업 공급업체로부터 주문하십시오.
   참고: 100 nM 합성 스케일과 합성 후 HPLC 정제는 설명된 분석에 적합합니다.

2. 핵산 듀플렉스 조립 및 어닐링

1. oligonucleotide의 재현탁 및 희석
   1. 개봉하기 전에 2mL 튜브의 동결건조된 올리고뉴클레오티드를 벤치탑 원심분리기에서 2-5분 동안 최고 속도로 원심분리하여 핵산이 튜브 바닥에 있는지 확인합니다.
   2. TE 완충액(10mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))에 올리고뉴클레오티드를 재현탁하여 100μM의 마스터 스톡을 준비합니다. 올리고뉴클레오티드가 전속력으로 반복적인 부드러운 소용돌이와 짧은 원심분리를 통해 완전히 재현탁되도록 합니다.
   3. 마스터 스톡의 부분 표본을 TE 버퍼로 희석하여 10μM 스톡을 준비합니다. 10μM 스톡을 초순수(MQ 물)로 희석하여 표 2와 같이 0.5μM, 0.7μM 또는 2.5μM 농도의 작업 스톡을 준비합니다.
2. 반응 마스터 믹스 조립 및 어닐링
   1. 작업 스톡을 사용하여 표 2 에 제공된 조합과 표 3에 제공된 부피를 사용하여 반응 마스터 믹스를 구성합니다. 표준 DNA 리가아제 분석 및 여기에 설명된 대부분의 다른 분석의 경우, 최종 완충액 조성은 50mM Tris pH 8.0, 50mM NaCl, 10mM Dithiothreitol(DTT)이며 10mM Mg을 2가 양이온으로 합니다.
   2. 가열 블록 또는 열순환기를 사용하여 95°C에서 5분 동안 가열하여 PCR 또는 마이크로 원심분리기 튜브의 올리고뉴클레오티드를 어닐링합니다. 30분(부피 <1mL)에서 1시간(부피 >1mL) 동안 실온으로 냉각합니다. 더 긴 올리고뉴클레오티드(>40 nt)의 경우 95 °C에서 25 °C의 하향 램프가 있는 써모사이클러를 사용하여 45분 동안 천천히 냉각하거나 어닐링 혼합물이 들어 있는 튜브를 끓는 물 1L 비커에 띄우고 밤새 실온으로 냉각시킵니다.
   3. 뉴클레오티드 보조인자 및 기타 열에 민감한 완충 성분을 실온으로 냉각한 후 마스터 믹스에 추가합니다. 효소를 첨가하여 최종 반응 혼합물을 분석에 직접 사용하거나(아래 3단계 참조) 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관하십시오.

3. 표준 분석 설정

1. 분석 반응의 조립 및 시작
   1. PCR 튜브에서 22.5 μL의 관심 기질 마스터 믹스를 2.5 μL의 DNA 리가아제 또는 기타 관심 효소와 결합합니다. 특히 결과가 정량화되는 경우 중복 또는 삼중 반응을 실행합니다.
   2. 분석 샘플에 no-protein control(완충액만 해당)을 포함합니다. 필요한 경우 이 시점에서 보조 인자 컨트롤을 포함하지 않습니다.
      참고: 효소는 -20°C에서 50% v/v 글리세롤로 보관할 수 있어 용액에서 직접 피펫팅할 수 있습니다. 글리세롤이 함유된 효소 용액이 첨가 전에 잘 혼합되었는지 확인하십시오., 피펫팅을 통해 혼합하거나 부드러운 소용돌이를 통해.
2. 즉시 반응을 25°C의 PCR 기계로 옮기고 30분 동안 배양합니다. 효소 활성을 위한 최적의 조건에 따라 온도와 지속 시간을 변경합니다.
3. 5μL의 로딩 염료(95% 포름아미드, 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 브로모페놀 블루)를 첨가하여 반응을 퀀칭하고 95°C에서 5분 동안 배양합니다.

4. 분석 결과 분석

1. 아래 설명에 따라 Tris-Borate-EDTA(TBE)-Urea PAGE 겔을 준비합니다.
   1. 20% 아크릴아마이드, 7M 요소 및 1x TBE 용액을 준비합니다. 여기에 설명된 올리고뉴클레오티드 세트의 경우 최적의 분리능을 위해 Acrylamide/Bis Solution을 29:1 비율로 사용하십시오.
   2. 겔 1개의 경우 10mL의 20% 아크릴아마이드와 7M 요소 용액을 100μL의 APS(10%) 및 3μL의 테트라메틸에틸렌디아민(TMED)과 결합하고 겔 캐스터에 주조합니다.
2. 겔이 응고된 후 45 - 55 °C에서 TBE 요소 겔의 샘플을 실행합니다.
   1. 외부 가열을 통해 겔당 10mA로 30분 동안 1x TBE 버퍼에서 겔을 사전 실행합니다.
   2. 목초지 피펫을 사용하여 1x TBE로 세척하여 겔의 웰에서 과도한 요소를 제거합니다.
   3. 각 반응의 10μL를 로드하고 외부 가열로 1.0-1.5시간 동안 10mA에서 실행합니다.
3. 선택한 형광단에 대한 올바른 설정으로 이미저의 겔을 시각화합니다. FAM의 경우 495/519nm에서 여기/방출을 제공하는 필터 세트를 사용하며, 이는 대부분의 이미저에 사전 설정으로 저장됩니다.
4. 이미저가 있는 이미지 처리 소프트웨어 또는 ImageJ^49,50과 같은 외부 프로그램을 사용하여 제품 및 기판의 밴드 강도를 정량화하고 공식을 사용하여 제품의 백분율을 계산합니다.
   
   여기서 P 는 제품 밴드의 적분 값이고 S 는 기판 밴드의 적분 면적입니다. DNA 리가아제 반응 예의 경우, 생성물 띠는 40 뉴클레오티드(nt)에서 실행되고 기질 띠는 20 nt에서 실행됩니다.

5. 보조인자 특이성을 테스트하기 위한 DNA 리가아제의 탈아데닐화

1. 반응 마스터 믹스의 준비
   1. 표 4에 기재된 바와 같이 FAM-labeled NL1 oligonucleotide를 함유하는 마스터 믹스 한 세트를 준비한다. 표 4에 설명된 대로 FAM 라벨이 없는 NL1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 두 번째 세트를 준비합니다.
   2. 별도로 두 DNA 듀플렉스를 95°C에서 5분 동안 가열하고 25°C에서 30분에서 1시간 동안 냉각합니다. 두 마스터 믹스 모두에 뉴클레오티드 보조 인자를 추가하지 마십시오.
2. 탈아데닐화(de-adenylation) 반응의 조립 및 시작
   1. 라벨링되지 않은 마스터 믹스 10μL와 리가아제 효소 2.5μL를 결합하여 테스트할 각 보조인자 유형/농도에 대한 단일 탈아데닐화 반응을 준비합니다.
   2. 비 보조 인자 대조군 및 단백질 대조군이 없는 추가 튜브를 준비합니다(효소 대신 2.5μL의 완충액 추가).
   3. 효소의 최적 활성에 특정한 온도에서 1-2시간 동안 반응을 배양합니다. 효소가 여전히 아데닐화되어 있는 경우 배양 시간이 증가할 수 있습니다.
3. 보조 인자로 결찰 반응을 실행합니다.
   1. 라벨링된 마스터 믹스 10μL와 원하는 뉴클레오티드 보조인자(예: ATP, NAD, ADP 또는 GTP) 2.5μL를 탈아데닐화 반응(0.1-1mM 최종 농도)에 직접 첨가합니다.
   2. 2.5μL의 반응 완충액을 뉴클레오티드가 없는 보조인자 대조군에 추가합니다.
   3. 이전에 사용한 것과 동일한 기간 및 온도 동안 반응을 배양합니다. 4단계에서 설명한 대로 담금질하고 시각화합니다.

6. 부목 결찰 또는 다중 부품 조립을 위해 이중 라벨링 기판 사용

1. 이미 사용된 형광단과 다른 excitation/emission 스펙트럼을 가진 형광 부분을 가진 oligonucleotide를 설계하고 구매합니다.
   1. 여기에 설명된 설정에서는 3' 말단에 5-카르복시테트라메틸로다민(TAMRA)이 있는 NL2(TAMRA) 올리고뉴클레오티드를 사용합니다(표 1).
2. 아래 설명에 따라 마스터 믹스를 조립합니다.
   1. 어셈블리에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드의 등몰비와 완충액 및 2가 양이온을 포함하여 2단계에서 설명한 반응 성분을 결합합니다.
   2. 95 ° C에서 5 분 동안 가열하고 25 ° C에서 30 분 - 1 시간 동안 냉각하여 어닐링합니다. 보조 인자와 효소를 추가하고 3단계에서 설명한 대로 배양합니다.
3. 4단계에서 설명한 대로 기판의 fluorophore pair에 적합한 채널을 사용하여 샘플을 실행하고 이미지화합니다. FAM 및 TAMRA의 경우 대부분의 이미저에 존재하는 플루오레세인(FITC) 및 테트라메틸 로다민(TRITC) 채널입니다.

7. 네이티브 겔에 대한 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)에 의한 DNA 결합 평가

1. 아래 설명에 따라 10% 천연 TBE PAGE 겔을 준비합니다.
   1. 40% 아크릴아마이드 2.5mL, 10x TBE 1mL, 10% APS 100μL, TMED 3μL, MQ 물 6.5mL를 겔 캐스터에 넣고 주조합니다.
2. 아래 설명된 대로 결합 반응을 조립합니다.
   1. EDTA(10 mM)를 포함시키고 금속 이온을 생략하도록 표 5 에 따라 EMSA 기판을 조립한다.
   2. PCR 튜브에서 20μL의 EMSA 기질 마스터 믹스와 5μL의 단백질을 결합합니다. 단백질 대조군이 없는 검체를 포함합니다. 25 °C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 아래에 설명된 대로 기본 전기영동으로 분석합니다.
   1. 5x 네이티브 로딩 염료 5μL(100mM EDTA, 0.25% 브로모페놀 블루, 25% v/v 글리세롤 및 최대 1mL의 MQ 물)를 샘플에 추가합니다.
   2. 준비된 겔에 로드하고 염료 전면이 겔 끝에서 몇 cm 위에 올 때까지 물 순환으로 냉각하면서 60V에서 2-3시간 동안 실행합니다.
   3. 4단계에서 설명한 대로 겔을 시각화하고 분석합니다.

결과

DNA 리가아제에 의한 결찰
DNA 리가아제 효소 활성은 요소 PAGE 겔에서 시각화할 때 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 크기를 증가시킵니다. 표 2에 나열된 DNA 및 RNA 접합을 위한 기질의 경우, 이는 크기가 20nt에서 40nt로 두 배로 증가하는 것에 해당합니다(그림 3A). 최적의 효소 활성은 온도, 단백질 농도 또는 배양 시간(그림 3B), 뉴클레오티드 보조 인자, 금속 보조 인자(그림 3C)와 같은 조건을 변경하여 결정할 수 있습니다. 서로 다른 기질에 대한 리가아제의 상대적 활성을 병렬로 비교할 수 있습니다(그림 3D).

제품 및 기질 밴드의 정량화는 결찰된 총 기질의 백분율로 표시되며, 그림 3과 같이 효소의 특정 활성을 평가하거나 2가 양이온 선호도, 온도 또는 pH와 같은 활성 최적 조건을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

박테리아 DNA 리가아제 DV-1-1-Lig(그림 3)는 nick 및 mismatch DNA 기질을 결찰할 수 있으며 마그네슘을 선호하여 결찰 활성을 위해 마그네슘과 망간을 모두 사용할 수 있습니다. 이 효소에 대한 추가적인 세부사항은^{문헌 51}에 기재되어 있다.

DNA 중합효소에 의한 프라이머 확장
20 nt 형광 표지된 프라이머의 확장을 통한 DNA 중합효소 활성은 여기에 제시된 올리고뉴클레오티드 세트를 사용할 때 최대 40 nt의 크기 증가를 초래할 것입니다(그림 4A). 부분적으로 확장된 제품은 템플릿 크기까지 제품의 래더로 표시됩니다(그림 4B 및 그림 4C). 여기에 표시된 프라이머 확장 분석(그림 4C)은 프라이머 가닥의 완전한 합성으로 이어졌습니다.

뉴클레아제에 의한 분해
뉴클레아제 활성은 요소 PAGE 겔에서 시각화할 때 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 크기를 감소시킵니다. 특정 엔도뉴클레아제 활성을 가진 뉴클레아제는 단일 20 nt 산물을 생성할 수 있습니다(그림 5A-C). 엑소뉴클레아제 활성을 가진 뉴클레아제는 다양한 크기의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 생성합니다(그림 5D-F). 여기에서 박테리아 남극 메타게놈 뉴클레아제 단백질의 결과를 보여주며, 이는 이중 가닥 비염기성 부위 기질에서 특정 엔도뉴클레아제 활성을 나타내고 단일 가닥 기질에서 비특이적 엑소뉴클레아제 활성을 나타냅니다(각각 그림 5C 및 그림 5F).

Ligase de-adenylation 및 뉴클레오티드 보조 인자 사용 분석
많은 재조합으로 발현된 리가아제 효소는 숙주(51,52,53,54,55)에서 제거된 ATP 또는 NAD로부터 이미 아데닐화된 상태로 정제된다. 이러한 공유 AMP 중간체의 제거는 효소가 핵산 기질(⁵¹)의 ligation을 위해 사용할 수 있는 뉴클레오티드 보조인자의 범위를 정확하게 식별하기 위해 필요하다. 외인성 뉴클레오티드 보조인자가 없는 상태에서 표지되지 않은 기질을 가진 아데닐화 리가아제 효소의 회전율은 아데닐화 중간체를 고갈시킬 것입니다. 형광 표지된 DNA 기질을 사용하고 두 번째 단계에서만 뉴클레오티드 보조인자를 추가함으로써, 겔 이미저에서 형광 채널(Fluorescein-FITC)을 사용할 때 보이는 모든 ligation 산물은 이 단계에서 추가된 뉴클레오티드 보조인자를 사용한 아데닐화의 결과입니다.

대장균 시스템에서 발현되는 박테리아 DNA 리가아제로 설정된 활성 분석은 사전 아데닐화 형태로 정제되었으며 추가 보조 인자 없이 흠집이 난 DNA를 결찰할 수 있는 배경 능력을 나타냈음을 보여줍니다(그림 6Ai-ii). 아데닐화 리가아제에 ATP를 첨가하면 반응에서 형성되는 결찰 산물의 양이 증가하지만, 이러한 기저 활성이 광범위한 스펙트럼 보조 인자 사용에 대한 잘못된 인상을 줄 수 있거나 반응에 뉴클레오티드 보조 인자를 추가로 추가하면 기질의 결찰을 억제할 수 있기 때문에 항상 신뢰할 수 있는 것은 아닙니다. 먼저 nicked DNA substrate의 unlabeled 버전으로 ligase를 배양함으로써 AMP를 뒤집고 ATP가 반응에 첨가되지 않는 한 labeled DNA nick 기질에서 ligation이 관찰되지 않습니다. 두 번째 활성 분석(그림 6B)은 탈아데닐화된 DNA 리가아제가 ATP 및 ADP를 첨가하여 nick DNA 기질에 대한 ligation 활성을 개선했음을 보여줍니다. 또한 GTP를 추가하면 ligation이 약간 개선되는데, 이는 no-cofactor 대조군에서 볼 수 있는 배경 ligation보다 큽니다. NAD와의 반응에서 관찰된 ligation은 non cofactor control 반응에서 볼 수 있는 ligation과 비슷하며, 이는 NAD를 ligation의 보조 인자로 배제합니다.

dual-labeled assay의 결과
직교 형광단은 복잡한 기판의 다른 부분에서 활성을 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 7 의 예는 부목이 있는 DNA/RNA 듀플렉스에서 T4 DNA 리가아제와 비교하여 최근에 설명된 DNA 리가아제 R2D⁵⁶ 의 활성을 보여줍니다. 기질의 RNA 공여체 섹션에 대한 DNA 수용체의 결찰은 6-FAM을 사용하여 검출된 반면, DNA 공여체에 대한 RNA 수용체의 결찰은 5-TAMRA를 사용하여 검출되었습니다(그림 7A). RNA 기질의 양쪽 말단에 대한 DNA 접합의 상대적 범위는 6-FAM 및 5-TAMRA 채널 모두에 형광을 가진 제품 밴드의 존재에 의해 평가될 수 있으며, 이는 복합 이미지에서 노란색으로 표시되는 반면 개별 6-FAM 및 5-TAMRA는 각각 녹색과 노란색으로 표시됩니다(그림 7B). 이전 간행물⁵⁶에서 자세히 설명한 바와 같이, R2D 리가아제만이 DNA를 RNA의 5' 말단에 결찰할 수 있었던 반면, 두 리가아제는 DNA를 RNA의 3' 말단에 결찰할 수 있었다. 단일 반응 혼합물에서 두 DNA 분자를 RNA에 연결할 때 R2D 리가아제는 띠가 위쪽으로 이동하고 색상이 노란색으로 변하는 것이 관찰됨에 따라 DNA 올리고를 RNA의 양쪽 끝에 결찰할 수 있습니다(그림 7C).

그림 8의 두 번째 예는 이중 라벨링 접근법을 사용하여 서로 다른 pH에서 여러 올리고뉴클레오티드의 ligation을 보여줍니다. 7개의 올리고뉴클레오티드의 혼합물로부터 조립된 기질은 짧은 단편을 조립하는 R2D 리가아제의 능력을 보여주기 위해 사용되었다. 5' 가닥에는 FAM 형광단 표지된 14 nt 가닥이 있는 반면, 보체 가닥에는 16 nt 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 TAMRA 형광단이 있습니다. 성공적인 ligation은 FAM(녹색) 올리고 및 TAMRA(빨간색) 올리고에 대한 추가적인 더 높은 밴드에서 볼 수 있습니다. 두 형광단의 겹침은 뉴클레오티드 밴드를 동일한 크기의 완전히 결찰된 가닥으로 노란색으로 만듭니다.

EMSA를 이용한 DNA 리가아제 효소의 DNA 결합 결과
DNA 리가아제 효소가 인산화된 흠집이 난 DNA에 결합하면 올리고뉴클레오티드 단독보다 더 높은 분자량으로 작동하는 복합체가 생성됩니다(그림 9A). 여기에서, 박테리아 ATP-의존성 DNA 리가아제(bacterial ATP-dependent DNA ligase)와 nick DNA 기질의 결합을 나타낸다. 높은 단백질 농도에서, 표지된 DNA 기질의 대다수는 결합되어 더 높은 분자량 대역에서 볼 수 있습니다. 낮은 단백질 농도에서는 유리 DNA 기질이 우세합니다(그림 9B).

그림 1: 리가아제 효소 활성을 테스트하기 위해 설계된 다양한 핵산 기질의 개략도. 별은 5' 말단(5' FAM)에서 6-카르복시플루오레세인으로 라벨링을 나타냅니다. 라벨링된 가닥은 검은색 또는 진한 파란색/빨간색(DNA/RNA 듀플렉스의 경우) 라인으로 표시되며, 기질 듀플렉스의 라벨링되지 않은 부분은 회색 또는 연한 파란색/빨간색(DNA/RNA 듀플렉스의 경우) 라인으로 표시됩니다. 라벨이 부착된 가닥은 20nt이며, 가닥이 결찰되면 40nt 제품을 형성합니다. 5' 인산화된 부위는 원 안에 P로 표시됩니다. 올리고뉴클레오티드 가닥은 라벨링되어 있으며, 이름은 표 1 및 표 2에 참조되어 있습니다. (A) DNA 리가아제의 효소 활성을 테스트하는 데 사용되는 다양한 유형의 절단이 있는 이중 가닥 DNA 기질의 설계. (B) DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 RNA 및 RNA/DNA 이중 가닥 기질 설계. 기질은 단일 nick site를 포함하며 RNA/DNA duplexes의 nick break를 밀봉하는 ligase의 능력을 테스트하는 데 사용됩니다. 빨간색 선은 RNA 올리고뉴클레오티드를 나타내고 파란색 선은 DNA 올리고뉴클레오티드를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 뉴클레아제 효소 활성을 테스트하기 위해 설계된 다양한 핵산 기질의 개략도. 별은 5' 단자(5' FAM)에서 6-카르복시플루오레세인으로 라벨링을 나타냅니다. 라벨이 부착된 가닥은 검은색 선으로 표시되고, 기판 듀플렉스의 라벨이 지정되지 않은 부분은 회색 선으로 표시됩니다. 5' 인산화된 부위는 원 안에 P로 표시됩니다. 올리고뉴클레오티드 가닥은 라벨링되어 있으며, 이름은 표 1 및 표 2에 참조되어 있습니다. (A) 이중 및 단일 가닥 부분이 있는 기판 설계. (B) 이중 가닥 DNA 기질의 설계는 3' 또는 5' 말단(플랩 3', 플랩 5' 또는 플랩 양쪽 끝(펼쳐짐))에서 단일 가닥 플랩을 생성하도록 수정됩니다. (C) 중앙 위치에서 손상된 베이스 또는 불일치를 포함하는 이중 가닥 기판의 설계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 박테리아 ATP 의존성 DNA 리가아제 DV-1-1-Lig의 결찰 활성 테스트. (A) TBE urea PAGE 겔에서 분석한 결과와 함께 DNA 기질의 리가아제 활성에 대한 효소 분석 개략도. 별은 5' 단자(5' FAM)에서 6-카르복시플루오레세인으로 라벨링을 나타냅니다. 라벨링된 가닥은 검은색 선으로 표시되고, 분석 중에 보이지 않는 기판 듀플렉스의 라벨링되지 않은 부분은 회색 선으로 표시됩니다. (B) 서로 다른 시점에서 흠집이 난 DNA에 대한 DV-1-1-Lig에 의한 ligation의 정량화. 각 기판에 대한 활성을 이중으로 수행하였다. 25°C에서 4μM 최종 단백질 농도, 1mM 최종 ATP 농도 및 10mM 최종 마그네슘 이온 농도로 서로 다른 기간(0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h) 동안 반응을 배양했습니다. (C) 흠집이 난 DNA 기질을 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)과 결찰. 반응은 25°C에서 1mM 최종 ATP 농도 및 10mM 최종 금속 이온 농도로 3시간 동안 수행되었습니다. (D) 다른 DNA 기질에 대한 결찰 결과. 20°C에서 2μM 최종 단백질 농도 2μM, ATP 최종 농도 1mM 및 마그네슘 최종 농도 10mM로 8시간 동안 반응을 수행했습니다. 반응에 단백질을 추가하면 더하기 기호(+)로 표시됩니다. 대조 반응은 C로 표시되며 포함된 단백질이 없으면 마이너스 기호(-)로 표시됩니다. 제품(40 nt)과 기판(20 nt)은 빨간색 화살표로 표시됩니다. 활동 분석의 결과는 이미징 시스템을 사용하여 시각화되었습니다. 밴드는 ImageJ 소프트웨어(⁴⁹ )를 사용하여 강도의 적분에 의해 정량화되었고, 그래프는 그래프 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: DNA 중합효소 분석. (A) DNA 기질에 대한 프라이머 확장 분석의 개략도. 별은 5' 단자(5' FAM)에서 6-카르복시플루오레세인으로 라벨링을 나타냅니다. 라벨링된 가닥은 검은색 선으로 표시되고, 분석 중에 보이지 않는 기판 듀플렉스의 라벨링되지 않은 부분은 회색 선으로 표시됩니다. (B) 뉴클레오티드를 첨가하여 라벨링된 프라이머의 길이가 증가했음을 보여주는 예상 TBE Urea PAGE 겔 결과의 개략도. (C) E. coli Klenow fragment DNA polymerase enzyme을 사용한 프라이머 확장의 예. 반응에 단백질을 추가하면 더하기 기호(+)로 표시됩니다. 레인 1, 12.5U; 레인 2, 2.5U; 레인 3, 1.25U. 대조 반응은 C로 표시되며 포함된 단백질이 없으면 마이너스 기호(-)로 표시됩니다. 반응은 25 °C에서 15 분 동안 수행되었으며 5 mM MgCl₂, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl₂, 1 mM DTT 및 0.25 mM dNTPs를 포함하였다. 제품(40 nt)과 기판(20 nt)은 빨간색 화살표로 표시됩니다. 활동 분석의 결과는 이미징 시스템을 사용하여 시각화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 다양한 기질, 금속 및 배양 온도를 사용한 박테리아 남극 메타게놈 뉴클레아제의 활성 테스트. (A) 염기성 부위(x로 표시) 기질에서 뉴클레아제 단백질의 도식별 엔도뉴클레아제 활성. 별은 5' 단자(5' FAM)에서 6-카르복시플루오레세인으로 라벨링을 나타냅니다. 검은색 선은 라벨링된 가닥을 나타내고 회색 선은 라벨링되지 않은 DNA 가닥을 나타냅니다. 뉴클레아제에 의한 특정 절단은 염기성 부위의 오른쪽에 표시되지만 왼쪽에서도 발생할 수 있습니다. (B) 빼기 기호(-)로 표시된 단백질이 없는 경우 절단되지 않은 기질(40 nt)과 더하기 기호(+)로 표시된 뉴클레아제가 있는 절단 생성물(20 nt)을 보여주는 변성 요소 PAGE 겔의 개략도. (C) 염기성 부위가 있는 이중 가닥 DNA 기질에서 특정 엔도뉴클레아제 뉴클레아제 활성의 결과를 보여주는 TBE 우레아 페이지 겔의 예. 분석은 1.0 μM 및 1 mM MgCl₂의 단백질 농도로 수행되었습니다. 20°C에서 단백질이 없는 반응(웰 1)과 금속이 없는 반응(웰 2)의 두 가지 대조 반응을 수행했습니다. 반응은 겔 이미지 위에 표시된 바와 같이 1°C에서 50°C로 증가하는 온도에서 5시간 동안 배양되었습니다. 단백질의 추가는 더하기 기호(+)로 표시되고 단백질의 부재는 빼기 기호(-)로 표시됩니다. 기판과 제품은 빨간색 화살표로 표시됩니다. (D) 단일 가닥 기질에서 뉴클레아제 단백질의 비특이적 엑소뉴클레아제 활성을 보여주는 개략도. 별은 5' 말단(5'FAM)에서 6-carboxyfluorescein으로 라벨링을 나타냅니다. 검은색 선은 레이블이 지정된 가닥을 나타냅니다. 뉴클레아제의 비특이적 절단은 다양한 길이(<39 nt)의 표지된 가닥을 생성합니다. (E) 단백질이 첨가되지 않은 절단되지 않은 기질(40nt)을 보여주고(-) 비특이적 엑소뉴클레아제의 활성으로 인해 발생할 수 있는 단백질이 첨가된(+) 다양한 길이의 절단 기질을 보여주는 변성 요소 PAGE 겔을 나타내는 개략도. (F) TBE urea PAGE 겔은 단일 가닥 기질을 가진 동일한 남극 메타게놈 뉴클레아제의 비특이적 엑소뉴클레아제 활성의 예를 보여줍니다. 분석은 1.5 μM의 최종 농도에서 단백질과 10 mM의 금속 이온의 최종 농도로 20 °C에서 4 시간 동안 수행되었습니다. 사용된 금속 이온은 이미지 위에 표시되어 있습니다. 단백질의 추가는 더하기 기호(+)로 표시되고 단백질의 부재는 빼기 기호(-)로 표시됩니다. 기판(40nt)은 빨간색 화살표로 표시되고 길이가 다른 제품은 빨간색 클램프로 표시됩니다. 모든 뉴클레아제 반응의 결과는 이미징 시스템을 사용하여 시각화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 박테리아 DNA 리가아제의 아데닐화 및 탈아데닐화 버전에 의한 닉된 DNA 기질의 결찰 결과. (A) i) ATP가 있거나 없는 아데닐화 및 탈아데닐화 리가아제 효소에 의한 결찰 정량화. 그래프의 점은 각 반응 반복실험의 평균을 나타냅니다. 표준 오차 막대가 포함되어 있습니다. ii) ATP가 있거나 없는 아데닐화 및 탈아데닐화 리가아제 효소에 의한 nick DNA 기질에 대한 ligation 결과를 보여주는 TBE urea PAGE 겔. 반응은 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. 탈아데닐화 효소를 비표지된 nick DNA 기질과 0.1μM 효소로 25°C에서 2시간 동안 사전 배양한 후 표지된 nick DNA 기질로 1시간 배양했습니다. 아데닐화된 효소는 표지되지 않은 기질로 사전 배양되지 않았습니다. ATP(1mM)를 표지된 DNA 기질의 첨가와 함께 반응에 첨가하였다. (B) i) 다른 보조 인자(ATP, NAD, ADP 및 GTP)를 가진 nick DNA에 대한 탈-아데닐화 리가아제에 의한 ligation의 정량화. 그래프의 점은 각 농도의 평균을 나타냅니다. 표준 편차 오차 막대가 포함되어 있습니다. ii) 다양한 보조 인자를 추가하거나 추가하지 않은 리가아제에 의한 결찰 결과를 보여주는 TBE 요소 페이지. 각 기판에 대한 활성을 이중으로 수행하였다. 반응은 라벨링되지 않은 nicked DNA 기질, 4μM 단백질 및 5mM 마그네슘 이온을 사용하여 25°C에서 2시간 동안 사전 배양한 후 1mM 최종 농도에서 labeled nicked DNA 기질, 5mM 마그네슘 및 다른 보조 인자를 추가하여 4시간 배양했습니다. 반응에 단백질을 추가하면 더하기 기호(+)로 표시됩니다. 단백질을 포함하지 않는 대조군(대조군, C) 또는 보조인자(보조인자 없음)를 사용하였다. 제품(40 nt)과 기판(20 nt)은 빨간색 화살표로 표시됩니다. 활동 분석의 결과는 이미징 시스템을 사용하여 시각화되었습니다. 밴드는 ImageJ 소프트웨어⁴⁹를 사용하여 강도의 적분에 의해 정량화되었습니다. 그래프는 그래프 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: DNA 템플릿에 의해 배치된 5' 인산화 RNA 올리고의 양쪽 말단에 대한 짧은 형광 표지 DNA 올리고뉴클레오티드의 결찰. (A) 이중 라벨링 전략을 사용하여 가능한 결찰 산물을 시각화할 수 있는 방법을 보여주는 DNA-splinted DNA-RNA ligation의 개략도. (B) 두 채널에서 이미징된 Urea-PAGE 겔에서 볼 수 있을 것으로 예상되는 제품의 개략도. (C) 이중 형광단 결찰(dual fluorophore ligation)의 실험 결과. 연결 반응은 DNA가 RNA의 5' 말단(2-4 레인) 또는 3' 말단(5-7 레인)에 결찰된 분리 반응 또는 두 DNA 올리고뉴클레오티드가 동일한 반응 혼합물(8-10 레인)에 결찰된 단일 반응에서 T4 DNA Ligase 및 R2D 리가아제를 사용하여 테스트되었습니다. 단백질 조절(NPC)에는 효소가 첨가되지 않았습니다. 이 예에서 사용된 반응 조건 및 특정 올리고뉴클레오티드는⁵⁶에 주어진 것과 동일하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 서로 다른 pH에서 3개의 R2D 변이체를 가진 여러 개의 짧은 올리고뉴클레오티드 분절의 결찰. (A) 다중 부분 결찰 전략의 개략도. (B) FAM 및 TAMRA 채널로 이미지화한 다중 부품 어셈블리의 pH 의존성을 보여주는 대표 겔. 레인 C: 효소 제어 없음, 레인 1-3 pH 6.0, 레인 4-6 pH 6.5, 레인 7-9 pH 7 및 레인 10-12 pH 7.5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: EMSA 결과. DNA 기질에서 ATP 종속 DNA 리가아제(남극 M^cMurdo Dry Valleys의 메타게놈 데이터에서 제공)의 결합 활성을 시각화하는 EMSA(Electrophoretic Mobility shift assay)의 회로도 및 기본 TBE PAGE 겔. (A) nick DNA 기질의 DNA 리가아제에 의한 EMSAs/DNA 결합 활성의 개략도. 결합 결과는 비변성성 TBE PAGE 겔에서 시각화됩니다. 리가아제 효소에 결합된 DNA 기질은 겔을 통해 더 느리게 이동하는 반면, 효소가 없는 기질은 더 빠르게 이동하므로 겔에서 밴드 크기(노란색 상자)의 이동이 시각화됩니다. 기질이 변성되지 않은 겔에서 시각화됨에 따라 올리고뉴클레오티드는 어닐링된 상태로 유지되어 FAM 표지 가닥(노란색 별)이 자유 기질과 결합 기질 모두에 존재할 수 있습니다. 단백질 농도 구배는 최적의 결합을 위한 단백질 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. (B) 다양한 단백질 농도에서 ATP 의존성 DNA 리가아제와 nick DNA 기질에 대한 결합 능력을 보여주는 네이티브 TBE PAGE 겔의 EMSA 시각화. 효소를 25°C에서 1mM 최종 ATP 농도 및 40mM EDTA로 30분 동안 흠집이 난 DNA 기질로 배양했습니다. 세 가지 다른 단백질 농도(5.5μM, 2.3μM 및 1.5μM)를 사용했습니다. 반응은 10% 천연 TBE 겔에서 소진되었으며, 반응에서 천연 로딩 염료가 사용되었습니다. 단백질을 함유한 샘플은 서로 다른 단백질 농도에 대해 세 번에 걸쳐 소진되었습니다. control lane에는 1mM, 최종 ATP 및 EDTA가 있는 흠집이 난 DNA 기질이 포함되어 있지만 단백질은 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 분석 기질을 구성하는 데 사용되는 DNA 기질 올리고뉴클레오티드 서열. 손상은 굵은 글씨체로 밑줄이 그어져 표시됩니다. 최종 듀플렉스에서 불일치 및 간격의 위치에 밑줄이 그어져 있습니다. 약어: 5' 6-carboxyfluorescien(5' FAM), 8-Oxo-deoxyguanosine(8OxodG), 비염기성 테트로하이드로푸란(dSpacer). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 다양한 효소 분석을 위해 마스터 믹스를 조립하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드의 조합. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 최대 4개의 올리고뉴클레오티드와 어세이 마스터 믹스 설정. 다양한 분석 기질에 사용할 올리고뉴클레오티드 조합에 대해서는 표 2 를 참조하고 반응 조건에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 최소한, 라벨링된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 필요하며, 듀플렉스의 추가 부분은 괄호로 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: nick DNA를 이중으로 만들기 위한 라벨링된 마스터 믹스와 라벨링되지 않은 마스터 믹스의 구성 요소. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 다양한 듀플렉스 조합을 위한 EMSA 마스터 믹스 설정. 다양한 EMSA 기질에 사용할 올리고뉴클레오티드 조합에 대해서는 표 3 을 참조하고, 반응 조건에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. EMSA 기질은 활성 분석과 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 설계되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜의 중요한 단계
올리고뉴클레오티드 설계 및 구매: 이중 형성을 위한 올리고뉴클레오티드를 구매할 때는 염기서열 설계를 고려하는 것이 필수적입니다. ⁵⁷을 주문하기 전에 올리고 분석기 도구를 사용하여 GC 함량, 용융 온도, 2차 구조 및 이합체화 전위와 같은 뉴클레오티드 서열의 특성을 예측하는 것이 좋습니다.

핵산 듀플렉스의 조립 및 어닐링: RNA/RNA-DNA 듀플렉스를 준비할 때 RNase가 없는 시약과 물을 사용하거나 RNAse 억제제를 첨가하여 RNase 오염을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다(조사 중인 효소 자체가 RNAse가 아닌 경우). 장비, 장갑 및 벤치 공간은 올리고뉴클레오티드(⁵⁸)의 분해를 피하기 위해 마스터 믹스를 조립하기 전에 RNase 오염 제거 용액으로 처리해야 합니다. RNA 올리고뉴클레오티드의 마스터 스톡은 오염 시 더 작은 배치로 구성될 수 있습니다.

DNA 리가아제는 항상 0.1에서 1mM 사이의 최종 농도에서 ATP 또는 NAD의 뉴클레오티드 보조인자를 필요로 합니다. DNA 중합효소는 가닥 합성을 위해 dNTP가 필요하며, 이들은 일반적으로 각각 50μM의 등몰 비율로 첨가됩니다. 리가아제 및 중합효소 듀플렉스를 위한 마스터 믹스를 준비할 때 ATP, NAD 및 dNTP와 같은 뉴클레오티드 보조인자는 열에 민감하기 때문에 혼합물을 실온으로 가열 및 냉각한 후 마스터 믹스에 추가해야 합니다.

올리고뉴클레오티드를 어닐링하기 위한 10x 완충액은 DTT를 추가해야 하며, DTT는 반감기가 짧고 이상적으로는 사용하기 전에 신선 또는 냉동 준비해야 합니다. 10x 완충액의 더 작은 부분 표본은 미리 준비하고 사용 전에 DTT를 추가하여 4°C에서 보관할 수 있습니다.

올리고뉴클레오티드 스톡 및 마스터 혼합물은 장기간 사용을 위해 -20°C에서 보관해야 하며, 형광 라벨이 부착된 올리고뉴클레오티드 또는 혼합물은 형광단의 광표백을 방지하기 위해 호일로 싸야 합니다. 올리고뉴클레오티드 무결성을 손상시킬 수 있는 반복적인 동결-해동 주기를 피하려면 더 작은 용량(>1mL)을 준비하고 사용하는 것이 좋습니다.

분석 설정 및 결과 분석: 대조군의 포함은 분석 결과의 올바른 해석을 위해 필수적입니다. 단백질이 없는 대조군(완충 용액이 있는 DNA 기질)을 사용하여 기질의 명백한 활성이 효소의 결과인지 확인해야 합니다. 뉴클레아제의 경우, 외인성 기질 분해로 인해 저분자량 대역 또는 래더링이 제어되는 반면, 리가아제 또는 중합효소의 경우 불완전한 이중 변성으로 인해 고분자량 대역이 제어됩니다. 예상 제품의 크기에 대한 포지티브 컨트롤은 표 2 에 제공되며 올바른 제품 크기를 확인하기 위해 포함되어야 합니다.

분석 산물의 성공적인 전기영동에서의 중요한 파라미터는 이전 프로토콜(⁵⁹)에서 설명되었다. 여기에는 아크릴아마이드의 비율이 기판 크기에 적합한지 확인하고 기판의 크기와 결과 시각화에 필요한 겔 유형에 따라 적절한 로딩 염료를 사용하는 것이 포함됩니다. 추적 염료 브로모페놀 블루는 10-염기 올리고뉴클레오티드의 대략적인 크기로 실행되므로 여기에 설명된 올리고뉴클레오티드 세트에 적합합니다. 그러나, 더 짧은 뉴클레오티드를 사용할 때 형광 생성물 또는 기질 밴드와 겹치는 염료 띠가 있는 경우, 추적 염료는 더 느리게 실행되는 크실렌 시안올로 교환될 수 있다(⁶⁰).

기판/제품 밴드의 우수한 분리능을 보장하기 위해 겔 탱크는 수조를 사용하여 외부에서 가열하거나 고전압(예: 180V)을 작동시켜야 합니다. 최소 30분 동안 요소 PAGE 젤을 사전 실행하고 피펫으로 웰을 세척하여 과도한 요소를 제거하는 것은 정량화에 적합한 날카롭고 직선 밴드를 얻는 데 필수적입니다.

기판 및 제품의 정량화를 위해 전체 재료의 20%-80% 범위를 제품으로 변환하여 형광 겔 밴드의 정확한 통합을 허용해야 합니다. 새로운 효소를 분석하는 경우 이 범위에서 후속 측정을 수행할 수 있도록 단백질 농도의 구배를 실행하는 것이 좋습니다. 많은 형광 이미저에는 이러한 목적으로 사용할 수 있는 내장 밴드 통합 기능이 있습니다. ImageJ⁴⁹와 같은 외부 프로그램을 사용하는 경우 젤 이미지를 tiff 형식으로 고품질로 내보내야 합니다.

기술의 수정 및 문제 해결
올리고뉴클레오티드 설계 및 구매: 이 프로토콜에 제공된 올리고뉴클레오티드는 유용한 시작점이며 방법 섹션에서 제안한 대로 올리고뉴클레오티드 서열을 변경하고 변형을 통합하여 확장할 수 있습니다.

표준 분석 설정 및 결과 분석: 최적의 반응 조건은 단백질마다 다르기 때문에 새로운 효소의 활성을 테스트할 때 파일럿 실험이 필수적입니다. 이 프로토콜에 제공된 매개변수는 시작점으로만 사용됩니다. 효소 농도, 반응 온도, 배양 기간, 보조 인자 및 완충액 조성/pH와 같은 요인은 마스터 믹스 및 분석 반응 조립 중에 변경될 수 있습니다. 보조인자 농도는 뉴클레오티드 보조인자 또는 금속 이온의 과잉이 억제될 수 있으므로 특히 중요하며, 각각의 농도 범위를 검사하는 것이 좋습니다. DNA 중합효소의 경우, 권장되는 dNTP 농도는 총 20 내지 200 μM 범위이지만, 높은 dNTP 농도는 충실도를 감소시킨다⁶¹. 마찬가지로, 폴리뉴클레오티드 리가아제는 전형적으로 0.1-1.0mM 뉴클레오티드 보조인자로 분석되지만, 과도한 농도는 축적된 DNA를 아데닐화 및 반응 억제를 유발한다⁶².

여기서 표준 프로토콜은 Mg를 2가 양이온으로 사용합니다. 그러나 일부 효소는 망간(Mn) 또는 아연(Zn)에서 더 활성화됩니다. Mn 또는 Zn을 포함하는 마스터 혼합물은 더 낮은 pH 완충액(<7.5)으로 제조해야 하며 가열 후 금속을 첨가해야 합니다. 마스터 믹스는 침전과 효소 활성의 억제를 피하기 위해 같은 날에 사용해야 합니다.

폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 군집제 또는 소 혈청 알부민과 같은 안정제를 포함하는 첨가제는 일부 효소^63,64의 활성을 증가시키는 데 사용될 수 있습니다. 이들은 thermolability 때문에 어닐링 단계 후에 추가되어야 합니다. 생물학적으로 파생된 모든 시약은 오염성 뉴클레아제의 유입을 방지하기 위해 분자생물학 등급이어야 합니다.

이 프로토콜에 사용된 포름아미드 소멸 완충액의 부피는 올리고뉴클레오티드의 기저 세트에 적합합니다. 그러나 더 긴 올리고뉴클레오티드의 경우 완전한 가닥 분리를 보장하기 위해 포름아미드의 부피를 10μL에서 20μL 사이로 늘려야 하며, 담금질된 반응은 얼음에서 스냅 냉각하여 전기영동이 될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.

몇몇 효소의 경우에, 기질/제품에 단백질의 단단한 결합은 전기 이동법 도중, 특히 효소가 고농도에 사용될 때 젤로 oligonucleotides의 이동을 배제할지도 모릅니다. 이는 겔에 생성물/기질 밴드가 부족하고 종종 웰에 형광 물질(단백질과 복합된 제품 및/또는 기질)이 축적된 것으로 나타납니다. 이러한 복합체를 파괴하기 위해 담금질 완충액을 첨가하기 전에 분석 혼합물을 Proteinase K로 처리하거나 담금질 중에 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 첨가할 수 있습니다.

DNA 리가아제 활성은 정량화하기 쉬운 두 개의 개별 밴드를 생성합니다. 단일 20 뉴클레오티드 생성물이 예상되는 경우 DNA 손상 기질에서 엔도뉴클레아제 활성을 정량화하기 위해 동일한 방법을 사용하거나 결합/결합되지 않은 상태가 명확하게 구별되는 EMSA 분석을 사용할 수 있습니다. 중합효소 및 processive nuclease 활성의 정확한 정량화는 band integration으로 인해 어려우며, 일반적으로 소개에서 설명한 대로 프로브 또는 비콘과 함께 실시간 분석을 사용하는 것이 권장됩니다.

DNA 리가아제의 탈아데닐화 및 보조인자 특이성: 모든 배경 활성을 제거하기 위해 이 프로토콜의 일부 최적화가 필요할 수 있으며, 이는 뉴클레오티드 보조인자를 추가하여 복원됩니다. 탈-아데닐화(de-adenylation) 후에도 배경 리가아제 활성이 남아 있는 경우(no-cofactor 대조군에서 ligation으로 나타남), 탈-아데닐화 단계의 배양 시간이 증가하거나 리가아제의 농도가 감소할 수 있습니다. 라벨이 없는 DNA nick duplex가 단백질보다 더 농축되어 있는지 확인합니다(> 4:1::substrate: protein). 라벨링된 DNA가 있는 상태에서 보조인자를 추가해도 테스트된 보조인자 중 어느 것에도 대한 결찰이 복원되지 않는 경우, 효소가 변성되었을 수 있으므로 탈아데닐화 단계를 단축해야 합니다. 새로운 리가아제 또는 재조합 효소의 새로운 배치의 경우, 추가적인 뉴클레오티드 보조인자가 없는 상태에서 아데닐화 효소를 사용한 배경 결찰의 정도를 결정하는 것이 유용합니다. 여기에는 10 μL의 un-labeled master mix, 10 μL의 labeled master mix 및 de-adenylation되지 않은 2.5 μL의 신선한 효소를 동시에 배양하는 또 다른 반응 설정이 포함됩니다.

이중 라벨 기판 사용: 이 프로토콜은 원래 사용된 형광단과 다른 excitation/emission 스펙트럼을 갖는 형광 부분이 있는 oligonucleotide를 설계하고 구매한 다음 이를 이중으로 조립하여 두 개의 직교 형광단이 기판의 다른 부분을 라벨링하도록 해야 합니다. 의심스러우면 FPbase Spectra Viewer 및 BD Spectrum Viewer와 같은 여러 온라인 스펙트럼 뷰어를 사용하여 fluorophore pair의 호환성과 가장 적절한 이미저 설정을 모두 확인할 수 있습니다. 겔을 시각화하는 데 사용되는 특정 설정은 이미저의 모델과 사용된 형광단에 따라 다릅니다. 합성 이미지는 단일 겔에서 두 채널의 신호를 기록하고 두 형광단이 동일한 제품에 부착된 밴드는 중간 색상으로 표시됩니다. 개별 채널의 개별 이미지를 분석하여 차등적으로 라벨링된 가닥의 접합 또는 분해 정도를 정량화할 수 있습니다.

기술의 한계
형광 라벨링된 기판으로 작업하면 낮은 건강 위험과 같은 많은 이점이 있지만 이러한 유형의 라벨이 부착된 기판으로 작업할 때 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그 중 하나는 이러한 올리고뉴클레오티드를 형광단 라벨과 함께 주문하거나 손상된 염기 추가와 같은 변형을 주문하는 데 드는 비용이 사내 방사선 라벨링에 비해 상대적으로 높다는 것입니다. 다른 하나는 라벨링된 가닥을 감지하기 위해 특수 이미징 장비와 소프트웨어가 필요하다는 것입니다. 그러나 이러한 기능은 이제 대부분의 새로운 젤 이미징 시스템에 포함되어 있습니다. 또한 fluorophores가 target interaction protein의 결합 특성을 변경할 수 있는 가능성도 고려해야 합니다. 플루오레세인 및 그 유도체 FAM은 일반적으로 올리고뉴클레오티드를 라벨링하는 데 사용되며 pH 및 뉴클레오베이스 소멸의 변화에 민감합니다⁶⁵. 이러한 제한 사항은 이중 설계를 위해 올리고뉴클레오티드에 대한 형광단의 유형과 배치를 결정할 때 신중하게 고려해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
30% 아크릴아미드/비스 용액 (29:1)	BioRad	1610156
아데노신 삼인산(ATP)	많은 공급업체
과황산암모늄(APS)	많은 공급업체
탁상용 원심분리기	많은 공급업체
붕산염	많은 공급업체
브로모페놀 블루	많은 공급 업체
Dithiothreitol (DTT)	많은 공급 업체
순환 수조가있는 전기 영동 시스템	많은 공급 업체
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)	많은 공급 업체
형광 이미저, 예 : iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
포름 아미드	많은 공급 업체
겔 주조 시스템	많은 공급 업체
가열 블록	많은 공급 업체
마그네슘	많은 공급 업체		기타 금속 이온은 연구 된 단백질에 따라 선호 될 수
마이크로 원심 분리 튜브 (1.5 mL)	많은 공급 업체
마이크로 피펫 및 팁	많은 공급 업체		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)	많은 공급업체
들 올리고뉴클레오티드	통합 DNA 기술	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript 및 기타 업체도 이러한
목초지 피펫	공급업체
PCR 열순환기	많은 공급업체
PCR 튜브	RNAse
away	ThermoFisher	7002PK	RNA 올리고로 작업할 때만 필요
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	RNAse 제거를 위한 계면활성제 표면 오염
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	RNA 올리고로 작업할 때만 필요
염화나트륨	많은 공급업체
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	이것은 염색 후 겔을 시각화하고 라벨링되지 않은 올리고뉴클레오티드를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다:
테트라메틸에틸렌디아민(TMED),	많은 공급업체
, 트리스 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄	많은 공급업체
초순수(Milli-Q)	머크
, 요소,	많은 공급업체
, 볼텍스	많은 공급업체