이 프로토콜은 아가미에서 개복술을 통해 복제된 돼지 배아를 이식하는 데 사용되는 수술 기술의 적용을 설명합니다.
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이 프로토콜은 아가미에서 개복술을 통해 복제된 돼지 배아를 이식하는 데 사용되는 수술 기술의 적용을 설명합니다.
이 프로토콜은 복제된 돼지 배아를 난관으로 이식하는 수술 기술을 시연하는 것을 목표로 하며, 이는 생물 의학 연구를 위한 유전자 변형 돼지 생산에 널리 사용되는 방법입니다. 9마리의 길트는 체세포 핵 전달(SCNT)에 의해 생성된 복제 배아를 2일째에 최대 4개의 세포 단계에서 난관으로 이식하기 위해 호르몬 동기화 및 개복술을 받았습니다. 임신 진단은 이식 수술 30일 후 초음파 검사를 통해 시행되었습니다. 수술을 받은 9명 중 6명은 초음파 검사에서 임신 징후를 보였다. 그러나 에코그래피에서 평가한 바와 같이 태아 발달에 진전이 없었기 때문에 길트는 생물학적 물질 수집 및 생식기관 평가를 위해 60일째에 부검을 받았습니다. 자궁 뿔, 난소 및 난관에서 유착이 관찰되었습니다. 안락사된 두 마리의 자궁 내강에서 재태 연령이 12일에서 20일 사이인 1개와 4개의 배아 구조를 얻었다. 이식된 배아의 수와 질을 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받는 복제 돼지 배아의 낮은 효율성에 기인하는 것으로 보이는 살아있는 새끼 돼지가 없음에도 불구하고, 제시된 수술 기법은 빠르고 안전한 것으로 입증되었습니다.
돼지는 인간과 해부학적, 생리학적, 유전적 유사성으로 인해 생물의학 연구를 위한 훌륭한 실험 모델입니다1. 이 동물은 인간에게 이식 할 때 거부 반응의 위험이 낮은 장기, 세포 또는 조직을 생산하려는 의도로 이종 이식과 관련된 연구에 자주 사용되었습니다. 이종장기이식 연구는 인간 이식을 위한 장기 공급을 증가시켜 환자 대기자를 줄이는 것을 목표로 한다2.
이종 이식을 위한 돼지 생산에는 유전자 편집된 돼지 세포에서 클론을 생산하는 것을 포함하여 여러 단계가 포함됩니다. 유전자 변형된 복제 배아의 시험관 내 생산 후, 배아는 새로운 개념3의 수용 및 임신을 위한 자궁 생리를 준비하기 위해 동기화된 발정 주기를 가진 암퇘지의 생식계로 이식된다.
돼지에서의 배아 이식은 비침습적 또는 침습적 방법으로 수행할 수 있다4. 비침습적 방법 중에는 외과적 개입이 필요하지 않은 경경부 이식이 있습니다. 그러나, 이 방법은 후기 발달 단계(즉, 모룰라 또는 배반포 단계)에서 배아를 이식하는 것으로 제한되며, 카테터 삽입 부위 또는 배아 침착물의 정확한 측정을 허용하지 않는다5. 복강경 검사와 개복술은 배아 이식의 침습적 방법으로 간주됩니다. 복강경 검사는 덜 침습적이지만 구체적이고 값비싼 장비가 필요하며, 생식 구조 조작의 어려움및 사용되는 카테터 유형과 같은 다양한 요인으로 인해 효율성이 상당히 다양합니다(20% 미만에서 80% 이상까지). 따라서 복강경을 통한 이식은 개복술을 통한 외과적 이식 방법에 비해 여전히 효율성이 떨어진다4.
개복술을 통한 모돈의 배아 이식 수술은 비교적 간단하고 빠른 절차로 일반적으로 약 30분이 소요됩니다. 그러나 흡입 마취 장치를 갖춘 수술 센터와 전문 팀에서 수행해야합니다. 상업용 돼지 품종 (예 : Landrace, Large White 또는 그들의 교배종)의 경우 동물의 상당한 무게 (약 130-150kg)로 인해 아가미를 들어 올리기위한 호이스트와 넓고 견고한 수술 테이블과 같은 특수 장비가 필요합니다.
수술이 성공적이려면 배아의 발달 단계에 대한 평가를 미리 받아야 합니다. 최대 4개의 세포로 이루어진 배아는 자궁관으로 이식하는 것이 권장됩니다. 모룰라(morulas)와 배반포(blastocyst)와 같은 4개 세포를 넘어서는 단계의 배아는 자궁 뿔(uterine horn)로 옮겨져야 한다 7,8.
전 세계 연구 그룹이 유전자 변형 복제 돼지 배아의 생산 및 외과적 이식을 수행하고 있지만 비디오를 통해 이 절차를 입증하는 잘 정의된 프로토콜은 아직 없습니다. 이 접근법은 난관의 정확한 위치에 배아를 정밀하게 배치해야 하기 때문에 임신의 성공에 매우 중요하며, 여기에는 난관 골의 국소화와 배아가 포함된 피펫의 도입이 포함됩니다. 이 기술은 전체 절차에 대한 설명 비디오를 통해 더 잘 이해할 수 있습니다. 따라서 이 논문은 복제된 배아를 길트의 난관으로 이식하기 위한 개복술 수술을 시연하는 것을 목표로 하며, 이는 이종 이식 또는 기타 관련 목적으로 사용되는 유전자 변형 돼지의 미래 생산을 위한 필수 전제 조건입니다.
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이 연구는 상파울루 대학교 수의학 및 동물 과학 대학의 동물 사용 연구 윤리 위원회(프로토콜 번호 6088030523)의 승인을 받았습니다. 브라질 상파울루주 이투시에 위치한 아구아 브랑카(Água Branca) 핵돼지 농장에서 생산된 7개월 된 9마리의 금박이 두 번째 발정 감지 직후 사용되었다9. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 동물 준비
2. 수술 절차
3. 수술 후 관리
4. 임신의 초음파 임신 진단
5. 동물의 안락사
참고: 초음파 검사에서 재태 연령에 해당하는 크기와 외모의 태아가 나타나지 않은 아가미를 안락사시킨다.
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이 기사는 복제된 배아를 금박의 난관으로 이식하는 개복술 수술을 시연하는 것을 목표로 합니다. 모든 동물은 마취 회복 중 수술 중 사고나 합병증 없이 적절한 마취 상태에 있었습니다. 수술이 끝난 후 길트가 일어서기까지 평균 2-3시간이 걸렸다.
모든 수술 과정은 평균 44분 동안 지속되었습니다. 9개의 배아가 수술을 받았고, 길트당 평균 185개의 복제 배아가 이식되어 총 1,664개의 배아가 양측으로 이식되었다(표 1). 난소의 국소화, 난소의 외부화, 배아를 포함하는 Tomcat 카테터를 난관의 골방에 삽입하는 것은 수술의 가장 섬세한 순간에 해당했습니다. 수술 중 모든 아가미의 난소를 검사한 결과, 배란 발생 직후 배아 이식을 수행하기 위해 수행된 발정 동기화 프로토콜에 대해 예상된 것과 일치하는 최근에 배란된 출혈성 난포가 모두 나타났습니다. 모든 시술은 수술 중 사고 없이 진행되었습니다.
수...
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설명된 수술 방법은 복제 돼지 또는 유전자 변형 복제 돼지의 생산에 종사하는 다른 연구 그룹에 의해 이전에 수행되었으며, 이 기술의 구현 후 출생에 대한 보고가 있습니다 15,16,17,18,19,20. 다양한 세포주에서 생산된 SCNT 배아의 임신 및 출산율은 약 20%-30%(2017년 이후 264건의 이식 중)이며, 새끼 돼지당 평균 3.2 ± 0.4마리의 새끼 돼지가 태어납니다 3,21. 수혜 모돈에 사용되는...
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저자 중 누구도 이해 상충을 공개하지 않습니다.
브라질 상파울루 대학교 수의과대학 Equine Veterinary Hospital 및 Ruminants Veterinary Hospital of the College of Veterinary Medicine(FMVZ/USP), 브라질 상파울루, FAPESP(보조금 2022/11459-3, 상파울루 연구 재단), EMS Pharma, CNPq(보조금 405254/2022-9) 및 브라질 상파울루 이투의 Água Branca 돼지 농장에 감사드립니다.
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| 0.25 mL 빨대 | 일반 | - | 수술 재료 |
| 1 mL 주사기 | Descarpack | 341001 | 수술 재료 |
| 10 mL 주사기 | Descarpack | 324601 | 수술 재료 |
| 20 mL 주사기 | Descarpack | 324801 | 수술 재료 |
| 3 mL 주사기 | Descarpack | 324201 | 수술 재료 |
| 5 mL 주사기 | Descarpack | 324401 | 수술 재료 |
| 60 mL 주사기 | Descarpack | 323201 | 수술 재료 |
| 9 mm 기관내 튜브 | Rusch | 112482-000090 | 수술 재료 |
| Allis 겸자 | 일반 | 수술 | 기구 |
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| Bakhaus 겸 | 일반 | 수술 | |
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