방법 논문

허혈성 뇌졸중 후 아급성 및 만성 시기에 형질도입된 세포에서 Neurod1의 이소성 발현을 조사하기 위한 AAV 시스템 및 마우스 모델

DOI:

10.3791/66965

⸱

2024년 11월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 피질 허혈성 뇌졸중 후 Neurod1의 바이러스 매개 이소성 발현을 설명합니다. Neurod1은 (1) 뇌졸중 후 아급성기(7일) 동안 야생형 마우스에서 Cre-Flex AAV 시스템을 사용하여 전달되고 (2) 뇌졸중 후 만성기(21일) 동안 조건부 리포터 마우스에서 단일 AAV 벡터를 사용하여 전달됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vivo에서 신경인성 인자의 이소성 발현은 질병 모델에서 손실된 뉴런을 대체하기 위한 유망한 접근 방식으로 부상했습니다. 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV)를 포함한 비전파 바이러스 유사 입자 시스템을 통한 신경 기본 나선-루프-나선(bHLH) 전사 인자의 사용은 광범위하게 보고되었습니다. in vivo 실험의 경우, AAV는 병원성이 낮고 번역 가능성이 높기 때문에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 후 형질도입된 세포에서 전사 인자의 이소성 발현을 조사하기 위한 두 가지 AAV 시스템을 설명합니다. 두 시스템 모두에서 Neurod1 발현은 짧은 GFAP(gfaABC(1)D) 프로모터에 의해 제어되며, 이는 신경인성 인자 발현과 결합될 때 뇌졸중 후 반응성 성상세포와 내인성 뉴런에서 상향 조절됩니다. 설명된 허혈성 뇌졸중 모델에서, 국소 허혈은 엔도텔린-1(ET-1)을 마우스의 운동 피질에 주입하여 반응성 GFAP 발현 성상세포와 생존 뉴런으로 둘러싸인 병변을 생성함으로써 유도됩니다. AAV의 뇌내 주사는 뇌졸중 후 아급성(7일) 및 만성(21일) 단계에서 Neurod1의 발현을 외부적으로 유도하기 위해 수행됩니다. AAV 주입 후 몇 주 이내에 AAV 대조군 바이러스를 투여받은 마우스에 비해 Neurod1을 이소성 발현하는 마우스에서 형질도입된 세포 중 훨씬 더 많은 수의 뉴런이 확인되었습니다. 사용된 AAV 기반 전략은 경증에서 중등도의 피질 뇌졸중 모델에서 리포터 유전자를 발현하는 뉴런 수가 증가하여 관찰된 결과를 복제했습니다. 이 프로토콜은 AAV 기반 시스템으로 전달된 전사 인자의 이소성 발현 효과를 탐색하기 위한 표준 플랫폼을 구축하여 뇌졸중의 맥락에서 신경인성 인자 발현을 이해하는 데 기여합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌졸중은 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 뇌졸중은 뇌로 가는 혈류가 중단될 때 발생합니다. 이는 뇌혈관이 파열되는 출혈성 뇌졸중(~15%의 경우) 또는 뇌로 가는 혈류가 차단되는 허혈성 뇌졸중을 통해 발생할 수 있다1. 허혈성 뇌졸중이 가장 흔하며 뇌졸중 사례의 ~85%를 차지한다1. 뇌졸중이 발생하면 뇌로 가는 포도당과 산소의 전달이 감소하여 신경 세포가 빠르게 죽고 신경 기능이 손상됩니다.

허혈성 뇌졸중은 흥분독성, 산화 및 니트로성 스트레스, 칼슘 조절 장애, 피질 확산 탈분극, 부종, 혈액뇌장벽(BBB) 파괴 및 염증의 메커니즘을 통해 병변의 중심부에서 몇 분 이내에 세포를 잃게 됩니다 2,3. 경색 주위 영역의 세포는 몇 시간 내에 세포사멸 세포가 사멸되며, 뇌졸중 후에는 며칠 동안 사멸 세포가 사멸한다4. 경색 주위 환경은 손상 후 다양한 역할을 하는 미세아교세포와 성상세포("반응성" 성상세포)의 활성화로 이어지는 전염증 및 항염증 신호에 노출됩니다 5,6,7,8. 반응성 성상세포는 신경교섬유산단백질(GFAP)의 상향조절과 뇌졸중 후 며칠 이내에 병변 주위에 경계가 형성되는 등 여러 가지 표현형 변화를 겪으며, 이는 병변의 범위를 제한하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 손상된 조직 내의 신경 가소성에 영향을 미칩니다 8,9,10.

직접 세포 재프로그래밍(direct cellular reprogramming)은 만능 상태를 거치지 않고 하나의 성숙한 세포 유형을 다른 성숙한 세포 유형으로 변환할 수 있게 합니다11. 상주하는 뇌세포를 새로운 뉴런으로 바꾸어 부상으로 잃은 세포를 대체하는 것은 뇌 회복을 위한 매력적인 방법을 제시합니다. 뇌졸중은 손실된 뉴런을 대체하고, 치료 기간을 넓히고, 궁극적으로 기능 회복을 촉진하기 위한 치료 방법의 필요성을 감안할 때 세포 기반 치료의 이상적인 표적입니다. 이를 위해 Ascl1, Neurog2, Neurod1 및 최근에는 향상된 재프로그래밍 효능을 입증한 Ascl1(Ascl1-SA6)의 돌연변이 버전을 포함한 다양한 기본 나선-루프-나선(bHLH) 신경원성 전사 인자를 사용하여 체외 및 생체 내에서 성상세포에서 뉴런(AtN)으로의 재프로그래밍을 입증하는 많은 논문이 있었습니다 11,12,13,14. 고려해야 할 중요한 사항은 결과, 해석 및 연구 간 비교에 영향을 미칠 수 있는 많은 실험 설계 요인입니다. Ghazale 등은 동일한 bHLH 전사 인자14를 사용할 때 AtN 재프로그래밍 효율이 서로 다른 마우스 균주, AAV 혈청형 및 프로모터에 따라 다르다는 것을 입증했습니다. 손상 모델, 뇌 영역, 바이러스 투여, 유전자 전달 시기, 재프로그래밍 인자 및 전달 방식과 같은 다른 고려 사항이 결과에 영향을 미칠 것입니다. 최근 보고에 따르면 기존의 형질전환 뉴런이 재프로그래밍된 뉴런으로 잘못 해석되어 왔다15,16. 보고서가 AtN 변환이 발생한다는 것을 반드시 부정하는 것은 아니지만, 이러한 연구는 잘 통제된 실험의 중요성을 강조했으며 여러 논문에서 이 분야의 다음 단계에 대한 권장 사항을 제시했습니다 15,17,18,19. 문헌에서 명백한 것은 bHLH 전사 인자의 이소성 발현이 신경퇴행성 질환/손상의 다양한 동물 모델에서 기능적 결과를 향상시킬 수 있다는 것입니다 13,20,21,22,23,24.

여기서, 관심있는 전사 인자 인 Neurod1 프로토콜은 형질전환 된 세포13 , 22에서 이소성으로 발현됩니다. 성체 마우스에서 감각 운동 피질에 대한 허혈성 뇌졸중의 잘 정립된 endothelin-1(ET-1) 모델이 사용됩니다. ET-1의 주사는 기능 장애를 포함하여 허혈성 뇌졸중의 병태생리학을 모방한 국소 혈관 수축을 유발합니다 22,23,25. 일반적으로 사용되는 short-GFAP promoter(gfaABC(1)D)는 두 가지 바이러스 전략을 사용하여 손상 부위 및 병변 주위 영역에서 Neurod1의 이소성 발현을 유도하는 데 사용됩니다: (1) 야생형 마우스에서 AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre 전달 및 (2) tdTom-Cre 리포터 마우스에서 AAV5-GFAP-Neurod1-Cre 전달. 뇌졸중 손상 뇌에서 Neurod1의 이소성 발현 가능성을 더 자세히 이해하기 위해 AAV는 뇌졸중 후 아급성기(7일) 또는 만성기(21일)에 전달되었습니다. 두 패러다임 모두에서 이소성 Neurod1 발현 후 몇 주 이내에 훨씬 더 많은 표지된 뉴런이 발견되었습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 토론토 대학의 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide to the Care and Use of Experimental Animals, 2판, 캐나다 동물 보호 위원회, 2017)를 준수합니다. 본 연구에서는 야생형(C57BL/6J) 및 형질전환 tdTom-Cre 리포터(B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 마우스 균주를 사용하였다. 생쥐는 생후 7-9주였고 수컷과 암컷을 모두 포함했다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 엔도텔린-1 뇌졸중 수술

참고: 모든 수술 기구 및 재료는 수술 전에 오토클레이브로 멸균됩니다. 입체식 프레임은 PREempt로 살균됩니다. 주사기는 PREempt, 70% 알코올로 멸균되고 수술 전에 멸균 PBS로 프라이밍됩니다. 엔도텔린-1(ET-1)은 수술 내내 얼음에 보관됩니다.

  1. 수술을 시작하기 전에 37°C로 설정된 발열 패드에 깨끗한 케이지를 놓고 회복 영역을 설정합니다. 또는 난방 램프를 사용하는 경우 케이지의 절반만 열 아래에 놓습니다.
    1. 이소플루란을 사용하여 생쥐를 마취하려면 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)에서 승인한 프로토콜을 따르십시오. 마우스를 마취 유도 챔버에 놓고 산소를 1-1.5L/min으로 켠 다음 이소플루란 기화기를 3%-5%로 조정하여 마취를 시작합니다.
  2. 동물이 옆으로 누워 더 이상 서 있을 수 없게 되면 동물을 방에서 꺼내 깨끗한 표면에 놓으십시오. 수술 전과 수술 내내 발가락 꼬집음 반사가 없는지 확인하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인합니다.
    1. 마취 기계에서 확장된 콧방울을 동물에게 고정하고 유지 관리를 위해 이소플루란을 1%-2%로 조정합니다. 절차를 완료하는 데 최대 40분이 소요될 수 있으므로 이소플루란에 대한 노출을 최소화합니다(유도의 경우 3%-5%에서 5분, 나머지 시간은 1%-2%).
  3. 동물 털 트리머를 사용하여 동물의 목/귀 뒤에서 코까지 털을 제거하여 수술을 위해 두개골의 피부를 노출시킵니다.
  4. 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 적절한 용량의 수술 전 진통제(Meloxicam (2.0 mg/kg))를 피하로 투여합니다.
  5. 마취 중 각막 건조를 방지하기 위해 마우스의 각 눈에 눈 윤활제 연고를 바르십시오.
  6. 털이 잘린 피부 부위를 70% 에탄올로 살균한 후(1.3단계) 클로르헥시딘 알코올을 2회 투여하여 수술 부위를 만듭니다.
  7. 먼저 마우스의 코를 입체성 노즈콘에 놓아 마우스를 입체성 프레임으로 옮긴 다음 이어바로 두개골을 안정화합니다. 수술 과정 내내 열 지지를 위해 37°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 보관하십시오. 이소플루란을 1%-2%로 유지하여 마우스가 1 호흡/초의 호흡수를 표시하도록 합니다.
  8. 필요한 경우 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 반복적으로 도포합니다. 귀 아래 마우스의 몸에 멸균 수술용 드레이프를 적용하여 멸균 영역의 크기를 확장합니다.
  9. #10 메스 날로 눈의 중간 지점 뒤에서 머리 뒤쪽(두정골)까지 동물의 시상면과 평행하게 수직 절개를 만듭니다. 피부를 옆으로 부드럽게 집어넣어 두개골을 노출시킵니다.
  10. Q-tip을 사용하여 두개골의 근막을 파괴하고 두개골을 건조시켜 브레그마를 노출시킵니다.
  11. .018" 드릴 비트가 있는 고속 입체 드릴을 운반하는 드릴 홀더가 있는 매니퓰레이터 암을 설정합니다.
  12. 브레그마 측면 2.25mm, 브레그마 측면 +0.0mm, 꼬리 방향 +0.0mm, 브레그마 방향 -1.0mm의 오른쪽 감각 운동 피질 좌표에서 고속 입체 드릴로 3개의 버 구멍(직경 .018")을 뚫습니다.
  13. 드릴을 26인치 길이의 바늘이 있는 0.375G 주사기로 교체합니다.
  14. 멸균 PBS에 용해된 1.5μL의 400μM ET-1을 주사기에 로드합니다. 양호한 흐름을 보장하려면 바늘 끝에서 방울이 관찰될 때까지 소량의 ET-1을 방출합니다. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오.
  15. 경막에 구멍을 뚫지 않고 바늘 끝을 두개골을 지나 중간 버 구멍(오른쪽 감각 운동 피질, 브레그마 측면 + 0.0, 2.25mm 측면)으로 내립니다. 정렬되면 바늘을 뇌 안으로 1mm 내립니다.
  16. 한 번에 0.1μL를 분주하여 1μL의 ET-1을 주입합니다. Hamilton 주사기의 플런저를 앞으로 밀어 0.1 μL를 분주하고 다음 0.1 μL를 주입하기 전에 1분 동안 기다렸다가 1 μL가 분주될 때까지 주입합니다.
    1. 최종 0.1μL를 분주한 후(0.1μL x 10회 주입 = 총 1μL) 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 제자리에 유지한 다음 천천히 위쪽으로 당겨 주사기를 제거합니다.
  17. 주사 중 바늘이 막히지 않도록 바늘 끝에서 물방울이 관찰될 때까지 소량의 ET-1을 방출합니다. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오. 다음 동물에게 PREempt를 주입하기 전에 주사기를 살균한 다음 70% 알코올을 주입한 다음 PBS를 멸균합니다.
  18. 상처를 봉합하기 위해 4-0 폴리솝 폴리에스테르 멸균 봉합사를 사용하여 두개골의 위에 있는 피부를 함께 봉합합니다.
  19. 봉합된 부위에 면봉을 사용하여 항생제 연고를 투여하여 수술 후 감염을 예방합니다.
  20. 입체성 프레임에서 마우스를 제거하고 회수 구역의 깨끗하고 예열된 동물 사육장으로 옮깁니다. 이소플루란 기화기와 산소를 끕니다.
  21. 마취에서 회복하는 동안 케이지를 가열 패드 위에 두십시오. 또는 가열 l을 사용하는 경우amp l, 마우스가 과열을 방지하기 위해 마취에서 깨어날 때 케이지의 시원한 쪽으로 이동할 수 있도록 l 아래의 케이지 측면에 마우스를 놓습니다. 다음 5-10분 내에 마우스가 마취에서 나올 때 모니터링합니다.
  22. 향후 3일 동안 마우스를 모니터링하고(체중 모니터링), 수술 후 관리(수분 공급을 위한 촉촉한 으깬 차우) 및 진통제(2mg/kg meloxicam, 2-3일 동안 매일 2회 피하)를 제공합니다.

2. 뇌졸중 후 아데노 관련 바이러스(AAV) 분만(7일 - 아급성 모델 또는 21일 - 만성 모델)

주의: AAV 작업에 대한 기관의 생물 안전 지침을 참조하십시오. 토론토 대학의 지침에 따라 이 수술은 봉쇄 레벨 2 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

참고: 모든 수술 기구 및 재료는 수술 전에 오토클레이브로 멸균됩니다. 입체식 프레임은 PREempt로 살균됩니다. 주사기는 PREempt, 70% 알코올로 멸균되고 멸균 PBS로 프라이밍됩니다. AAV는 수술 내내 얼음 위에 보관됩니다.

  1. 수술을 시작하기 전에 37°C로 설정된 발열 패드에 깨끗한 케이지를 놓고 회복 영역을 설정합니다. 또는 난방 램프를 사용하는 경우 케이지의 절반만 열 아래에 놓습니다.
    1. 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취하려면 마우스를 마취 유도실에 넣고 산소를 1-1.5L/분으로 켠 다음 이소플루란 기화기를 3%-5%로 조정하여 마취를 시작합니다(주입적으로 승인된 프로토콜에 따름).
  2. 동물이 옆으로 눕고 더 이상 깨끗한 표면에 서 있을 수 없게 되면 챔버에서 동물을 제거하십시오. 수술 전과 수술 내내 발가락 꼬집음 반사가 없는지 확인하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인합니다.
    1. 마취 기계에서 확장된 콧방울을 동물에게 고정하고 유지 관리를 위해 이소플루란을 1%-2%로 조정합니다. 절차를 완료하는 데 최대 40분이 소요될 수 있으므로 이소플루란에 대한 노출을 최소화합니다(유도의 경우 3%-5%에서 5분, 나머지 시간은 1%-2%).
  3. 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 적절한 용량의 수술 전 진통제(Meloxicam (2.0 mg/kg))를 피하로 투여합니다.
  4. 마취 상태에서 각막 건조를 방지하기 위해 마우스의 각 눈에 눈 윤활제 연고를 바르십시오.
  5. 털이 잘린 피부 부위를 70% 에탄올로 살균한 다음 클로르헥시딘 알코올을 두 번 투여하여 수술 영역을 형성합니다.
  6. 먼저 마우스의 코를 입체성 노즈콘에 놓아 마우스를 입체성 프레임으로 옮긴 다음 이어바로 두개골을 안정화합니다. 수술 과정 내내 열 지지를 위해 37°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 보관하십시오. 이소플루란을 1%-2%로 유지하여 마우스가 1 호흡/초의 호흡수를 표시하도록 합니다.
  7. 필요한 경우 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 반복적으로 도포합니다. 귀 아래 마우스의 몸에 멸균 수술용 드레이프를 적용하여 멸균 필드의 크기를 확장합니다.
  8. 그래도 남아 있으면 수술용 가위로 봉합사를 자르고 집게로 딱지를 제거합니다. 두개골을 드러내기 위해 피부를 집어넣습니다.
    참고: 만성 모델의 경우 #10 메스 칼날로 피부를 절제해야 할 수도 있습니다.
  9. 멸균 Q-tip을 사용하여 두개골을 말리고 버 구멍을 찾습니다.
  10. 26인치 길이의 바늘이 있는 0.375G 주사기를 운반하는 바늘 홀더가 있는 정위 장치의 매니퓰레이터 암을 설정합니다.
  11. 3.4 μL의 AAV(급성 연구의 경우 1 x 109 게놈 사본(GC)/μL, 만성 연구의 경우 1 x 1010 GC/μL)를 주사기에 로드합니다. 흐름이 양호한지 확인하려면 바늘 끝에서 물방울이 관찰될 때까지 소량의 AAV를 방출합니다. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오.
  12. 경막에 구멍을 뚫지 않고 ET-1에 사용되는 첫 번째 버 구멍(경막 앞쪽 + 0.0 및 브레그마 측면 2.25mm의 오른쪽 감각 운동 피질)에서 두개골을 지나 바늘 끝을 내립니다. 정렬되면 바늘을 뇌 안으로 1mm 내립니다. (0 AP, +2.25 ML, 브레그마에서 -1.0 DV).
  13. 한 번에 0.1 μL를 분주하여 1 μL의 AAV(급성 연구의 경우 1 x 109 GC/μL, 만성 연구의 경우 1 x 1010 GC/μL)를 주입합니다. Hamilton 주사기의 플런저를 앞으로 밀어 0.1μL를 분주하고 1분 동안 기다렸다가 다음 0.1μL를 주입합니다. 1μL가 분주될 때까지 주입합니다. 최종 0.1μL를 분주한 후(0.1μL x 10회 주입 = 총 1μL) 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 제자리에 유지한 다음 천천히 위쪽으로 당겨 주사기를 제거합니다.
  14. 주사 중 바늘이 막히지 않도록 바늘 끝에서 한 방울이 관찰될 때까지 소량의 AAV를 방출하십시오. 주사를 수행하기 전에 멸균 Q-tip을 사용하여 초과분을 닦아내십시오.
  15. 남아있는 두 개의 버 구멍(브레그마에서 +1 AP, +2.25 ML, -1.0 DV 및 -1 AP, +2.25 ML, -1.0 DV mm의 오른쪽 감각 운동 피질)에 AAV 주입에 대해 2.11-2.14 단계를 반복합니다. 다음 동물에게 PREempt를 주입하기 전에 주사기를 살균한 다음 70% 알코올, 마지막으로 PBS를 멸균합니다.
  16. 상처를 봉합하기 위해 4-0 폴리솝 폴리에스테르 멸균 봉합사를 사용하여 두개골의 위에 있는 피부를 함께 봉합합니다.
  17. 수술 후 감염을 예방하기 위해 봉합된 부위에 면봉을 사용하여 항생제 연고를 투여합니다.
  18. 입체성 프레임에서 마우스를 제거하고 회수 구역의 깨끗하고 예열된 동물 사육장으로 옮깁니다. 이소플루란 기화기와 산소를 끕니다.
  19. 마우스를 케이지 내부에 보관하고 케이지 외부를 PREempt와 70% 알코올로 살균한 후 마취 회복을 위해 가열 패드 위에 올려 놓습니다.
    1. 또는 난방 l을 사용하는 경우amp, l, lamp 아래 케이지 측면에 마우스를 놓으십시오.amp 마우스가 과열을 방지하기 위해 마취에서 깨어날 때 케이지의 시원한 쪽으로 이동할 수 있도록 합니다. 다음 5-10분 내에 마우스가 마취에서 나올 때 모니터링합니다.
  20. 향후 3일 동안 마우스를 모니터링하고(체중 모니터링), 수술 후 관리(수분 공급을 위한 촉촉한 으깬 차우) 및 진통제(2mg/kg meloxicam, 2-3일 동안 매일 2회 피하)를 제공합니다.

3. 조직 준비 및 해부

  1. 마우스를 안락사시키려면 마우스에 트리브로모에탄올(Avertin)(conc. 12.5 mg/mL, 250 mg/BW(kg))을 복강내 주사하고 완전한 유도를 위해 2-3분 동안 기다립니다. 케이지에서 마우스를 꺼내 동물이 적절하게 마취되었는지 확인하고 발가락 핀치 반사가 없는지 확인합니다.
  2. 흄 후드에서 식염수와 4% 파라포름알데히드를 투여하여 경심 관류26 을 수행합니다. 안락사된 동물의 머리에 70% 에탄올이 젖을 때까지 뿌립니다.
  3. 큰 가위를 사용하여 두개골 바닥의 머리를 자릅니다. 4-1/2" 홍채 가위를 사용하여 두개골 전체의 정중선을 따라 피부를 잘라냅니다. 두개골을 드러내기 위해 피부를 집어넣습니다.
  4. 목의 척추강 입구에서 홍채 가위를 삽입하고 시상 및 전두엽 봉합사를 따라 두개골을 자릅니다.
  5. 그런 다음 두 눈구멍에 가위를 삽입하고 전두-코 봉합사를 자릅니다.
  6. 뇌가 손상되지 않도록 특히 주의하십시오. 뇌가 노출될 때까지 두개골 판을 왼쪽과 오른쪽으로 들어 올립니다.
  7. 뇌를 4% 파라포름알데히드가 함유된 섬광 바이알로 옮깁니다. 뇌를 4% 파라포름알데히드로 4°C에서 4시간 동안 유지합니다.
  8. 그런 다음 뇌는 4%의 파라포름알데히드를 30%의 자당으로 대체하여 냉동 보호됩니다. 뇌가 바이알 바닥으로 가라앉을 때까지(~12시간) 4°C에서 뇌를 30% 자당으로 유지합니다.

4. 얼어붙은 뇌 절편

  1. 저온 유지 장치 챔버의 온도를 -20 °C에서 -26 °C 사이로 설정합니다.
  2. 소뇌를 가로질러 관상 절개를 만들고 뇌의 편평한 꼬리 부분을 최적 절단 온도 화합물(OCT)이 있는 저온 유지 장치 척에 부착합니다.
  3. 뇌와 함께 척을 디스크 홀더에 넣고 후각 전구를 칼날에 맞춥니다.
  4. 뇌를 20μm 두께의 관상 동맥 조각으로 나눕니다. 절편된 뇌 절편에 줄무늬나 긁힌 선이 생기지 않도록 하려면 절편 플랫폼에 테이프 조각을 올려 롤링 방지 플레이트와 플랫폼 사이에 작은 틈을 만듭니다. 페인트 브러시를 사용하여 양전하를 띤 유리 슬라이드에 캡처하기 전에 섹션의 방향을 조정할 수 있습니다.
  5. 뇌 절편이 포함된 슬라이드는 -20°C에서 보관하십시오.

5. 면역조직화학 및 정량화

  1. 표준 프로토콜22,26에 따라 범신경 마커인 NeuN에 대한 1차 항체를 사용하여 면역조직화학을 위한 절편을 처리합니다.
  2. 실온에서 5분 동안 냉동 보존된 뇌 절편을 해동합니다. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 각 5분씩 섹션을 세 번 세척합니다.
  3. PBS의 0.3% Triton X-100에 절편을 실온에서 20분 동안 배양하여 투과화합니다.
  4. 차단 용액(PBS 중 5% 일반 염소 혈청 및 0.3% Triton X-100)을 준비하고 차단 용액의 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 1차 항체인 rabbit anti-NeuN을 차단 용액에서 1:500 비율로 희석합니다. 1차 항체 용액이 포함된 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  6. PBS에서 0.3% Triton X-100으로 각 섹션을 5분 동안 세 번 세척합니다.
  7. 2차 항체인 goat anti-rabbit 568 또는 488을 PBS에서 1:1000 비율로 희석합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 2차 항체 용액으로 절편을 배양합니다.
  8. PBS에서 0.3% Triton X-100을 5분씩 3회 세척합니다. 실온에서 5분 동안 DAPI(PBS의 경우 1:10,000)로 절편을 배양합니다.
  9. PBS로 각각 5분씩 세 번 더 씻습니다. 얼룩진 부분을 형광 장착 매체와 유리 커버슬립이 있는 유리 슬라이드에 장착합니다. 장착된 슬라이드를 밤새 건조시키십시오.
  10. 컨포칼 현미경이 있는 20x 대물렌즈를 사용하여 각 동물에 대해 3개의 서로 다른 코로나 절편(전방의 뇌량과 후방의 전방 코미셔널 교차점의 해부학적 영역 사이)에서 뇌졸중 병변 주변의 Reporter+ 세포를 볼 수 있는 이미지 염색 슬라이드.
    참고: AAV 확산의 거리는 반구 내에서 다릅니다. 그러나 우리의 경험과 Reporter+ 세포에 대한 조직 후 처리 분석에 따르면 AAV 확산은 일반적으로 브레그마에서 약 +3mm에서 -3mm에 걸쳐 있습니다. 뇌졸중 병변(NeuN의 부재/희박한 염색으로 확인됨) 주변의 리포터+ 세포는 말뭉치가 정중선을 가로지르는 곳과 전방 커미셔 연결 사이의 영역에서 정량화되어야 합니다.
  11. 형질도입된 뉴런의 정량화를 위해 colocalization analysis를 수행합니다. 뇌 절편에서 이중 양성 세포의 수(Reporter+NeuN+)와 형질도입된 세포의 총 수(Reporter+)를 수동으로 계산합니다. 본 명세서의 결과를 위해, 마우스당 3개의 관상 절편에서 병변(내측, 측면 및 하측)을 둘러싼 >3개의 시야를 계산했습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

야생형(C57BL/6J) 및 형질전환 tdTom-Cre 리포터 균주(특히 B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 두 개의 AAV5 기반 시스템이 ET-1 뇌졸중 손상 마우스에 사용되었습니다(그림 1A-C). 아급성 뇌졸중 모델에서 Neurod1은 Cre-Flex AAV 시스템에 패키징되어 뇌졸중 후 7일째에 야생형 마우스에 전달되었습니다(그림 1B). 두 번째 Flex 벡터는 이형, 역평행 loxP 유형 재조합 부위 측면에 있는 CAG promoter에 의해 구동되는 GFP에 대한 반전된 서열을 포함합니다(그림 1B). 두 바이러스 구조는 뇌졸중 후 동시에 함께 주입됩니다. Cre가 형질도입된 세포에서 발현되면 GFP는 재조합 부위에서 반전 및 절제되어 GFP의 발현을 허용하는 감지 방향으로 염기서열을 배향합니다. 따라서 Cre를 발현하는 세포는 GFP 양성이 되며, 이는 Cre-Flex 벡터에 의해 transduction되었음을 나타냅니다. 아급성 모델에서는 형질도입 후 21일(즉, 뇌졸중 후 28일)에 마우스를 희생하고, 뇌졸중 손상 뇌의 실질에서 형질도입된 세포(GFP+)와 NeuN+GFP+(NeuN을 발현하는 형질도입 세포) 세포의 수를 계수했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 허혈성 손상 부위에서 뉴런이 손실됩니다. Cre-Flex AAV 시스템을 사용하여 아급성 패러다임에서 형질도입된 세포를 정량화하면 Stroke-Cre 대조군 마우스에 비해 Neurod1 처리한 마우스에서 훨씬 더 많은 표지된 뉴런(NeuN+GFP+/GFP+ 세포)이 드러납니다(43.05 +/- 5.50% vs. 18.43 +/- 3.03% NeuN+GFP+/GFP+ 세포, Stroke-Neurod1 vs. 뇌졸중-크레(대조군) 처리된 마우스, 각각) (p = 0.0172) (그림 2B,C).

별도의 실험 세트에서, AtN 변환은 만성 뇌졸중 모델에서 수행되었습니다(그림 1B, C). 전사 인자 Neurod1 은 뇌졸중 후 21일째에 ET-1 뇌졸중 손상 tdTom-Cre 리포터 마우스에 전달되었습니다(그림 1C). 야생형 마우스에 사용된 Cre-Flex 시스템과 동일한 Neurod1 발현은 짧은 GFAP 프로모터에 의해 주도되었습니다. 그러나 이 시스템에서는 Neurod1 에 이어 Cre 재조합효소와 함께 단일 AAV 구조체가 사용되었습니다(그림 1B). 따라서 GFAP를 발현하는 세포는 Cre 재조합효소를 생성하여 tdTom 리포터를 유도하여 AAV 형질도입된 세포를 나타냅니다. 마우스는 뇌졸중 후 77일(AAV 후 8주)에 희생되었습니다(그림 1C). 그림 3A에서 볼 수 있듯이, tdTom-Cre 마우스에서 뇌졸중 후 77일째에 피질 병변이 관찰됩니다. 뇌졸중 후 만성 단계에서 뉴런 마커 NeuN+를 발현하는 형질도입 세포의 수를 정량화(NeuN+tdTom+/tdTom+ 세포의 상대적 백분율)한 결과, Stroke-Neurod1 을 투여받은 마우스가 Stroke-Cre 대조군 마우스에 비해 표지된 뉴런이 훨씬 더 많았음을 발견했습니다(74.81 +/- 4.835% vs. 53.05 +/- 5.028% NeuN+tdTom+/tdTom+ 세포의 뇌졸중-Neurod1대. 뇌졸중-크레( 대조군) 처리된 마우스, 각각) (p = 0.0355) (그림 3B,C).

전반적으로, 이 결과는 두 개의 서로 다른 AAV 기반 시스템을 가진 야생형 및 tdTom-Cre 리포터 마우스의 아급성 및 만성 뇌졸중 후 단계 모두에서 Neurod1 전달과 함께 NeuN+를 발현하는 더 많은 수의 형질도입 세포와 뉴런의 기준선 형질도입 세포를 보여줍니다.

figure-results-1
그림 1: Neurod1, 벡터 및 타임라인의 이소성 발현. (A) 마우스 운동 피질에 Endothelin-1(ET-1) 주입에 의한 뇌졸중 유도의 그래픽 표현. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 ET-1 주사 부위와 병변 주변 부위, 1mm 전방 및 후방의 3개 부위에 전달됩니다. 운동 피질에서 AAV-Neurod1 을 가진 형질도입된 세포를 보여주는 확대된 패널. (B) 야생형 마우스에 전달된 Cre-Flex 시스템의 두 AAV 벡터의 개략도(상단 패널). AAV5 벡터 1은 짧은 GFAP 프로모터, Neurod1 전사 인자 및 loxP 부위(검은색 삼각형)와 lox2272 부위(흰색 삼각형)가 측면에 있는 Cre 재조합효소 서열을 포함합니다. AAV5 벡터 2는 한 쌍의 loxP 및 lox2272 부위 옆에 있는 반전된 GFP 유전자 리포터 염기서열을 운반합니다. 세포에서 두 벡터의 형질도입은 Cre 매개 절제 및 역전을 초래하여 GFP 발현이 형질도입된 세포를 라벨링할 수 있도록 합니다. Neurod1 은 또한 하나의 AAV5 벡터(하단 패널)를 사용하여 tdTom-Cre 마우스에 전달되었습니다. AAV5 vector 1에서는 short GFAP promoter, Neurod1 transcription factor 및 Cre recombinase sequence가 패키징됩니다. 형질도입된 세포에서 Cre 발현은 loxP 부위(검은색 삼각형)에서 Stop 코돈의 절제를 유도하여 tdTomato 발현을 가능하게 합니다. (C) Cre-Flex 시스템은 뇌졸중 후 아급성기(뇌졸중 후 7일차)에 AAV를 주입한 야생형 마우스에서 테스트되었습니다. 야생형 마우스는 AAV 형질도입 후 21일(뇌졸중 후 28일)에 희생되었습니다. AAV는 뇌졸중 후 만성 기간(뇌졸중 후 21일)에 tdTom-Cre 마우스에 전달되었으며, 마우스는 AAV 형질 주입 후 56일(뇌졸중 후 77일)에 희생되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 뇌졸중 후 아급성기에서 Cre-Flex AAV를 사용한 이소성 Neurod1 전달은 NeuN을 발현하는 형질도입 세포의 수를 증가시킵니다. (A) 뇌졸중 후 28일째에 Stroke-Cre control(왼쪽) 및 Stroke-Neurod1 (오른쪽) 마우스에서 운동 피질을 통한 관상 뇌 절편의 면역염색. 신경 세포 손실은 병변 부위에서 관찰됩니다(흰색 점선). 형질도입된 세포(GFP+, 녹색), 뉴런(NeuN+, 빨간색) 및 공동 국소화된 NeuN+GFP+(주황색) 세포가 피질에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대: 250μm. (B) 뉴런(NeuN+, 빨간색) 및 AAV가 GFP+(녹색)로 형질전환된 뇌졸중-크레아 조절(위) 및 뇌졸중-뉴로드1 (아래) 뇌 조직의 대표 이미지. 흰색으로 윤곽선이 표시된 삽입은 각 개별 채널에 대한 셀의 클로즈업을 보여줍니다. 흰색 화살표는 AAV 형질도입 세포(GFP+)를 나타냅니다. 흰색 화살표는 공동 국소화된 NeuN+GFP+ 세포를 나타냅니다. 스케일 바: 125μm. (C) Stroke-Cre 및 Stroke-Neurod1 마우스에서 NeuN+GFP+/GFP+ 세포의 정량화. N = 그룹당 3마리의 마우스. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. Shapiro-Wilk 검정(p = 0.3223). 쌍체를 이루지 않은 t-검정, *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 뇌졸중 후 만성기에 있는 tdTom-Cre 리포터 마우스의 이소성 Neurod1 전달은 NeuN을 발현하는 형질도입 세포의 수를 증가시킵니다. (A) Stroke-Cre control 및 Stroke-Neurod1 마우스에서 뇌졸중 후 77일째에 운동 피질을 통한 관상 뇌 절편의 면역 염색. 허혈성 손상 부위(흰색 점선)에서 신경 세포 손실이 보입니다. 형질도입된 세포는 infarct 주위에서 tdTom(빨간색)으로 표지됩니다. NeuN+tdTom+(주황색)은 뉴런 마커를 발현하는 형질도입 세포입니다. 눈금 막대: 250μm. (B) 뉴런(NeuN+, 녹색) 및 AAV 형질 주입 세포(tdTom+, 빨간색)를 보여주는 Stroke-Cre control(위) 및 Stroke-Neurod1 (아래) 뇌 조직의 대표 이미지. 흰색으로 윤곽선이 표시된 삽입은 각 개별 채널에 대한 셀의 클로즈업을 보여줍니다. 흰색 화살표는 AAV 형질도입 세포(tdTom+)를 나타냅니다. 흰색 화살표는 공동 국소화된 NeuN+tdTom+ 세포를 나타냅니다. 스케일 바: 125 μm. (C) 만성 패러다임에서 NeuN+tdTom+/tdTom+ 세포의 정량화는 Neurod1 처리된 마우스에서 NeuN+(NeuN+tdTom+/tdTom+ 세포)를 발현하는 훨씬 더 많은 형질도입 세포를 보여줍니다. N = 그룹당 3마리의 마우스. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. Shapiro-Wilk 검정(p = 0.2044). 쌍체를 이루지 않은 t-검정, *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 경증-중등도 ET-1 피질 뇌졸중 모델의 맥락에서 Neurod1의 이소성 발현을 조사하기 위한 두 가지 AAV 시스템과 마우스 모델에 대해 자세히 설명합니다. ET-1 뇌졸중과 관련된 여러 가지 중요한 단계는 부상의 재현성과 일관성을 위해 고려해야 할 중요한 단계입니다. 버 구멍은 의도하지 않은 수술 부상을 방지하기 위해 경막에 구멍을 뚫지 않고 조심스럽게 뚫어야 합니다. 유사한 관심 영역(이 연구에서는 감각 운동 피질)을 보장하기 위해 일관된 랜드마크(이 경우 브레그마)를 사용하는 것이 중요합니다. 이는 병변의 위치와 크기가 기능적 결과에 영향을 미치기 때문에 행동 평가를 사용하는 연구에서 특히 중요하다 13,22,25,27. 가장 중요한 것은 ET-1의 주입 속도와 외과의가 주사기에 가하는 압력이 일치해야 재현 가능한 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 참고로, 주사기의 바늘이 막힐 수 있으며 정확한 ET-1 전달을 보장하기 위해 동물 사이를 청소해야 합니다. 조직의 세포 분석 중 뇌졸중 병변이 관찰되지 않으면 수술 중에 바늘이 막혔을 가능성이 있습니다. 문제가 지속되면 과거에 로트 의존적 효능 문제가 관찰되었으므로 제조업체로부터 새로운 로트의 엔도텔린-1을 구하십시오.

AAV를 전달하는 수술 절차는 ET-1 뇌졸중 유도 프로토콜의 단계와 유사합니다. 따라서 앞서 언급한 고려 사항이 중요합니다. 또한 AAV 바이러스 역가와 부피는 그룹 간에 transduction efficiency를 비교할 수 있도록 일관되어야 합니다. 이 프로토콜에서는 급성 연구를 위한 1 x 109 GC/μL의 AAV와 만성 연구를 위한 1 x 1010 GC/μL의 AAV를 투여했습니다. 인공물 발현을 최소화할 수 있을 만큼 충분히 낮은 바이러스 용량을 선택하는 동시에 충분한 세포 전달을 보장할 수 있을 만큼 충분히 높은 용량을 선택하여 실험 그룹 간의 차이를 감지할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 이러한 연구를 위한 최적의 바이러스 선량 범위는 10, 7-10,10 GC/μL,13,24로 결정되었습니다. AAV 역가가 높을수록 대조군의 뉴런이 광범위하게 표지될 뿐만 아니라 성상세포작용(astrocytosis)을 유도하고, 혈액-뇌장벽을 파괴하며, 염증 반응을 상향 조절하는 것으로 나타났습니다28,29. 뇌졸중 후 바이러스 매개 전사 인자 전달을 조사하는 연구에서는 AAV 주사를 위해 다양한 전달 부위를 사용했습니다. 한 연구에서는 뇌졸중 병변 부위에 AAV 단일 주사를 사용하여 형질도입된 세포를 성공적으로 라벨링하는 방법을 설명했습니다13. 다른 연구들은 경색 부위 주변의 1-3개 부위를 대상으로 한다30. 본 명세서에서, AAV는 병변 주변 신경교세포경계선 9에서 반응성 성상세포를 transduction하는 것을 목표로 ET-1 주사 부위 좌표에 1회, 병변 부위 주변 2회(1.0mm 전방에 1회, 1.0mm 후방에 1회)의 3개 위치로 전달되었습니다. 조직의 세포 분석 중 형광 세포가 전혀 또는 극소수(1-10개 세포/절편)로 관찰되지 않으면 주사 중 바늘이 막혔거나 AAV가 너무 많이 동결-해동되어 바이러스가 비활성화되었을 수 있습니다.

경증-중등도 뇌졸중 모델에서 서로 다른 시기에 형질도입의 효율성을 조사했으며, 그 결과는 뇌졸중 후 아급성 및 만성 시기 모두에서 Neurod1 치료 뇌에서 훨씬 더 많은 뉴런이 표지되어 있음을 보여줍니다. 여기에 표시된 연구는 뇌졸중 후 만성 단계에서 Neurod1 전달을 입증한 최초의 연구이며 뇌졸중 후 8주 동안 Neurod1을 이소적으로 발현하는 뉴런을 보여줍니다. 대조 벡터에 비해 Neurod1을 받은 뇌졸중 손상 뇌에서 형질전환 뉴런의 수가 증가한다는 발견은 Neurod1이 AtN 변환에 중요한 역할을 하는 것과 일치하지만, 세포 결과를 해석하려면 실험 패러다임의 한계에 대한 건전한 지식이 필요합니다. AtN 변환을 조사한 발표된 연구의 대다수는 뇌졸중을 포함한 신경퇴행성 질환의 반응성 성상세포에서 GFAP가 상향 조절되기 때문에 GFAP를 프로모터로 사용합니다 4,31. 그러나 낮은 GFAP 발현은 뉴런에서도 발생하는 것으로 나타났습니다32. 이는 대조군(Stroke-Cre)에서 형질도입된 세포의 비율이 이미 존재하는 뉴런이라는 본 명세서에 보고된 연구 결과와 일치한다32. 구체적으로, 이 프로토콜의 Stroke-Cre 대조군은 NeuN+Reporter+ 세포의 18.43 +/- 3.03% 및 53.05 +/- 5.028% 라벨링을 보여주었으며, 이는 기존 뉴런의 라벨링을 나타내며 뉴런에서 GFAP promoter-driven 발현을 나타냅니다. 실제로, Neurod1의 표적 발현은 바이러스 친화성(viral tropism)을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. AAV5는 감각 운동 피질을 포함하여 다른 뇌 영역에서 다른 효율로 뉴런을 transduction하는 것으로 나타났으며, 이는 AAV serotype이 전사 인자의 이소성 발현을 유도하는 연구에서 고려되어야 하는 국소 세포 영양성을 가지고 있음을 나타냅니다 31,33. 생쥐 균주는 또한 AAV 형질도입에 영향을 미칠 수 있습니다14,34. 야생형(C57BL/6J)과 FVB/N 마우스의 선조체에서 AAV 형질도입을 비교한 연구에서는 두 균주에서 다양한 세포 영양성 및 형질주입 효율을 발견했습니다34.

Cre-Flex 시스템의 장점은 야생형 마우스에서 장기간 라벨링에 사용할 수 있다는 것인데, 이는 Cre-reporter 마우스 라인15,35에 존재하는 비특이적 Cre 발현 문제를 줄일 수 있습니다. Cre-Flex 시스템의 단점은 바이러스 생산 중 LoxP 부위가 재조합된 바이러스 입자의 0.1%-0.8%로 인해 Cre-독립적 전이유전자 발현이 발생할 수 있다는 것입니다36. 이러한 결과는 예를 들어 Aldh1l1-CreERT2 마우스 라인을 사용하여 AAV 투여 전에 성상세포를 사전 라벨링하여 결론을 보고할 때 AtN 변환이 과대평가되지 않도록 하는 계통 추적 실험의 중요성을 강조합니다15. 연구에 따르면 다운스트림 유전자(예: Neurod1)에 의한 시스 조절을 통해 인간 GFAP 프로모터(이러한 연구에 사용됨)의 활성화는 내인성 뉴런에서 GFAP 발현을 유발할 수 있으며, 이는 치료 그룹15,32에서 더 많은 수의 표지된 뉴런으로 이어질 수 있습니다. 이러한 연구와 본 연구의 결과는 분석 중에 기존 뉴런과 내인성 뉴런을 구별하기 위해 AAV 투여 전에 성상세포 또는 뉴런을 사전 라벨링하는 것과 같은 계통 추적 실험의 중요성을 강조합니다15.

신경 세포 전달을 감소시킬 수 있는 다음 단계를 고려할 때, 다양한 AAV 혈청형 및/또는 덜 난잡한 성상세포 특이적 프로모터의 사용이 유용할 수 있다19. 성상세포의 이질성을 설명하는 보고의 수가 증가함에 따라 일반적으로 성상세포의 다른 하위 집단이 AtN 변환에 더 취약한 경우 유전자 발현 특이성에 더 많은 영향을 미칠 수 있습니다 37,38,39,40.

부상 또는 질병의 전임상 모델에 사용된 동물의 연령도 다양한 결과를 초래할 수 있는 중요한 고려 사항입니다. 예를 들어, 신경 외상의 경우, 나이는 성상세포 반응성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 AtN 변환에 대한 연구 결과에 영향을 미칠 수 있다41. 또한, Cre-inducible reporter lines는 시간이 지남에 따라 표현 특이성을 잃을 수 있으며, 이는 결과 측정에 영향을 미칠 수 있습니다42. 현재까지 나이가 많은 동물에 대한 재프로그래밍은 종합적으로 조사되지 않았다43.

이 프로토콜은 뇌졸중 후 AAV 전달을 2단계로 설명합니다: (1) 아급성기(7일)와 (2) 허혈성 뇌졸중 후 만성기(21일). 만성 뇌졸중 모델에서 Neurod1의 이소성 발현은 조사되지 않았습니다. 따라서, 이 후기 단계에서 현저히 더 많은 뉴런이 라벨링된다는 관찰은 만성 뇌졸중의 뇌졸중 회복을 촉진하는 것을 목표로 하는 향후 연구에 중요한 의미를 갖습니다. 뇌졸중 결과를 향상시키기 위한 Neurod1의 이소성 발현 가능성을 조사하는 연구는 뇌졸중 후 기능적 결과가 치료 중재를 위한 가장 임상적으로 유의미한 성공 척도이기 때문에 행동 평가를 통합해야 합니다 13,22,25,27.

뇌졸중 후 아급성 및 만성 단계에서 뇌졸중으로 인한 장애를 앓고 있는 환자를 위한 치료법은 현재 재활을 제외하고는 제한적이며, 이는 이점이 제한적입니다. 신경교세포에서 신경인성 bHLH 유전자의 강제 발현은 뇌졸중 후 기능적 결과를 개선하는 것으로 나타났습니다 22,30. 이 연구 결과는 Neurod1의 이소성 발현이 대조군 벡터를 투여받은 마우스에 비해 AAV 전달 후 3주 및 7주에 신경 세포 전달을 증가시킨다는 것을 보여주는 AtN 재프로그래밍 연구와 일치합니다. 가장 중요한 것은 여러 논문에서 AtN 재프로그래밍 분야의 연구 통제, 설계 및 해석에 대한 권장 사항을 설명했습니다 17,18,19,22. 이를 위해 이 프로토콜은 뇌졸중 후 전사 인자의 이소성 발현을 위한 AAV 시스템 및 마우스 모델을 설명했으며, 이는 관찰의 기초가 되는 세포 메커니즘에 대한 추가 연구를 알리고 발전시키는 데 사용할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Heart and Stroke Foundation, Ontario Institute of Regenerative Medicine, Canada First Research Excellence Fund(Medicine by Design, MbD) 및 Connaught Innovation Award(토론토 대학교)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#77 드릴 비트(.018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre벡터  Biolabs
흡수성 봉합사 니들 Polysorb™ 폴리에스터 CV-15 3/8 원형 테이퍼 포인트 바늘 크기 4 - 0 꼰CovidienGL-881
Anti-NeuN 항체 (토끼) 밀리포어 시그마ABN78 
C57BL/6 마우스Charles River027
클로르헥시딘 용액PartnarPCH-020
Contec™   PREempt™ RTU 소독 솔루션Fisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
깃털 안전 면도기 마이크로톰 블레이드깃털12-631P
Fisherbrand  커버 안경: 사각형Fisher Scientific12-545M 
형광 장착 매체Agilent TechnologiesS3023 
Hamilton 주사기Hamilton Company7634-01
고속 입체 드릴David Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
폴리덤 연고 USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   동물 온도 가열 패드Fisher Scientific04-777-177
스테레오택시 기기David Kopf Instruments모델 902
Superfrost Plus 현미경 슬라이드, 흰색Fisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter 마우스 Jackson Laboratory007914
V-1 탁상용 실험실 동물 마취 시스템VetEquip901806

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

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