방법 논문

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

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DOI:

10.3791/66966

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2024년 11월 15일

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1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

초록

Th17 세포로 알려진 IL-17A를 생산하는 T 보조 세포는 면역 방어에 중요한 역할을 하며 자가면역 질환과 관련이 있습니다. CD4 T 세포는 in vitro 에서 항원과 잘 정의된 사이토카인 칵테일로 자극하여 in vivo에서 Th17 세포 분화를 모방할 수 있습니다. 시험관 내 Th17 분광 분석을 사용하여 Th17 분화 조절 메커니즘에 대한 연구가 광범위하게 수행되었습니다.

기존의 Th17 분극 방법은 일반적으로 Th17 분화 및 기능에 대한 특정 유전자의 영향을 연구하기 위해 유전자 변형 마우스에서 naive CD4 T 세포를 얻는 것을 포함합니다. 이러한 방법은 시간과 비용이 많이 소요될 수 있으며 녹아웃 동물의 세포 외적 요인의 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 가이드 RNA의 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cell에 유전자 knockout을 도입하는 프로토콜은 매우 유용한 대안 접근법으로 작용합니다. 본 논문은 레트로바이러스 매개 유전자 표적화에 따라 naive primary T cell을 Th17 cell로 분화하는 프로토콜과 감염 및 분화 효율을 분석하기 위한 후속 유세포 분석 방법을 제시합니다.

서론

CD4+ T helper cell의 고유한 하위 집합인 Th17 세포는 세포외 박테리아와 진균을 박멸하는 데 필수적이며 다양한 자가면역 질환에서 중요한 역할을 합니다 1,2,3. 새로운 증거에 따르면 Th17 세포는 환경 및 유전적 요인의 영향을 받는 병원성 및 비병원성 조건 모두에서 기능하는 이질성을 나타냅니다. Th17 세포의 분화, 가소성 및 이질성을 제어하는 조절 과정을 규명하는 것은 보다 효과적인 면역 치료 전략의 발전에 매우 중요합니다.

유전자 변형 동물은 Th17 세포 분화 및 기능의 핵심 조절자를 밝히는 데 널리 사용되었습니다. 유전자 변형 동물을 사용하는 것은 생체 내에서 완전한 조작을 포함하며, 생리학적 조건 또는 질병 모델에서 그 역할에 대한 진정성과 체계적인 연구를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 이 접근 방식을 사용한 고처리량 스크리닝은 대체로 비실용적입니다. In vitro 편광 분석은 Th17 세포 분화 연구를 위한 대안을 제공합니다. 형질전환 성장 인자 β1(TGFβ1)과 결합된 인터루킨 6(IL-6)은 비병원성 Th17 세포의 발달을 촉진하는 것으로 나타났으며, IL-6, IL-1β 및 IL-23은 병원성 Th17 세포(pTh17)4,5의 분화를 촉진하는 데 관여합니다.

CRISPR/Cas9 기술의 출현으로 특정 염기에서 정밀한 게놈 편집이 가능해졌습니다. 레트로바이러스 형질도입과 결합할 때, 이 접근법은 Th17 세포에서 잠재적 조절인자를 스크리닝하고 기능적으로 연구하기 위한 강력하고 효율적이며 경제적인 유전적 방법을 제공합니다 6,7. 이 연구에서는 Th17 분극 시스템 내에서 레트로바이러스 형질주입 절차를 개선했습니다. 레트로바이러스 시스템을 사용하여 생쥐의 사전 확립된 Cas9 발현 활성화 미접촉 T 세포를 감염시켰습니다. 세포는 표적 유전자의 knockout을 촉진하기 위해 EF1a 프로모터의 제어 하에 형광 리포터 단백질을 암호화하는 유전자와 함께 U6 프로모터에 의해 구동되는 가이드 RNA(gRNA) 구조체로 형질도입되었습니다. 그런 다음, 형질도입된 T 세포를 특정 사이토카인 조건에서 배양하여 Th17 세포로의 분화를 유도하였다. 특히 RoRγt를 knockout한 그룹은 대조군에 비해 IL-17A 생산량을 유의하게 감소시켰다. 이 시스템의 효과는 활성화된 일차 T 세포에 대한 최적화된 레트로바이러스 생산 및 형질 도입 조건에 달려 있으며, 이는 Th17 분화 및 기능의 특정 유전자를 연구하기 위한 빠르고 실용적인 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

모든 절차는 상하이 자오퉁 의과대학 렌지병원 실험동물복지윤리위원회(Experimental Animal Welfare Ethics Committee)의 승인을 받았으며 제도적 지침을 준수하고 있습니다.

1. 레트로바이러스 생산

  1. 레트로바이러스 구조체의 제조
    1. CRISPick 도구(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)를 사용하여 RORγt knockout8을 위한 sgRNA를 설계합니다. reference genome을 Mouse GRCm38로 지정하고, CRISPRko guide system에 따라 PAM sequence를 NGG(SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA의 경우)로 선택합니다. 타겟 유전자의 이름 또는 기타 타겟 유전자 형식을 검증하고 유효한 입력을 제출하여 sgRNA 후보 물질을 획득합니다. 다른 파라미터를 기본값으로 설정하고, sgRNA target을 RORγt(Rorc, Gene ID: 19885)로 설정하여 Th17의 분화를 방해하고, 마우스 GeCKO v2 라이브러리에서 non-targeting sgRNA(약어: sgNT, sequence: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG)를 선택합니다.
      참고: 이 도구는 가이드 RNA를 설계하기 위한 다양한 클릭 가능한 옵션을 제공하여 특정 요구 사항을 충족하도록 편리하게 사용자 정의할 수 있습니다.
      1. Quick Gene Lookup(빠른 유전자 조회) 열 아래의 검색 상자에 타겟 유전자 이름을 입력합니다. 시스템은 정확한 선택을 보장하기 위해 유전자 ID와 대상 유전자의 전체 이름을 표시합니다.
        참고: 다양한 표적 유전자 형식을 검증하기 위해 추가 옵션을 사용할 수 있습니다.
    2. off-target match를 피하고 on-target 효능을 높이기 위해 높은 조합 rank 및 pick 순서에 따라 Rorc (약어: sgRorc) sequence에 target된 하나의 sgRNA를 선택합니다(sgRorc sequence: GTCATCTGGGATCCACTACG). sgRorc 및 sgNT에 대해 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성합니다: 순방향 올리고의 경우 각 가이드 서열의 5' 끝에 "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" 서열을 추가합니다. 리버스 올리고의 경우 각 가이드 시퀀스의 3' 끝에 "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" 시퀀스를 추가합니다.
      참고: 일반적으로 sgRNA 염기서열에는 여러 옵션이 있습니다. knockout 효율을 평가하기 위해 동일한 유유전자형을 표적으로 하는 2개 또는 3개의 sgRNA 염기서열을 선택하는 것이 필수적입니다. 본 연구의 예비 실험에서는 Rorc 를 타겟으로 하는 두 개의 gRNA를 비교를 위해 선택했습니다(sgRNA sequence1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sgRNA sequence2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). 실험 결과에 따르면 현재 방법(sgRNA sequence1)에서 제시된 gRNA는 둘 사이에서 더 높은 knockout 효율을 나타냅니다.
    3. 위의 프라이머와 함께 PCR에서 DNA 중합효소를 사용하여 sgRorc 및 sgNT 코딩 염기서열을 증폭하고 mCherry 형광 단백질이 있는 프레임에서 pMX-U6-MCS 벡터(U6 promoter와 gRNA scaffold 사이)로 각각 클로닝합니다9. 반응 시스템(50μL)을 표 1과 같이 설정합니다. 이러한 primer는 sgRNA를 벡터에 삽입할 수 있는 sgRNA sequence(3')와 전체 길이 벡터 단편을 증폭할 수 있는 vector sequence(5')의 세그먼트로 구성됩니다. 또한, sgRNA 영역 내에서 약 18 bp의 중첩(완전히 중첩되지는 않음)으로 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하여 ligation process 동안 선형화된 cloning vector의 조립을 용이하게 합니다.
      참고: 약 5,551 kd의 PCR에 의한 프라이머가 있는 sgRNA 염기서열 부위의 선형화된 벡터 단편을 얻어야 합니다.
    4. 겔 추출 키트를 사용하여 구조체를 정제하고 클로닝 키트를 사용하여 원형화합니다. 형질전환 분석을 위한 재조합 제품을 사용하십시오.
    5. 플레이트에서 단일 클론을 선택하고 U6 promoter primer(염기서열: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA)를 사용하여 1세대 염기서열분석을 통해 sgRorc 또는 sgNT 코딩 염기서열을 검증합니다.
    6. LB 브로스에서 증폭을 위해 원하는 단일 클론을 선택합니다. 내독소가 없는 플라스미드 키트를 사용하여 박테리아 세포에서 고품질 플라스미드 DNA를 추출합니다.
      참고: 플라스미드 용액의 품질이 좋은지 확인하십시오. 플라스미드 용액의 농도는 1 μg/μL 이상이어야 합니다.
  2. 패키징 셀의 준비
    1. 다음 절차를 사용하여 Platinum-E(Plat-E) 세포를 준비합니다: 10cm 배양 접시에서 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 units/mL 페니실린 및 0.1 mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM 배지)으로 Plat-E 세포를 배양합니다. 하기에서 세포 배양 배지 로 지칭될 것이다.
      참고: 적절한 transfection 효율을 얻으려면 대수 성장 단계에서 계대 수가 15개 미만인 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 10cm Plat-E 세포(~2.6 × 107 세포)를 적절한 비율로 전체 플레이트를 transfection 1일 전에 새로운 10cm 접시에 분할하여 다음 날 약 80%의 세포 밀도를 달성하며, 이는 transfection을 위한 최적의 조건입니다. 새로운 10cm 접시에 대해 1:3 비율로 세포 계대 분석을 수행합니다(transfection 전날 새로운 10cm 접시에 ~8 ×6 세포를 시드).
      참고: split ratio는 세포의 성장 조건에 따라 달라지며, 강력한 성장을 보이는 세포에서 더 높은 transfection 효율을 달성할 수 있습니다. 10cm 접시에 대해 1:3 비율로 세포 통과를 수행합니다. 6cm 접시와 같은 다양한 세포 배양 접시의 경우 1.5 × 106 Plat-E 세포를 transfection 전날에 파종하는 것이 좋습니다.
  3. 형질주입(Transfection)
    1. 형질주입 1시간 전, 세포 배양 배지를 페놀 레드가 없는 8mL의 환원된 혈청 배지로 5% FBS가 포함되지만 페니실린-스트렙토마이신이 없는 경우 형질주입 시약에 방해가 될 수 있으므로 대체하십시오. 사용하기 전에 환원된 세럼 매체를 37°C로 데우십시오.
    2. 믹스 1 및 믹스 2를 포함하는 형질주입 혼합물을 제조한다: 믹스 1은 1,000 μL의 환원된 혈청 배지에 18 μg의 플라스미드 DNA(pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) 및 6 μg의 pCL-Eco를 포함한다. Mix 2에는 1,000μL의 환원된 혈청 배지에 48μL의 transfection 시약이 포함되어 있습니다. 믹스 1에 믹스 2방울을 한 방울씩 넣고 부드럽고 철저히 섞습니다. 20-25 ° C에서 15-20 분 동안 복합체를 배양하십시오.
    3. 혼합물을 Plat-E 세포에 조심스럽게 떨어뜨리고 플레이트를 부드럽게 휘젓어 균일하게 분포되도록 합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 이하에서 6-12 시간 동안 세포를 배양합니다.
    4. 배지를 10mL의 신선한 세포 배양 배지로 교체하고 37°C, 5%CO2 에서 48시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
    5. 형광 현미경 검사 또는 유세포 분석을 통해 프록시 역할을 하는 레트로바이러스 벡터 태그를 검출하여 Plat-E 세포의 transfection 효율을 평가합니다.
      참고: pMX-U6-MCS 벡터로 transfection된 Plat-E 세포의 상당한 비율에서 강력한 mCherry 형광(형광 양성이 80% 초과) 신호가 검출되어 성공적인 transfection을 나타냅니다.
    6. 바이러스 함유 배양 상등액과 원심분리기를 1,500 ×g에서 10 분 동안 수확 하여 세포 조각을 제거합니다. 바이러스 상등액을 바이알당 1mL로 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
      알림: 여과는 세포 파편을 제거하는 대체 방법입니다. 공극 크기가 0.45μm인 주사기 필터와 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인을 사용하여 필터 멤브레인에 바이러스 입자가 머무르는 것을 최소화하는 것이 좋습니다.

2. 활성화된 CD4 + T 세포의 레트로바이러스 감염 및 Th17 분화

  1. 일차 무접촉 CD4+ T 세포를 준비하고 활성화합니다.
    1. 멸균 500μL PBS에 2μg/mL의 항-CD3e 및 4μg/mL의 항-CD28로 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰을 코팅하고, 증발 및 오염을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름으로 감싼 다음, 미접촉 CD4+ T 세포를 분리하기 전날 4°C에서 하룻밤(또는 CD4+ T 세포 도금 전 1-2시간 동안 37°C)에서 플레이트를 배양합니다.
      참고: 이 단계는 바이러스 형질도입을 수행하기 전에 마우스 T 세포에 대한 플레이트 결합 자극을 수행하는 데 필요합니다.
    2. 다음날, 6-8주 된 Cas9 발현 마우스(R26-CAG-Cas9 마우스)를 CO2 질식으로 안락사시키고 70% 에탄올로 살균합니다.
    3. 마우스 비장을 채취하여 2% FBS 및 100μM EDTA(FACS: 완충액)가 있는 PBS에 넣습니다.
    4. FACS 완충액에서 멸균된 접지 유리(무광택 면)로 비장을 분쇄하고, 조직을 단일 세포 현탁액으로 균질화하고, 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 튜브로 여과합니다.
      알림: 조직을 촉촉하게 유지하기 위해 조직을 부드럽고 일관되게 갈아서 사용하십시오. 조직을 격렬하게 갈면 세포 생존에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
    5. 비장 세포 현탁액을 800 × g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 그대로 둔 다음 FACS 버퍼를 추가하여 총 부피가 15mL에 도달하도록 합니다. 비장세포를 800 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 비장세포를 재현탁하고 40μm 세포 여과기를 통해 여과합니다. CD4+ T 세포 분리를 위해 최종 부피를 1mL로 조정합니다.
    7. 설명서의 지침에 따라 상용 시약 키트를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리합니다.
    8. CD4+ T 세포를 형광 항체 혼합물(CD4, CD25, CD44 및 CD62L)로 4°C에서 30분 동안 라벨링하고, FACS 완충액으로 세포를 세척하고, 플로우 셀 분류기를 사용하여 naive CD4+ T 세포를 분리합니다. 이를 통해 CD4+CD25-CD62L높은CD44낮은 나이브 T 세포를 얻을 수 있습니다.
    9. 24-well 세포 배양 플레이트(단계 2.1.1에서 준비)에서 plate-bound stimulation supertatent를 제거하고 500μL의 PBS로 각 well을 두 번 헹굽니다. 플레이트 1 x 106 나이브 CD4+ T 세포를 24웰 세포 배양 플레이트의 웰에 있는 1mL의 림프구 배양 배지에 넣습니다. 세포 배양기에서 세포를 배양합니다.
      참고: 림프구 배양 배지에는 RPMI 1640 배지에 10% FBS, 100 units/mL 페니실린 및 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM HEPE 및 50 μM β-ME가 포함되어 있습니다.
  2. 레트로바이러스 감염
    1. 18-24시간 후 활성화된 세포의 각 웰을 1.5mL 튜브에 수집합니다. 800 ×g에서 5 분 동안 원 심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
    2. 감염 혼합물 1mL(10μg/mL 헥사디메트린 브로마이드, 바이러스 상등액 내 10mM HEPES)에 세포 펠릿을 재현탁하고 혼합물 1mL를 48웰 세포 배양 플레이트의 새 웰에 추가합니다. 그 동안, 충분한 세포를 음성(형질전환되지 않은) 대조군으로 저장하십시오.
      참고: 웰당 1 x 106 활성 naive CD4+ T 세포 미만을 보유하는 것이 가능하지만 웰당 0.5 x 106 세포 미만을 사용하는 것은 권장하지 않습니다. 또한 48웰 배양판의 주변 웰에 세포를 파종해서는 안 됩니다.
    3. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 800 x g 에서 32°C에서 90분 동안 원심분리합니다. 가속 및 감속을 3으로 설정합니다. 원심분리 후 파라필름을 제거하고 인큐베이터에서 세포를 4시간 동안 배양한 후 분화 단계를 진행합니다.
  3. 감염된 세포를 Th17 세포로 분화
    1. 레트로바이러스 감염 중 항원제시세포(APC)를 준비합니다. 먼저, 2.1.2 단계에서 2.1.4 까지의 지침에 따라 야생형 마우스에서 비장 세포를 얻습니다. 15mL 튜브에 50μg/mL 미토마이신이 포함된 1mL의 림프구 배양 배지로 비장 세포를 재현탁합니다. 비장 세포를 37 ° C에서 5 % CO2 이하에서 1 시간 동안 배양합니다.
    2. 1시간 후, PBS를 15mL 표시까지 첨가하여 비장세포를 세척하고, 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 1mL의 림프구 배양액으로 비장세포를 재현탁하고 세포수를 계수합니다. APC 세포는 성공적으로 준비되었습니다.
    3. 세포 배양 4시간 후(단계 2.2.3과 같이) 형질도입된 CD4+ T 세포를 1.5mL 튜브에 넣고 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 감염된 세포를 600μL의 PBS에 재현탁시켜 세척합니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
    4. 0.5 × 106 형질도입 CD4+ T 세포를 1mL의 림프구 배양 배지에 넣고 1.5 x 106 APC 세포를 24웰 세포 배양 플레이트의 웰에 넣습니다. 2 μg/mL의 anti-CD3e, 2 μg/mL의 anti-CD28 및 10 μg/mL anti-IFNγ, 10 μg/mL anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL anti-IL4, 2.5-3 ng/mL hTGF-β 및 20-30 ng/mL IL-6을 포함하는 Th17 세포 분화 칵테일을 보충합니다. 2일 동안 세포를 배양합니다.
    5. 각 세포 웰을 1.5mL 튜브에 모으고 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 새로운 림프구 배양 배지 1mL를 3ng/mL TGF-β 및 30ng/mL IL-6으로만 새로 고칠 수 있습니다. 확장된 배양 기간 동안 24웰 세포 배양 플레이트의 새 웰에 세포를 놓습니다. 매체 변화 2일 후 세포를 분석합니다.

3. Transduction Efficiency 및 차별화 결과 평가

  1. 배지 교체 2일 후 세포를 채취하여 800× g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다. 분화된 세포를 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 24웰 세포 배양 플레이트의 새 웰에서 500μL의 림프구 배양 배지에 500ng/mL 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 500ng/mL 이오노마이신(ionomycin) 및 5μg/mL 브레펠딘 A로 처리합니다. 유세포 분석을 위해 세포의 절반을 채취하고 qPCR 분석을 위해 RNA 추출 버퍼로 세포의 나머지 절반을 용해합니다.
  2. 유세포 분석 분석용
    1. 세포를 1.5mL 튜브에 모읍니다. 튜브에 1mL의 FACS 완충액을 추가하고 800× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
    2. 세포 펠릿을 형광 항체 혼합물(CD4 및 Fixable Viability Dye in 100 μL of PBS)로 재현탁하고 4°C에서 30분 동안 세포를 염색합니다.
    3. 300μL의 PBS로 세포를 세척하고 300μL의 2% 인산염 완충 포름알데히드(FA)로 4°C에서 최소 60분 동안 고정합니다.
    4. 1시간 후, PBS로 세포를 세척하고 600μL의 1x 투과 완충액으로 재현탁시킨 다음 800×g에서 5 분 동안 원 심분리합니다.
    5. 상층액을 버리고 100μL의 1x 투과 완충액에 항-IL-17A를 실온에서 60분 동안 또는 하룻밤 동안 4A로 염색합니다.
    6. 다음 날, 1x 투과 완충액으로 세포를 세척하고 200μL의 PBS에 재현탁합니다. 유세포 분석10으로 세포를 분석합니다. Representative Results 섹션을 참조하십시오.
  3. qPCR 분석의 경우 RNA 추출 키트의 지침에 따라 RNA를 추출합니다. 저장 또는 후속 qPCR 분석을 위해 RNA를 cDNA로 역전사합니다. 이러한 프라이머의 설계는 일반적인 qPCR 프라이머 설계 원칙을 준수해야 하며, gRNA 매개 절단이 발생한 것으로 예상되는 indel 부위에 걸쳐 있는 영역을 구체적으로 표적으로 해야 합니다. 이 사이트에서 증폭 효율의 감소 또는 신호 손실은 성공적인 녹아웃의 지표가 될 수 있습니다. qPCR 프라이머는 다음과 같습니다.
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

결과

이 연구에서는 sgRNA 타겟을 Rorc에 복제하고 sgRNA-비표적 코딩 염기서열을 mCherry 형광 단백질이 있는 pMX-U6-MCS 벡터에 복제했습니다(그림 1A,B). 레트로바이러스 생산은 그림 2에 요약된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. transfection은 0일째에 시작되었고, 레트로바이러스 수확은 2일에 이루어졌다. transfection 효율은 mCherry 형광 강도로 테스트할 수 있습니다(그림 1C). 바이러스를 채취하기 전에 naive CD4+ T 세포를 분류하고 활성화했습니다. 그런 다음 이러한 활성화된 CD4+ T 세포를 스핀 감염을 사용하여 감염시킨 후 설명된 대로 분화 단계를 계속했습니다. 마지막으로, 형질도입의 효율성과 분화 결과는 유세포 분석 및 qPCR 분석을 사용하여 평가되었습니다.

그림 3은 naive CD4+ T cell을 분류하기 위해 적용되는 게이팅 전략을 보여줍니다. 주세포 집단과 단일항 세포를 선택한 후(그림 3의 처음 두 게이트에서 볼 수 있듯이), FVD-CD4+ 세포를 게이팅하여 Th17로 편광된 CD4 T 세포와 APC의 세포를 구별했습니다. 마지막으로, CD4 T 세포에 의해 생성된 IL-17A는 Th17 분화 효율을 나타내며, 이는 녹아웃 효율을 나타냅니다. mCherry 양성 세포의 비율은 레트로바이러스 감염의 효율성을 반영하며, 녹아웃 효율은 IL-17A 양성 세포의 비율로 표시됩니다. 세포 생존력을 높이고 분류 기간을 최소화하기 위해 마우스 CD4+ T 세포 분리 키트를 사용하여 비장세포를 농축하여 90%를 초과하는 농축 효율을 달성했습니다.

mCherry 양성 세포의 존재로 나타나는 레트로바이러스 감염의 효율은 일반적으로 약 40%입니다(그림 4A). 바이러스 농도를 통해 감염 효율을 높일 수 있지만, 이 접근 방식은 실험 기간이 길어지고 비용이 많이 듭니다. 본 실험에서 Th17 세포 분화 칵테일 없이 배양된 감염된 세포는 Th0로 지정된 Th17 분화 음성 대조군 역할을 했습니다. 비표적 sgRNA를 sgNT라고 하는 positive control로 사용했습니다. 유전자 편집을 위해 RORγt 유전자를 표적으로 하는 gRNA(sgRNA-Rorc)를 사용하여 Th17 분화 효율을 크게 줄였습니다(그림 4A). 이러한 개입은 또한 Rorc 및 IL-17a 의 발현 수준을 크게 감소시켰습니다(그림 4B).

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그림 1: 레트로바이러스 벡터로 sub-clone된 sgRNA의 예 및 transfection 효율. pMX-U6-MCS 벡터가 초기 구조로 사용되었습니다. gRNA 스캐폴드는 (A) 스크램블 부위 및 (B) Rorc를 표적으로 하는 sgRNA 염기서열(주황색 부분)과 함께 U6 promoter(U6 프라이머로 염기서열분석을 위한 섹션으로서의 녹색 부분)의 다운스트림에 삽입되었습니다. sgRNA 함유 프라이머 및 염기서열분석 프라이머 부위의 위치는 원형 벡터 아래에 표시되어 있으며, 플라스미드에 있는 약어의 전체 이름은 다음과 같습니다. 약어: AmpR = 암피실린, 카르베니실린 및 관련 항생제에 대한 내성; LTR = 긴 단자 반복; MMLVψ = Moloney murine leukemia virus의 패키징 신호; gag = 시작 코돈이 없는 잘린 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV) 개그 유전자. (C) 플라스미드 DNA 형질 주입된 Plat-E 세포에서 mCherry의 현미경 이미징. 눈금 막대: 500픽셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 프로토콜의 개략도. transfection 전날에는 Plat-E 세포의 밀도를 적절한 범위로 조정해야 합니다. 다음날(0일)에 transfection을 수행하고 12시간 후에 배지를 교체합니다. 1일차에 Cas9 발현 마우스의 naive T cell을 분류하고 활성화합니다. 그 후(2일차), 바이러스 함유 배양 상등액을 수확하고 활성화된 T 세포와 결합하여 레트로바이러스 형질도입을 수행합니다. 그런 다음 감염된 세포를 3-4일 동안 Th17 세포로 분화하고 FACS를 사용하여 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: CD4 naive T cell을 분류하기 위한 게이팅 전략. CD4, CD25, CD44 및 CD62L을 표지하기 위해 농축된 CD4 T 세포에 표면 염색을 수행했습니다. 사용된 게이팅 전략은 다음과 같습니다: 초기에 림프구는 전방 산란 및 측면 산란 매개변수를 기반으로 게이트되었습니다. 그 후, FSC-H 및 FSC-W를 사용하여 단일 세포를 식별했습니다. 그런 다음 CD4 + CD25- 세포를 게이트하여 조절 T 세포 (Tregs)를 배제했습니다. 마지막으로, CD44낮은CD62L높은 naive T 세포가 확인되었습니다. 분리된 CD4+ naive T cell은 후속 실험을 위해 수집되었습니다. 약어: FSC = 전방 산란; SSC = 측면 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 활성화된 T 세포의 성공적인 형질도입 및 Th17 분화의 예. (A) Th17의 분화 효율은 RORγt gRNA(mCherry+ IL-17a+population에 대한 게이팅)에 의해 편집되는 현저히 감소합니다. (B) Th0(Th17 세포 분화 칵테일 없이 배양된 감염된 세포), sgNT(비표적 sgRNA) 및 sgRNA-Rorc( RORγt 유전자를 표적으로 하는 sgRNA)에서 Rorγt 및 IL-17a 상대 mRNA 발현. p < 0.001 (짝을 이루지 않은 양측 학생의 t-검정, 데이터는 SEM± 평균으로 제공됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PCR 반응 성분PCR 프로그램
구성 요소부피(μL)걸음임시 직원.시간주기
2 × 판타 믹스 (염료 플러스)25195 ºC3 분1
DDH2020295 ºC15들
프라이머-F(10μM)2356 ºC15들
프라이머-R(10μM)2472 ºC5 분 30 초2단계로 이동합니다.
35 ×
템플릿(~30ng)1572 ºC5 분1
612 ºC∞

표 1: PCR 반응 구성 요소 및 gRNA 벡터 구축을 위한 PCR 프로그램.

토론

레트로바이러스 전달을 통한 CRISPR/Cas9 게놈 편집은 보조 T 세포의 역할을 탐구하기 위한 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 Th17 분화 및 기능에 관여하는 특정 유전자를 검사하는 빠르고 효과적인 접근 방식을 제공합니다. 최적의 결과를 얻으려면 몇 가지 중요한 단계를 주의 깊게 따라야 합니다. 첫째, gene knockout 효율을 높이기 위해서는 gRNA를 신중하게 선택해야 합니다. CRISPR/Cas9 유전자 편집에서 off-target 효과의 위험을 감안할 때, 추가 실험을 위해 프로토콜 섹션 1.1.1에서 확인된 바와 같이 점수가 높은 2-3 gRNA를 선택하는 것이 현명합니다11,12. 둘째, 높은 바이러스 역가가 성공적인 감염에 필수적입니다. Plat-E 패키징 세포주의 적절한 유지 관리는 매우 중요합니다. 세포는 transfection 당일에 약 80%의 합류점에 도달해야 하는데, 불충분하거나 과도한 세포 수는 바이러스 역가를 손상시킬 수 있기 때문입니다. Plat-E 세포를 사용할 수 없는 경우, human embryonic Kidney 293T 세포와 pCL-Eco 벡터를 co-transfection하면 높은 바이러스 역가를 생성할 수도 있습니다13,14. 최소 1 μg/μL의 높은 플라스미드 농도를 유지하는 것은 높은 바이러스 역가를 달성하는 데 중요합니다. 바이러스는 pH 변화에 민감하기 때문에 레몬 노란색으로 변하기 전에 바이러스 현탁액을 수확하는 것이 필수적입니다. 따라서 배양 배지의 pH는 적절한 범위 내에서 신중하게 조절해야 합니다. 바이러스는 무결성을 유지하고 반복적인 동결-해동 주기로부터 보호하기 위해 -80ºC에서 보관해야 합니다15.

셋째, 높은 감염 효율을 달성하기 위해서는 일차 세포가 적절하게 활성화되어야 합니다. 부적절한 세포 활성화는 바이러스 감염 효율을 크게 저하시킨다16. 바이러스 감염 전에 T 세포의 활성화 상태를 현미경으로 확인해야 하는데, 이는 활성화된 세포가 비활성화된 세포보다 현저히 큰 크기를 나타내기 때문입니다. 당사의 Th17 분화 프로토콜은 C57BL/6 마우스에 특별히 최적화되어 있으므로 다른 마우스 균주에 대한 조정이 필요할 수 있습니다. 넷째, 원하는 Th17 분화 결과를 얻기 위해서는 최적의 세포 조건을 유지하는 것이 중요합니다. 스핀 감염 중에는 세포 생존력을 유지하는 데 도움이 되도록 중앙 근처의 웰에 세포를 배치하는 것이 중요합니다. 스핀 감염 후 세포를 4시간 동안 배양하는 것(프로토콜 단계 2.2.4)은 세포의 회복에 매우 중요합니다. 또한 세포를 이식할 때 세포 생존력을 유지하기 위해 부드러운 피펫팅이 중요합니다. 다양한 자극 조건이 Th17 분화에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 실험에서 항원제시세포를 분화 시스템에 통합하면 anti-CD3e 및 anti-CD28 plate-bound stimulation에 비해 분화 효율이 크게 향상되었습니다. 마지막으로, 사용되는 모든 사이토카인이 운송 및 저장 중에 기능을 유지하도록 하는 것이 중요합니다. 사이토카인은 반복되는 동결-해동 주기 또는 부적절한 재구성 용액에서 안정성을 빠르게 잃을 수 있습니다. 냉간 처리와 등분 분취량은 사이토카인이 시술 전반에 걸쳐 기능을 유지하는 데 필요합니다.

특정 유전자 knockout Th17 세포를 생성하기 위한 이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 1차 마우스 T 세포에서 완전한 transduction efficiency를 달성하기가 어렵습니다. 일부 세포는 Th17 분화 동안 의도한 유전자 녹아웃을 겪지 않을 수 있습니다. 둘째, 일차 T 세포는 in vitro의 수명이 제한되어 있습니다. 약 일주일 후에 이러한 세포는 사멸하는 경향이 있어 후속 실험에 어려움을 겪습니다. 셋째, 당사의 프로토콜은 Cas9 형질전환 마우스에 의존하고 있으며, Cas9 염기서열을 코어 플라스미드에 통합하려고 시도했을 때 바이러스 역가가 크게 감소했습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 레트로바이러스 형질도입 전에 세포가 활성화되어야 하기 때문에 미접촉 CD4+ T 세포 활성화의 초기 단계에 관여하는 유전자의 기능을 분석하는 데 적합하지 않습니다.

한계에도 불구하고 이 프로토콜은 다양한 연구에 성공적으로 적용되어 Th17 분화와 관련된 주요 유전자 조절자의 탐색을 촉진했습니다. 이를 통해 활성화된 T 세포에서 표적 유전자의 knockout에 따른 Th17 분화 효율의 변화를 평가할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 세포 증식, 생존, 전사 인자 안정성, 사이토카인 분비 및 면역 반응을 포함한 Th17 세포 기능의 다른 측면을 평가하는 데 적합합니다. 또한, 본 연구실은 유도 조절 T 세포(iTregs)의 레트로바이러스 형질도입 및 분화에 대한 효과를 입증했습니다. 모든 유형의 T 세포가 테스트된 것은 아니지만, 이 프로토콜은 Th1, Th2 및 CD8+ T 세포와 같은 다른 하위 집합에도 적용할 수 있습니다. 전반적으로 이 기술은 면역 세포에서 유전자 녹아웃을 수행하는 데 유용한 도구 역할을 하며 면역 기능을 조절하는 중요한 유전 신호를 발견할 수 있는 상당한 잠재력을 제공합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 말합니다.

감사의 글

상하이 면역 치료 연구소(Shanghai Immune Therapy Institute)의 핵심 시설에서 근무하는 Dou Liu, Dongliang Xu, Pinpin Hou에게 기기 활용에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 31930038, U21A20199, 32100718 및 32350007 (Linrong Lu에게)의 지원을 받았습니다. 32100718 (Xuexiao Jin에게); 상하이 SHSMU-ZLCX 20211600 (Linrong Lu까지)의 고급 지역 대학의 혁신적인 연구 팀; 내부 배양 프로그램 RJTJ24-QN-076(Zejin Cui에게). 그림 2는 Figdraw로 준비되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 m EDTA (pH 8.0)SolarbioE1170
100 mm 세포 및 조직 배양 접시BIOFILTCD010100
1 M Hepes (Free Acid, sterile)SolarbioH1090
24-well cell and tissue culture plateNEST702002
48-well cell and tissue culture plateNEST748002
Brefeldin 용액 (1,000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 항체 (RM4-5)BioLegend100546
CD3e 단클론 항체 (145-2C11), 기능 등급, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 단클론 항체 (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) 단클론 항체 (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
세포 계수기Nexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
세포 여과기 (40 μ m)biosharpBS-40-CS
세포 여과기(70 μ m)biosharpBS-70-CS
원심분리기 에펜도르프5425  R
원심분리기 eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR 마스터 믹스VazymeQ411-02
ClonExpress II 원스텝 클로닝 키트VazymeC112
DH5α 유능한 세포Sangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation KitSTEMCELL19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit IITIANGENDP118-02
ExFect 트랜스펙션 시약VazymeT101-01
소 태아 혈청, 프리미엄 플러스Gibco A5669701
FITC 안티 마우스 IL-17A 항체 (TC11-18H10.1)BioLegend506907
포름알데히드 용액MacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix for qPCR?+gDNA 와이퍼?VazymeR423-01
IonomycinBeyotimeS1672
Mitomycin CMaokang Biotechnology7/7/1950
마우스 GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM 감소 혈청 매체Gibco31985070감소 혈청 매체
Pacific Blue 안티 마우스 CD4 항체 (RM4-5)BioLegend
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 항체 (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 항체 (GK1.5)BioLegend100422
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 마우스 상하이 모델 유기체 센터Cat. NO. NM-KI-00120
재조합 인간 TGF-베타 1 (CHO 발현) 단백질, CFR & D Systems11409-BH
재조합 쥐 IL-6PeproTech216-16
연구 세포 분석기BD BiosciencesBD LSRFortessa
연구 세포 분류기SONYMA900
RPMI 1640 중간BasalMediaL210KJ
SimpliAmp 열 순환기 PCR 시스템응용 BiosystemsA24811
나트륨 피루브산 용액 (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 항체 (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-γ 항체 (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 항체 (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 항체 (C17.8)BioLegend505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)SolarbioM8211
100531

참고문헌

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  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
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  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

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