방법 논문

α-Synuclein 응집체의 비강 내 투여 기법

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⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

2024년 11월 8일

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 α-synuclein 응집체의 비강 내 투여 방법을 설명합니다. 이 방법은 파킨슨병에서 후각 점막에서 후각구까지 α-synuclein 전파에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

파킨슨병(PD)은 α-시누클레인(α-Syn)의 응집체인 루이소체(Lewy bodies)의 존재를 특징으로 하는 신경퇴행성 질환입니다. 최근에는 미주신경의 등핵(oabal nucleus 또는 olfactory bulb)에서 α-Syn 응집체의 프리온(prion)과 같은 증식을 통해 발병하고 진행하는 것으로 제안되었습니다. 산부인과에서 α-Syn 응집체의 기원은 불분명하지만, 후각 점막에서 전파되는 것으로 최근 제안되었습니다. 우리는 이전에 마우스 모델에서 α-Syn 응집체의 비강 내 투여가 마우스의 OB에서 α-Syn 병리학을 유발한다는 것을 보여주었습니다. 본 연구에서는 생쥐의 산부인과에서 α-Syn 병리를 유발한 α-Syn 응집체의 비강 내 투여 방법을 제시한다. α-Syn 응집체의 비강 내 투여는 매우 간단하고 간단한 방법이며, 산부인과에서 α-Syn 병리의 기원과 후각계를 통한 α-Syn 증식 경로를 규명하는 연구에 유용한 도구가 될 것이라고 생각합니다.

서론

파킨슨병(PD)은 서동증, 안정시 떨림, 근육 경직과 같은 운동 증상을 특징으로 하며, 두 번째로 흔한 신경퇴행성 질환이다1. 파킨슨병은 또한 후각 기능 장애, 인지 장애, 우울증, 환각, 변비 및 기립성 저혈압을 포함한 비운동 증상을 나타냅니다. 그것의 병리학적인 특징은 substantia nigra에 있는 도파민 세포 죽음 및 Lewy 몸에게 불린 α-synuclein (α-Syn) 응집체의 존재입니다2.

참고로, α-Syn은 정상적인 조건에서 용해성 단량체(또는 사량체) 형태로 존재하는 140-아미노산 단백질입니다. 그러나 비정상적인 조건에서 용해성 단량체는 올리고머 및 피브릴을 포함하는 불용성 고분자량 응집체로 전환됩니다. α-Syn이 올리고머와 피브릴로 전환되는 것은 세포 독성에 관여하는 것으로 보고되었습니다3.

최근 연구에서는 뉴런 사이의 α-Syn 응집체의 프리온과 유사한 전파를 제안했습니다. 2003년 Braak 등은 수많은 사후 검시를 바탕으로 루이소체 병리학이 다소 정형화된 방식으로 뇌에서 점진적으로 퍼진다는 가설을 제안했습니다(Braak의 가설)4,5. 2008년, 태아 중뇌 이식을 받은 PD 환자에 대한 사후 검사에서 태아 조직에서 유래한 도파민 뉴런에서 루이소체가 발견되었습니다 6,7. 이 연구는 α-Syn 응집체가 병든 뇌에서 이식편으로 퍼질 수 있음을 시사하여 Braak의 가설을 뒷받침했습니다.

이러한 관찰에 이어, 1차 신경 세포 배양 및 마우스에서 α-Syn 응집체의 뇌내 주입과 관련된 실험은 Lewy body와 같은 응집체의 확산을 재현하여 프리온과 같은 방식으로 α-Syn 증식에 대한 추가 증거를 제공했습니다 8,9.

Braak 등은 PD의 루이소체 병리학이 후각구(OB) 및/또는 미주신경(dmX)의 등핵에서 시작된다는 것을 보여주었습니다4. Braak의 가설에 기초하여, 여러 연구에서 PD 뇌의 α-Syn 응집체 또는 루이소체 추출물을 실험 동물의 산부인과 및 위장관으로 투여한다고 보고했습니다 10,11,12. 2018년 한 연구에서는 야생형 마우스의 산부인과에 α-Syn 응집체를 투여하면 후각 경로를 따라 α-Syn 병리학이 증식되어 후각 기능 장애를 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다13. 우리는 이전에 α-Syn 응집체를 α-Syn 형질전환 마우스의 OB에 접종한 결과 이것이 해마 위축과 기억 장애를 유발한다는 것을 발견했습니다14.

2022년, 우리는 인간이 아닌 작은 영장류인 마모셋(marmosets)의 OB에 α-Syn 응집체를 접종했습니다. 그 결과 후각 경로를 따라 α-Syn 병리학이 전파되고, 산과 위축이 발생하며, 대뇌 포도당 대사 저하가 광범위하게 발생했다10.

그러나 α-Syn 응집체의 전파가 OB에서 발생하는 경우 중요한 질문이 발생합니다. α-Syn 응집체는 처음에 어떤 메커니즘에 의해 나타나는가? Saito 등은 이전에 코 점막에서 루이소체(Lewy body)의 존재를 보고했다15. PD 및 다발성 시스템 위축(MSA) 환자의 코 점막에서 실시간 떨림 유도 변환(RT-QUIC) 분석을 사용하여 α-Syn 응집체의 존재를 감지했습니다16. 특히, 파킨슨병 전구 단계로 간주되는 급속 안구 운동 수면 행동 장애(RBD) 환자의 코 점막 샘플을 분석한 결과, α-Syn 수치가 증가한 것으로 나타났습니다17. 이 연구는 α-Syn 병리학이 PD의 전구기에서도 코 점막에 존재할 수 있음을 시사했습니다.

이러한 발견은 코 점막에서 산부인과로 가는 잠재적인 경로를 시사했지만, 이 시나리오를 뒷받침하는 실험적 증거는 제한적이었습니다. 이 간극을 해소하기 위해 α-Syn 응집체를 마우스의 비강에 투여하고 α-Syn 병리학이 코 점막에서 산부인과로 전파되는 것을 조사했습니다. 우리의 실험적 접근 방식은 야생형 마우스에서 α-Syn 응집체의 단일 용량 비강 내 투여가 OB에서 α-Syn 병리학을 유발하여 코 점막에서 OB로의 증식 경로에 대한 실험적 증거를 제공한다는 것을 입증했습니다.

프로토콜

본 연구에는 생후 2개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용하였다. 모든 실험 절차는 국가 지침에 따라 수행되었습니다. 교토 대학의 동물 연구위원회는 이 연구에 대한 윤리적 승인과 허가를 내렸습니다(MedKyo 23,544).

1. α-Syn 미리 형성된 원섬유의 비강 내 투여

  1. 이전에 보고된 방법11에 따라 PBS(4mg/mL)에서 마우스 α-Syn 피브릴 용액을 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 튜브를 투명 필름으로 감쌉니다.
  2. 수조형 초음파 처리기를 사용하여 α-Syn 예비형성된 원섬유(PFF)를 생성하기 위해 200μL의 α-Syn 피브릴 용액을 초음파 처리합니다(재료 표). 초음파 수조에 물을 채우고 얼음 조각을 넣어 초음파 처리를 위해 4 ° C로 식히십시오. 총 5 분 동안 원섬유를 초음파 처리 각 사이클은 30 초의 초음파 처리 후 30 초 간격 (총 5 사이클)으로 구성됩니다.
    알림: 일회용 장갑, 마스크, 보안경과 같은 개인 보호 장비를 사용하여 α-Syn에 노출되지 않도록 하십시오.
  3. 10 μL 피펫 팁이 있는 P10 피펫(Table of Materials)을 준비합니다. 복강내(i.p.) 주사로 메데토미딘 하이드로클로라이드, 미다졸람 및 부토르파놀(MMB)의 조합을 사용하여 각 마우스를 마취합니다. MMB 복합 마취제에는 미다졸람(0.3mg/kg), 메데토미딘(4mg/kg) 및 부토르파놀 타르타르산염(5mg/kg)이 포함되어 있습니다. 미다졸람(1mg/mL) 0.3mL, 메데토미딘(5mg/mL) 0.8mL, 부토르판올 주석산염(5mg/mL) 1mL, 식염수 2.9mL를 혼합할 때 0.005mL/g을 i.p. 주사로 사용합니다.
  4. 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 10분 동안 기다립니다. 적절한 마취는 마우스가 측면 누운 상태에 있고 스스로 바로설 수 없는 경우 확인할 수 있습니다. 마취가 끝나면 멸균 면 어플리케이터를 사용하여 안과 연고를 바르면 눈이 건조해지는 것을 방지합니다.
    참고: 마취가 없으면 비강을 투여할 때 생쥐를 누운 상태로 유지하고 생쥐가 재채기를 할 때 α-Syn 용액을 적절하게 투여하기 어렵습니다. 이러한 이유로 진정제가 필요했습니다.
  5. 마취된 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 종이 타월이나 이와 유사한 재료를 몸 아래에 놓고 머리가 약간 아래쪽으로 기울어지도록 합니다(그림 1A, B). 이러한 포지셔닝은 투여된 α-Syn 용액이 폐나 식도로 빠르게 흘러 들어가는 것을 방지하여 비강에 머무르는 것을 용이하게 합니다. 콧구멍은 그림 1C에서 볼 수 있습니다.
  6. 1 μL의 α-Syn 용액(4 mg/mL)을 P10 피펫에 주입하고 피펫 팁을 마우스의 코 근처에 놓습니다. 천천히 둥근 방울을 형성하고 피펫 팁 끝에 유지합니다(그림 1D, 빨간색 화살표). 비강 내 투여는 편측성 콧구멍에 대해 수행되며 반대쪽 쪽을 대조측으로 사용합니다.
  7. 방울을 마우스 콧구멍의 한쪽 면에 가까이 가져가 마우스가 자연스럽게 흡입할 수 있도록 합니다. 흡입을 관찰하고 30초에서 1분 동안 기다립니다(그림 1E).
  8. 1.6.-1.7단계를 반복합니다. 총 부피 20μL의 α-Syn 용액이 투여될 때까지. 모든 절차가 끝나면 장갑을 버리고 표면이 α-Syn으로 오염된 경우 상업용 세제로 벤치를 닦으십시오.
    알림: 전체 절차는 절차를 수행하는 직원이 α-Syn 원섬유를 흡입하는 것을 방지하기 위해 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 이전 보고서에 따르면 25μL의 부피가 코에서 뇌로 약물 투여에 가장 효율적입니다18. 본 연구에서는 유사한 부피의 20μL를 사용합니다. 또한 이전 보고서10에서 OB에 주입할 때와 동일한 농도의 PFF를 사용하며, 이는 PFF19의 400μM(5.6mg/mL)에 가깝습니다.
  9. 아티파메졸(3mg/kg; 재료 표) 메데토미딘을 역전시키고 회복을 촉진하기 위해 I.P. 주사로. 아티파메졸(5mg/mL) 0.6mL와 식염수 4.4mL를 혼합할 때 0.005mL/g을 ip. 주사로 사용합니다.
    참고: α-Syn의 비강 내 투여가 얼마나 스트레스가 많은지 완전히 이해되지 않았기 때문에 진통제를 제공하십시오.
  10. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복된 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.

2. 시료 준비

  1. α-Syn preformed fibrils의 비강 내 투여 후 1, 3, 6 및 12개월에 처리된 마우스를 희생합니다.
    1. 마우스를 유도 상자에 넣고 세보플루란(>6.5%)을 투여하고 > 60초 동안 호흡 정지가 발생할 때까지 계속합니다. 쥐를 제거하고 안락사를 보장하기 위해 우심방 절개로 신속한 출혈을 수행합니다.
  2. 25G 바늘(재료 표)을 심장 정점에 삽입합니다. 15mL의 PBS를 사용하여 4mL/분으로 마우스를 관류한 다음 PBS에 15mL의 4% PFA를 주입합니다.
  3. 가위로 머리를 잘라내고 메스로 두피를 2cm 정도 절개한다. 가위로 두개골 뼈를 아래쪽에서 코까지 옆쪽으로 절개합니다(그림 2A, B). OB를 얻으려면 OB의 두개골 뼈를 완전히 제거합니다(그림 2B, 노란색 원).
  4. 머리를 뒤집어 뇌 신경을 절단한 다음 집게로 조심스럽게 뇌를 제거합니다(그림 2C, D). OB가 손상되지 않은 뇌를 얻습니다(그림 2E). 온전한 OB를 얻으려면 OB가 두개골 뼈에 부착될 때 집게로 후각 신경을 조심스럽게 절단합니다(그림 2D, 노란색 원).
  5. 뇌 샘플을 4% PFA에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 PBS에 넣습니다. 뇌 샘플을 24시간 이상 방치하지 마십시오.
    참고: 과도한 고정은 면역조직화학 염색을 감소시킵니다. 장기 보관이 필요한 경우 뇌 샘플을 0.1% 아지드화나트륨을 함유한 70% 에탄올 또는 PBS에 보관하여 무균 상태를 유지하십시오.

3. OB의 면역조직화학적 염색

  1. 아래와 같이 자동 조직 처리기(Table of Materials)를 사용하여 샘플을 파라핀화합니다.
    1. 70% 에탄올에 120분 동안 담근 다음 100% 에탄올에 8배 60분 동안 담그십시오. 그런 다음 100% 자일렌에 3회 120분 동안 담급니다.
    2. 파라핀에 60°C에서 120분 동안 담근 다음 파라핀에 60°C에서 240분 동안 침지합니다.
  2. 아래 설명된 대로 샘플을 파라핀에 삽입합니다.
    1. 모듈식 조직 포매 센터(Table of Materials)를 사용하여 60°C의 파라핀에 샘플을 삽입합니다. 얼음에 식히십시오.
  3. 마이크로톰(Table of Materials)을 사용하여 샘플을 8μm 두께의 섹션으로 자릅니다18.
  4. 아래와 같이 파라핀화를 수행합니다.
    1. 100% 자일렌에 2회 5분 동안 담근 다음 100% 에탄올에 2회 3분 동안 담그십시오.
    2. 70% 에탄올에 3분 동안 담그십시오. PBS에서 3분 동안 세척합니다.
  5. 아래 설명된 대로 항원 회수를 수행합니다.
    1. 100% 포름산에 15분 동안 담급니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 2분 동안 헹굽니다.
    2. 120°C에서 10분 동안 오토클레이브 자연적으로 식히십시오.
  6. 메탄올에 1% 과산화수소를 10분 동안 담가둡니다. PBS에서 5분 동안 세척합니다.
  7. 슬라이드의 PBS에 5% 탈지유 500μL를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  8. PBS에 500μL의 항인산화α-Syn 항체(p-α-Syn, 1/10000)를 슬라이드에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 각각 5분 동안 2번 세탁합니다.
  9. 범용 면역 과산화 효소 중합체, 안티 토끼 (재료 표)로 25 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다. PBS로 각각 5분 동안 2번 세탁합니다.
  10. 제조업체의 지침에 따라 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색 키트(재료 표)를 사용하여 5분 동안 현상합니다.
  11. 헤마톡실린 용액에 1분 동안 담급니다(재료 표). 흐르는 물에 10분 동안 탈색합니다.
  12. 아래 설명된 대로 장착을 수행합니다.
    1. 70% 에탄올에 5분 동안 담가둡니다. 100% 에탄올에 2회 5분 동안 담그십시오.
    2. 100% 자일렌에 5분 동안 2회 담그십시오. 임베딩 매체를 사용하여 장착합니다(Table of Materials). 100μL의 임베딩 매체를 슬라이드에 적용하고 유리 커버슬립으로 덮습니다.
  13. All-in-One 현미경을 사용하여 20x 및 40x 배율로 이미지를 획득합니다(Table of Materials).

결과

그림 3은 OB에서 α-Syn 응집체의 몇 가지 예를 보여줍니다. 본 연구에서는 α-Syn 응집체를 편측 콧구멍에 투여했습니다. 두 개의 비강은 비중격에 의해 분리되어 있으며, 각 산부인과는 후각 감각 뉴런을 각 비강에 개별적으로 투영합니다. 따라서 반대쪽 OB를 대조군으로 사용할 수 있습니다.

P-α-Syn 병리는 1개월 및 3개월 후 치료 측의 산부인과에서 관찰되지 않았습니다(그림 3A, B). Lewy neurite-like p-α-Syn 응집체는 6개월 및 12개월 후에 처리된 측의 사구체에서 관찰되었습니다. (그림 3C, D, F, G). 이러한 응집체는 대조군 측의 OB에서 관찰되지 않았습니다(그림 3E).

α-Syn 응집체를 계산하거나 ImageJ(Table of Materials)를 사용하여 크기 등을 검사하여 α-Syn 병리학을 추정할 수 있습니다. 예를 들어, 이전에 이 모델20에서 α-Syn 응집체의 수를 계산하고 보고했습니다. 치료된 쪽의 산부인과에서, 산부인과 내 루이 중성석 유사 응집체는 12개월에 걸쳐 유의하게 증가했다(일원 분산 분석, Dunnett의 검정, p < 0.01; 그림 3H). 제어 측의 OB에는 α-Syn 응집체가 거의 없습니다.

이전 연구에서는 쥐의 뇌에 주입된 PFF가 일주일 이내에 분해되고 내인성 마우스 α-Syn이 α-Syn 응집체로 전환되는 것으로 나타났습니다19. 본 연구에서 시간 경과에 따른 α-Syn 병리학의 증가는 내인성 마우스 α-Syn이 PFF의 단일 용량 비강 내 투여에 의해 α-Syn 응집체로 전환되었음을 나타냅니다. 이러한 결과는 α-Syn 병리학이 후각 점막에서 산부인과로 퍼질 수 있음을 시사했습니다.

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그림 1: 마우스의 비강 투여 방법. (A) 마우스는 머리가 약간 아래쪽으로 기울어진 상태에서 앙와위 위치에 있습니다. (B) 마우스의 콧구멍은 노란색 화살촉으로 표시됩니다. (C, D) α-Syn 피브릴 용액을 마우스의 콧구멍에 떨어뜨리고(C, 빨간색 화살표) 빠르게 흡입합니다(D, 빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 온전한 후각구를 얻기 위한 단계의 개요. (A) 가위를 사용하여 두개골 뼈를 궁수 및 측면으로 절개합니다(노란색 점선). (B) 후각구(OB)의 두개골 뼈를 완전히 제거합니다. (C) 머리를 뒤집어 조심스럽게 뇌를 제거합니다. 뇌 신경을 절단하십시오. (D) 두개골에 붙어있는 후각 신경을 절단한다. (E) 온전한 OB가 있는 전체 뇌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: P-α-Syn은 후각구의 사구체에서 응집됩니다. (A-G) P-α-Syn (EP1536Y) 비강 투여 후 처리측 1, 3, 6, 12개월(각각 1m, 3m, 6m, 12m)에 대한 산부인과의 면역조직화학과 (E) 비강 투여 후 12개월 후 대조군. (C, D) 루이소, 중성석, 실과 같은 α-Syn 응집체가 사구체 주위에 나타납니다. (여, 지) 확대 이미지는 비강 투여 후 12개월 후의 Lewy neurite-like p-α-Syn 6의 고배율 이미지입니다. (H) 처리 및 대조 측의 OB에서 Lewy neurite-like p-α-Syn 침전의 양(n = 4-5). 그래프는 평균 ± SEM을 보여줍니다. 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 검정이 뒤따릅니다. **<0.01. 이 수치는 이전 보고서(20)에서 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이전 연구에서, 원숭이의 비강에 α-Syn 응집체를 투여하면 도파민 세포의 사멸과 흑질에 철의 침착이 유도되었지만, α-Syn 응집체는 관찰되지 않았다21. A53T 인간 α-Syn 응집체를 프리온 프로모터 α-Syn 형질전환 마우스(M83 마우스)의 비강에 28일 동안 매일 투여하면 마우스의 뇌에서 α-Syn 병리학이 유발되고 운동 증상이 유발되는 것으로 보고되었습니다19,22. 본 연구에서 우리는 α-Syn의 단일 용량 투여가 산부인과에서 α-Syn 병리학을 유발하는 야생형 마우스의 비강으로 응집된다는 것을 입증했습니다. 이 간단한 방법은 코 점막에서 산부인과로의 α-Syn 전파를 조사하는 데 유용한 것으로 간주될 수 있습니다.

이전 보고서에서 단편화된 α-Syn 응집체의 크기가 작을수록 α-Syn 병리학을 유발하는 데 가장 효율적이라는 것을 보여주었기 때문에 이 방법에서 α-Syn 피브릴의 충분한 초음파 처리가 중요합니다23,24. α-Syn 피브릴의 불충분한 초음파 처리는 OB로의 전파를 거의 일으키지 않습니다. 다른 초음파 발생기는 다양한 초음파 처리 능력을 가지고 있기 때문에이 프로세스의 최적화가 필요합니다. α-Syn 용액을 마우스의 콧구멍에 투여할 때 마우스의 누운 자세도 중요합니다. 쥐의 머리를 들어 올리면 α-Syn 용액이 폐와 식도로 흘러 들어갑니다. 부적절한 자세는 예기치 않은 사망 또는 불충분한 α-Syn 전파를 유발할 수 있습니다.

본 연구에서 i.p.는 마취를 위해 MMB 복합 마취제를 사용했습니다. MMB 병용 마취는 우수한 진정 및 진통제를 제공하는 것으로 보고되었으며, 그 효과는 아티파메졸에 의해 빠르게 역전될 수 있었다23. 흡입 마취는 마취를 유지하기 위해 마스크로 콧구멍을 덮어야 하기 때문에 α-Syn 용액을 비강 내에 투여하는 것이 더 어렵습니다. 또한, 로테논 모델은 널리 연구되어 왔으며 매우 유용한 모델이다25. 그러나 이 질환은 약물 유도 모델이며 특발성 파킨슨병(iPD)과는 다른 병리기전을 가질 수 있다25. 이 모델은 α-Syn 전파를 유도했기 때문에 iPD에 더 가깝다고 생각합니다.

본 연구는 또한 외인성 α-Syn 응집체가 코 점막을 통해 전달될 수 있음을 시사했습니다. 따라서 연구자가 α-Syn 응집체를 사용하여 실험을 수행할 때 α-Syn 응집체의 흡입을 방지하기 위한 예방 조치를 취해야 합니다. 예를 들어, α-Syn 에어로졸은 초음파 처리 단계에서 생성될 수 있습니다. 안전 캐비닛 내에서 밀봉 형 초음파 발생기 또는 초음파 처리를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 생쥐는 재채기를 하여 잠재적으로 α-Syn 에어로졸을 생성할 수 있습니다. 이러한 위험을 완화하려면 모든 작업을 안전 캐비닛 내에서 수행해야 합니다. 또한 연구원은 α-Syn에 노출되지 않도록 일회용 장갑, 마스크, 보안경과 같은 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 모든 절차가 끝나면 연구원들은 표면이 α-Syn으로 오염된 경우 상업용 세제로 벤치를 닦아야 합니다. 이전 보고서에 따르면 상업용 세제와 SDS는 모두 오염된 표면에서 골재를 분리했습니다26,27.

이 연구에서는 OB의 작은 구조가 동결 절편에 비해 파라핀 절편에서 더 잘 보존되기 때문에 OB에서 α-Syn 병리를 평가하기 위해 파라핀 절편을 사용했습니다. 이 연구는 산부인과에서 α-Syn 병리학이 유도되었음을 보여주었습니다. 그러나 관찰된 α-Syn 병리학은 경미하고 제한적이었으며 대부분 사구체에서 루이 신경돌기로 알려진 실 모양의 응집체에 의해 나타났습니다.

실험용 마우스의 명백한 행동 변화는 본 연구에서 관찰되지 않았다는 점에 유의해야 합니다. 이 방법에 의해 유도된 α-Syn 병리학은 행동 표현형의 변화를 유도하기에 불충분할 수 있습니다. 심각한 병리학 및 행동 변화로 이어지는 특정 조건을 밝히기 위해 추가 조사가 필요합니다. 앞으로 코 점막에서 산부인과로 전파하는 보다 효율적인 방법을 확립할 수 있다면 이 간단한 방법은 수술 없이 α-Syn 전파를 평가할 수 있는 대안적인 방법을 제공할 것입니다.

또한, 우리는 치료된 마우스의 반대쪽 측면에 있는 OB를 대조군으로 사용했습니다. 그러나 전방 후각핵 또는 이상형 피질에서 반대쪽 OB로의 역행 전파는 장기적인 추적 관찰에서 발생할 수 있습니다. 이 경우, 처리되지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다.

이 간단한 방법은 코 점막에서 산부인과로의 α-Syn 전파에 대한 귀중한 통찰력을 제공하지만, PD의 기저에 있는 메커니즘을 종합적으로 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

모든 실험은 히카와 리에의 지원을 받았습니다. 서류 작업에 대해 Yasuko Matsuzawa에게 감사를 표합니다. 본 연구는 JSPS KAKENHI(M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 및 JP20H00663).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
일체형 형광 현미경 BZ-X710KEYENCEN/A일체형 현미경
암피실린 나트륨 염Nacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006A수조 유형 초음파 발생기.
Butorphanol 주석산 MeijiSeika PharmaWAK-52850
셀룰로오스 튜브MISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21 (DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255유능한 셀
EntellanSigma-Aldrich107961현미경 검사용 빠른 설치 매체
Graefe Extra Fine Forceps Curved SerratedFST11152-10 집게
경화 파인 가위FST14090-09가위
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick scientific9105085Incubator shaker
Isopropyl-β- D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB broth, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108모듈식 조직 임베딩 센터
Leica TP 1020Leica14 0422 85108자동 조직 처리기 
메데토미딘후지 필름135-17473
Microm HM325 로터리 마이크로톰Thermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
새로운 헤마톡실린 G형Muto65-9197-38헤마톡실린 용액
정맥 D형용 일반 날개 바늘, 25G테루모NN2332R25G 바늘
Optima TLX 초원심분리기Beckman Couler8043-30-1197초원심분리기
P10 피펫GilsonFA10002P
파라핀Leica39601095
파라포름알데히드Nacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23225BCA 분석
pRK172Addgene#134504플라스미드
Q-세파로스 빠른 흐름. cytiva17051001이온 교환 수지

참고문헌

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