방법 논문

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

DOI:

10.3791/66971

⸱

2024년 9월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다공성 기판 전기천공법(PSEP)은 높은 세포 생존율과 일관되고 높은 처리량 전달을 결합합니다. 경상피 전기 임피던스(TEEI) 측정의 도입은 PSEP의 중간 프로세스에 대한 통찰력을 제공하고 무표지 전달을 가능하게 합니다. 이 기사에서는 PSEP 전달 실험과 TEEI 측정 분석을 동시에 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

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다공성 기판 전기천공법(PSEP)은 높은 처리량과 일관된 전달을 제공하는 새로운 전기천공법 방법입니다. 다른 많은 유형의 세포 내 전달과 마찬가지로 PSEP는 성공적인 전달을 결정하기 위해 형광 마커와 형광 현미경에 크게 의존합니다. 전기천공법 공정의 중간 단계에 대한 통찰력을 얻기 위해 경상피 전기 임피던스(TEEI) 모니터링이 통합된 PSEP 플랫폼이 개발되었습니다. 세포는 다공성 멤브레인이 있는 상업적으로 이용 가능한 삽입물에서 배양됩니다. 완전히 합류하는 세포 단층을 형성할 수 있도록 12시간의 배양 기간을 거친 후, 삽입체는 PSEP 장치의 웰에 위치한 transfection 매체에 배치됩니다. 그런 다음 셀 단층은 사용자 정의 파형을 받고 형광 현미경을 통해 전달 효율성을 확인합니다. 이 워크플로우는 PSEP 공정에 대한 추가 데이터를 수집하기 위해 펄스 현미경과 형광 현미경 간의 TEEI 측정을 통해 크게 향상될 수 있으며, 이 추가 TEEI 데이터는 전달 효율성 및 실행 가능성과 같은 전달 지표와 상관 관계가 있습니다. 이 문서에서는 TEEI 측정으로 PSEP를 수행하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

서론

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전기천공법은 세포를 전기장에 노출시켜 단백질, RNA 및 DNA를 포함한 화물이 1,2를 통과할 수 있는 세포막에 임시 기공을 만드는 기술입니다. 가장 널리 사용되는 버전은 벌크 전기 천공법(BEP)입니다. BEP는 수백만 개의 세포를 포함하는 전해질로 큐벳을 채우고, 전해질을 고전압에 노출시키고, 화물이 확산 또는 세포내이입(endocytosis)을 통해 세포로 들어갈 수 있도록 하여 수행됩니다1. BEP에는 높은 처리량과 수많은 상업적으로 이용 가능한 시스템을 포함하여 많은 이점이 있습니다. 그러나 BEP 전달에는 제한이 있습니다. 전극에 대한 일관되지 않은 셀 위치 및 인접 셀로부터의 전기장 차폐는 BEP 3,4 동안 전기장 노출에 상당한 변동성을 유발합니다. BEP에 필요한 고전압은 또한 세포 생존력에 상당한 부정적인 영향을 미친다5. 20116 년에 시작된 이래로 PSEP (porous substrate electroporation)라는 전기 천공법 방법에 대한 관심이 높아지고 있지만, 국소 전기 천공법 및 나노 또는 마이크로 전기 천공법 1,7,8을 포함한 다른 이름으로 불리기도 합니다. BEP의 세포 현탁액과 달리 PSEP는 다공성 기판에 부착된 세포에서 수행됩니다. 부착 상태는 인간 세포주(9)의 대다수에 대해 선호될 뿐만 아니라, 기질 내의 기공은 또한 전류에 초점을 맞추어, 세포막(10,11)의 특정 영역으로 막횡단 전위(TMP)를 국소화한다. 이러한 국소화를 통해 인가 전압을 크게 줄여 손상을 줄이며 세포 생존율을 높일 수 있습니다. 이러한 효과의 조합은 세포막 공극 발달을 제어하여 보다 일관되고 효율적인 전달을 가능하게 합니다 1,5,12.

최근 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 다공성 멤브레인 인서트(13)(그림 1A,B)를 고정하기 위한 6웰, 금도금 전극 어레이가 있는 PSEP 장치를 소개했으며, 이는 Vindis et al.14에 의해 처음 소개된 관행입니다. 이 장치는 펄스를 적용하고 경상피 전기 임피던스(TEEI)로 알려진 세포 단층 전체에 걸쳐 전기 임피던스를 실시간으로 측정할 수 있습니다13. 장치의 사용자 인터페이스를 통해 electroporation 파형 및 극성을 완벽하게 제어할 수 있습니다. 중요한 것은 실시간 임피던스 측정을 사용하여 값비싼 시약이나 형광 마커 없이도 전달 결과를 예측할 수 있다는 것인데, 이는 무표지 전달로 알려진 개념입니다15.

PSEP 플랫폼은 펄스 발생기 및 TEEI 측정 장비를 수용하는 장치 본체와 다공성 기판이 삽입되고 전기천공이 발생하는 전극 어레이의 두 가지 주요 맞춤형 전기 부품으로 구성됩니다. 모든 맞춤형 전자 장치 및 3D 프린팅 구성 요소에 대한 다이어그램은 GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI 에서 찾을 수 있습니다. 맞춤형 전자 장치 외에도 플랫폼이 제대로 작동하려면 컴퓨터도 필요합니다. 사용자 지정 소프트웨어를 사용하려면 MATLAB(버전 2021a 이상)을 실행하고 분석을 위해 데이터를 저장하고 액세스하려면 Microsoft Excel이 필요합니다. 이 프로그램은 맞춤형 전자 장치를 제어하고 설정 조정을 위한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공합니다. 이러한 프로그램은 GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI 에서도 사용할 수 있습니다.

예비 데이터에 따르면 이 과정은 다양한 유형의 부착 세포에 대해 가능하지만(그림 1C), 이 기사에서는 Brooks et al.13에 의해 이 세포주에 대해 최적으로 발견된 매개변수를 사용하여 A431 세포를 준비하는 방법에 대해서만 설명합니다. 또한 프로피듐 요오드화물(PI) 화물은 세포독성이 있기 때문에 두 가지 실험이 수행되는데, 첫 번째는 전달 효율성을 정량화하기 위해 고농도 PI transfection 배지를 사용하고, 두 번째는 장기간에 걸쳐 TEEI를 측정하기 위해 세포 배양 배지만 사용합니다. 이러한 실험은 동일한 전기천공법 파형을 사용하여 결과를 상호 연관시킬 수 있습니다(그림 1D).

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그림 1: 전극 어레이 조립 다이어그램 및 기본 데이터. (A) 전극 어레이의 웰 내부 인서트의 CAD 모델. (B) 전극 어레이의 CAD 모델. (C) 선택한 세포주에 대한 PSEP로 인한 임피던스 증가, 세포주당 n = 3. 오차 막대: 평균의 표준 오차입니다. (D) 배송 효율성 vs. TEEI는 상관 관계 데이터를 증가시킵니다. 전달 효율은 전달 실험의 PI 및 calcein 이미지에 라벨링된 세포의 수를 Hoechst로 식별된 총 세포 수로 나누어 계산했습니다. 셀 수는 맞춤형 CellProfiler 파이프라인(전압당 n = 6)을 사용하여 측정되었습니다. 오차 막대: (x축 및 y축) 평균의 표준 오차입니다. 이 그림은 Brooks et al.13 의 허가를 받아 복제한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

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연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 시약의 준비 및 세포 배양

  1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 500mL 용기에 소 태아 혈청(FBS) 50mL와 페니실린-스트렙토마이신 5mL를 추가하여 세포 배양 배지를 준비합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 50mL 부분 표본 11개를 생산하고 4°C에서 냉장 보관합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 인산염 완충 식염수(PBS) 원액에 1mL의 25μg/mL 인간 혈장 피브로넥틴을 생성합니다.
  3. DMEM 스톡 용액에 0.1mg/mL 프로피듐 요오드화물 15mL를 생성하여 다양한 화물 농도로 실험할 수 있습니다.
  4. 준비된 세포 배양 배지 12mL를 포함하는 T75 플라스크에서 A431 세포를 배양합니다. 세포는 50%의 밀도를 유지하기 위해 1-2일마다 통과시켰습니다.

2. 시료 전처리

  1. 피브로넥틴 코팅
    1. 12개의 인서트와 2개의 24웰 플레이트를 선택합니다. 인서트를 하나의 웰 플레이트에 놓고 6개씩 두 줄을 만듭니다. 두 번째 웰 플레이트는 나중으로 미뤄두십시오.
    2. 1.5mL 튜브에 52μL의 피브로넥틴 원액과 1,248μL의 PBS를 혼합하여 1,300μL의 1μg/mL 피브로넥틴 용액을 만듭니다.
    3. 100μL의 피브로넥틴 용액을 각 삽입물에 분배합니다. 37°C의 웰 플레이트에서 3시간 동안 인서트를 배양합니다.
  2. 세포 밀도 최적화를 위한 세포 농도 조정
    1. 피브로넥틴 배양이 완료되기 약 1시간 전에 세포 추출을 위해 인큐베이터에서 A431 세포의 T75 플라스크를 제거합니다.
    2. 흡입기로 플라스크의 매체를 제거하고 5mL의 PBS로 세척합니다. 같은 방식으로 PBS를 제거하고 트립신 3mL를 추가합니다. 플라스크의 측면을 두드려 세포를 완전히 분리하기 전에 3-4분 동안 배양합니다.
    3. 플라스크에 6mL의 세포 배양 배지를 추가하고 피펫으로 세게 혼합하여 남아 있는 세포를 분리하고 내용물을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 100 x g 및 20°C에서 5분 동안 원심분리기
    4. 흡인기기를 사용하여 원심분리기 튜브에서 세포 배양 배지와 트립신을 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다. 원심분리기 튜브에 1mL의 매체를 추가하고 피펫을 앞뒤로 (기포를 생성하지 않고) 세포 펠릿을 분해하고 세포를 재현탁시킵니다.
    5. 세포 현탁액 10μL, 세포 배양 배지 40μL, 트리판 블루 염료 50μL를 200μL 튜브에 넣고 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다.
    6. 염료 혼합물 10μL를 제거하고 혈구계에 주입합니다. 염료 혼합물의 10% 희석을 사용하여 세포 수를 계산하여 15mL 원심분리 튜브의 총 세포 수를 추정합니다.
      참고: 이 프로토콜의 경우 5,000,000cells/mL의 농도를 가정합니다.
    7. 원하는 seeding 밀도에 인서트 멤브레인의 표면적을 곱하고, 현탁액에서 계수된 cells/mL로 나누고, 1,000을 곱하여 인서트당 필요한 셀 현탁액의 마이크로리터를 계산합니다.
      1. 필요한 셀 현탁액의 총 수량을 찾으려면 이 수치에 10을 곱하고(12개의 인서트 중 3개는 셀이 없는 대조군이므로 9개의 샘플에 충분한 셀을 보장하기 위해) 가장 가까운 정수로 반올림합니다. 이 경우 이 실험에는 총 135μL의 셀 현탁액이 필요합니다.
    8. 이전에 계산한 135μL의 세포 현탁액과 1,865μL의 세포 배양 배지를 별도의 15mL 원심분리 튜브에 혼합하여 2,000μL의 조정된 세포 용액을 생성합니다.
  3. 세포 시딩
    1. 피브로넥틴 배양이 완료되면 각 삽입물에서 과도한 피브로넥틴을 제거합니다.
    2. 각 인서트에 100μL의 멸균 증류수를 추가하여 인서트를 두 번 세척합니다. 인서트 사이에 일관된 세척 시간을 보장하기 위해 첨가된 것과 동일한 순서에 따라 물을 제거하십시오.
    3. 각 인서트에 100μL 세포 배양 배지를 추가하여 인서트를 다시 세척합니다. 인서트 사이에 일관된 세척 시간을 보장하기 위해 추가된 순서와 동일한 순서에 따라 미디어를 제거합니다.
    4. 세포 시료 인서트
      1. 각 삽입물에 200μL의 조정된 세포 용액을 피펫팅하여 세포를 파종합니다. 인서트 간의 일관된 농도를 보장하려면 분배 전에 원심분리기 튜브에 세포 용액을 혼합하고 분배 후 각 인서트 내에서 다시 혼합하십시오.
    5. 네거티브 컨트롤 인서트
      1. 각 삽입물에 200μL의 세포 배양 배지를 피펫팅합니다. 세포 시료 삽입체와의 일관성을 유지하려면 피펫을 사용하여 각 삽입물 내에서 세포 배양 배지를 혼합하십시오.
  4. 라벨링 및 인큐베이션
    1. 영구 마커를 사용하여 두 번째 웰 플레이트를 세 개의 웰 너비(조건이 세 배로 실행되는 경우)인 두 개의 열로 나누는 선을 그립니다. 각 열을 행으로 구분합니다. 그리드의 각 영역에 관련 매개변수로 레이블을 지정합니다.
    2. 모든 웰에 1mL의 세포 배양 배지를 추가하여 실험용 삽입물을 받습니다. 준비 웰 플레이트의 인서트를 라벨링된 실험 웰 플레이트의 적절한 위치로 옮기고 37°C에서 최소 12시간 동안 배양합니다.

3. 실험 절차

  1. 납품 실험
    1. 0.1mg/mL PI 용액 1.5mL를 전극 배열의 각 웰에 피펫팅합니다. 인서트를 전극 배열의 각 웰에 배치하고 인서트의 다리를 정렬 홈에 끼워 인서트가 웰의 상부 표면과 같은 높이가 되도록 합니다(그림 1A, B).
    2. 상단 전극 인쇄 회로 기판(PCB)을 전극 어레이 웰 상단에 나사로 고정하고 전극 어레이를 PSEP 장치에 연결합니다.
    3. 온도가 평형을 이룰 수 있도록 37°C 인큐베이터에 전극 어레이를 최소 1시간 동안 놓습니다.
    4. GUI의 왼쪽 상단 모서리에 있는 "Membrane" 옆에 있는 드롭다운을 클릭하고 400nm GBO를 클릭합니다. "Electrolyte", "Cells", "Cell Seeding Density" 및 "Cell Duration"에 대해 이 단계를 반복하여 각각 DMEM, A431, 200 및 12를 선택합니다.
      알림: 이 값은 기록 보관 목적으로만 사용되며 장치 기능에는 영향을 미치지 않습니다. 올바른 데이터 추적을 위해 필요에 따라 이러한 값을 조정해야 합니다.
    5. GUI 오른쪽의 Post Pulse Time Duration (min) 편집 필드에 1을 입력하여 기본 포스트 펄스 측정 시간을 1분으로 변경합니다. 다른 모든 설정은 기본 상태로 둡니다.
      참고: 기본 펄스 매개변수는 30V, 20Hz, 1ms 기간 및 200펄스의 구형파를 생성합니다. 기본 TEEI 측정 매개변수는 0.5V 및 100Hz, 1,000Hz, 10,000Hz 및 100,000Hz입니다.
    6. Run 버튼을 클릭하고 메시지가 표시되면 웰 1-3 및 4-6에 대한 적절한 이름을 입력합니다. 확인을 클릭하여 실험을 시작합니다.
    7. 인큐베이터에서 전극 어레이를 제거하고 프로그램 실행이 완료되면 인서트를 실험 웰 플레이트의 원래 위치로 다시 옮깁니다.
    8. 200 μL 튜브에 2 μL의 Hoechst 33342와 5 μL의 calcein AM 123 μL를 섞습니다.
    9. 염색 용액 10μL를 각 포스트 펄스 인서트에 부드럽게 피펫팅하고 인서트를 5분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    10. 웰 플레이트를 5x 배율 대물렌즈가 있는 형광 현미경의 플레이트 홀더로 옮깁니다. 명시야와 각 염색의 형광을 사용한 이미지. 카메라를 작동시키기 전에 인서트를 대물렌즈 중앙에 놓으십시오.
      참고: PI, calcein AM 및 Hoechst 33342의 여기 파장은 각각 558nm, 495nm 및 353nm입니다. 방출 파장은 각각 575nm, 519nm 및 465nm입니다.
  2. TEEI 측정 실험
    1. 세포 배양 배지 1.5mL를 전극 배열의 각 웰에 피펫팅합니다. 세포 시료 삽입물을 웰 1-3에 넣고 제어 삽입물을 웰 4-6에 배치하여 삽입물의 다리를 정렬 홈에 끼워 삽입물이 웰의 상부 표면과 같은 높이가 되도록 합니다.
    2. 상단 전극 PCB를 전극 어레이 웰 상단에 나사로 고정하고 전극 어레이를 PSEP 장치에 연결합니다.
    3. 온도가 평형을 이룰 수 있도록 37°C 인큐베이터에 전극 어레이를 최소 1시간 동안 놓습니다.
    4. GUI의 왼쪽 상단 모서리에 있는 "Membrane" 옆에 있는 드롭다운을 클릭하고 400nm GBO를 클릭합니다. "Electrolyte", "Cells", "Cell Seeding Density" 및 "Cell Duration"에 대해 이 단계를 반복하여 각각 DMEM, A431, 200 및 12를 선택합니다.
      알림: 이 값은 기록 보관 목적으로만 사용되며 장치 기능에는 영향을 미치지 않습니다. 올바른 데이터 추적을 위해 필요에 따라 이러한 값을 조정해야 합니다.
    5. 나머지 모든 설정은 기본 상태로 둡니다.
      참고: 기본 펄스 매개변수는 30V, 20Hz, 1ms 기간 및 200펄스의 구형파를 생성합니다. 기본 TEEI 측정 매개변수는 0.5V 및 100Hz, 1,000Hz, 10,000Hz 및 100,000Hz입니다.
    6. Run 버튼을 클릭하고 메시지가 표시되면 웰 1-3 및 4-6에 대한 적절한 이름을 입력합니다. 확인을 클릭하여 실험을 시작합니다.
    7. 인큐베이터에서 전극 어레이를 제거하고 프로그램 실행이 완료되면 인서트를 실험 웰 플레이트의 원래 위치로 다시 옮깁니다.
    8. 200 μL 반응 튜브에서 2 μL의 Hoechst 33342, 5 μL의 calcein AM 및 10 μL의 PI를 113 μL의 세포 배양 배지와 혼합합니다.
    9. 염색 용액 10μL를 각 포스트 펄스 인서트에 피펫팅하고 인서트를 5분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    10. 웰 플레이트를 5x 대물렌즈가 있는 형광 이미징 현미경의 플레이트 홀더로 옮깁니다. 명시야와 각 염색의 형광을 사용한 이미지. 카메라를 작동시키기 전에 인서트를 렌즈 중앙에 놓으십시오.
      참고: PI, calcein AM 및 Hoechst 33342의 여기 파장은 각각 558nm, 495nm 및 353nm입니다. 방출 파장은 각각 575nm, 519nm 및 465nm입니다.

4. 데이터 분석

  1. CellProfiler 파이프라인을 사용한 이미지 데이터 분석
    1. GitHub(https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI)에서 제공하는 사용자 지정 CellProfiler 워크플로우를 사용하여 전달 및 TEEI 측정 실험 이미지를 처리합니다.
  2. TEEI 분석
    1. GUI에서 Analysis(분석 ) 탭을 클릭합니다.
    2. GUI 하단의 임피던스 유형 표시기 를 TEEI로 전환합니다.
    3. 왼쪽 상단 상자의 화살표를 클릭하여 데이터 파일의 모든 실험 이름을 표시합니다. TEEI 측정 실험에서 모든 세포 샘플 데이터를 선택합니다.
    4. 오른쪽에 있는 다음 상자의 화살표를 클릭하여 데이터 파일의 모든 실험 이름을 표시합니다. TEEI 측정에서 모든 제어 삽입 데이터를 선택합니다.
    5. 실행을 클릭합니다. 가장 낮은 측정 빈도에서 선택된 셀 샘플 데이터를 포함하는 기본 그림이 나타납니다.
    6. GUI의 오른쪽에 있는 샘플 옵션 상자에서 화살표를 클릭하여 선택한 모든 삽입 데이터를 표시합니다. 이상값은 적절한 데이터를 선택하고 아래의 제거 를 클릭하여 제거할 수 있습니다.
      참고: 제거 버튼의 마지막 클릭으로 해석에서 제거된 모든 데이터는 실행 취소 버튼으로 검색할 수 있습니다.
    7. 완료를 클릭하여 원하는 데이터가 그림에 표시될 때 다음 그림으로 이동합니다.
    8. 나머지 셀 표본 데이터와 제어 데이터에 대해 4.2.6단계와 4.2.7단계를 반복합니다. "완료"를 클릭하여 최종 데이터 세트가 확인되면 전체 분석 수치가 나타납니다.
    9. 해석 Figure를 저장합니다.

결과

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주어진 프로토콜은 TEEI 측정을 사용하여 전기천공법의 중간 프로세스를 검사하고 특히 A431 세포주 및 PI 화물에 대한 배송 예측을 수행하는 방법을 설정합니다. 이 프로토콜의 수정은 이 기사에서 더 자세히 논의되지만 특정 값은 변경될 수 있지만 응답의 일반적인 추세는 일관되게 유지된다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, 초기 기준선 아래로 떨어지는 TEEI 데이터는 세포 사멸에 해당하고, 최소값을 초과하는 TEEI 값의 최대 증가는 전달 효율13에 해당합니다. 이러한 일반적인 추세와 그 의미는 아래에서 살펴봅니다.

그림 2A에서 볼 수 있듯이 PSEP 플랫폼을 사용하는 동안 다양한 TEEI 측정 및 세포 이미징 추세가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜의 이상적인 결과는 그림 2Ai에 표시된 최적화된 정상 데이터와 유사한 곡선을 생성하는 것입니다. 이는 기준선 이하로 떨어지지 않기 때문에 이상적인 결과로 특징지어지며, 이는 세포 사멸이 거의 없음을 나타냅니다. 또한, 최적화된 건강 곡선은 TEEI가 최소값에서 가장 크게 증가하여 높은 수준의 전달 효율성을 나타냅니다13. 이러한 추론은 세포 단층의 PSEP 후 이미징에 의해 뒷받침되며, 이는 무시할 수 있는 세포 사멸과 건강하고 완전히 합류하는 세포 단층을 보여줍니다(그림 2Aiii). 또한, 동일한 PSEP 파형을 사용한 성공적인 전달 실험은 그림 2B에 표시된 이미지로 특성화할 수 있습니다. 적절한 electroporation 파형 적용 및 화물 농도는 높은 수준의 배송 일관성과 셀 생존력을 제공합니다.

세포 단층의 건강 및 밀도는 TEEI 기반 전달 예측의 성공적인 적용에 매우 중요합니다16,17. 최적화된 파형을 사용하더라도 비정상적이거나 불완전한 세포 단층은 그림 2Aii의 최적화된 비정상 데이터에서 볼 수 있듯이 TEEI 반응을 감소시킵니다. 그러나 이 결과에 대한 이미지(그림 2Avi)는 여전히 Brooks et al.13이 제공한 TEEI 응답의 해석과 일치합니다. 기준선 아래로 내려가지 않았으며, 이는 세포 사멸이 거의 0에 가깝다는 것을 나타냅니다(그림 2C,D). 또한, 최소값에서 감소된 증가는 단층의 더 적은 셀이 총 PI 전달을 감소시키기 때문에 전달 효율성에 부정적인 영향을 미칩니다(그림 2C, D).

최적화되지 않은 파형이 적용되면 TEEI 응답이 훨씬 더 크게 감소할 수 있습니다. 총 에너지와 에너지가 적용되는 기간에 따라 최적화되지 않은 파형은 효율 감소에서 셀 단층의 거의 완전한 소멸에 이르는 결과를 생성할 수 있습니다(그림 2Ai,iii,v). 최적화되지 않은 곡선과 매우 최적화되지 않은 곡선 모두 기준선에서 상당한 감소를 보이며, 이는 상당한 세포 사멸을 나타냅니다. 그러나 점점 더 최적화되지 않는 파형은 세포 회수를 방해하여 전달 효율성을 감소시킵니다.

전달 효율은 전달 실험의 PI 및 calcein 이미지에 라벨링된 세포의 수를 Hoechst로 식별된 총 세포 수로 나누어 계산했습니다. 사멸은 TEEI 측정 실험에서 PI로 표시된 세포를 Hoechst로 식별된 총 세포 수로 나누어 계산했습니다. 셀 수는 두 지표 모두에 대해 사용자 지정 CellProfiler 파이프라인을 사용하여 결정되었습니다.

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그림 2: 일반적인 조건에 대한 TEEI 응답 곡선 및 이미징. (A) (i) 최적화 및 최적화되지 않은 조건에 대한 TEEI 변화율을 보여주는 TEEI 응답 데이터. (ii) 최적화된 파형 조건에서 정상 및 비정상 단층 간의 TEEI 응답 비교. (III-V) 세포 사멸(빨간색) 및 살아있는 세포(녹색)를 보여주는 최적화된 파형 및 최적화되지 않은 파형 조건에 대한 잠재적 결과의 대표 이미징. (vi) 세포 사멸(빨간색), 살아있는 세포(녹색)를 보여주는 최적화된 파형 조건을 적용한 후 건강하지 않은 단층의 대표적인 이미징. (B) 성공적인 PI 전달(빨간색), 살아있는 세포(녹색) 및 핵 위치(파란색)를 보여주는 이미지. 선명도를 위해 모든 이미지가 밝아졌습니다. 스케일 바: 1000 μm. (C) 주어진 전압에 대해 TEEI가 PSEP 이전 기준선에서 PSEP 후 최소 값으로 감소하고 PSEP 이후 최소 피크에서 PSEP 이후 피크로 증가합니다. (D) 주어진 전압에 대한 전달 효율 및 세포 사멸 비율. 오차 막대는 SEM(n = 6)을 나타냅니다. (C,D)는 Brooks et al.13의 허가를 받아 복제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 2C 는 TEEI가 각 PSEP 파형 전압에 대해 최소값에서 증가하고 기준선에서 감소하는 것을 보여줍니다. TEEI 증가는 감소하기 전에 약 20볼트에서 최고조에 달하는 포물선 아크를 생성하는 반면, 기준선에서 TEEI 감소는 전압이 증가함에 따라 기하급수적으로 증가합니다. 그림 2D 의 전달 효율 및 소멸 비율은 이러한 추세를 반영하며, 전달 효율은 포물선 모양으로 호를 그리며 약 30V에서 최고조에 이르고 파형 전압이 증가함에 따라 사망이 기하급수적으로 증가합니다.

TEEI 증가를 일으키는 기본 메커니즘에 대한 한 가지 가설은 음전하를 띤 기판 마이크로 채널을 통한 전기 삼투이며, 이는 전기장18,19의 적용으로 인해 발생하는 현상입니다. TEEI 응답이 전기천공법(20)에서 발생하는 것으로 알려진 요인인 전기삼투압 유체 흐름으로 인한 세포 팽윤으로 인한 기계적 자극에 의한 것이든, 파형 자체의 전기적 자극에 의한 것이든, 전기천공법에 필요한 세포막을 가로지르는 적절한 전압 강하를 달성하는 데 단층의 건강과 완성도가 가장 중요하다는 것은 분명하다. 이러한 이유로 이 방법에서 가장 중요한 단계는 세포 파종과 관련된 단계이며 적절한 세포 단층 형성을 보장하는 단계입니다. 이는 세포 단층을 이미징하고 기준선 TEEI 값으로 확인할 수 있습니다. A431 세포의 경우 평균 TEEI는 약 7 Ω·cm²인 반면, HEK293T 세포는 평균 5 Ω·cm²로 약간 낮은데(그림 2Aii), 이는 세포-세포 접합 면적의 차이를 유발하는 형태학적 차이로 인한 것으로 보입니다.

다공성 기판 전기천공에 필요한 전기장으로 인해 전기분해가 발생하여 전극이 부식됩니다(12,21). 이것은 이 실험에서 양전하를 띤 PI를 전달하기 위해 양전하를 띤 바닥 전극에서 특히 분명했습니다. 실험을 통해 하단 PCB를 약 20번 사용할 수 있으며 심각한 부정적인 영향으로 교체가 필요하기13번이 확인되었습니다. 재사용을 위해 전극 어레이를 세척하려면 흡입기를 사용하여 챔버에서 남아 있는 세포 배양 또는 transfection 배지를 제거합니다. 각 챔버의 3/4을 70% 에탄올로 채우고 상단 전극 PCB를 전극 어레이에 배치하여 상단 전극이 잠기도록 합니다. 에탄올을 제거하고 전극 어레이를 건조시키기 위해 따로 보관하기 전에 전극 어레이에 에탄올을 최소 10분 동안 그대로 두십시오.

기판을 제거하고, 삽입물을 멸균하고, 기판을 다른 출처에서 가져온 것으로 교체하여 구입한 인서트를 재사용할 수 있습니다. 공극 밀도와 직경이 동일한 6웰 인서트가 시판되고 있으며 4개의 24웰 인서트 크기의 교체용 기판을 수확하는 데 사용할 수 있습니다. 이전에 사용한 인서트가 멸균되면 새 페트리 접시에 10μL의 자외선 경화 에폭시를 추가합니다. 인서트의 기판 쪽을 에폭시 풀에 담궈 바닥 표면을 코팅하고 인서트의 구멍 위에 새 기판을 조심스럽게 놓습니다. 연결부에 틈이 없는지 확인하기 위해 에폭시가 완전한 고리를 만드는지 육안으로 확인합니다. UV 광선 아래에서 30초 동안 경화하고 재사용하기 전에 새 기판이 손상되지 않도록 리퍼브 인서트를 깨끗한 24웰 플레이트에 보관합니다.

앞서 언급한 바와 같이, 관찰된 TEEI 증가가 여러 세포 유형에서 발생할 것이라는 가설이 세워졌지만, 이는 부착 세포인 A431 및 HEK293T 세포주13 (그림 1C)에서만 입증되었습니다. 이 방법은 다른 공극 특성을 가진 막을 선택하거나, 농도를 조정하여 피브로넥틴 코팅을 다른 세포외 기질 단백질로 대체하거나, 화물을 변경하여 수정할 수 있습니다. 그러나 실험 설정이 변경된 경우 파형을 다시 최적화해야 할 수 있습니다. 파형을 최적화하기 위해 3개의 샘플로 구성된 각 그룹 간에 전압과 같은 파형 파라미터를 하나만 변경하는 TEEI 측정 실험을 수행할 수 있습니다. 최소 9개의 건강한 샘플에서 TEEI의 가장 큰 증가를 식별하여 최적의 전압을 선택합니다. 각 파형 파라미터에 대해 이 프로세스를 반복하고 다음 파라미터로 이동할 때 새로 최적화된 값을 사용합니다. 파형 파라미터에 대한 여러 로컬 최적이 있을 수 있음을 기억하십시오(즉, 한 펄스 지속 시간에 대한 최적 전압이 다른 펄스 지속 시간에 대한 최적 전압이 아닐 수 있음 등).

다공성 기판 전기천공법의 이점은 광범위합니다. 다른 세포 내 전달 방법은 상당한 기간 동안 존재해 왔지만, PSEP가 1,13을 보유할 만큼 높은 처리량과 높은 수준의 제어를 결합한 방법은 거의 없습니다. 또한 플랫폼의 TEEI 측정 사용은 electroporation 프로세스의 중간 단계를 엿볼 수 있도록 합니다. TEEI 판독은 셀의 상태를 알려주고, 전기천공법 파라미터의 선택을 안내하며, 특정 셀의 거동 및 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공합니다13,17. TEEI 측정을 통해 플랫폼은 또한 무표지 전달(label-free delivery)13이 가능하며, 이를 통해 실험을 수행할 때마다 값비싼 바이오마커 및 시약의 필요성을 줄여 신속한 최적화가 가능합니다. 세포 내 전달 분야에 대한 이러한 기여는 이 제품을 기초 생물학 연구 및 생물 의학 응용 분야를 위한 전달 플랫폼으로 주요 후보로 만듭니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) 및 P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), Nebraska Collaborative Initiative 및 Voelte-Keegan Bioengineering Support의 자금 지원을 인정합니다. 이 장치는 네브래스카 연구 이니셔티브(Nebraska Research Initiative)에서 부분적으로 자금을 지원하는 NERCF(NanoEngineering Research Core Facility)에서 제조되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL 원추형 원심분리기 튜브Thermo Scientific339651
2칩 일회용 혈구계Bulldog BioDHC-N01
75 cm2 조직 배양 플라스크fisherbrandFB012937
A431 세포ATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛LabgardNU-543-600
사용자 정의 구성 요소YangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
일회용 원심 분리기 튜브 (50mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
소 태아 혈청GibcoA5670401
유체 흡인 시스템vacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
인간 플라즈마 FibronectinSigma-AldrichFIBRP-RO
도립 형광 현미경Zeiss491916-0001-000
도립 현미경LabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
PCR 튜브 200 &마이크로; LSarstedt72.737
페니실린 / 스트렙토마이신Gibco15140148
피펫 (0.2-2 µ L)fisherbrand EliteFBE00002
피펫 (100-1000 &마이크로; L)fisherbrand EliteFBE01000
피펫 (20-200 &마이크로; L)fisherbrand EliteFBE00200
피펫 (2-20 &마이크로; L)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
Reaction Tube 1.5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R 원심분리기Thermo Scientific75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410.4 & 마이크로; M 기공 직경, 2x106 cm-2 기공 밀도, 투명 PET
조직 배양 플레이트(24-well)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
트립신Gibco15090046

참고문헌

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