방법 논문

동물 행동 평가와 컨볼루션 신경망의 통합으로 와사비-알코올 맛-냄새 상호작용 연구

DOI:

10.3791/66981

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2024년 8월 16일

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1State Key Laboratory of Environmental and Biological Analysis, Department of Chemistry, Hong Kong Baptist University, 2Guangdong-Hong Kong-Macao Joint Laboratory for Contaminants Exposure and Health, School of Environmental Science and Engineering, Institute of Environmental Health and Pollution Control, Guangdong University of Technology, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development of Natural Drugs, and School of Pharmacy, Guangdong Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 와사비로 인한 따끔거림에 대한 알코올 음료의 냄새를 맡을 때 억제 능력을 측정하는 일련의 방법에 대해 설명합니다.

초록

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음식 준비에 일반적으로 사용되는 상업용 와사비 페이스트에는 섭취 시 자극적인 감각을 유발하는 화학감각 이소티오시아네이트(ITC)의 상동 화합물이 포함되어 있습니다. 식이 알코올 음료의 냄새를 맡는 것이 와사비의 매운맛에 미치는 영향은 연구된 적이 없습니다. 대부분의 관능평가 연구가 개별 식품과 음료에 개별적으로 초점을 맞추는 반면, 와사비를 섭취할 때 술 냄새를 맡는 후각 연구에 대한 연구는 부족합니다. 여기에서는 동물 행동 연구와 컨볼루션 신경망을 결합하여 쥐가 술 냄새를 맡고 와사비를 섭취할 때 쥐의 얼굴 표정을 분석하는 방법론을 개발합니다. 그 결과, 훈련되고 검증된 딥 러닝 모델이 사전 교육 자료 필터링 없이 와사비 음성 주류 양성 그룹 클래스에 속하는 와사비와 알코올의 동시 처리를 묘사하는 이미지의 29%를 인식한다는 것을 보여줍니다. 선택된 비디오 프레임 이미지로부터 얻어진 쥐의 찡그린 얼굴 척도 점수의 통계적 분석은 술의 유무 사이에 유의한 차이(P < 0.01)를 보여줍니다. 이 발견은 식이 알코올 음료가 쥐에서 와사비 유도 반응을 감소시키는 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 이 조합 방법론은 향후 개별 ITC 화합물 스크리닝 및 스피릿 성분의 관능 분석에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 알코올에 의한 와사비 매운맛 억제의 기본 메커니즘을 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

서론

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일반적으로 와사비로 알려진 와사비아 자포니카는 식품 준비 1,2에서 인정을 받았습니다. 섭취 시 눈물, 재채기 또는 기침을 특징으로 하는 강렬한 감각 경험은 잘 알려져 있습니다. 와사비의 이러한 독특한 매운맛은 화학감각 이소티오시아네이트(ITC)의 상동 화합물에 기인할 수 있습니다. 이들은 ω-알케닐 및 ω-메틸티오알킬 이소티오시아네이트로 분류할 수 있는 휘발성 유기황 식물 화학 물질입니다3. 이러한 화합물 중 알릴 이소티오시아네이트(AITC)는 양 고추냉이 및 겨자와 같은 십자화과에 속하는 식물에서 발견되는 가장 우세한 천연 ITC 제품입니다4. 상업용 와사비 페이스트는 일반적으로 양 고추냉이로 제조되므로 AITC는 이러한 상업용 제품의 품질 관리에 사용되는 화학 마커입니다5.

식이 알코올 음료와 와사비를 넣은 요리를 함께 먹는 것은 문화적 성향의 한 예라고 할 수 있다6. 주관적으로 이 조합은 와사비와 증류주 사이의 매운맛과 열을 보완하여 전반적인 요리 경험을 향상시킬 수 있습니다. 동물 질적 행동 평가(QBA)는 단기 또는 장기 외부 자극에 대한 반응으로 피험자의 행동 변화를 수치 용어7를 사용하여 검사하는 포괄적인 전체 동물 방법론적 접근 방식입니다. 이 방법에는 통증 테스트, 운동 테스트, 학습 및 기억력 테스트, 설치류 모델8을 위해 특별히 설계된 감정 테스트가 포함됩니다. 그러나 후각과 함께 구음의 시너지 감각 평가를 조사한 연구는 지금까지 문헌에서 드물게 남아 있습니다 9,10. 화학감각에 관한 대부분의 연구는 개인의 식품과 음료 섭취를 개별적으로 조사하는 것에 국한되어 있다11. 따라서 와사비를 섭취하는 동안 술을 킁킁거리는 행위와 관련된 맛과 냄새의 상호작용에 대한 연구가 부족합니다.

와사비에 의한 찌르는 느낌은 통각(nociception)의 한 형태로 여겨지므로12, 동물행동평가는 설치류 동물의 통각감각반응을 평가하는 데 매우 적합하다 8,13,14. MGS(mouse Griace scale) 점수로 알려진 마우스의 통각을 평가하는 방법은 Langford et al.15,16에 의해 개발되었습니다. 이 행동 연구 방법은 실험 쥐가 보여준 얼굴 표정 분석에 의존하는 통증 관련 평가 접근 방식입니다. 실험 설정은 투명 케이지와 비디오 녹화를 위한 2개의 카메라를 포함하여 간단합니다. 자동 데이터 캡처를 위한 첨단 기술(17,18,19)을 통합함으로써 정량적 및 질적 행동 측정을 얻을 수 있어 행동 모니터링 중 동물 복지를 향상시킬 수 있습니다(20). 결과적으로, MGS는 중단되지 않고 임시방편적인 방식으로 동물에 대한 다양한 외부 자극의 영향을 연구하는 데 적용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 채점 과정에는 토론자가 평가할 수 있도록 몇 개(10개 미만)의 비디오 프레임 이미지만 선택되며 사전 교육이 필요합니다. 많은 수의 샘플 이미지를 스코어링하는 것은 노동 집약적일 수 있습니다. 이 시간 소모적인 문제를 극복하기 위해 여러 연구에서 MGS 점수21,22를 예측하기 위해 기계 학습 기술을 사용했습니다. 그러나 MGS는 지속적인 측정이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 다중 클래스 분류 모델은 와사비를 동시에 섭취하고 액체 냄새를 맡는 쥐의 이미지가 일반 쥐의 이미지와 유사한지 여부를 결정하는 것과 같은 논리적이고 범주적인 문제를 평가하는 데 더 적합합니다.

이 연구에서는 생쥐의 맛-냄새 상호작용을 조사하는 방법론을 제안하였다. 이 방법론은 동물 행동 연구와 CNN(Convolutional Neural Network)을 결합하여 쥐 피험자의 얼굴 표정을 분석합니다. 두 마리의 쥐가 정상적인 행동 조건에서, 와사비에 의한 통각을 경험하는 동안, 그리고 특별히 설계된 케이지에서 술을 냄새를 맡는 동안 세 번 관찰되었습니다. 생쥐의 얼굴 표정은 비디오로 녹화되었으며, 생성된 프레임 이미지는 딥 러닝(DL) 모델의 아키텍처를 최적화하는 데 활용되었습니다. 그런 다음 독립적인 이미지 데이터 세트를 사용하여 모델을 검증하고 실험 그룹에서 획득한 이미지를 분류하기 위해 배포했습니다. 쥐가 와사비 섭취 중 동시에 술 냄새를 맡았을 때 와사비 톡 쏘는 맛이 억제되는 정도를 확인하기 위해 인공 지능이 제공하는 통찰력은 다른 데이터 분석 방법인 MGS 점수16점과의 교차 검증을 통해 더욱 확증되었습니다.

프로토콜

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이 연구에서는 체중이 17-25g 사이인 7주 된 ICR 수컷 마우스 두 마리를 동물 행동 평가에 활용했습니다. 모든 주거 및 실험 절차는 교육 및 연구에서 인간 및 동물 피험자 사용에 관한 홍콩 침례 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 동물실은 25°C의 온도와 40%-70%의 실내 습도로 12시간 명암 주기로 유지되었습니다.

1. 케이지 디자인

  1. 케이지 구성을 위해 8mm x 8mm x 2mm, 16mm x 16mm x 6mm, 32mm x 16mm x 6mm의 3가지 치수로 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌 벽돌을 준비합니다.
  2. 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌 플레이트(312mm x 147mm x 2mm)를 케이지 베이스로 준비합니다.
  3. 바닥판으로 사용하는 239mm 두께의 107mm x 2mm 불투명 아크릴판을 준비합니다.
  4. 천판으로 사용하는 239mm x 107mm 두께의 5mm 투명 아크릴 판을 준비합니다.
  5. 단자판으로 사용하는 107mm 두께의 50mm x 7mm 투명 아크릴 판을 준비합니다.
  6. 벽돌을 54mm 높이로 쌓아 불투명한 측벽 2개를 건설하세요.
  7. 그림 1A와 같이 아크릴 플레이트를 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌 기반 케이지에 내장합니다.
  8. 그림 1B와 같이 두께가 2mm인 90mm x 50mm 투명 아크릴 판 5개로 구성된 차우 챔버를 준비합니다. 5 개의 투명 아크릴 판 중 측면에 2 판, 상부에 1 판, 하단에 1 판, 단자에 1 판을 사용합니다.
  9. 60mm x 50mm 2mm 투명 아크릴 판을 차우 소개 접시로 준비하여 차우의 방에 넣습니다.

2. 동물행동평가

  1. 7주 된 ICR 수컷 쥐 2마리의 새끼를 일반 케이지에 함께 넣습니다.
  2. 2마리의 새끼 쥐에게 1주일의 적응 기간 동안 음식 펠릿과 수돗물을 무료로 이용할 수 있도록 합니다.
  3. 1주일 후, 에탄올 한 병(~40% v/v)으로 생쥐 2마리의 새끼를 소개합니다.
    알림: 음주가 제한되는 동안 제공된 수성 에탄올을 임시 로 냄새를 맡거나 흡입하는 것만 허용되는지 확인하십시오.
  4. 9-10주 된 마우스 모델과 그림 1A에 표시된 투명한 큐비클 케이지를 사용하여 행동 실험을 수행합니다.
  5. 모든 아크릴 판과 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌 판을 분해하고 철저히 청소하십시오. 먼저 초순수로 3번 이상 헹구고 종이 타월로 말리십시오. 그런 다음 75% 에탄올을 뿌린 다음 렌즈 종이로 청소합니다. 마지막으로 최소 15분 동안 자연 건조시킵니다.
  6. 행동 실험을 각 복제하기 전에 쥐의 무게를 측정하고 체중을 기록합니다.
  7. 시판되는 와사비 1g과 땅콩 버터 4.5g의 무게를 달아 와사비와 땅콩 버터의 혼합물을 갓 준비합니다. 지퍼 비닐 봉지에 섞는다.
    참고: 와사비에 함유된 이소티오시아네이트의 휘발성으로 인해 상업용 와사비는 -20°C 냉동고에 보관하는 것이 중요합니다.
  8. 그림 1B, C와 같이 무게를 측정하여 0.5g 땅콩 버터 페이스트 2개 또는 와사비와 땅콩 버터의 혼합물을 차우 소개 플레이트에 제공합니다.
  9. 그림 1B, C와 같이 준비된 차우 소개 플레이트를 차우의 챔버에 놓아 2마리의 마우스가 각 비디오 녹화 세션 동안 음식에 애드리비텀으로 접근할 수 있도록 합니다.
  10. 그림 1B, C와 같이 동시 흡입을 용이하게 하기 위해 아래 홈에 30mL의 액체(순수한 물 또는 액체(~42% v/v 에탄올))를 채웁니다.
  11. 각 단말기의 전화기 거치대에 놓인 2대의 스마트폰에 있는 카메라를 사용하여 녹화를 시작합니다.
    참고 : 비디오의 사양은 다음과 같습니다 : 프레임 너비, 1920; 프레임 높이, 1080; 데이터 속도, 20745kbps; 프레임 속도, 초당 30.00프레임(FPS).
  12. 훈련된 2마리의 새끼 쥐를 위에서 설계된 동물 행동 연구 플랫폼에 조심스럽게 배치하고 즉시 상판으로 케이지를 고정합니다.
    참고: 이 단계가 15초 이내에 완료되어야 합니다.
  13. 각 비디오를 2-3분 동안 녹화합니다.
    참고: 땅콩 버터-와사비 혼합물 준비부터 비디오 녹화 완료까지 실험의 전체 시간이 5분으로 제한되어 있는지 확인하십시오.
  14. 전체 실험을 3회 반복합니다.
    참고: 실험의 각 반복실험이 최소 6시간 동안 분리되어 있는지 확인하십시오.
  15. 다양한 시나리오를 모방합니다.
    참고: 예를 들어, 이 작업에서는 한 쌍의 쥐를 4개의 다른 시나리오로 4개 그룹으로 나누어 사용했으며, 위에서 설명한 실험 설정을 사용하여 모방했습니다. 이러한 시나리오에는 배경 연구에 대한 시나리오 A, 양성 대조 연구에 대한 시나리오 B, 와사비-알코올 맛-냄새 상호 작용 연구에 대한 시나리오 C, 음성 대조 연구에 대한 시나리오 D가 포함됩니다. 표 1 은 이러한 시나리오에 대한 요약을 제공합니다.

3. 이미지 인식

이미지 처리 23,24,25에 대한 많은 연구와 유사하게, 분류 모델은 CNN을 훈련시킴으로써 얻어졌다. DL 작업을 위한 스크립트는 Jupyter Notebook(anaconda3)에서 Python v.3.10으로 작성되었습니다. 다음 GitHub 저장소에서 사용할 수 있습니다: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. CNN을 구성하고 훈련시키기 위해 numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 및 keras v.2.11.0을 포함한 오픈 소스 라이브러리가 사용되었습니다. 이러한 라이브러리는 이미지 인식을 위해 CNN을 개발하고 훈련하는 데 필요한 도구와 기능을 제공했습니다.

  1. 수집된 비디오 클립에서 일련의 비디오 프레임 이미지를 내보내어 제공된 Jupyter Notebook( Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb)을 사용하여 모델 학습을 위한 데이터 세트를 생성합니다.
  2. 제공된 페이스트를 사용하는 마우스가 1개 이상 있는 이미지만 선택하십시오. 선택된 이미지의 예는 보충 그림 1, 보충 그림 2, 보충 그림 3, 보충 그림 4, 보충 그림 5, 보충 그림 6 및 보충 그림 7에 제공된다.
  3. Jupyter Notebook에 제공된 스크립트(Step2_DataAugmentation.ipynb)를 구현하여 생성된 이미지를 가로로 대칭 이동하여 데이터 증강을 수행합니다.
  4. 외부 독립 CNN 모델 검증을 위해 각 초 반복실험의 이미지 데이터를 예약합니다. 첫 번째 및 세 번째 반복실험의 이미지를 내부 모델 훈련 및 테스트에 사용합니다.
  5. 이미지 크기 조정, 검정색 변환 및 이미지 신호 정규화를 포함하여 Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb라는 Jupyter Notebook에서 스크립트를 실행하여 CNN 모델링에 사용되는 이미지 데이터를 전처리합니다.
  6. 교육 자료를 내부 교육 및 테스트 데이터 세트로 무작위로 8:2 방식으로 분할합니다.
  7. CNN의 아키텍처를 초기화합니다. 검사할 시나리오의 수에 따라 CNN의 출력 수를 설계합니다.
    참고: 예를 들어, 이 연구에서 신경망은 3가지 클래스를 분류하도록 지정되었습니다. 클래스 가중치에 대한 데이터 불균형을 처리하기 위한 스크립트가 컴파일되었는지 확인합니다.
  8. CNN 구성을 위한 내부 테스트 샘플에서 손실을 최소화하는 하이퍼파라미터 조합을 찾습니다.
  9. CNN 아키텍처를 구성하기 위한 최적의 하이퍼파라미터 조합을 채택합니다.
  10. 제공된 Jupyter Notebook Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb 및 Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb를 엽니다. 동물 행동 실험의 두 번째 반복에서 독립된(원본 및 뒤집힌) 이미지를 사용하여 얻은 모델을 검증합니다.
  11. Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb를 사용하여 실험 그룹에서 생성된 비디오 프레임 이미지를 분류하기 위해 획득되고 검증된 모델을 배포합니다.
    참고: 예를 들어, 이 작업에서는 시나리오 C입니다.

4. 수동 마우스 찡그린 얼굴 스케일 채점

참고: CNN 모델 예측이 제공하는 통찰력을 검증하기 위해, Langford et al.이 이전에 개발하고 검증한 또 다른 방법이 적용되었다16. 이 방법은 5가지 특정 마우스 안면 행동 단위(AU)인 안와 조임, 코 팽창, 뺨 팽창, 귀 바깥쪽 조임 및 수염 변화)를 기반으로 MGS를 채점하는 것을 포함합니다. 각 AU에는 0, 1 또는 2의 점수가 할당되며, 이는 각각 AU의 부재, 보통 존재 또는 명백한 존재를 나타냅니다. 이 채점 시스템을 사용하면 각 AU를 정량화하고 스케일링하여 마우스가 경험한 통각 또는 불편함 수준을 평가할 수 있습니다.

  1. 각 비디오 클립에 대한 페이스트를 섭취하는 쓰레기의 비디오 프레임 이미지 3개를 캡처합니다. 각 프레임이 3초 이상 떨어져 있어야 합니다.
  2. 블라인드 코드를 만들고 "shuffleSlides.pptm"(보충 파일 1)이라는 제공된 템플릿 파일을 사용하고 포함된 매크로 코드를 실행하여 서로 다른 시나리오 클래스의 이미지를 순서대로 임의로 재정렬합니다.
  3. 최소 10명의 토론자를 초대하여 샘플 이미지에 점수를 매기도록 합니다.
  4. MGS를 사용하여 이미지 샘플의 점수를 매기도록 토론자를 교육합니다. 패널리스트에게 MGS 및 매뉴얼15,16에 관한 원본 기사가 포함된 교육 자료를 제공합니다.
  5. 해당 5개의 얼굴 AU의 모든 점수 점수를 평균하여 캡처된 프레임에서 각 동물 피험자의 MGS 점수를 계산합니다. MGS 점수를 SEM (SEM)의 평균 ± 표준 오차로 제시합니다.
  6. Bonferroni의 다중 비교 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석(ANOVA)을 통해 서로 다른 시나리오 클래스 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는지 여부를 확인합니다.
    참고: P < 0.05 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구의 주요 목적은 생쥐의 미각-후각 상호 작용을 조사하기 위한 강력한 프레임워크를 확립하는 것입니다. 이 프레임워크는 인공 지능과 QBA의 사용을 통합하여 예측 분류 모델을 개발합니다. 또한 DL에서 얻은 통찰력은 내부 독립 분석을 위해 정량적 MGS 평가와 교차 검증됩니다. 이 방법론의 주요 응용 프로그램은 쥐가 식이 알코올 음료의 냄새를 맡을 때 와사비 호출 통각의 억제 정도를 조사하는 것입니다.

딥 러닝 모델에 의한 wasabi-negative liquor-positive group의 클래스에 속하는 wasabi-alcohol co-treatment 이미지의 29% 인식
안면 과잉 반응은 상업적인 와사비 페이스트 섭취 시 인간에게 발생할 수 있습니다. 유사한 경험은 생쥐에서도 관찰될 수 있다(보충 비디오 1). 통각 감각은 설치류의 얼굴 표정과 밀접한 관련이 있기 때문에 상업용 와사비가 함유되거나 없는 차우를 제공받았을 때 반응을 결정하기 위해 2마리의 새끼 고양이의 행동을 모니터링했습니다. 이 연구에서 CNN은 DL 기술을 사용하여 훈련되었습니다. 각 시나리오에 대해 3번의 반복실험이 수행되었기 때문에 1차 및 3차 반복의 이미지 자료는 CNN 모델 하이퍼파라미터 튜닝 및 모델링 내부 교육 및 테스트에 사용되었습니다. 이 연구에서 CNN 아키텍처의 진화는 표 2에 자세히 설명되어 있습니다. CNN의 최적화된 아키텍처는 268 x 268 픽셀 해상도의 입력 계층과 각각 8개의 필터가 있는 4개의 2차원 컨볼루션 계층으로 구성되었습니다. 또한 2개의 풀링 레이어, 2개의 드롭아웃 레이어, 플래트닝 레이어 및 2개의 조밀한 레이어가 3등급 분류 작업을 위해 통합되었습니다. CNN 아키텍처에 대한 보충 파일 2를 참조하십시오.

이 연구의 모델은 35,486개의 이미지로 구성된 데이터 세트를 사용하여 훈련되었으며 7개의 epoch에 걸쳐 8,872개의 이미지에 대해 테스트되었습니다. 내부 훈련 및 테스트 데이터 세트에 대한 손실, 정밀도-재현율, 정밀도 및 민감도(또는 재현율)와 같은 메트릭을 포함하여 훈련 중 훈련된 모델의 성능은 보충 그림 8A-D에서 볼 수 있습니다. 이 모델은 내부 훈련 및 테스트 세트 모두에 대해 정확도, 정밀도 및 민감도 1을 입증했습니다. 이는 모델의 예측이 내부 교육 및 테스트 데이터 세트 모두에서 이미지의 실제 클래스와 일치했음을 나타냅니다. 모델 훈련 후, 2차 반복실험의 이미지를 사용하여 달성된 CNN 모델에서 과적합이 문제가 되지 않는지 확인하고 독립적으로 검증했습니다. 이 모델은 배경 연구(시나리오 A)에서 4,820개 이미지, 양성 대조군 연구(시나리오 B)에서 3,900개 이미지, 음성 대조군 연구(시나리오 D)에서 2,731개 이미지에 대해 정확도, 정밀도 및 민감도 값 1로 예측의 견고성을 보여주었습니다. 달성된 예측 모델은 생쥐가 증류주를 냄새를 맡고 와사비 함유 땅콩 버터를 섭취하는 비디오 프레임 이미지(시나리오 C)를 다른 연구 시나리오, 즉 시나리오 A, B 및 D로 분류하기 위해 배포되었습니다. 그 결과, 이미지의 0%와 29%는 각각 배경 연구 등급(시나리오 A, 순수한 물과 와사비 없는 땅콩 버터 존재)과 음성 대조군 연구(시나리오 D, 중국 증류주 및 와사비 없는 땅콩 버터 존재)로 분류되었으며, 이미지의 71%는 양성 대조군 등급(시나리오 C, 순수한 물과 와사비-땅콩 버터 혼합물이 존재)으로 분류되었습니다. 이러한 발견은 식이 주류의 존재가 쥐에서 와사비 유발 통각을 감소시킬 수 있음을 암시합니다. 기계가 제공된 교육 자료에서 학습한 내용을 평가하기 위해 각 컨볼루션 계층에 대해 기능 맵이 생성되었습니다. 보충 그림 9A-D에 묘사된 바와 같이, 기계의 관심은 눈의 안와, 코, 뺨과 몸의 가장자리, 귀, 그리고 차우의 접촉면과 같은 다양한 얼굴 특징에 집중되는 것으로 관찰되었습니다. 이러한 관찰을 바탕으로 또 다른 데이터 분석 방법인 MGS가 수행되었습니다. MGS는 쥐의 안면 AU에 초점을 맞추어 통계적 평가와 와사비 유발 통각에 알코올 음료를 제시하는 억제 능력에 대한 추가 검증을 가능하게 합니다.

수동 마우스 찡그린 얼굴 척도 점수는 기계 학습 예측을 통계적으로 검증합니다.
와사비 유발 통각의 강도는 MGS 점수를 사용하여 평가되었으며, MGS 점수는 0에서 2까지의 점수를 할당하며, 점수 0은 가장 심각하지 않은 반응을 나타내고 점수 2는 가장 심각한 반응을 나타냅니다. 이 연구에서 24 마리의 마우스 (즉, 2 마리의 마우스는 보충 그림 10, 보충 그림 11, 보충 그림 12, 보충 그림 13 으로 선택된 12 개의 이미지에 제시됨)는 22 명의 훈련 된 패널리스트에 의해 평가되었습니다. 세 가지 실험을 통해 2마리의 마우스의 littermate를 분석한 결과, 배치 내 정밀도와 배치 간 정밀도의 상대 표준 유도율이 각각 0%-25% 및 9%-33% 범위인 것으로 나타났습니다. 이는 MGS 채점 과정에서 우수한 정밀도와 일관성을 나타냅니다. 땅콩 버터 페이스트 (그림 3A, 0.73 ± 0.04)와 와사비와 땅콩 버터의 혼합물을 제공 한 쥐 (그림 3B, 1.59 ± 0.11)의 MGS 점수 사이에 상당한 차이가 관찰되었습니다. 이는 동물 행동 연구를 위한 실험 설정을 검증하고 통각 반응을 유도하는 와사비의 효능을 확인합니다. 제공된 알코올 음료(알코올의 ~42% v/v)에서 방출되는 알코올 증기가 자극적일 수 있지만 MGS 점수(그림 3D, 0.86 ± 0.16)는 대조군(그림 3A, 0.73 ± 0.04)에 비해 유의한 차이를 보이지 않았습니다. 그러나 와사비-땅콩 버터 혼합물을 제공 한 마우스의 MGS 점수 (그림 3B, 1.59 ± 0.11)와 와사비 섭취 중 알코올 증기에 노출 된 마우스 (그림 3C, 0.95 ± 0.07) 사이에 < 0.05의 P 값이 관찰되었습니다. 이러한 연구 결과는 와사비와 알코올 음료를 함께 사용하면 와사비로 인한 자극을 잠재적으로 줄일 수 있음을 시사하며, 이는 인공 지능의 관점과 일치합니다. 와사비의 매운 맛을 억제하는 데 기여하는 제공된 중국 증류주 내의 효과적인 성분을 조사하기 위한 추가 조사가 필요하며, 이는 에탄올의 존재에 기인할 수 있습니다.

이미 사용할 수 있는 코드의 예입니다. 현재 제출과 관련된 이미지 인식을 수행하기 위한 모든 코드는 공개 GitHub 리포지토리(git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git)에서 사용할 수 있습니다. 모든 업데이트는 이 작업의 최종 DOI에 대한 인용과 함께 GitHub 리포지토리에도 게시될 예정이다.

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그림 1: 통증 관련 동물 행동 연구를 위한 실험 설정. (A) 각 단말기에 설치된 전화기 스탠드에 설치된 2대의 스마트폰에 있는 카메라를 사용하여 2마리의 쥐의 얼굴 표정을 비디오로 녹화하기 위한 전체 설정. (B) 0.5g의 땅콩 버터 페이스트 2개 또는 와사비와 땅콩 버터의 혼합물을 생쥐 2마리에게 임시 로 제공하는 데 사용되는 차우 챔버를 사용하고, 30mL의 액체(물 또는 ~42% v/v 액체)를 페이스트 아래의 홈에 채워 동시 흡입을 위해 했습니다. (C) 30mL의 액체로 채워지고 와사비-땅콩 버터 혼합물 2 페이스트가 들어있는 홈을 자세히 살펴 봅니다. 혼합물은 4.5g의 땅콩 버터에 1g의 상업용 와사비를 혼합하여 제조하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 컨볼루션 신경망 모델의 아키텍처와 입력 및 출력. 배경 연구를 위한 시나리오 A, 양성 대조군 연구를 위한 시나리오 B, 음성 대조군 연구를 위한 시나리오 D를 포함하여 3가지 다른 시나리오의 이미지가 훈련에 사용되었습니다. 와사비-알코올 맛-냄새 상호작용 연구를 위한 시나리오 C의 이미지는 모델 학습 후 시나리오 A, B 또는 D로 분류되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 : 다른 차우를 제공 한 쥐의 MGS (Mouse Griace Scale) 점수. MGS 점수는 0에서 2까지이며, 점수 0은 가장 덜 심각하고 점수 2는 가장 심각한 것을 나타냅니다. 참조 MGS 척도는 Langford et al. (2010)16에서 조정되었습니다. (A) 땅콩 버터를 섭취하도록 제공된 쥐의 찡그린 얼굴은 0.73 ± 0.04; (B) 섭취를 위한 와사비와 땅콩 버터의 혼합물(땅콩 버터 4.5g에 상업용 와사비 1g)은 1.59 ± 0.11을 기록했습니다. (C) 섭취를 위한 와사비와 땅콩 버터의 혼합물, 제공된 증류주(알코올의 ~42% v/v)에서 알코올을 흡입할 수 있는 동안, 점수는 0.95 ± 0.07; (D) 제공된 증류주 아래에서 알코올을 흡입할 수 있는 동안 섭취하기 위한 땅콩 버터는 0.86 ± 0.16을 기록했습니다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ns, 95% 신뢰 구간에서 Bonferroni의 다중 비교 사후 검정과 함께 일원 분산 분석을 통해 유의한 차이가 없습니다. 오차 막대는 표준 측정 오차(SEM)를 나타냅니다. 각 시나리오에서 2마리의 마우스에 대해 세 번의 측정을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 동물 행동 평가에서 모방된 4가지 시나리오의 요약. 비고: a 이 혼합물은 시판용 와사비 1g을 땅콩 버터 4.5g에 섞어 제조하였다. b ~42% v/v 알코올을 함유한 중국 증류주. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 모델 성능 요약. 배치 크기 64의 하이퍼파라미터, 드롭아웃을 따르지 않는 1번째 2D 컨볼루션 레이어의 필터 번호 8, 2번째 2D 컨볼루션 레이어의 필터 번호 8, 0.1 드롭아웃이 있는 3번째 2D 컨볼루션 레이어 8의 필터 번호, 4번째 2D 컨볼루션 레이어의 필터 번호 8, 그리고 0.5 드롭아웃이 있는 64의 조밀한 층의 필터 수는 내부 분할 테스트 세트에 대해 가장 낮은 손실을 산출했습니다. 그런 다음 이러한 하이퍼파라미터를 채택하여 시나리오 C의 이미지를 예측하기 위한 3그룹(시나리오 A, B 및 D) 분류 모델을 훈련했습니다. 시나리오 A는 배경 연구를 위한 것이었습니다. 시나리오 B는 양성 대조군 연구를 위한 것이었습니다. 시나리오 D는 음성 대조군 연구를 위한 것이었습니다. 시나리오 C는 와사비-알코올 맛-냄새 상호작용 연구를 위한 것이었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 시나리오 A 클래스의 딥 러닝을 위한 예제 교육 자료(배경 학습). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 시나리오 B(positive control study) 클래스의 딥 러닝을 위한 예제 교육 자료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 시나리오 D(negative control study) 클래스의 딥 러닝을 위한 예제 교육 자료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 모델 검증을 위한 시나리오 A(배경 연구) 클래스의 예측 및 예제 독립 자료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 5: 모델 검증을 위한 시나리오 B(양성 대조군 연구) 클래스의 예측 및 예제 독립 재료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: 모델 검증을 위한 시나리오 D(음성 대조군 연구) 클래스의 예측 및 예제 독립 자료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 7: 모델 적용을 위한 시나리오 C(와사비-알코올 맛-냄새 상호작용 연구) 클래스의 예측 및 예제 자료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 8: 최적의 딥 러닝 모델의 예측 성능. (A) 7 Epoch에 따른 학습 손실 및 내부 검증 손실; (B) 정밀도-재현율 곡선, (C) 정밀도 및 (D) 7개의 Epoch에 따른 교육 및 내부 검증 회상. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 9: 각 컨볼루션 레이어의 기능 맵. 시나리오 A, B, D에서 (A) 첫 번째, (B) 두 번째, (C) 세 번째, (D) 마지막 컨볼루션 레이어의 기능 맵은 위에서 아래로 정렬됩니다. 시나리오 A는 배경 연구를 위한 것이었습니다. 시나리오 B는 양성 대조군 연구를 위한 것이었습니다. 시나리오 D는 음성 대조군 연구를 위한 것이었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 10: 시나리오 A(배경 연구)에 대한 수동 마우스 찡그린 얼굴 척도 점수를 위해 선택한 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 11: 시나리오 B(양성 대조군 연구)에 대한 수동 마우스 찡그린 얼굴 척도 점수를 위해 선택한 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 12: 시나리오 C(와사비-알코올 맛-냄새 상호 작용 연구)에 대한 수동 마우스 찡그린 얼굴 척도 점수를 위해 선택한 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 13: 시나리오 D(음성 대조군 연구)에 대한 수동 마우스 찡그린 얼굴 척도 점수를 위해 선택한 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1 : 와사비 섭취 후 쥐의 찡그린 얼굴은 아래에 제공된 알코올 음료의 유무에 따라 움츠러듭니다. 0초에서 8초까지, 비디오 클립은 땅콩 버터를 섭취한 쥐의 정상적인 얼굴 표정을 보여주었습니다. 8초부터 17초까지, 그것은 와사비를 섭취할 때 쥐의 찡그린 얼굴을 보여주었습니다. 생쥐는 안와 조여짐, 코가 부풀어 오르고, 뺨이 부풀어 오르고, 귀가 바깥쪽으로 조여지고, 수염이 변하는 것을 보였다. 17초부터 29초까지, 그것은 와사비에 의해 유발된 통각이 정신이 아래에 있을 때 억제될 수 있음을 보여주었다. 29초부터 끝까지 위에서 설명한 다양한 시나리오에서 찡그린 얼굴 모음을 보여주었습니다. 제공된 비디오는 설명용으로만 사용됨을 유의하시기 바랍니다. 그 품질은 이미지 인식 및 모델링에 대해 설명된 품질 요구 사항과 다릅니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: shuffleSlides.pptm. "shuffleSlides.pptm"이라는 추가 Microsoft PowerPoint 매크로 사용 프레젠테이션. 이 파일은 쥐의 찡그린 얼굴 척도 점수 매기기의 블라인드 테스트를 위해 이미지를 섞기 위해 준비되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: CNN 아키텍처. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서 미각-후각 상호작용을 연구하기 위해 제안된 방법은 Langford et al.16에 의해 개발된 생쥐의 통증 얼굴 표정을 위한 행동 코딩의 원래 방법을 기반으로 합니다. 최근에 발표 된 여러 기사는 자동 마우스 얼굴 추적 및 후속 MGS 점수 21,26,27,28에 대한 CNN을 소개했습니다. CNN을 적용하면 예측 모델을 훈련하는 데 사용할 수 있는 일련의 비디오 프레임 이미지를 생성하는 데 사용할 수 있기 때문에 독창적인 방법보다 이점이 있습니다. 대조적으로, 원래 방법은 MGS를 위해 제한된 수의 이미지를 미리 선택해야했기 때문에 주관성과 편견이 발생할 수 있습니다.

이전에 발표된 CNN 기반 방법 중에서, 모든 방법은 혈액 순환에 직접적인 통증 유발 물질 주입에 대한 고통 또는 불편함의 정도를 평가하기 위해 개발되었다26,28. 이 약물 도입 접근법의 한 가지 단점은 마우스의 얼굴 프로필을 캡처하지 않는 비디오 프레임 이미지를 필터링하는 데 상당한 노력이 필요하다는 것입니다. 본 연구에서는 통각유발물질인 시판와사비(commercial wasabi)를 애드리비텀(ad libitum)으로 제공하였다. 휘발성 성분인 AITC를 가리는 것 외에도 땅콩 버터는 쥐 피험자가 선명한 정면 제스처를 제시하도록 유인할 수 있어 비디오 녹화 중에 얼굴 프로필을 쉽게 캡처할 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 바늘 삽입으로 인한 통증으로 인한 잠재적인 간섭을 제거합니다. 그러나 마우스의 섭취 동작이 코 팽창 및 뺨 팽창에 대한 MGS 점수를 방해 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 문제를 해결하려면 쥐에게 순수한 땅콩 버터를 제공하여 기본 대조 실험을 수행해야 합니다.

동물 행동 연구를 위한 특정 CNN 기반 알고리즘에서는 훈련 이미지에서 쥐 얼굴 행동 단위의 하위 집합만 선택되고 캡처되도록 프로그래밍됩니다21,22. 이러한 계산 방법은 통각 감각과 관련된 사전 정의된 기능에 의존하는 동시에 개별 마우스 피험자에 특정한 다른 중요한 기능을 무시할 수 있습니다. 결과적으로 정보 손실로 이어질 수 있습니다. 대조적으로, 이 연구는 전체 마우스 얼굴 이미지를 사용하여 CNN 모델을 훈련시키는 다른 접근 방식을 취합니다. 이 이미지 전용 사용(IOU) 기반 방법은 이미지 분류25에 더 효율적인 것으로 나타났습니다. 따라서, 본 연구에서 제안된 CNN 모델링 접근법은 먼저 지역 주석 없이 전체 이미지를 사용하여 CNN 모델을 훈련시킨 다음 수동 인간 평가를 통해 모델을 검증하는 일부 제안된 방법과 유사하다(27,29). 이 접근 방식은 이미지에 더 많은 정보를 유지하고 주관성이 도입되는 것을 방지할 수 있습니다.

그러나 이 연구에서 실험 설정의 한계는 쥐 피험자들이 개별 서식지가 아닌 2의 새끼 고양이로 수용되었다는 것입니다. 이 결정은 쥐가 사회적 동물이며 일반적으로 그룹 환경에서 번성한다는 점을 고려하여 의도적이었습니다. 흥미로운 발견은 동물 훈련 기간 동안 3 개의 케이지 중 1 개의 케이지에서 2 마리의 새끼 고양이 만이 중국 영혼의 존재에 적응하도록 훈련되었다는 것입니다. 그 결과, 이 2마리의 새끼에 대해서만 3회 실험만 수행되었습니다. CNN 모델링을 위한 교육 자료의 경우, 2마리의 새끼를 모두 포함하는 개별 이미지도 세분화를 수행하지 않고 개별 샘플로 취했습니다. 이 접근 방식을 통해 새끼 간의 상호 작용을 포착하고 얼굴 표정과 함께 그들의 행동을 집합적으로 분석할 수 있었습니다.

이미지 기반 MGS 채점 방법과 유사하게, 본 연구에서 제안된 방법은 고양이 및 말과 같은 다른 종류의 동물로 이전될 수 있을 것으로 예상된다30,31. 제안된 방법론을 적용함으로써, 컴퓨터 비전을 적용한 음식 유도 차우 도입 방법은 동물 행동 연구, 특히 다양한 동물의 맛-냄새 상호 작용을 촉진하는 접근 방식이 될 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Cai는 Kwok Yat Wai Endowed Chair of Environmental and Biological Analysis의 설립을 위한 Kwok Chung Bo Fun Charitable Fund의 재정적 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올 (EtOH)VWR 화학 BDHCAS # 64-17-5
아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌 벽돌Jiahuifeng 플래그십 스토어https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌 플레이트Jiahuifeng 플래그십 스토어https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
알릴 이소 티오 시아네이트 (AITC)시그마-알드리치CAS# 57-06-7
무수 디메틸 설폭사이드시그마-알드리치CAS# 67-68-5
중국 정신Yanghe Qingcihttps://www.chinayanghe.com/article/45551.html
상업용 와사비S& B 식품 INC.
포름산 (FA)VWR 화학 물질 BDHCAS # 64-18-6
GraphPad 프리즘 5GraphPadhttps://www.graphpad.com
HPLC 등급 아세토 니트릴 (ACN)VWR 화학 물질 BDHCAS # 75-05-8
HPLC 등급 메탄올 (MeOH)VWR 화학 BDHCAS # 67-56-1
Microsoft Excel 2016마이크로 소프트https://www.microsoft.com 
Microsoft PowerPoint 2016Microsofthttps://www.microsoft.com
Milli-Q 급수 시스템Milliporehttps://www.merckmillipore.com
Mouse: ICRLaboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)N/A
땅콩 버터스키피https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
파이썬 v.3.10파이썬 소프트웨어 재단https://www.python.org 
투명 아크릴 플레이트Taobao Storehttps://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797
0 & spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM
EHU
https://www.sbfoods-worldwide.com

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