방법 논문

mRNA 및 단백질 분석을 위한 마우스의 눈물 수집 최적화

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DOI:

10.3791/66955

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2024년 7월 19일

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1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

이 논문에서

요약

마우스 모델의 눈물에서 RNA 및 단백질 바이오마커를 식별하는 것은 다양한 질병의 조기 진단에 큰 가능성을 제공합니다. 이 원고는 mRNA의 효능과 효율성을 최적화하고 마우스 눈물에서 단백질을 분리하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

초록

눈물막은 안구 표면뿐만 아니라 다른 조직과 장기에서도 병리학 관련 분자 변화를 반영할 수 있는 매우 역동적인 생체 유체입니다. 이 생체 유체의 분자 분석은 질병을 진단 또는 모니터링하고, 의학적 치료 효능을 평가하고, 가능한 바이오마커를 식별하는 비침습적 방법을 제공합니다. 시료의 양이 제한되어 있기 때문에 눈물 시료를 채취하려면 높은 품질과 최대 효율성을 보장하기 위해 특정 기술과 적절한 도구가 필요합니다. 인간을 대상으로 한 연구에서 다양한 눈물 채취 방법이 설명되었습니다. 이 기사에서는 실험 동물 모델, 특히 마우스에서 눈물 관련 단백질 정보를 추출하기 위해 특별히 맞춤화된 최적화된 프로토콜에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다. 이 방법에는 2개월 된 마우스의 눈물 생성에 대한 약리학적 자극, Schirmer 스트립을 사용한 샘플 수집, 표준 절차, SDS-PAGE, qPCR 및 디지털 PCR(dPCR)을 통한 프로토콜의 효능 및 효율성 평가가 포함됩니다. 이 프로토콜은 다양한 실험 패러다임에서 눈물 단백질 시그니처 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 동물 모델을 위한 저렴하고 표준화되고 최적화된 눈물 샘플링 프로토콜을 수립함으로써 인간과 동물 연구 간의 격차를 해소하고 중개 연구를 촉진하며 안구 및 전신 질환 연구 분야의 발전을 가속화하는 것이 목표였습니다.

서론

눈물은 혈장 초여과물로 간주되며, 혈장 혈청과 뇌척수액이 공유하는 생체 분자에서 상당한 중복이 있기 때문에 혈장 혈청과 뇌척수액 사이의 중간 유체로 설명되기도 합니다1. 인간의 눈물에는 단백질, 눈물 지질, 대사 산물 및 전해질이 포함되어 있는 것으로 보고되었습니다2. 최근에는 mRNA, miRNA 및 세포외 소포체와 같은 다른 생체 분자도 확인되었습니다 3,4,5,6,7.

인간의 경우 기저 눈물은 3 개의 층으로 구성된 눈물막에 위치하고 있습니다 : 외부 지질층은 눈물 표면을 매끄럽게 유지하여 우리가 그것을 통해 볼 수 있도록하고 눈물 증발을 방지합니다. 눈을 촉촉하게 유지하고, 박테리아를 격퇴하고, 각막을 보호하고, 눈물막의 90%를 구성하는 중간 수성층. 마지막으로 점액층(mucin-layer)은 각막과 접촉하여 눈물이 눈에 부착될 수 있도록 하는 고분자량 단백질군의 일종이다8. 안구 표면을 가로지르는 눈물 분포는 눈물샘에서 분비되는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 이 액체는 누관을 통해 안내되어 눈 표면을 통과하여 배액 채널로 흐릅니다. 눈을 깜빡일 때마다 눈물이 눈 전체에 고르게 분산되어 촉촉한 상태를 유지할 수 있다9.

눈물막은 안구 표면뿐만 아니라 다른 조직과 장기에서도 발생하는 분자 변화를 반영할 수 있는 매우 역동적인 생체 유체입니다. 이 생체 유체의 차등 발현 분석은 인간 질병에서 바이오마커를 발견하기 위한 유망한 접근 방식을 나타냅니다10,11. 다양한 병리학에서 조기 진단을 위한 바이오마커의 원천으로 눈물막을 활용하는 것은 비침습적 수집 방법의 존재에 의해 크게 촉진되었습니다. 인간 및 동물 병원에서 눈물을 채취하는 가장 일반적인 방법은 모세관 작용의 원리에 따라 작동하는 막 기반 지지체(Schirmer's strip)와 관련이 있으며, 이는 눈물의 물이 피험자의 하부 결막낭에 배치된 종이 테스트 스트립 또는 모세관의 길이를 따라 이동할 수 있도록 합니다 12,13,14. 이 방법을 통해 소량의 시료를 얻는 내재적 한계에도 불구하고, 다양한 민감한 기술을 사용한 눈물 조성의 생화학적 분석은 잠재적인 생체지표 분자의 식별을 용이하게 했습니다11,15. 인간 환자에서 Schirmer 스트립 및 모세혈관의 눈물 단백질 용리를 최적화하고 평가하기 위한 프로토콜은 잘 문서화되어 있습니다16,17. 그러나 실험 동물 모델에서 눈물과 관련된 분자 정보를 추출하도록 특별히 설계된 최적화된 프로토콜에 대한 완전한 설명은 제공되지만 드뭅니다. 눈물샘(18)의 직접적인 자극을 통한 눈물 유도와 같은 기존의 방법은, 더 큰 부피의 수집을 허용하면서도, 침습적이며 동물에게 불편을 야기할 수 있다. 안구 표면에서 눈물을 수집하는 것과 같은 비침습적 방법은 DNA와 miRNA를 분리하는 방법으로 설명되었습니다19,21.

이 프로토콜은 마우스의 눈물을 수집하고 처리하기 위한 비용 효율적이고 최적화된 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 SDS-PAGE, qPCR 및 dPCR과 같은 기술을 통해 분자 분석에 적합한 충분한 눈물 부피를 얻으면서 비침습성을 우선시합니다. 추출된 단백질 및 mRNA 함량 정보는 기존 질병 실험 모델에서 잠재적인 바이오마커를 식별하는 데 활용될 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 절차는 Cinvestav의 동물 윤리 위원회(CICUAL, # 0354/23)의 승인을 받았습니다. 실험용 동물은 저널의 동물 사용 지침과 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 성명서에 따라 엄격하게 처리 및 취급되었습니다. 시술 전후의 안구 건강은 안구 분비물, 눈꺼풀 부종, 안구 이상 및 행동 변화를 평가하여 평가되었습니다.

1. 동물 및 시약 준비

  1. 절차를 위해 복제당 3마리의 2개월 된 C57BL/6 수컷 마우스를 사용하며 시작 체중은 ~25g입니다(그림 1). 각 마우스를 개별적으로 처리하고 가열 패드에 올려 따뜻함을 유지합니다.
  2. 눈물 분비를 유도하기 위해 멸균수를 사용하여 20mg/mL의 필로카르핀 원액을 준비합니다.
  3. Schirmer의 테스트 스트립을 5mm 길이로 자르고 노치에서 각 스트립을 90° 각도로 구부립니다.
  4. 프로테아제 억제제와 함께 250μL의 멸균수를 준비합니다(제조업체 지침에 따라 50mL당 1정).

2. 눈물 생성 자극 및 수집

  1. 적절한 치료 복용량을 계산하기 위해 각 마우스의 무게를 개별적으로 측정합니다.
  2. 눈물 생성을 자극하려면 6mm 인슐린 주사기로 복강 내 30mg/kg의 필로카르핀을 투여합니다(그림 1B). 약물 주입 후 2분이 지나면 효과가 나타날 때까지 기다립니다.
    참고: 자극을 받지 않은 동물의 데이터는 눈물액의 가용성이 제한되어 있기 때문에 얻을 수 없습니다.
  3. 핀셋으로 각 Schirmer 스트립 조각의 끝을 아래 눈꺼풀 중앙에 놓고 찢어짐이 스트립 한계에 도달할 때까지 제자리에 유지하여 눈물을 수집합니다(그림 1C). 그런 다음 스트립을 교체하십시오. 채취를 위해 스트립 사이에 2분 간격으로 각 눈에 2개의 Schirmer 스트립을 순차적으로 배치합니다. 눈물 채취 과정에는 마우스당 10분 동안 약 4개의 스트립 조각이 필요합니다.
  4. 구성 요소의 성능 저하를 방지하기 위해 Schirmer 스트립 조각을 멸균 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 수집이 완료되는 즉시 찢어짐 처리를 시작합니다.

3. 단백질 분리

  1. 앞서 표시된 대로 프로테아제 억제제와 원심분리기를 사용하여 20μL의 멸균수가 들어 있는 600μL 미세 원심분리기 튜브에 스트립 단편을 넣고 4°C에서 600 x g에서 1시간 동안 떨어뜨립니다(그림 1D).
  2. 샘플이 들어있는 600μL 튜브 끝에 7.5cm 스테인리스 스틸 주입기 바늘을 사용하여 구멍을 뚫습니다(그림 1E). 그런 다음 이 구멍이 뚫린 튜브를 멸균된 새 1.5mL 튜브로 옮기고 이전에 보고된대로 17과 같이 4°C에서 10분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심분리하여 희석된 눈물의 부피를 회수합니다. 눈물막의 부피(상층액)는 튜브의 바닥에 있습니다.
  3. 모든 샘플에서 회수된 상층액을 결합하여 단백질 풀을 만듭니다. 이 실험에서는 약 200μL의 총 부피를 얻었습니다.
    알림: 찢어짐 생성은 1시간 이상 지속될 수 있습니다. 이 기간 동안에도 눈물이 고일 수 있습니다.
  4. Bradford 표준 방법22를 사용하여 눈물 풀의 총 단백질 함량을 정량화합니다.

4. SDS-PAGE 분석

  1. 단백질 샘플을 99°C에서 4분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 구성 요소를 혼합하기 위해 샘플을 잠시 소용돌이칩니다.
  2. 각 샘플에서 정량화된 단백질 함량 30μg을 10% SDS-PAGE 겔(표 1)에 로드하고 표준 방법23을 사용하여 90V에서 2시간 동안 샘플을 실행합니다.
  3. 전기영동 후 겔을 염색 용액(표 1)으로 덮고 30분 동안 배양하여 단백질을 염색합니다.
  4. 배경이 투명해지고 단백질 띠가 보일 때까지 탈색 용액으로 젤을 여러 번 헹굽니다.
  5. 겔 문서화 시스템으로 이미지를 획득합니다.

5. qPCR 및 디지털 PCR을 위한 mRNA 분리

  1. 20μL의 멸균수가 들어 있는 600μL 미세 원심분리기 튜브에 스트립을 넣습니다. 샘플이 들어있는 튜브의 끝에 구멍을 뚫고 멸균된 새로운 1.5mL 튜브에 넣고 이전에 human tears3에서 보고된 대로 4°C에서 2,000 x g에서 20분 동안 원심분리합니다(그림 1E-H).
  2. 모든 샘플에서 풀을 만듭니다. 이 실험에서 회수된 부피는 각 마우스에 대해 약 22μL의 상층액, 즉 총 부피의 66μL였습니다. 생체 분자 분해를 방지하기 위해 튜브를 드라이 아이스 위에 놓습니다.
  3. 페놀 및 구아니디늄 이소티오시아네이트(상업적으로 획득)의 단상 용액 200μL를 추가하고 피펫팅으로 균질화합니다. 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 이 단계에서 샘플은 -20°C에서 몇 주 동안 또는 -70°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
  4. 클로로포름 40μL를 넣고 15초 동안 소용돌이에서 섞습니다. 실온에서 2분 동안 그대로 두십시오. 10,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
  5. 수성상(간기를 취하지 않고)을 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
  6. 0.5μL의 글리코겐(0.05μg/μL)을 100μL의 이소프로판올에 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 글리코겐은 RNA와 함께 침전되며 후속 단계를 방해하지 않습니다.
  7. -20 °C에서 10분 동안 그대로 두십시오. 10,000 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 빠르게 디캔팅합니다.
  8. 200μL의 차가운 75% 에탄올을 첨가하고 볼텍싱으로 RNA 펠릿을 재현탁시킵니다. 8,000 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리기.
  9. 에탄올을 디캔팅합니다. 튜브를 뒤집지 않고 20-30분 동안 자연 건조시키십시오. RNase가 없는 물 20μL를 넣고 재현탁합니다.
  10. RNA의 순도를 평가하기 위해 260 nm 및 280 nm에서 마이크로볼륨 분광 광도계에서 광학 밀도를 판독합니다. 샘플은 얼음 위에 있어야 합니다.
    참고: 리보솜 밴드 28S 및 18S는 샘플의 특성으로 인해 아가로스 겔을 사용하여 관찰할 수 없습니다. miRNA 또는 mRNA와 같은 다른 RNA의 존재는 이전에 표시된 바와 같이 바이오분석기를 사용하여 분석할 수 있습니다18.
  11. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 눈물 RNA에서 cDNA를 합성합니다.
    1. 10 ng-5000 ng 범위의 입력 RNA로 시작하십시오. 사용된 키트에 따라 1μL의 Oligo(dT) 및 최대 12μL의 RNase-free 물과 혼합합니다. 500 x g 에서 30초 동안 회전시키고 65°C에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 혼합 튜브에 4μL의 5x 반응 완충액, 1μL의 RNase 억제제, 2μL의 dNTP 혼합물 및 1μL의 역전사 효소를 추가합니다.
    3. 튜브를 500 x g 에서 30초 동안 돌려 혼합물을 아래로 당깁니다. 그런 다음 42°C에서 60분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브를 70°C에서 10분 동안 배양하여 반응을 마칩니다.
  12. 눈물 내 mRNA 농도가 낮기 때문에 qPCR24에는 희석되지 않은 cDNA를 사용하는 것이 권장됩니다. 이 실험을 위해 150ng의 cDNA가 사용되었습니다. DNMT3a 프라이머를 사용하여 qPCR을 수행합니다.
    앞으로: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, 역방향: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA 및 GAPDH 프라이머:
    앞으로: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, 역방향: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC 제조업체 및 장비 절차의 지침을 따릅니다.
    1. qPCR 주기의 경우 다음 프로그램을 사용하십시오: 초기 변성: 10분 동안 95°C, 95°C - 15초, 60°C- 30초 및 72°C-30초의 45주기 후 72°C에서 5분 동안 최종 확장으로 끝납니다.
    2. 용융 곡선 분석을 수행하여 반응에서 프라이머 이량체 또는 비특이적 앰플리콘의 존재를 평가합니다. 온도 램프는 50°C에서 시작하여 최종 99°C까지 진행되었으며, 첫 번째 단계의 경우 초기 유지는 90초, 각 단계 사이에는 5초의 유지가 있었습니다.
    3. dPCR25의 경우 연속 희석을 수행하여 관심 mRNA를 검출하는 데 필요한 cDNA의 양을 최적화합니다. 이 실험에서는 뉴클레아제가 없는 물에 희석된 cDNA를 150ng, 75ng, 37.5ng 및 18.75ng로 사용합니다. 앞서 언급한 DNMT3a 용 프라이머를 사용하였다. dPCR 주기를 위해, 뒤에 오는 프로그램을 사용하십시오: 처음 변성: 95 °C 2 분 동안 95 °C와 60 °C- 30 초의 40 주기에 뒤행됩니다.

결과

이 논문에 설명된 프로토콜은 대부분의 분자 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 기술을 사용하여 눈물액에서 분자 정보를 얻는 쉽고 저렴한 방법을 제공합니다. 또한 효소 활성 검출을 위한 ELISA와 같은 고감도 기술을 사용하여 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

이러한 절차 후 총 단백질 수율은 약 3-4 μg/μL였습니다. 총 단백질 추출물에 대한 Coomassie-stained SDS 페이지 분석은 총 망막과 눈물에서 단백질 발현 패턴을 보여줍니다(그림 2A).

분리된 RNA는 1.9와 2.0 사이의 260/280 UV 흡수 비율을 가졌습니다. 평균 수율은 134.8ng/μL였습니다. qPCR은 하우스키핑 유전자(글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소, GAPDH)3 및 추정 바이오마커 유전자(DNA-메틸 전이효소 3a, DNMT3a)26에 대한 프라이머 세트를 사용하여 수행했습니다. 희석되지 않은 cDNA 샘플 1:1(150ng)을 사용했습니다.

용융 곡선 분석을 수행하고 qPCR 소프트웨어에서 Ct 속도를 계산했습니다. 모든 실험은 중복으로 수행되었습니다. 분석 결과 20에서 24 사이의 Ct 값이 나타났으며, 이는 샘플에서 표적 mRNA의 시작 양이 적정한 범위입니다(그림 2B). 그러나 그림 2C 의 용융 곡선 분석은 타겟 mRNA의 존재가 낮다는 것을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 2% 아가로스 겔은 예상되는 크기의 앰플리콘의 존재를 확인하였다(그림 2D).

dPCR은 DNMT3a에 대해 동일한 한 쌍의 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 사용된 cDNA 샘플의 희석은 1:1(150ng), 1:2(75ng), 1:4(37.5ng), 1:8(18.75ng)이었습니다. 모든 실험은 중복으로 수행되었습니다. dPCR은 희석되지 않은 샘플에서 1.33 copies/μL에서 8배 희석된 샘플에서 0.45 copies/μL까지 검출할 수 있었습니다(그림 3A, 3B). 따라서, dPCR은 qPCR에 비해 눈물에 존재하는 타겟 mRNA에 대한 민감도가 증가한 것으로 나타났다.

figure-results-1
그림 1: 생쥐의 눈물 추출 프로토콜 개략도. (a) 눈물 채취. 2개월 된 C57BL/6J 마우스 3마리를 사용하였다. (B) 눈물 생성은 필로카르핀의 복강내 투여에 의해 약리학적으로 유도되었다. Schirmer 스트립의 배치를 보여주는 사진. (C) 찢어짐 처리. 그런 다음 Schirmer 스트립을 사용하여 10분 동안 눈물을 수집하고 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겼습니다. (D) Schirmer 스트립에 수집된 눈물을 멸균수 및 프로테아제 억제제 또는 멸균수로 원심분리했습니다. (E, F) 이 튜브는 바닥에 구멍을 뚫은 후 유체 용리를 용이하게 하기 위해 새로운 멸균된 1.5mL 튜브로 옮겼습니다. (지, H) 눈물은 1.5 튜브 mL에 수집됩니다. (I) 눈물을 모으는 절차의 대표 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 분자 응용을 위한 눈물막의 다운스트림 분석. (A) 쥐 눈물 및 망막 단백질 추출물의 SDS-PAGE. MW : 분자량 마커.; 1열: 망막의 단백질 프로필(30μg); 2열: 눈물의 단백질 프로필(30μg). (B) 마우스 눈물에서 GAPDH 및 DNMT3a 에 대한 qPCR. 평균 CT 및 ΔCT는 표 2에 나와 있습니다. (C) DNMT3a 및 GAPDH PCR 제품에 대한 용융 곡선 분석. y축은 증폭 반응(dF/dT)의 형광 변화율을 나타내고, x축은 온도(°C)(D)를 나타냅니다. 0.5μg/mL 브롬화 에티듐을 함유한 2% 아가로스 겔 전기영동에서 PCR 앰플리콘 분석. 레인 M: 1kb 플러스 DNA 래더. 레인 1,2: 각각 GAPDH 및 DNMT3a PCR 앰플리콘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 생쥐 눈물에서 DNMT3a 발현을 위한 디지털 PCR(dPCR). (A) dPCR 결과는 DNMT3a 전사체가 복사하는 파란색 점으로 표시된 1D 산점도로 표시됩니다. 검은색 점은 DNMT3a 전사 복사본이 없는 파티션입니다. (B) DNMT3a 전사체 사본을 정량화하기 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 일련의 희석 cDNA를 생성했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료의 이름묘사
10% SDS 젤분리 겔 1개: 3.8mL 증류된 H2O; 2.6 mL 트리스; 산도 8.8; 1.5 M 3.4 mL 아크릴아미드; 100 μL 10% SDS; 100 μL 10% APS; 4 μL 테메드.
수집 젤 1 개 : 2.72 mL 증류 H2O, 0.52 mL 트리스; 산도 6.8; 1.5 M 0.68 mL 아크릴 아미드, 40 μL 10 % SDS, 40 μL 10 % APS 4 μL TEMED.
전기영동 버퍼250mM 트리스베이스, 2M 글리신, 1 % SDS
염색 용액다음 시약을 물 43mL에 녹입니다 (호박색 병에 담아 실온에서 보관) : Coomassie 0.25g; 아세트산 7mL; 메탄올 50mL
탈색 용액다음 시약을 물 63mL에 용해 (실온에서 보관) : 아세트산 7mL; 에탄올 30mL

표 1. SDS-Page를 설정합니다.

유전자 이름CT1CT2SD로 평균ΔCT
갭디20.1420.7320.44±0.17
DNMT3ᅡ24.5924.9724.78±0.074.35

표 2. 생쥐의 눈물에서 DNMT3a 및 GAPDH 의 Ct 값.

토론

눈물액은 쉽게 접근할 수 있으며, 눈물의 바이오마커 측정은 다양한 인간 질병의 조기 진단을 위한 성공적인 보완 기술로 사용될 수 있습니다27. 실험 동물 모델에서 눈물 조성에 대한 생화학적 분석은 이러한 접근 방식을 보완하고 질병의 분자적 기초를 이해하는 데 상당한 진전을 약속하지만, 사용 가능한 데이터와 프로토콜이 부족하여 이를 개발하게 되었습니다. 이 보고서에 기술된 방법은 기술적으로 수행이 간단하며 다양한 질병 관련 후보 분자의 차등 발현을 예비적으로 식별할 수 있습니다.

눈물 수집은 모세관 및 쉬르머 스트립(16,17), 면봉(28) 및 스펀지(29)와 같은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. Schirmer strip 방법은 접근 용이성, 정량 분석 기능, 시료 수집 중 적응성, 비용 및 실험실 처리를 위한 눈물 성분 추출의 단순성 때문에 선호되었습니다. 게다가, 이 방법은 비용 효율적이고, 최소한으로 침습적이며, 종이 필터 스트립(16,17)의 구성 덕분에 각막에 부상이나 손상의 위험이 없다. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 필로카르핀을 사용한 눈물 생성의 약리학적 자극과 적절한 용출 완충액의 선택이 포함됩니다.

필로카르핀은 M3 무스카린 수용체에 결합하는 콜린성 작용제로서 외분비선의 약리적 자극을 일으켜 눈물 생성, 타액 분비 및 배뇨를 향상시킬 수 있습니다. 인간을 대상으로 한 연구에서 눈물 자극이 수집된 유체(30)의 삼투압을 변화시키지 않는다는 것이 입증되었지만, 이는 단백질 프로필(31)에 분명히 영향을 미친다. 외분비선 및 눈물 분비 증진제의 콜린성 약리학적 자극제로서의 필로카르핀의 사용은 토끼와 생쥐 19,32,33에서 성공적으로 보고되었지만, 단백질 함량에 대한 자극의 영향은 평가되지 않았다. 이러한 제한을 피하고 실험 조건 간의 인열 프로파일을 정확하게 비교할 수 있도록 하려면 특정 수집 설정을 고려하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 눈물이 채취되기 전에 헹굼 단계를 도입하면 눈 표면이 이전에 오염되는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 30mg/kg의 필로카르핀 농도가 사용되었다13. 이 약물을 주입한 후 쥐가 움직이지 않고 침착했기 때문에 마취 없이 눈물을 채취하여 검체 채취가 용이했습니다.

적절한 용리 완충액의 선택은 눈물 샘플의 생화학적 조성 및 스트립에서 생물학적 물질의 회수율을 분석하기 위해 선택한 방법과 밀접한 관련이 있습니다. 예를 들어, 환자를 대상으로 한 Schirmer's strips의 단백질 보유에 초점을 맞춘 비교 연구에서, 100mM 암모늄 바이카보네이트와 0.25% Nonidet P40(NP40)으로 구성된 완충액이 단백질체학 또는 다중 ELISA 분석 응용 분야에서 우수한 결과를 산출한다는 것이 확인되었습니다17. 우리의 손에서 멸균수의 사용은 SDS-PAGE에서 총 단백질 추출물을 시각화하고 PCR로 관심 유전자의 mRNA를 검출하기에 충분한 것으로 입증되었습니다.

마우스 눈물에서 DNMT3a 및 GAPDH mRNA의 존재를 평가하기 위해 qPCR과 dPCR의 성능을 비교했습니다. qPCR 용융 곡선에서 관찰된 프라이머 이량체의 존재는 DNMT3a 전사체의 존재량이 적기 때문입니다. 입증된 바와 같이 dPCR은 희석되지 않은 및 희석된 샘플에서 이러한 샘플의 타겟 mRNA를 검출하는 데 훨씬 더 큰 감도와 효능을 가지고 있습니다. 이러한 정밀한 검출 기능은 dPCR을 마우스의 눈물 분석에 선호되는 방법으로 만들어 연구자와 임상의에게 향후 연구 및 잠재적인 임상 응용 분야를 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

동물 모델에서 눈물 샘플 수집을 위한 표준화된 프로토콜의 개발은 연구의 중요한 진전을 나타냅니다. 이 프로토콜은 눈물 샘플의 체계적이고 정확한 수집을 용이하게 할 뿐만 아니라 다양한 연구 분야에서 눈물 샘플을 응용할 수 있는 광범위한 가능성을 열어줍니다. 동물 모델에서 눈물 샘플을 얻을 수 있는 능력을 통해 광범위한 질병 및 상태를 조사할 수 있을 뿐만 아니라 새로운 바이오마커 및 잠재적 치료법을 탐구할 수 있습니다. 또한 표준화된 프로토콜을 수립함으로써 다양한 연구 및 실험실에서 결과의 재현성을 촉진하여 연구의 타당성과 신뢰성에 기여합니다. 궁극적으로, 동물 모델에서 눈물 샘플 수집 방법론의 이러한 발전은 중요한 발견을 주도하고 다양한 질병의 병태 생리학에 대한 이해를 개선하여 진단, 치료 및 예방을 위한 새로운 길을 열 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 VELUX STIFTUNG [프로젝트 1852]의 지원을 받아 M.L.에 지원되었으며, CONAHCYT에서 M.B.(836810), E.J.M.C.(802436) 및 A.M.F(CVU 1317418)에 대학원 펠로우십 보조금을 지원했습니다. 활발한 토론에 기여해 주신 연구소, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento 및 Departamento de Farmacobiología (Cinvestav)의 모든 구성원에게 진심으로 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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아크릴아미드시그마-알드리치A4058
브래드포드 시약시그마-알드리치B6916
클로로포름시그마-알드리치1003045143
쿠마시 블루 R 250미국 생물학6104-59-2
에탄올퀴미카 리케64-17-5
GeneRuler 1kb 플러스 DNA 래더써모피셔 사이언티픽에스엠1331
글리세롤미국 생물학지8145
글리신산타크루즈SC- 29096
글리코겐로슈10901393001
HCl퀴미카 리케7647-01-0
이소프로필 알코올퀴미카 리케67-63-0
메탄올퀴미카 마이어67-56-1
마이크로 튜브 1.5ml액시젠MCT-150-C
마이크로 튜브 600 및 마이크로; l액시젠MCT-060-C
나크롬시그마-알드리치S3014 시리즈
PCR 튜브 및 스트립노바스비오PCR 0104
필로카르핀시그마-알드리치P6503-10g
프로테아제 억제제로슈11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR 키트 (5mL)키아겐250112
QIAcuity 나노플레이트 26k 24웰 (10)키아겐250001
리얼 qPlus 2x 마스터 믹스 그린앰플리콘A323402
RevertAid First Strad cDNA 합성 키트써모피셔 사이언티픽K1622
쉬르머의 테스트 스트립산트가르 연구소SANT1553
SDS시그마-알드리치L3771
테메드시그마 알드리치102560430
TRI 시약시그마-알드리치T9424-200ML페놀과 구아니디늄 이소티오시아네이트의 단상 용액
트리스미국 생물학T8650
트리스 베이스켐 크루즈SC-3715A

참고문헌

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