Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

요약

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

초록

면역 대사는 리슈만편모충증의 진행에서 중추적인 결정 요인입니다. 합성생물학 기반 접근법은 리슈만편모충증을 유발하는 숙주 관련 요인을 표적으로 하는 치료적 개입을 향한 단계로 상당한 주목을 받고 있습니다. 합성생물학은 생물학적 시스템을 정밀하게 조절하고 세포에 새로운 기능을 부여하기 위해 직교하고 모듈화된 방식으로 유전 구성 요소를 엔지니어링하는 것을 수반합니다. 제시된 연구에서는 유도성 테트라사이클린 제어(TetON) 기반 합성 회로 개발을 위한 체계적인 파이프라인을 규명하는 것을 목표로 했으며, 세포 내 리슈마니아 기생충 제거를 촉진하기 위한 치료제로 석시네이트 탈수소효소를 전달하는 것을 목표로 했습니다. 개요된 프로토콜은 합성 회로의 설계와 후속 검증을 설명합니다. 제안된 전략은 또한 플라스미드 백본(plasmid backbone)에 합성 회로를 전달 수단(delivery vehicle)으로 통합하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 또한, 합성 회로의 전달을 위해 폴리플렉스 기반 나노 입자를 사용하는 전달 기계는 세포 형태를 손상시키지 않고 쥐 대식세포 세포주에 사용되었습니다. 형질주입된 세포를 선택하고 합성 회로 발현을 위한 최적의 유도 농도를 결정하기 위해 방법의 표준화를 수행했습니다. 관찰 결과, 감염된 세포에 비해 transfection된 세포의 세포 내 기생충 부담이 뚜렷하게 감소한 것으로 나타났습니다. 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)은 기생충 제거를 촉진하기 위한 기전으로 합성 회로 transfection되고 유도된 세포에서 감염 후 발현되었습니다. 이는 합성생물학 기반 방법이 질병 진행과 관련된 숙주 요인을 표적으로 삼아 리슈마니아증에 대한 강력한 접근 방식임을 강조합니다.

서론

전체론적 통합 의학의 발전은 면역 세포의 대사 변화와 감염성 질환에서 면역 세포 표현형을 조절하는 능력 사이에 확인된 중요한 연결 고리입니다. 면역 대사는 인간에게 널리 퍼진 전염병의 발병 기전을 밝히기 위한 새로운 관점을 제공합니다. 또한, 중재를 위한 새로운 표적을 식별함으로써 백신 및 약물 개발을 위한 유망한 기술을 제공합니다¹. 면역 세포의 대사 재프로그래밍은 리슈마니아증을 포함한 다양한 감염성 질환에서 확인됩니다. 리슈마니아 종 리슈마니아증을 일으키는 원인이 되며, 그 중 리슈마니아 메이저 (L. major)는 피부 리슈마니아증(CL)을 유발합니다. L. 주요 기생충은 세포 내 기생충으로서 증식과 생존을 위해 숙주 세포, 특히 대식세포의 대사에 상당한 영향을 미친다². 대식세포는 일반적으로 M1 세포가 높은 전염증성 사이토카인 분비 및 질소 종의 대사를 통해 산화질소(NO) 생성을 갖는 고전적 활성화(M1) 또는 대안적으로 활성화된(M2) 부분집합으로 분극될 수 있습니다. M2 세포는 항염증성 사이토카인 수치가 높아지고 질소 대사를 통해 높은 아르기나아제 활성을 나타낸다³. 따라서 두 표현형 모두 면역 반응뿐만 아니라 대사 경로에서도 다릅니다.

리슈마니아증의 시스템 생물학은 약물 설계 및 개발을 통해 새로운 치료법을 설계하기 위한 분자 표적을 식별하는 것을 목표로 합니다. 신호 전달 네트워크 및 대사 경로의 재구성은 리슈만편모충증을 전체론적 모델로 이해하는 데 도움이 되며 질병 상태를 주도하는 주요 구성 요소를 식별하기 위한 통찰력을 도출합니다. 수학적 모델링은 리슈만편모충증⁴의 복잡성을 이해하기 위해 가장 선호되는 응용 분석 접근법 중 하나입니다. 면역대사 네트워크 및 수학적 모델을 통해 기생충을 제거하기 위해 발현되는 M1 표현형의 핵심 구성 요소인 석시네이트 탈수소효소(SDHA)를 식별할 수 있었다⁵. 합성생물학은 리슈만편모충증의 진단, 백신 개발 및 치료제에 응용되고 있습니다. 면역 반응 조절을 목표로 하는 신진대사는 합성생물학 도구를 통해 달성할 수 있습니다. 스핑고지질 대사를 조절하고 숙주 면역 신호 전달을 변경하는 이노시톨 포스포릴 세라마이드 합성효소의 조절을 위해 쌍안정 행동을 가진 유전 회로를 사용하여 L. 주요 감염 모델 ^6,7의 내재적 견고성을 종합적으로 조정했습니다. 따라서 시스템 및 합성생물학은 리슈마니아 모델 시스템에서 정밀 의학 개발을 위한 모델 기반 유전 공학 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

M1 표현형은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)과 대사 경로(metabolic pathway)의 생성이 시너지 효과를 발휘하여 기생충 제거를 향상시키는 면역 대사 신호 네트워크의 발현으로 표시됩니다. M1 분극은 인터루킨-12(IL-12), 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양괴사인자 알파(TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 의미합니다. M1 표현형에서 고도로 농축된 대사 경로에는 해당과정(glycolysis), 펜토스 인산염 경로(pentose phosphate pathway) 및 truncated tricarboxylic acid cycle(TCA ^cycle)이 포함됩니다5. 잘린 TCA 사이클은 증가된 숙시네이트 및 시트레이트 수치를 통해 기생충 제거 기계를 지시하며, 이는 NO³의 생산을 안내합니다. SDHA에 의한 숙시네이트의 축적은 전사 인자 저산소증 유발 인자 1-알파(HIF-1α)의 활성화를 유도하여 IL-1β⁸의 생성을 유도합니다. M2 표현형에서는 인터루킨-10(IL-10), 형질전환성장인자베타(TGF-β), 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13⁾³과 같은 항염증성 사이토카인의 생성과 함께 지방산 산화, 글루타민 이용 증가 및 포도당의 산화적 인산화 향상이 관찰됩니다. M2는 길쭉한 미토콘드리아를 특징적으로 나타내어 에너지 생성 효율성을 향상시킵니다. 그들은 지방산, 포도당 및 글루타민을 기질로 사용하여 TCA 회로에 연료를 공급함으로써 더 빠른 속도로 산화적 인산화를 통해 ATP를 생성하여 기생충 성장과 증식을 촉진합니다⁹. truncated TCA를 통한 숙시네이트 축적을 담당하는 SDHA 효소는 NO 생성을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 전자 수송을 통해 석시네이트 의존성 산소 소비를 시작할 수 있다¹⁰. 리슈마니아에 감염된 대식세포에서 SDHA는 2.17배 하향 조절되며, 이는 호기성 호흡도 하향 조절될 수 있음을 시사한다¹¹. 석시네이트 섭취를 늘려 전염증성 사이토카인 매개 NO 생성을 유도하고 기생충 제거를 촉진하기 위해서는 SDHA의 발현이 필수적입니다.

합성 회로는 시공간 수준에서 건강한 표현형을 복원할 수 있는 쌍안정 진동을 달성하기 위해 질병 시스템을 변경할 수 있는 정밀 표적 요법을 제공합니다. 합성 회로 전달 및 표현은 시스템을 역동적이고 견고하게 만듭니다. 합성생물학의 발전에 기여하는 한 가지 중추적인 요인은 유전적 부분과 요소를 모듈식으로 조립하여 복잡한 아키텍처와 맞춤형 기능을 생성할 수 있는 능력에 있습니다¹². 전통적인 발현 기법과 관련된 제약으로 인해 테트라사이클린 오페론 기반 유도 플라스미드 합성 회로의 출현이 촉진되었으며, 이에 따라 플라스미드를 신속하게 평가하고 다양한 세포 유형에 걸쳐 쉽게 전달할 수 있게 되었습니다¹³. 테트라사이클린 반응성 억제자(TetR) 단백질은 이량체로 존재할 때 테트 오페론(TetO)에 강한 결합 친화력을 나타내어 전사를 효과적으로 억제합니다. 그러나 리간드인 독시사이클린(dox)의 상호 작용에 따라 TetR은 구조적 변화를 겪어 TetO에서 분리되어 결과적으로 전사가 방해받지 않고 진행될 수 있습니다. 이 회로는 단백질 번역 제어¹⁴를 나타낼 수 있다. 따라서, 정의된 방법론을 통해, 설계된 테트라사이클린 오페론 기반 유도 플라스미드 합성회로를 통해 pEGFP-N1 벡터에서 SDHA를 발현할 수 있게 되었습니다. 회로의 변환 효율성과 수율에 대한 평가는 납품 능력에 대한 통찰력을 제공했습니다. 벡터의 제한 분해를 통해, 클로닝 효율의 측정이 확인되었습니다. 또한, Balb/c 마우스의 복막 대식세포에서 유래한 형질주입된 RAW264.7 마우스 대식세포 세포주가 형질주입된 세포에서 독시사이클린 용량 의존성 녹색 형광 단백질(GFP) 발현에 대해 관찰되었습니다. 또한, 형질주입된 세포에서의 기생충 제거 효과는 합성 회로의 발현으로 확증되었습니다. 또한, 전염증성 사이토카인의 유도 및 발현이 관찰되었는데, 이는 합성 회로의 기능과 직접적인 관련이 있는 합성 회로 transfected 및 유도 세포의 감염 시점 증가를 통해 지시되었습니다.

프로토콜

1. RAW264.7 세포의 세포 배양

참고: 실험을 위해 낮은 구절 번호를 사용하십시오. RAW264.7 세포주는 푸네에 있는 BRIC-NCCS(National Centre for Cell Sciences)의 Biotechnology Research Innovation Council-National Centre of Biotechnology Research Innovation Council의 National Cell repository에서 조달했습니다. RAW264.7 세포주는 대식세포 세포주이므로 통로가 증가함에 따라 분화를 시작할 수 있습니다. 세포를 되살린 후 2회 통과 후 세포주를 transfection에 사용합니다.

1. RAW264.7 세포주의 5 x 10⁵ 세포를 25cm² 플라스크에 넣고 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 100 I.U./mL 페니실린을 완전한 배지로 사용하여 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 5mL를 주입합니다.
2. 90 % 밀도가 달성 될 때까지 37 ° C에서 5 % CO₂ 인 인큐베이터에서 성장 및 증식을 위해 세포를 보관하십시오.
3. 매체를 버리고 3x 인산염 완충 식염수(PBS)로 1번 세척합니다. 플라스크에 PBS 1mL를 넣고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어낸 다음 1.5mL 튜브에 세포를 수집합니다.
4. 24°C에서 5분 동안 300 x g 에서 세포를 원심분리하고 1mL의 DMEM complete medium에 1mL 피펫을 사용하여 펠릿을 재현탁시킵니다.
5. 0.5% 트리판 블루를 사용하여 세포 계수 챔버의 세포 수를 세어 살아있는 세포의 비율을 확인합니다.

2. L. major parasite의 세포 배양

참고: L. major promastigotes(MHOM/Su73/5ASKH)는 BRIC-NCCS의 선물입니다. Promastigotes는 통로 번호가 10 미만이어야 합니다. 통로 수가 낮을수록 기생충이 건강하고 대식세포를 감염시키는 능력이 더 높다는 것을 보장합니다.

1. 완전한 배지로 20% FBS가 보충된 Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI)에서 L. major promastigotes(MHOM/Su73/5ASKH)를 성장시킵니다.
2. 5mL의 완전한 배지가 들어있는 통풍이 잘되지 않는 25cm² 플라스크에 1 x 10⁶ promastigotes를 뿌립니다. 플라스크를 27°C에서 5일 동안 배양하고 명시야 현미경으로 20x에서 고정기 promastigote L. major parasite를 관찰합니다.
   참고: 고정상 promastigotes는 배양 후 4-7일 이내에 달성할 수 있습니다. 그들은 길쭉한 편모 상태와 감소된 운동성을 특징으로 합니다.

3. plasmid에서 delivery vector로 synthetic circuit 설계

1. 합성 회로의 부품 설계
   1. Tinker cell 소프트웨어를 열고 부품 탭으로 이동합니다. 라이브러리에서 Promoter 구성 요소를 선택하고 캔버스에 배치하여 합성 회로 내의 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 기호화합니다. Parts 탭에서 TetO와 유사한 repressor binding site를 검색하고 캔버스의 promoter에 인접하게 배치하여 CMV promoter와 원활하게 통합합니다.
   2. 테트라사이클린 연산자(TetO), 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 코딩 영역을 억제 결합 부위, 리보솜 결합 부위(rbs) 및 코딩 영역을 캔버스에 드래그 앤 드롭하여 기존 유전 구성 요소와 통합합니다.
   3. 코딩 영역의 이름을 TetR로 바꾸고, 이는 합성 회로 내에서 추정되는 음성 조절자로 기능하는 테트라사이클린 반응성 억제제를 나타냅니다. 합성 부품의 구성을 용이하게 하기 위해 이러한 유전 요소를 병합하십시오.
   4. 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A)와 같은 세포 단백질 분해 효소에 의해 절단될 수 있도록 설계된 스페이서 영역(sd1)을 캔버스에 통합합니다. 관심 유전자를 나타내는 추가 코딩 영역을 도입하고 SDHA로 라벨링하여 합성 구조에 연결하고 다른 요소와 통합합니다.
   5. SDHA 코딩 영역에 인접하여, 세포 단백질 분해 효소 P2A에 의해 절단 가능한 다른 단백질 분해 효소 절단 가능 스페이서 영역(sd2)을 통합한다. 리포터 유전자를 나타내는 코딩 영역을 도입하고 이를 GFP로 구조체에 레이블링합니다.
      참고: GFP 발현은 SDHA의 생산에 대한 추정치를 제공하고 합성 회로가 논리적 기능(¹³)을 갖는지 확인할 수 있습니다.
   6. GFP 옆에 터미네이터(ter1)를 추가하고 모든 부품이 연결되어 있는지 확인하여 조립된 부품을 확인합니다. 회로는 부품을 클릭할 때 빨간색으로 나타나야 합니다. 이것은 기능적 유전 회로의 형성을 확인합니다.
   7. Reaction 탭에서 단백질 생산을 위한 파라미터 및 초기 값을 포함하는 조절 속도를 TetR, SDHA 및 GFP에 할당하여 합성 회로 내의 translation 반응을 설명합니다.
   8. Parts 탭에서 작은 분자를 추가하고, 이름을 Doxycycline (dox)로 지정하고, Parts and Connection 탭에서 Input 을 선택한 다음 Wave Input을 클릭하여 파동 함수를 할당합니다.
   9. Regulation(규정 ) 탭에서 Repression Reaction(억압 반응)을 클릭합니다. 캔버스의 Reaction Rate 를 dox와 TetR 사이로 끌어다 놓습니다. dox에서 Wave Function 아이콘을 두 번 클릭하고 Doxyxycline.sin.amplitude 를 10으로 조정하여 dox와 TetR 사이의 반응 역학을 설정합니다.
   10. Regulation 탭에서 반응을 선택하고 TetR과 TetO 사이의 캔버스에 배치하여 TetR 단백질과 억제 인자 결합 부위 사이의 전사 조절 반응을 구현합니다.
   11. 각 성분과 반응을 두 번 클릭하여 시뮬레이션을 위한 초기 농도와 매개변수를 설정합니다. Simulation( 시뮬레이션)을 클릭하고 Deterministic(결정론적 )을 선택한 다음 100개의 시간 단위에 대해 회로를 시뮬레이션합니다. 그래프와 함께 나타나는 제어판에서 시뮬레이션 그래프를 조정하고 SDHA 및 TetR 단백질에 대한 그래프 패턴을 관찰합니다.
2. iGEM 부품 레지스트리에서 유전자 구성 요소 식별
   1. Registry of Standard Biological parts (Table of Materials)를 열고 Search(검색)를 클릭합니다. 유전적 구성 요소의 이름(예: CMV promoter)을 입력합니다.
      알림: 합성 회로의 모든 유전 구성 요소에 대해 iGEM ID를 검색하는 프로세스를 수행해야 합니다. CMV 프로모터의 iGEM ID를 식별하는 단계가 나열됩니다. 그런 다음 다른 구성 요소에 대해 단계를 반복해야 합니다.
   2. CMV 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 얻으려면 Get Part Sequence 옵션을 클릭하고 파일을 텍스트 파일로 저장합니다.
      참고: 모든 유전 부분의 재고를 사용할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
   3. SDHA를 제외한 모든 유전자 부분(테트라사이클린 조작자, Kozak 서열, TetR, P2A 및 GFP)에 대해 3.2.1단계 및 3.2.2단계를 반복합니다.
   4. SDHA의 단백질 코딩 염기서열을 얻으려면 NCBI를 열고 검색 창 옆의 드롭다운에서 뉴클레오티드 를 선택합니다. Succinate dehydrogenase 및 Mus musculus 를 입력하고 뉴클레오티드 서열을 검색합니다.
   5. CDS 옵션을 클릭하여 SDHA의 코딩 시퀀스를 가져오고 시퀀스를 텍스트 파일에 저장합니다.
   6. 모든 유전적 조절 부분의 뉴클레오티드 염기서열을 하나의 파일에 순차적으로 병합합니다. Kozak 염기서열 바로 뒤에 시작 코돈(ATG)을 추가하고 초기 폴리펩티드의 형성을 피하기 위해 내부 정지 코돈을 제거합니다.
   7. ExPASy 웹 사이트¹⁵ 를 열고 뉴클레오티드 염기서열을 붙여넣습니다. Translate the Sequence 옵션을 클릭합니다. 5'3' 프레임 1 을 선택하고 결과 섹션에서 빨간색으로 강조 표시되는 정지 코돈을 제거합니다.
      주의: 뉴클레오티드 서열이 원하는 폴리펩티드 서열로 효과적으로 번역되고 있는지 확인하기 위해 ExPASy와 같은 번역 도구를 사용할 수 있습니다. 이를 통해 원치 않는 초기 폴리펩티드를 예방할 수 있습니다. CMV 프로모터 및 GFP 유전자가 벡터 내에 이미 존재하고 있었다는 점을 감안할 때, 합성 회로를 발현하기 위한 pEGFP-N1 벡터의 선택은 최적입니다. 모든 유전 부분은 복제 프로토콜(외주화)을 사용하여 조립되었습니다. 삽입체를 클로닝하는 데 사용되는 제한 효소는 NotI 및 XhoI입니다. 이러한 제한효소 부위는 pEGFP-N1 벡터의 다중 클로닝 부위 내에 위치합니다.

4. 대장 균(E.coli) DH5α 세포의 합성회로의 형질전환

1. E.coli DH5α competent cell의 제조
   알림: 시약을 고압멸균하는 것이 좋습니다. 시약은 사용할 때까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
   1. 37°C, 180rpm에서 50mL의 Luria Broth(LB)에 신선한 접종물 1mL를 배양합니다. 600nm에서 0.4-0.6의 광학 밀도(OD)가 달성될 때까지 약 2시간 동안 세포를 성장시킵니다.
   2. 4°C에서 4,696 x g 으로 15분 동안 세포를 원심분리합니다. 50mL 원심분리기 튜브를 뒤집고 세포 펠릿을 수확하여 폐기 플라스크에서 상층액을 수동으로 폐기합니다.
   3. 1mL 피펫을 사용하여 2mL의 얼음처럼 차가운 0.1M 염화마그네슘(MgCl2)에 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다. 얼음처럼 차가운 MgCl 2로 최대 20mL의 부피를 구성합니다_.
   4. 튜브를 4,696 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 1mL의 얼음처럼 차가운 0.1M 염화칼슘(CaCl₂)에 1mL 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 재현탁시키고 얼음 위에서 2시간 동안 배양합니다. 변형을 위해 갓 만든 유능한 세포를 사용하십시오.
2. 합성 회로 구조를 이용한 유능한 세포의 형질전환
   1. 50 μL의 competent cell을 측정하고 1.5 mL 튜브에 cell을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 부분 표본에 10ng의 합성 회로 구조를 추가하고 3분 동안 얼음 속에 두십시오.
   2. 건조 가열 블록에서 42°C에서 3분 동안 셀을 가열합니다. 건조 가열 블록에서 배양이 완료되면 세포를 다시 얼음 위에 놓고 3분 동안 1mL의 LB를 세포에 추가한 다음 37°C에서 250rpm에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. 배양이 완료되면 실온(RT)에서 4,696 x g 으로 5분 동안 세포를 원심분리하고 1mL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 100 μL의 LB에 세포를 재현탁시키고 50 μg/mL 카나마이신을 함유한 LB 한천에 플레이트합니다. 플레이트를 뒤집고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.

5. 합성 회로 구조의 절연

1. 50mL 원심분리 튜브에 10mL의 LB 배지를 넣고 50μg/mL의 카나마이신을 선택 육수로 첨가하여 플라스미드 분리를 위해 형질전환된 세포를 배양합니다. 200 μL 팁을 사용하여 변형된 콜로니를 선택하고 선택 육수에 추가합니다.
2. 접종 루프를 사용하여 다른 단일 콜로니를 선택하고 오각형 기술을 사용하여 플레이트를 줄무늬로 만든 다음 단일 콜로니 분리를 유지하기 위해 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
3. 37°C에서 180rpm으로 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음 날, 4,696 x g 에서 24 ° C에서 20 분 동안 배양액을 원심 분리합니다. 원심분리 후 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 1mL의 재현탁 완충액(50mM Tris(hydroxymethyl) 아미노메탄 염산염(Tris-HCl), 10mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 100μg/mL RNase A(pH-8.0))를 펠릿에 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
   참고: 재현탁 완충액을 만들려면 혼합물을 세포 펠릿에 첨가하기 5분 전에 RNase A를 첨가하십시오.
4. 혼합물을 RT에서 5분 동안 배양합니다. 1mL의 용해 완충액(0.2N 수산화나트륨(NaOH), 1% 도데실 설페이트(SDS))를 세포에 넣고 튜브를 2분 동안 뒤집어 혼합합니다. RT에서 5분 동안 튜브를 배양합니다.
5. 세포에 중화 완충액 1mL(3M Potassium Acetate (CH₃CO₂K))를 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다. RT에서 20분 동안 4,696 x g 에서 세포를 원심분리하고 1.5mL 튜브에 상층액을 수집합니다.
6. 상층액에 이소프로판올 500μL를 넣고 뒤집어 잘 섞는다. 상층액을 얼음에 15분 동안 배양한 다음 12,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
   알림: 배양 시간은 5분에서 1시간 사이입니다. 이 동안 5분마다 뒤집어서 내용물을 부드럽게 섞는 것이 좋습니다.
7. 상층액을 버리고 펠릿에 1mL의 70% 에탄올(냉각)을 넣고 12000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 단계를 다시 한 번 반복합니다.
8. 펠릿을 자연 건조하고 얻은 플라스미드를 20μL의 멸균 뉴클레아제가 없는 물(NFW)에 재현탁시킵니다. 260/280 nm 파장에서 분광광도계에서 플라스미드의 농도를 측정합니다.
   NOTE: 플라스미드 농도가 nanodrop을 통해 추정할 수 있는 매우 높은 경우 NFW를 더 추가합니다. 플라스미드 희석 과정은 층류 후드에서 수행되어야 합니다.

6. 합성 회로의 아가로스 겔 전기영동(AGE)

1. AGE를 위한 플라스미드 검체 준비
   1. 1.5mL 튜브에서 20μL의 1x Tris-acetate-EDTA(TAE)를 측정합니다. 4 μL의 6x 로딩 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
   2. 튜브를 빠르게 회전시키고 1 μg의 합성 회로 플라스미드 벡터를 추가한 다음 혼합물을 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 이 반응 혼합물은 아가로스 겔에 로드할 수 있습니다.
      NOTE: 플라스미드 구조를 손상시킬 수 있으므로 엄격한 피펫팅을 피하십시오. 대신 시약을 혼합하기 위해 빠르게 회전하십시오.
2. 합성 회로의 제한 소화
   1. 1.5mL 튜브에 10x 제한 완충액 2μL, NotI 1μL, XhoI 제한 효소 1μL를 넣고 내용물을 빠르게 회전시켜 잘 섞습니다. 1 μg의 synthetic circuit plasmid vector를 추가하고 내용물을 빠르게 회전시킵니다.
   2. 내용물에 NFW를 추가하고 튜브를 빠르게 회전시켜 튜브의 부피를 20μL로 구성합니다. 튜브를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. 배양 후 튜브를 건조 가열 블록에서 15분 동안 70°C로 유지하여 제한 효소를 비활성화합니다. 튜브의 내용물을 냉각하고 반응 혼합물에 6μL의 로딩 버퍼를 추가합니다. 튜브를 빠르게 돌려 내용물을 섞습니다. 이 반응 혼합물은 아가로스 겔에 로드할 수 있습니다.
   4. 아가로스 겔을 설정하고 이전에 설명된 프로토콜¹⁶을 사용하여 겔을 실행합니다. 간단히 말해서 각 웰에 20μL 샘플을 로드하고 5Kb DNA ladder 1μL를 로드한 다음 100V에서 겔을 실행합니다. 전기영동이 완료된 후 전원 공급 장치를 분리하고 겔 이미저에서 겔을 획득한 다음 형광 옵션을 켜서 밴드를 봅니다.

7. RAW264.7 세포주에서 합성 회로 구조의 Transfection

1. 시료 준비
   1. 유도 합성 회로에 의한 기생충 제거 효과를 결정하기 위해 샘플을 준비합니다. 첫 번째 샘플은 transfection되지 않은 RAW264.7 세포(대조군)이고, 두 번째 샘플은 6시간 동안 L. major promastigotes에 감염된 RAW264.7 세포(6시간 감염)이고, 세 번째 샘플은 합성 회로로 transfection되고 dox(IMT)로 유도된 RAW264.7 세포이며, 감염 시점 샘플은 합성 회로로 transfection되고 L. major 에 감염된 dox로 유도된 RAW264.7 세포입니다. 다른 시점에 대한 promastigotes (IMTI) 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 h (18 h IMTI) 및 24 h (24 h IMTI).
   2. 모든 샘플을 준비하려면 25cm² 플라스크에서 RAW264.7 세포를 긁어내고 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리기를 긁어냅니다.
   3. 펠릿을 1mL의 DMEM 완전 배지에 재현탁시킵니다. 100 μL 튜브에 재현탁 세포 10 μL를 넣고 10 μL의 0.5% 트리판 블루를 세포에 넣고 잘 섞습니다.
   4. 세포 계수 챔버 슬라이드에 10μL의 세포와 트리판 블루 믹스를 로드하고 4개의 챔버에서 세포 계수를 가져옵니다.
   5. 커버슬립 바닥 96 웰의 세포를 플레이트하고 웰당 2 x 10⁴ 개의 세포를 플레이트하고 24시간 동안 세포를 배양합니다. 이 샘플은 컨트롤 샘플입니다. 이 단계는 다른 샘플의 준비를 위해 일정하게 유지됩니다.
      알림: 사용하기 전에 미디어를 37°C의 수조에서 미리 데우십시오.
   6. 6시간 감염된 검체를 준비하려면 7,273 x g에서 10분 동안 1mL의 고정상 L. 주요 프로마스티고테를 원심분리합니다. 펠릿을 500μL의 DMEM 완전한 배지에 재현탁시키고 7.1.3-7.1.4단계에 따라 세포 계수 챔버에서 세포 계수를 측정합니다.
   7. 2 x 10⁵L. major promastigotes를 웰에 추가하고 37 ° C에서 6 시간 동안 5 % CO₂ 로 배양합니다. 배양 후 PBS로 세포를 3번 세척합니다.
   8. IMT 샘플을 준비하려면 단계(7.1.2-7.1.5)에 따라 세포를 시드하고 transfection 단계 7.2.1-7.2.6을 수행합니다.
   9. IMTI의 시점 샘플을 준비하려면 7.1.2-7.1.5 단계를 수행하고 7.2.1-7.2.6 단계 transfection을 수행합니다. 500μg/mL Geneticin(G418) 및 1μg/μL dox가 포함된 DMEM 전체 배지를 폐기하고 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다.
   10. 우물에 2 x 10⁵L. major promastigotes를 추가하고 6 시간, 12 시간, 18 시간 및 24 시간 동안 배양합니다. 감염 후 DMEM complete media가 포함된 promastigotes를 폐기하고 1x PBS로 웰을 3번 세척합니다. 500μg/mL Geneticin(G418) 및 1μg/μL dox를 함유한 200μL의 DMEM complete media를 세포에 추가하고 24시간 동안 배양합니다.
2. 합성 회로의 Transfection
   1. 1.5mL 튜브에 개선된 Minimal Essential Medium인 Reduced-Serum 배지 24μL를 추가합니다. 배지에 합성 회로 플라스미드로 클로닝된 pEGFP-N1 벡터 1μg을 추가합니다.
   2. 새 1.5mL 튜브에 24μL의 최소 필수 배지를 추가하고 1μL의 폴리에틸렌시민(PEI, 1μg/μL)을 추가합니다. 혼합물을 최소 10배 피펫팅하여 잘 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   3. PEI 혼합물을 DNA 혼합물이 들어 있는 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 피펫팅하여 방울로 최소 10회 이상 잘 섞습니다. DNA 배양: PEI 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   4. 96웰 커버슬립 바닥판의 웰에서 미디어를 버리고 PBS로 셀을 3번 세척합니다. 피펫을 사용하여 DNA:PEI를 세포에 부드럽게 적하하고 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 37 ° C에서 3 시간 동안 5 % CO₂ 로 세포를 배양합니다.
   5. 배양 후 200 μL의 신선한 Minimal Essential Medium을 세포에 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔든 다음 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 24 시간 동안 배양합니다.
      참고: PEI는 세포독성이 있습니다. 따라서 transfection 후 24시간 이상 세포를 배양하지 않는 것이 권장됩니다.
   6. 다음 날, 배지를 버리고 PBS로 세포를 2번 세척합니다. 500 μg/mL Geneticin(G418) 및 1 μg/μL dox를 함유한 DMEM complete media를 세포에 추가하고 24시간 동안 배양합니다.
3. 컨포칼 현미경 검사를 위한 샘플 고정
   1. 모든 샘플을 고정하려면 1x PBS 3x로 세포를 세척하고 4% 파라포름알데히드 100μL를 세포에 첨가한 다음 RT에서 10분 동안 배양합니다.
   2. PBS 3x로 세포를 세척합니다. 세척이 완료되면 1μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 세포에 추가하고 어두운 곳에서 15분 동안 실온에서 배양합니다.
   3. 배양 후 PBS로 세포를 3번 세척합니다. GFP 발현 및 DAPI 염색을 위해 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다.

8. confocal microscopy 및 quantification을 통한 transfection된 세포 획득

1. 흡수성 조직을 사용하여 우물의 커버슬립 바닥을 청소합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 컨트롤을 켭니다. 다음으로 압축기와 수은 램프를 켭니다.
2. 기기를 작동하려면 현미경 제어, 스캔 헤드 제어, 레이저 키, 레이저 모듈, 램프, 현미경 컨트롤러 및 CPU를 순차적으로 켜야 합니다.
3. 컴퓨터에서 소프트웨어(Table of Materials)를 열고 Enable XY Stage Control(XY 스테이지 제어 활성화)을 클릭합니다. 7S3에 대한 청소를 실행하라는 팝업이 열립니다. 아니요를 클릭합니다. 라이브 그래프를 닫고 설정 화면을 조정합니다.
4. 60x 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 추가하고 96웰 플레이트 커버슬립 바닥 플레이트를 스테이지에 놓고 스테이지를 X-Y 평면으로 이동하여 웰의 대물렌즈 위치를 조정합니다. Ocular 를 클릭하고 Alexa-488 채널을 선택합니다. 셔터 끄기를 클릭하여 접안렌즈에 셀의 초점을 맞춥니다. 코어와 미세 초점으로 접안렌즈를 조정합니다.
5. 현미경 컨트롤 박스에 있는 셔터 켜기 를 클릭하고 대물렌즈를 이동하여 위치를 조정하고 관심 영역에 초점을 맞춰 미분 간섭 대비(DIC)에서 세포를 관찰합니다. 현미경 컨트롤 박스에서 EPI 모드로 전환하여 GFP 발현을 위해 Alexa-488 파장 필터의 세포를 관찰합니다. 셀이 녹색으로 나타나야 합니다.
6. 셔터 끄기를 클릭하고 LSM 이미징으로 이동한 다음 이미지의 해상도를 1,024 x 1,024로 선택합니다. Add Phase(위상 추가)를 클릭하고 드래그하여 녹색 채널을 위상으로 추가합니다.
7. Olympus 프로그램에서 LSM 을 클릭하고 Live Button 을 클릭하여 위상차와 Alexa 488nm 채널에서 셀을 관찰합니다. Control 을 누르고 스크롤하여 이미지 캡처를 위한 소프트웨어의 셀에 초점을 맞춥니다.
8. 게인과 오프셋을 조정하여 검출기에 의해 캡처된 형광 강도를 조정합니다. Capture( 캡처)를 클릭하고 이미지 이름을 지정한 다음 Save( 저장)를 클릭합니다.
9. 이미징 소프트웨어에서 File(파일)을 클릭하고 확장자가 .oir인 모든 이미지를 선택한 다음 Open(열기)을 클릭합니다.
10. Tile View(타일 보기)를 클릭하면 모든 채널에서 이미지를 시각화할 수 있습니다. 이미지에 축척 막대를 추가하려면 View(보기)를 클릭한 다음 Scale bar(축척 막대) 옵션을 선택합니다.
11. 단일 채널의 이미지를 16비트 그레이스케일로 저장하려면 파일을 클릭하고 이미지 내보내기를 선택합니다. 이미지를 선택하고 모든 채널에서 눈금 표시 를 확인합니다. split view(분할 보기) 옵션의 select frame(프레임 선택) 탭에서 Yes(예)를 선택합니다. 출력 탭에서 번인 정보 옵션이 있는 24비트 RGB 색상을 선택하고 이미지의 파일 형식으로 tiff 를 선택합니다. 폴더로 내보내기에서 이미지를 저장할 적절한 파일 위치를 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
12. 병합된 이미지를 저장하려면 분할 보기 옵션에서 아니요를 선택하고 출력 탭에서 굽기 정보가 있는 병합된 채널을 선택하는 것을 제외하고 동일한 단계를 수행합니다.
13. 셀에서 GFP의 발현을 분석하려면 Windows에서 Fiji를 열고 tiff 파일을 내보냅니다. GFP 표현식을 분석하려면 녹색을 선택합니다.
14. 자유형 도구 옵션을 사용하여 셀 영역을 선택하고 Analyse(분석 )를 클릭하여 형광 강도를 측정합니다. 3개의 이미지에 대해 이 과정을 반복합니다.
15. 데이터를 분석 소프트웨어로 내보내고 정량화된 데이터에 대한 통계 테스트를 수행합니다.

9. 기생충 부하 분석

1. 컨포칼 현미경으로 세포를 시각화하는 동안 개별 대식세포에 존재하는 기생충의 총 수를 세십시오.
2. 무작위로 100개의 대식세포를 검사하고 세포 내 기생충의 수를 기록하십시오. SDHA 발현이 기생충 수에 미치는 영향을 조사하기 위해 감염된 IMTI 샘플과 IMTI 샘플의 시점 간의 Perfom 통계 테스트.

10. ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)를 통한 IL-10 및 IL-12 정량 분석

1. 7.1 및 7.2 단계에 따라 샘플을 준비하고 1.5mL 튜브에 배지를 수집합니다. 나중에 사용할 때까지 미디어를 얼음 위에 보관하거나 -20 °C에서 보관하십시오. 사용자 키트 설명서 지침에 따라 IL-10 및 IL-12에 대한 ELISA를 수행합니다.

11. 정량적 실시간 역전사 PCR(qRT-PCR)을 사용한 사이토카인 프로파일링

1. 7.1 및 7.2 단계에 따라 샘플을 준비합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 500μL의 TRIzol 시약을 넣고 RT에서 2분 동안 세포를 배양합니다.
   참고: RNA 분리 단계는 RNase 오염에 대한 안전 예방 조치로 층류 캐비닛에서 수행해야 합니다.
2. 1.5mL 튜브에 샘플을 수집하고 100μL의 클로로포름을 첨가한 다음 튜브를 5x-8x 뒤집어 혼합합니다. 상온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다.
3. 3개의 층이 관찰되고 새 1.5mL 튜브에 투명한 수성 최상층을 수집합니다. 수성층에 500μL의 이소프로판올을 첨가하고 10배를 뒤집어 잘 섞은 다음 상온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 매 5분 후에 튜브를 뒤집어 샘플을 다시 혼합합니다.
4. 12,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 물을 함유한 0.1% DEPC(Diethyl pyrocarbonate)로 만든 75% 에탄올로 펠릿을 2분 동안 세척하고 4°C에서 8,000 x g 으로 원심분리기를 세척합니다.
   참고: 물을 함유한 DEPC는 RNase를 분해하므로 RNA 분리에 사용하는 것이 좋습니다.
5. 마지막으로 펠릿을 RT에서 5분 동안 공기 건조하고 물이 포함된 20μL의 DEPC에 용해시킨 다음 분광 광도계를 사용하여 분리된 RNA, 260/280 및 260/230 비율의 농도를 측정합니다.
   참고: 260/280 비율은 일반적으로 순수한 형태의 RNA를 나타내는 약 2.0이어야 하며, 분리된 RNA에 TRIzole과 같은 원치 않는 화합물이 없음을 고려하기 위해 260/230 비율은 2.0-2.2 사이여야 합니다.
6. 각 cDNA 샘플의 20 μL를 준비하기 위해 시약을 얼음에서 해동하고 RT에서 15초 동안 짧게 회전시킵니다. 사용하기 전에 모든 시약과 RNA 샘플에 짧은 스핀을 줍니다.
7. 오토클레이브 100μL 튜브에서 0.8μL의 25x dNTP, 2μL의 10x Primer, 2μL의 10x 버퍼를 사용합니다. 1 μg/μL 농도의 RNA를 추가하고 0.5 μL의 역전사 효소를 추가합니다. DEPC가 함유된 물을 사용하여 부피를 20μL로 구성합니다.
8. cDNA 샘플을 RT에서 1분 동안 짧게 회전시킵니다. 샘플을 얼음 위에 두십시오.
9. 열 순환기를 켜고 상단 패널의 나사를 풀어 홀더를 풀고 샘플을 블록에 놓습니다. 샘플을 배치한 후 뚜껑을 단단히 조입니다.
10. 시스템이 켜지면 실행을 클릭합니다. 메인 옵션을 선택한 다음 프로그램 메뉴로 들어가 CDNA 옵션을 선택합니다. 시료 부피를 20μL로 정의하고 RUN을 클릭합니다. 열 순환기는 4단계로 프로그램을 실행합니다. 첫 번째 단계는 10분 동안 25°C, 두 번째 단계는 2시간 동안 37°C, 세 번째 단계는 5분 동안 85°C, 마지막 단계는 영원히 4°C입니다.
11. 주기가 네 번째 단계에 들어가면 Enter 를 클릭하고 주기를 마칩니다. 샘플을 수집하고 qRT-PCR을 진행합니다. RNA 샘플은 -80°C, cDNA 샘플은 -20°C에서 보관합니다.
12. 사이토카인 검출을 위해 필요한 시약 2x PCR Master mix, cDNA 및 TNF-α, IFN-γ, TGF-β 및 NFW용 프로브를 얼음 위에서 해동합니다.
    알림: 모든 시약, 반응 혼합물 및 샘플은 얼음 위에 보관해야 합니다.
13. 100μL 튜브에 1μL의 cDNA와 3.5μL의 NFW를 추가하여 cDNA 샘플을 준비합니다. 마스터 믹스를 준비하려면 5 μL의 마스터 믹스를 취하고 100 μL 튜브에 0.5 μL의 프로브를 추가합니다. 짧게 회전시켜 내용물을 섞습니다. 샘플과 표적 유전자의 수를 계산하고 그에 따라 반응 혼합물을 준비합니다.
    참고: 100 μL 튜브의 바닥에 NFW와 마스터 믹스를 추가합니다. 부피가 추가되었는지 확인하고 시약의 교차 혼합을 방지하기 위해 예방 조치로 cDNA와 프로브를 원심분리기 튜브의 벽에 추가합니다.
14. 8웰 스트립을 PCR 쿨러에 넣습니다. 5.5μL의 마스터 믹스와 프로브 함유 바이알을 8웰 스트립의 각 웰 바닥으로 옮깁니다. 따라서 모든 타겟 유전자에 대해 이 단계를 반복합니다.
15. 4.5 μL의 cDNA 및 NFW 혼합물을 8-웰 스트립으로 웰 벽으로 옮깁니다. 따라서 모든 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
16. 뚜껑으로 스트립을 밀봉하고 10초 동안 짧게 회전시켜 웰의 유전자와 샘플을 혼합합니다. 스트립을 qRT-PCR 샘플 슬롯에 놓고 슬롯을 닫습니다.
17. 바탕 화면에서 소프트웨어를 실행하고 게스트로 로그인합니다. 화면에 팝업이 나타납니다. 연결하지 않고 계속을 클릭합니다.
18. Setup(설정) 메뉴에서 Advanced Setup(고급 설정)을 클릭합니다. Experiment Properties(실험 속성)에서 Experiment Name(실험 이름) 탭에 실험 이름을 씁니다. 어떤 유형의 실험에서 옵션을 설정하시겠습니까? 정량-비교 CT (ΔΔ CT)를 선택합니다.
19. 계측기에서 어떤 램프 속도를 사용하시겠습니까? 탭에서 Fast (~ 40 minutes to complete a run)를 클릭하십시오. 플레이트 설정 메뉴의 Define Targets(타겟 정의) 옵션에서 유전자 이름을 정의하고 Define Samples(샘플 정의)에 샘플 이름을 입력합니다.
20. Run Method 탭에서 Reaction Volume per Well(웰당 반응 부피)에 10 μL를 입력합니다. 홀딩 스테이지 바로 전에 스테이지 추가 를 클릭하고 홀딩 스테이지를 선택합니다. 온도를 50°C로 변경하고 시간을 2분으로 변경합니다. 두 번째 유지 단계에서는 95초 동안 1°C가 되는 변경 사항을 만들지 마십시오.
21. 사이클링 스테이지에서 1단계에서 온도를 95°C로 변경하고 시간을 3초로 변경합니다. 2단계에서 온도를 60°C로 변경하고 시간을 30초로 변경합니다. 실행 을 클릭하여 qRT-PCR 주기를 시작합니다.

12. 통계 분석

참고: 모든 데이터에 대해 평균은 막대로 표시되고 표준 편차는 막대 그래프의 오차 막대를 나타냅니다(p-값< 0.05는 유의한 것으로 간주됨).

1. 데이터 분석 소프트웨어를 열고 공초점 실험에서 얻은 데이터를 삽입합니다.
2. 컨포칼 현미경 분석의 경우, GFP 발현에 대한 다중 그룹 비교를 위해 Tukey의 보정 테스트와 함께 일반 단방향 분산 분석을 적용합니다. p가 0.05< 데이터를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. 평균은 막대로 표시되고 표준 편차는 오차 막대로 표시되는 데이터의 그래픽 표현을 준비합니다.
3. 기생충 부하 분석의 경우 새 시트를 만들고 100개의 대식세포에 대한 기생충 수 데이터를 입력합니다. 모든 샘플 간에 Tukey의 보정과 함께 일반 일원 분산 분석을 적용합니다. p-값이 0.05< 데이터를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.
4. ELISA의 경우 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 이원 분산 분석을 수행합니다. qRT-PCR의 경우 Tukey의 보정 테스트를 사용하여 단방향 분산 분석을 수행합니다.

결과

합성회로를 발현하기 위한 합성회로를 형성하는 유전자 부분의 배열은 (도 1A)에 나타내었다. 해당 부품은 그림 1B에 표시된 직교 및 모듈식 방식으로 pEGFP-N1 벡터로 클로닝되었습니다. 합성 회로의 시뮬레이션은 SDHA와 테트라사이클린 억제기 모두에서 진동 역학을 드러냈습니다. 이 관찰은 주기적 파동 함수를 특징으로 하는 상호 표현 패턴을 제안합니다. SDHA 농도의 증가는 독시사이클린의 유도에 기인할 수 있으며, TetR의 발현은 독시사이클린의 수치 감소에 기인할 수 있습니다(그림 1C). 실리코(silico)에서 관찰된 SDHA 및 TetR의 유도성 진동 발현을 감안하여 pEGFP-N1 plasmid vector를 통한 synthetic circuit 전달 전략을 설계하고 구현했습니다.

이 연구에서 확인된 iGEM 부품에는 각각 TetO에 대한 BBa_K1493803, Kozak 서열에 대한 BBa_K4344028, TetR에 대한 BBa_C0040, P2A에 대한 BBa_K1537016이 포함됩니다. SDHA의 NCBI 등록 ID는 NM_025848입니다. 이러한 구성 요소는 총 1317개의 염기쌍에 걸쳐 있는 독시사이클린 유도성 TetON 합성 회로를 구성하기 위해 조립되었습니다(보충 파일 1). TetO는 DNA 조절 요소로 기능하기 때문에 그 염기서열은 번역되지 않았습니다. SDHA의 하류에 위치한 P2A의 5' TetR에서 3' 말단까지 확장되는 Kozak 염기서열의 다운스트림 서열은 번역의 인실리코(in silico ) 검증을 위해 선택되었습니다. 관찰 결과 내부 정지 코돈이 없는 것으로 나타났으며, 이는 전체 염기서열 길이에 걸쳐 중단 없는 번역을 보장했습니다(보충 파일 2). 1317 bp를 포함하는 합성 회로의 조절 부분은 EGFP의 5' 상류에 있는 NotI 및 XhoI 제한 부위 사이에 삽입되었습니다(그림 1B). 염기서열분석 결과는 삽입 서열이 플라스미드에 클로닝되었음을 강조합니다(보충 파일 3).

E. coli DH5α 균주에 면역 대사 회로를 도입하면 박테리아 형질전환 중 선택적 마커로 사용되는 항생제인 카나마이신에 대한 내성을 나타내는 형질전환된 콜로니가 성장했습니다. selection plate에서 형질전환된 콜로니의 풍부한 존재는 더 높았으며, 이는 competent cell이 transformation에 대한 높은 잠재력을 나타냈다는 것을 시사하며, 이는 사용된 형질전환 프로토콜의 효율성을 나타냅니다(그림 1D).

단일 콜로니를 분리하고 플라스미드 분리를 위해 카나마이신이 보충된 10mL의 LB에 파종했습니다. 10mL 배양에서 파생된 플라스미드 수율은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 이 절차에는 플라스미드 분리를 위한 표준 방법이 사용되었습니다. 완충액은 플라스미드 분리 전날 신선하게 준비되었으며, 배양 조건은 플라스미드 수율을 최대화하기 위해 최적화되었습니다. 얻어진 플라스미드 농도는 1 μg/μL를 초과하였으며, 260/280 및 260/230 비율은 각각 1.8 및 2.0을 초과하였다. 이러한 결과는 분리된 플라스미드가 순도가 높고 단백질, EDTA, 탄수화물 및 페놀과 같은 오염 물질이 없음을 나타냅니다.

고립된 합성 회로에 대한 전기영동 이동성 이동을 평가했습니다. 제한효소(restriction digestion)는 NotI 및 XhoI 제한효소(restriction enzymes)를 사용하여 수행하였는데, 이들 효소는 합성 회로가 삽입된 제한효소(restriction site)였다. 1% 아가로스 겔에서 두 개의 밴드, 1500bp 근처의 밴드, 4kb와 5kb 사이의 밴드가 관찰되었습니다. 인서트 크기가 1317bp인 경우 1500bp의 대역이 인서트에 해당할 수 있습니다. pEGFP-N1 벡터의 크기는 4.7kb입니다. 따라서 5kb에 가까운 대역은 pEGFP-N1 벡터로 추정됩니다. 결과적으로, 완전하고 온전한 합성 회로가 전달 벡터 내에 존재한다는 추론이 도출되었습니다. 또한, 분해되지 않은 intact synthetic circuit에 대해 약 6 kb band가 검출되었으며, 이는 pEGFP-N1 벡터가 plasmid vector 내에 거의 1.3 kb의 insert를 보유하고 있음을 나타냅니다(그림 1E).

그림 1: 합성 회로의 설계 및 검증. (A) 유전 부분과 조절 구성 요소의 조립에 의한 합성 회로의 표현. (B) 100시간 단위에서 SDHA 및 TetR의 주기적 발현을 보여주는 결정론적 시뮬레이션 그래프. (C) 카나마이신에 내성이 있는 대장균 DH5α의 합성 회로 변형 콜로니. 단위는 결정론적 시뮬레이션이므로 100시간 단위입니다. (D) NotI 및 XhoI 제한 효소를 사용한 온전하고 제한 소화된 합성 회로의 아가로스 겔 전기영동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

플라스미드 농도 (μg/mL)	260/280	260/230
1248.5	1.95	2.45
1123.1	1.89	2.43
1155.8	1.87	2.41
1056.8	1.94	2.47

표 1: 플라스미드 분리 후 얻은 합성 회로 구조체의 수율. 표는 μg/mL 단위의 플라스미드 농도, 260/280 및 260/230 비율을 보여줍니다.

대조군 및 감염된 세포에서 관찰된 형광 강도는 GFP에 대해 낮았습니다. 그러나 500 μg/mL G418을 1:1 비율로 사용한 합성 회로와 1 μg/mL dox를 사용한 유도를 사용한 합성 회로의 transfection은 IMT 세포에서 높은 GFP 발현을 유도하는 것으로 관찰되었습니다. 6시간 IMTI 세포에서는 GFP 발현이 IMT 샘플보다 낮았지만 GFP 발현도 유의하게 높았습니다(그림 2A, B). 또한, GFP 발현의 증가는 12시간 IMTI, 18시간 IMTI 및 24시간 IMTI 샘플에서 관찰되었다. 이러한 증가는 감염 시간의 증가에 기인할 수 있으며, 이는 거주 기생충¹⁷에 의해 대식세포에서 더 높은 대사 변화를 유도했을 수 있다. 세포 내 SDHA 수치는 감염 시간의 증가로 인해 영향을 받을 수 있다¹⁸. 이러한 IMTI 샘플에 dox가 보충됨에 따라 합성 회로를 통한 SDHA 수준이 증가하여 SDHA 발현이 증가했을 수 있습니다.

대식세포에 서식하는 기생충의 수를 확인하기 위해 DAPI 염색을 수행했습니다. 6 h L. 주요 감염 대식 세포에서 관찰 된 세포 내 기생충의 수는 대식 세포 당 6 개였으며, 이는 대식 세포 당 1-2 개의 세포 내 기생충이있는 6 시간 IMTI 샘플에 비해 높았습니다. transfection 및 dox induction 후, 감염 시점에 따라 세포 내 기생충 부하가 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다(그림 2C). 관찰 결과, 합성 회로가 SDHA 발현을 자극하여 기생충 제거 효과를 유도할 수 있음을 시사했습니다.

그림 2: 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경. 대조군, 감염자, IMT 및 IMTI 샘플의 이미지. (A) 대조군의 경우 50μm, 6시간 감염 및 IMT의 경우 20μm, 6시간 IMTI의 경우 20μm, 12시간 IMTI의 경우 10μm, 18시간 IMTI, 24시간 IMTI의 스케일 막대를 사용한 모든 실험 샘플에서 GFP의 발현 분석. 사용된 채널은 모든 채널의 DIC, DAPI, GFP 및 병합 이미지였습니다. (B) GFP 발현에 대한 모든 실험 샘플(n=3)에 대한 Tukey의 보정 테스트를 사용한 일원 분산 분석(p < 0.05가 유의한 것으로 간주됨) 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (C) (A) (n=3)의 샘플에 대해 100개의 대식세포 세포에서 기생충 부하에 대한 Tukey의 보정 테스트 분석을 사용한 일원 분산 분석을 수행했습니다(p < 0.05가 유의한 것으로 간주됨). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모든 샘플의 매체에서 IL-10 및 IL-12 수준을 검출한 결과, IL-10 및 IL-12의 농도는 감염 후 6시간에 가장 높았으며 24시간 감염 후 사이토카인 수치의 하향 조절이 이루어졌습니다. 합성 회로의 transfection 및 induction에서 IL-10 및 IL-12 수준에는 유의한 차이가 없었습니다. 또한 IMTI 시점 샘플에서 IL-10 및 IL-12 수준에는 유의하지 않은 차이가 있었습니다(그림 3). 6시간 감염된 샘플은 이미 IL-10 및 IL-12^19,20의 발현을 나타내는 것으로 보고되었으며, IL-10 및 IL-12에서 유의하지 않은 차이를 관찰하여 다른 사이토카인에 대한 합성 회로의 효과를 조사하게 되었습니다.

그림 3: IL-10 및 IL-12의 ELISA를 사용하여 서로 다른 샘플의 배지에서 분비 수준을 식별합니다. 샘플(n=2)에는 대조군, 6시간 감염, 24시간 감염, IMT, 6시간 IMTI, 12시간 IMTI, 18시간 IMTI, 24시간 IMTI가 포함됩니다. Tukey의 보정 검정 분석을 사용한 이원 분산 분석이 수행되었습니다(p <.05가 유의한 것으로 간주됨). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6시간 감염, IMT 및 24시간 IMTI 샘플에서 TNF-α, IFN-γ 및 TGF-β의 전사체 수준을 검출한 결과, 감염 및 IMT 샘플에 비해 24시간 IMTI 샘플에서 TNF-α가 2.5배로 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 4). 24시간 IMTI 샘플에서 감염 및 IMT 샘플에 비해 IFN-γ 수치가 35배 증가하는 것이 관찰되었습니다. TGF-β 수치는 24시간 IMTI 샘플에서 1.5배까지 상당한 상향조절을 보였지만 상대적 접힘 변화는 TNF-α 및 IFN-γ에 비해 낮았으며, 이는 24시간 IMTI 샘플에서 전염증성 사이토카인이 유의하게 상향 조절되었음을 시사합니다.

그림 4: 사이토카인의 qRT-PCR 분석. (A) TNF-α, (B) IFN-γ 및 (C) 6시간 감염, IMT 및 24시간 IMTI 샘플에 대한 TGF-β(n=2). Tukey의 보정 검정을 사용한 일원 분산 분석이 수행되었습니다(p < 0.05가 유의한 것으로 간주됨). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 합성 회로를 형성하기 위해 조립된 유전 부분의 뉴클레오티드 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: TetR, P2A 및 SDHA를 표현하는 합성 회로의 변환된 시퀀스. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: pEGFP-N1 플라스미드에서 클로닝된 합성 회로의 염기서열분석 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

얻어진 결과는 합성 회로의 설계 및 구현을 위해 채널화 된 파이프 라인의 효율성을 강조합니다. 이 합성 회로의 건설은 리슈만편모충증과 같은 전염병에 대한 정밀 의학을 개발하기 위한 단계였습니다. 유전자 부분의 인실리코(in silico ) 조립과 결정론적 시뮬레이션을 통해 TetON 시스템의 뚜렷한 조절 효과를 모니터링했습니다. 특히 회로의 효과는 TetR과 SDHA/GFP의 상호 쌍안정 발현으로 이어질 수 있습니다. SDHA의 발현은 주기적이었으며, 이는 독시사이클린의 존재 하에서만 그 발현이 증가했음을 나타낼 수 있습니다. 일정 기간 동안 표현 패턴의 잠재적인 변화를 관찰하기 위해 시간 단위 100을 선택했습니다. 그 결과, 합성 회로는 TetR 및 SDHA/GFP에 대해 주기적인 거동을 보였는데, 이는 그의 직교 특성에 기인하는 것으로 보인다²¹. iGEM 부품 레지스트리에서 유전자 부분의 조립은 합성 회로²²를 구성하는 데 필요한 유전 구성 요소를 제공했기 때문에 중추적인 역할을 했습니다. 유전자 부분의 모듈식 배열은 회로의 번역 및 기능이 영향을 받을 수 있으므로 필수적이며, 이는^세포(23)에서 비효율적인 발현 및 조절 효과로 이어질 수 있습니다.

합성 회로의 인서트 크기는 벡터의 크기가 너무 크지 않도록 약 1.3kb였으며, 이는 잠재적으로 변환 효율⁽²⁴)을 감소시킬 수 있습니다. 적절한 벡터를 선택하는 것은 박테리아 시스템에서 복제 수를 늘리고 높은 플라스미드 복사본을 생성하는 데 필수적인 유전 부분을 소유해야 하기 때문에 중요한 단계이며, 그 발현 기계는 포유류 시스템²⁵에서 잘 적응해야 합니다. pEGFP-N1 벡터는 RAW264.7 세포주에서 잘 특성화되어 있으며 다중 클로닝 사이트(multiple cloning site)²⁶을 가진 조밀한 플라스미드 구조를 가지고 있습니다. 고농축 및 순수 플라스미드의 생산을 보장하기 위해 플라스미드 분리에 실험실 표준 버퍼 용액을 사용했으며, 이는 분광 광도계 추정 및 AGE를 통해 검증되었습니다. pEGFP-N1 벡터에 합성 회로를 삽입하는 것은 제한 분해를 통해 검증하고, 샘플은 AGE 및 시퀀싱에서 분석했습니다. AGE 결과는 1.3kb 대역의 인서트, 4.7kb 대역의 pEGFP-N1 벡터 및 전체 합성 회로의 6kb 대역을 나타냈습니다.

DNA: PEI 비율의 1:1, 1:2 및 2:1 비율을 사용한 형질주입이 수행되었으며, 관찰된 1:1 비율이 세포 형태를 방해하지 않고 가장 잘 작동했습니다(데이터 표시 안 됨). 형질주입된 세포의 선택을 위해 400 μg/mL - 1000 μg/mL 농도의 G418을 사용하는 것이 권장된다²⁷. 500μg/mL의 G418은 형질주입된 세포의 세포 성장 또는 형태를 손상시키지 않으면서 비형질주입된 세포의 성장을 효과적으로 억제했기 때문에 형질주입된 세포의 선별에 사용되었습니다(데이터는 표시되지 않음). transfection 효율성에서 세포 표현형의 중요성을 감안할 때, 특히 분화를 거칠 수 있고 transfection이 까다로워질 수 있는 대식세포 세포주에서 RAW264.7 세포주의 낮은 통로 수를 형질전환에 사용했습니다²⁸. 세포 통로 수도 transfection 효율성에 중요한 요인이 될 수 있습니다. 높은 통로 수는 비효율적인 transfection(transfection)을 유발할 수^{있다 29}. Dox는 TetR에 대한 높은 결합 효율, 유리한 조직 분포, 낮은 독성 및 24시간³⁰의 반감기 때문에 Tet-ON 유도 시스템에 선호되는 유도제입니다. transfection 후, 세포는 24시간 동안 dox로 유도되었고, GFP 발현을 위해 관찰되었습니다. RAW264.7 세포의 경우 합성 회로 유도에 사용된 dox의 농도는 1μg/mL였으며 이는 1-2μg/mL³¹ 의 권장 범위에 속합니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 유도 후 SDHA 농도의 조절은 결정되지 않았습니다. 전반적으로, 세포 통로 수, DNA: PEI 농도, 포유류 transfection selection marker 농도 및 doxycycline induction concentration의 측정 및 표준화는 transfection 과정에서 중요한 요소입니다.

다른 시점에서 감염 후 합성 회로를 유도한 후, 세포 내 기생충 부담이 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다. 감염된 샘플과 IMTI 샘플 간의 기생충 부하를 비교한 결과, 합성 회로로 유도된 세포의 부담이 더 낮았으며, 이는 SDHA 발현에 기인하는 것으로 보입니다. SDHA 발현이 NO 생성과 연관되어 있기 때문에, IMTI 세포는 NO가 생성될 때 RAW264.7 세포주에서 발생하는 불규칙하고 거친 형태학적 형태를 갖는 것으로 관찰되었다³². 감염 후 6시간 후 IL-10 및 IL-12 수치가 가장 높았는데, 이는 두 사이토카인 모두 이 시점에서 상향 조절되는 것으로 보고되었으며, 이는 IL-12보다 IL-10을 더 많이 생성하기 위해 표현형 변형을 추가로 거치기 때문이다¹⁹. IL-10 및 IL-12 수준은 transfection 후 IMTI 샘플에서 유의한 변화를 일으키지 않았기 때문에 전염증성 및 항염증성 사이토카인 반응을 검출하기 위해 사이토카인 프로파일링을 수행했습니다.

TNF-α, IFN-γ 및 TGF-β의 발현 수준은 6시간 감염, IMT 및 24시간 IMTI 샘플에서 확인되었습니다. 세포 내 기생충을 제거하기 위해 TNF-α 및 IFN-γ은 NO 생성을 통해 산화 폭발을 유도하기 때문에 주로 필수적입니다. M2 편광 대식세포는 TGF-β를 발현하며, 이는 전염증성 사이토카인을 하향 조절한다³³. 24시간 IMTI 샘플은 TGF-β보다 TNF-α 및 IFN-γ 발현이 증가했으며, 이는 대식세포가 L. major에 대한 transfection 및 감염 시 전염증성 사이토카인을 발현하는 표현형으로 분극되었을 수 있음을 시사합니다. 따라서 이 연구는 합성 회로를 사용한 transfection 시 유도된 표현형 변화에 대한 통찰력을 제공하고 감염 역학을 강조합니다. 합성회로가 치료제로서 미치는 영향은 항염증성 사이토카인에 비해 전염증성 사이토카인 발현을 유의미하게 증가시켰기 때문에 조사할 수 있습니다. 따라서 이 연구는 합성 회로 구성 및 전달 파이프라인을 확립했을 뿐만 아니라 리슈마니아증 도전 숙주 세포에서 전염증성 사이토카인의 상향 조절을 통해 리슈마니아증 모델에서 치료 잠재력을 입증했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 &뮤; L 팁	Tarson	521050
10X 제한 버퍼	BioLabs	R0146S	제한 소화
1mL 팁	Tarson	521016
1mL 튜브	Eppendorf	30121023
200 μ L 팁	Tarson	521010
25cm2 플라스크	Corning	430639	세포 배양
4',6-디아미디노-2-페닐린돌	ThermoFischer Scientific	D1306	핵 염색
50mL 튜브	Corning	352070
60mm 플레이트	Falcon	353002
6X TrackIt 시안/오렌지 로딩 버퍼	ThermoFischer Scientific	10488085	AGE
96 웰 커버슬립 바닥 플레이트	로딩 ThermoFischer Scientific	160376	컨포칼 이미징 및 트랜스펙션용
96 웰 마이크로 테스트 플레이트, 평평한 바닥 웰	Tarson	941196
	Agarose Sigma	A9539	AGE
용 Agarose 젤 전기 영동 어셈블리	GeNei	93	용 AGE
세균	ESCO Lifesciences	2120765	For transformation
염화칼슘	Merck	C4901	완충액 / 시약 준비
세포 배양 층	ThermoFischer Scientific	1323TS	세포 배양
용 세포 스크레이퍼	Genetix	90020	세포 배양
용 세포 스프레더	Fischer Scientific	12822775
1.5mL 튜브용 원심분리기	Eppendorf	EP5404000537
50mL 팔콘용 원심분리기	ThermoFischer Scientific	75004210
Chlorofrom	Fischer Scientific	67-66-3	RNA 분리용
CO2 인큐베이터	ThermoFischer Scientific	3110	세포 배양용
큐벳	Eppendorf	6138000018	플라스미드 농도 추정
CYTIVA IQ 500 gel imager	Cytiva	29655893	For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	For RNA isolation
Doxycycline	Merck	33429	induction of transfected cells
건식 가열 블록	Labnet		제한 효소의 형질전환 및 불활성화를 위해
Dulbecco's Modified Eagle Medium	National centre for cell science 세포 배		양을 위해
에탄올	Sigma-Aldrich	1.00983	완충액/시약 준비
Ethidium bromide	Sigma	E7637	AGE
용 Ethylenediamine tetraacetic acid	Fischer	Scientific 12635	Buffer / 시약 제제
Evos 명시야 현미경	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		합성 회로 Fetal
Bovine Serum	Gibco	16000-044	세포 배양용
FV31S-SW 소프트웨어	Olypmus		이미지 획득
Geneticin	Gibco		transfection을 위한
1563411 복제를 위한 Gibson 조립 방법	BIOMATIK		합성 회로의 구성
Graphpad 프리즘	Graphpad		통계 분석
고용량 cDNA 역전사 키트	ThermoFischer Scientific	cDNA 합성을 위한	4368814
Isopropanol	Fischer Scientific	13825	완충액 / 시약 준비
Kanamycin	Sigma	60615	형질 전환 및 식민지 선택
용 Luria Bertini 국물	Himedia	M1245	coli< / em>
Magnesium chloride	Fischer Scientific	BP214	버퍼 / 시약 준비
Micro Filt 수직 층류 기류	Microfilt
MicroAmp Fast 8-튜브 스트립, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	for qRT-PCR
MicroAmp 광학 8-캡 스트립	ThermoFischer Scientific	4323032	qRT-PCR
전자레인지 LG		MC-7649DW	For AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman 프로브
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman 프로브
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman 프로브
마우스 ELISA 키트 IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	ELISA
마우스 ELISA 키트 IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	ELISA
Multiskan Sky용 터치 스크린 + μ 드롭 플레이트	ThermoFischer Scientific	51119600DP	ELISA
MX-M 마이크로플레이트 믹서용 96웰 세포 배양 플레이트 믹서 조정 가능한 0-1500rpm 실험실용 셰이커 교반기	DIAB
국립 생명공학 정보 센터	합성	회로 건설을 위한
Neubauer's chamber	Marienfeld superior	640010	세포 수
비환기식 25cm2 flask	Corning	353014	생충 배양용
NotI	BioLabs	R3189M	제한 효소
뉴클레아제 자유수	Biodesign	1QIA	시약 준비
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 소프트웨어	올림푸스		이미지 프로세싱
Olympus FV 3000	Olympus		컨포칼 이미징용
OPTI-MEM 매체	Gibco	31985070	매체 합성
회로로 복제된 트랜스펙션 pEGFP-N1 벡터	배지 Biomatik
페니실린	ThermoFischer, Scientific	15070063	세포 배양용
폴리에틸렌이민	MERCK	764965	트랜스펙션용
칼륨 아세테이트	피셔 과학	YBP364500	완충액 / 시약 준비
칼	피셔 과학적	BP366	버퍼 / 시약 준비
인산칼륨 일염기	시그마	P5655	버퍼 / 시약 준비
전원 공급 장치 팩	BIORAD	1645070	For AGE
생물학적 부품	등록 https://parts.igem.org/Main_Page		합성 회로의 건설을 위해
RNAiso Plus	Takara	38220090	RNA 분리를 위해
RNase A	ThermoFischer Scientific	12091021	완충액 / 시약 준비
Roswell Park Memorial Institute 매체	세포 과학		기생충
배양 Shaker incubator	REMI	CIS 24 plus	배양용 E.coli
Sodium chloride		Q27605	시약 준비
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	완충액/시약 준비
수산화나트륨	Fischer Scientific	15895	버퍼/시약 준비
산나트륨 이염기성	시그마	S5136	버퍼/시약
준비 분광 광도계	Eppendorf		플라스미드 농도 추정
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Real Time PCR 시스템	생명 기술	272006777	qRT-PCR용
StepOne 소프트웨어 버전 2.3	qRT-PCR용	Life 기술
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), AmpErase UNG 없음	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			합성 회로 구성 및 시뮬레이션
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFischer Scientific	10488085	For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride	Himedia	MB029	Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTA	SERVA	42549.1	완충액 /시약 준비
Trypan 파란	시그마	T8154	세포 수를
XhoI	BioLabs	R0146S	제한 효소