Small and Large Intestinal Monolayer interface를 사용한 소 오가노이드 기술의 발전

장 오가노이드로 알려진 3차원(3D) 배양에서 장 상피 줄기 세포의 배양은 장 기능, 영양 및 병원체와의 상호 작용을 조사하기 위한 체외 기술의 상당한 발전을 나타냅니다 ^1,2. 이러한 오가노이드는 다양한 장 세포 계통을 포괄하는 3D 형태로 자가 복제 및 조직화함으로써 생체 내 장 상피의 복잡한 구조를 모방합니다³. 이 기능은 장 생물학에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 상당한 잠재력을 강조합니다.

장내 오가노이드 기술을 농장 동물에 적용하는 것에 대한 관심이 높아짐에 따라 배양 및 유지 관리 기술의 개선이 필요하게 되었습니다 ^4,5. 이 기술의 관련성은 농장 동물의 장 건강을 연구하는 데 미치는 잠재적 영향에 의해 강조되며, 이는 농장 동물의 생산성에 중요한 역할을 하며, 결과적으로 동물 복지 및 운영 비용에 영향을 미침으로써 식품 동물 산업의 경제성에 중요한 역할을 합니다 ^6,7. 특히, 장내 오가노이드 배양을 사용하여 소의 장 기능을 조사하는 것이 가장 중요한데, 이는 장내 오가노이드 배양균이 Salmonella spp. 및 Escherichia coli (E. coli) O157:H7⁸과 같은 인수공통감염병성 장 병원체의 저장소로서의 역할을 하기 때문이다. 이러한 병원체는 장의 특정 분절에 국한되어 있기 때문에 연구에서 정밀도를 높이기 위해 장 분절별로 장 오가노이드 배양 방법을 구별하는 것이 필수적이다⁹.

장 오가노이드 연구에서 중요한 장애물은 상피 세포의 정점 표면¹⁰에 대한 접근이 제한되어 있다는 것입니다. 세포외 기질(ECM) 내에서 배양할 때, 세포는 자연적으로 기저 표면이 바깥쪽을 향하고 정점 표면이 안쪽을 향하도록 방향을 잡는다¹⁰. 이 문제를 해결하기 위해 3D 오가노이드를 단일 세포로 분리하고 반투과성 세포 배양 삽입물에 파종하는 방법을 제시합니다. 이 설정은 정점 표면과 기저측 구획 사이의 인터페이스를 설정합니다. 이 프로토콜은 소의 장 오가노이드에서 유래한 세포가 경상피 전기 저항(TEER) 측정 및 세포주위 투과성 분석을 통해 입증된 바와 같이 일관된 2D 단층을 형성할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 면역형광 및 전자현미경을 통해 오가노이드 유래 2D 단층 세포에서 브러시 경계와 긴밀한 접합을 가진 세포 극성의 발달을 확인했으며, 이는 생체 내 장 상피의 특성을 반영합니다.

이 연구에서 회장은 소장을 나타내고 직장은 대장을 의미합니다. 이러한 선택은 회장¹¹을 전위시킬 수 있는 살모넬라 종(Salmonella spp.)과 소의 직장⁹에 주로 서식하는 것으로 알려진 대장균 O157:H7과 같은 관련 장 병원체를 기반으로 합니다. 이러한 특정 장 분절의 선택은 연구의 정확성을 위해 장 오가노이드 배양 방법을 장 영역에 맞게 조정해야 할 필요성을 강조합니다. 이러한 방법은 이러한 장 분절에서 오가노이드 유래 2D 단층 인터페이스를 효과적으로 배양하는 절차를 자세히 설명하며, 소의 장 건강, 병원체 감염 및 장내 마이크로바이옴과 숙주 간의 상호 작용을 탐구하기 위한 강력한 모델을 제공합니다.

장 크립트는 지역 도축장에서 공급받은 잉여 장 검체에서 조달하였으며, 기증자의 신호는 보충 표 1에 나와 있습니다. 오가노이드는 도축장에서 인도적으로 안락사된 동물에서 추출한 조직을 사용하여 생성되었으며, 이 연구를 위해서만 동물을 조달한 것은 아닙니다. 따라서 본 연구는 IACUC 심사 대상에서 제외되며, 윤리 선언문은 적용되지 않습니다.

1. 오가노이드 유래 2D 단층 배양을 위한 세포 배양 인서트의 ECM 코팅

알림: 모든 절차는 생물 안전 캐비닛에서 멸균 재료와 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 절차 내내 얼음 위에 보관됩니다.

1. 마이크로튜브에 기저 배지와 2%(v/v) ECM 기반 하이드로겔을 철저히 혼합하여 각 0.33cm² 세포 배양 삽입물을 코팅하기 위해 100μL의 ECM을 준비합니다.
2. 멸균된 겸자로 포장에서 개별 세포 배양 삽입물을 제거하고 바닥이 평평한 24웰 세포 배양 플레이트의 웰에 개별적으로 넣습니다.
3. 1.1단계에서 준비한 ECM 코팅 100μL를 1.2단계에서 준비한 각 세포 배양 삽입체의 정점 챔버에 적용합니다.
4. 뚜껑을 교체하고 코팅된 세포 배양 삽입물이 들어 있는 세포 배양 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 의 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
   1. 회장 오가노이드 세포의 경우, 인서트는 1시간 배양 후 바로 사용할 수 있습니다. 직장 오가노이드 세포의 경우 1시간 배양 후 ECM 코팅을 직장 단층 배양 배지로 교체하고 밤새 배양합니다(표 1). TEER 측정을 수행하기 위한 경우 빈 대조군을 위한 추가 세포 배양 삽입물을 준비합니다.

표 1: 성체 소 회장 및 직장 오가노이드에서 유래한 2D 단층을 생성하기 위한 최적화된 프로토콜 요약.

2. 소 회장 및/또는 직장 오가노이드 세포 파종 및 2D 단층 배양

참고: 이 섹션에 설명된 프로토콜은 소 회장 및 직장 오가노이드를 사용하며, 이는 설명된 기술⁵를 사용하여 48웰 플레이트에서 배양 및 유지되었습니다. 최적의 결과를 얻으려면 초기 확립 후 3배 이상 통과하고 가장 최근 통과 후 3일 이상 배양된 안정적으로 유지되는 오가노이드를 사용하는 것이 좋습니다.

1. 성숙한 오가노이드가 포함된 ECM 기반 하이드로겔 돔을 방해하지 않고 진공 시스템에 부착된 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드 배양 배지를 제거하고 웰당 300μL의 얼음처럼 차가운 ECM 해중합 용액을 추가합니다. 4 °C에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 또는 ECM 해중합 용액을 첨가한 후 ECM 기반 하이드로겔 돔이 포함된 오가노이드를 기계적으로 파괴하고 4°C에서 배양하기 전에 15mL 원뿔형 튜브에 현탁액을 수집합니다. 이 방법은 2D 단층 배양에 사용할 수 없는 오가노이드를 동일한 플레이트에서 동시에 배양할 때 권장됩니다. 오가노이드 배양의 밀도는 세포 배양 삽입물에 최적의 seeding을 위해 필요한 오가노이드 배양 웰의 수에 큰 영향을 미칩니다.
   1. 고밀도 오가노이드 배양(보충 그림 1A)의 경우, 직장 세포 배양 삽입물은 1:1 - 1:2 범위의 파종 비율을 사용하며, 이는 하나의 배양 웰이 1-2개의 웰을 파종할 수 있음을 의미합니다. 회장의 경우 비율을 1:1로 유지하십시오. 대조적으로, 저밀도 배양(보충 그림 1B)에는 더 많은 배양 웰이 필요합니다. 직장 세포 배양 삽입물 1개(3-4:1 비율)에는 3-4개의 직장 오가노이드 배양 웰을 사용하고, 회장 세포 배양 삽입물 1개(4-5:1 비율)에는 4-5개의 회장 오가노이드 배양 웰을 사용합니다.
2. ECM 기반 하이드로겔이 완전히 용해되었는지 육안으로 검사하고 15mL 코니컬 튜브에 오가노이드 현탁액을 수집합니다.
3. 200 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠릿합니다. 상층액을 버립니다. 10μM Y-27632가 보충된 재조합 세포 해리 효소 용액 1mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.
4. 효과적인 오가노이드 해리를 촉진하기 위해 효과적인 오가노이드 해리를 촉진하기 위해 3-3분마다 소용돌이로 3-5초의 간헐적인 흔들림과 함께 37°C 수조에서 10분 동안 배양합니다.
5. 효소 분해 후 5mL의 기저 배지를 추가하고 P1000 마이크로피펫으로 공격적으로 피펫팅하여 오가노이드를 단일 세포로 더욱 파괴합니다. 현탁액에 오가노이드 덩어리가 있는지 검사하고, 여전히 육안으로 눈에 띄는 경우 피펫팅을 반복하여 단일 세포 해리를 향상시킵니다.
6. 70μm 셀 스트레이너가 있는 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다. 1-2mL의 기초 배지를 적용하여 여과기를 미리 적십니다.
7. 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과하여 잔류 ECM 기반 하이드로겔 파편과 큰 셀 덩어리를 제거합니다. 원래 15mL 튜브와 70μm 세포 여과기를 추가로 10mL의 기초 배지로 헹굽니다.
   참고: 세포 현탁액이 여과기를 쉽게 통과하지 못하는 경우 불완전한 오가노이드 해리의 징후일 수 있습니다. 수집된 세포 현탁액을 동일한 70μm 세포 스트레이너를 통해 재통과를 시도할 수 있습니다. 추가적인 효소적 또는 기계적 파괴가 필요할 수 있습니다.
8. 200 x g 및 4 °C에서 5분 동안 원심분리에 의한 펠릿 단일 세포 현탁액. 상층액을 제거하고 세포 계수를 수행하기 위해 적절한 부피의 기저 배지로 세포를 재현탁합니다.
9. trypan blue 염색 후 혈구계로 생존 가능한 세포를 계수하여 수집된 총 세포 수를 계산합니다.
10. 200 x g 및 4 °C에서 5분 동안 원심분리에 의한 펠릿 단일 세포 현탁액. 상층액을 제거하고 각 단층 배양 배지에서 세포를 적절한 파종 밀도로 재현탁시킵니다(표 1).
    1. 회장 오가노이드 세포의 경우 500nM LY2157299, 10μM Y-27632 및 20% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 오가노이드 배양 배지인 200μL의 회장 단층 배양 배지에 세포 배양 삽입물당 5 x 10⁵ 세포의 파종 밀도를 달성하기 위해 세포를 2.5 x 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.
    2. 직장 오가노이드 세포의 경우 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632로 보충된 오가노이드 배양 배지인 200 μL의 직장 단층 배양 배지에 세포 배양 삽입물당 3 x 10^{5 cells의} seeding 밀도를 달성하기 위해 세포를 1.5 x 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 및 20% FBS.
11. ECM 코팅된 세포 배양 인서트가 있는 24웰 세포 배양 플레이트를 회수하고 코팅을 방해하지 않도록 신중한 진공 흡입으로 세포 배양 인서트의 정점 챔버를 비웁니다.
12. 2.10단계에서 준비한 200μL의 단일 세포 현탁액을 세포 배양 삽입물의 정점 챔버에 부드럽게 적용합니다. 블랭크 대조군의 경우 정점 챔버에 세포 없이 200μL의 배양 배지를 추가합니다. 블랭크 대조군의 경우 정점 챔버에 세포 없이 200μL의 배양 배지를 추가합니다.
13. 적절하게 보충된 단층 배양 배지 500μL(회장 세포와 직장 세포에 따라 다름)를 각 웰의 기저측 챔버에 적용합니다.
14. 37 °C 및 5 % CO₂ 의 가습 인큐베이터에서 배양하여 세포 접착 및 성장을 촉진하여 세포 배양 삽입물에 합류 2D 단층을 형성합니다.
15. 세포 파종 후 48시간부터 격일로 정점 챔버와 기저측 챔버의 배양 배지를 교체합니다. blank control과 cell-containing insert에 대해 동일한 배양 시간을 보장합니다.

3. TEER 측정

참고: 여기에 설명된 방법은 한 쌍의 Ag/AgCl 전극이 있는 상피 전압계로 알려진 상업적으로 사용 가능한 수동 TEER 측정 시스템을 사용합니다(그림 1A). 2D 단층에서 TEER를 측정하려면 블랭크 웰을 측정해야 합니다. 샘플과 동일한 방식으로 빈 판독값을 채취해야 합니다.

1. 인큐베이터에서 오가노이드 유래 2D 단층과 블랭크가 있는 세포 배양 인서트가 포함된 플레이트를 검색합니다. 접시를 약 10분 동안 실온에 두십시오.
2. 70% 에탄올로 전극을 소독하고 완전히 건조시키십시오.
3. 짧은 끝이 정점 챔버에 있고 긴 끝이 기저측 챔버에 있는 전극을 조심스럽게 도입합니다(그림 1A).
   알림: 셀 단층을 방해하지 않도록 각별한 주의가 필요합니다.
4. 판독값이 평형을 이루도록 허용하고 안정화될 때 값을 옴 단위로 기록합니다.
   알림: 전압옴계의 감도는 전기 저항 측정을 수행하는 동안 옴 값의 변동이 발생하는 정도입니다. 신뢰할 수 있는 판독값은 측정값이 안정화되고 지속적으로 안정기 값 주위를 맴돌 때 얻어집니다.
5. 다음 공식에 따라 2D 단층의 TEER를 결정합니다.
   TEER(Ω x cm²) = 세포 배양 삽입물의 표면적(cm²) x 순 전기 저항
   여기서 순 전기 저항은 셀 단층 인서트의 측정된 저항에서 블랭크 인서트의 측정된 저항을 뺀 값과 같습니다. 24-well plate용 세포 배양 인서트의 표면적은 0.33cm2입니다.

그림 1: 소 장 오가노이드 유래 2D 단층의 상피 장벽 무결성 평가. (A) TEER 측정을 위한 세포 배양 삽입물의 정점 및 기저측 챔버 내 전극의 적절한 위치 개략도. 짧은 전극은 정점 챔버에 삽입되고 긴 전극은 멤브레인과의 접촉을 피하도록 주의하여 기저측 챔버에 배치됩니다. (B) 투과성 분석 과정의 개략도. 세포 배양 챔버를 따뜻해진 PBS로 2회 세척하고 PBS에 용해된 0.5mg/mL 4kDa FITC-dextran tracer를 정점 챔버에 적용합니다. 기저측 챔버에서 반복된 50μL 부분 표본은 배양 기간 동안 기저측 챔버의 총 부피를 유지하기 위해 동일한 부피의 PBS를 교체하여 샘플링합니다. 부분 표본의 형광 강도는 세포 단층 전체에서 4kDa FITC-dextran 추적자의 확산을 정량화하기 위해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정됩니다. (C) 시간 경과에 따른 회장 및 직장 단층 내 장벽 무결성의 동적 발달은 TEER 측정(회장의 경우 닫힌 원, 직장의 경우 닫힌 사각형으로 표시) 및 투과성 분석(회장의 경우 열린 원, 직장의 경우 열린 사각형으로 표시)을 사용하여 4kDa FITC-dextran 추적자를 사용하여 평가했습니다. 배양 3일째까지 두 가지 유형의 단층 모두 각각의 TEER 및 투과성 프로파일에 의해 입증된 바와 같이 안정적이고 기능적인 상피 장벽의 확립을 보여주었습니다. 결과는 두 개의 기술 반복실험이 있는 두 개 이상의 독립적인 실험의 평균입니다. 오차 막대는 측정의 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. Paracellular 투과성 분석

참고: 이 분석에는 120분 동안 2D 단층을 가로질러 정점 챔버에서 기저측 챔버로 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란의 확산으로 인한 형광 강도 측정이 포함됩니다(그림 1B). 최적의 결과를 얻으려면 분석 중 빛에 대한 노출을 최소화하고 형광의 감소 또는 소멸을 방지하기 위해 모든 샘플링 직후 마이크로플레이트 리더에서 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 각 웰은 한 번만 사용할 수 있으며 후속 분석에서 재사용할 수 없습니다. 각 분석에 대한 기술 복제로 사용할 최소 2개의 웰을 준비합니다. 예를 들어, 그림 1C에 제시된 결과를 얻기 위해 총 6개의 웰이 필요하며, 여기서 분석은 3개의 서로 다른 시점(배양 1일, 3일, 5일)에서 중복으로 실행되었습니다.

1. 인산염 완충 식염수(PBS)에서 4kDa FITC-dextran으로 표준 곡선 희석 시리즈를 준비합니다. 각 희석에 대해 50 μL를 96웰 플레이트에 세 번 피펫팅합니다.
   참고: 0에서 0.5mg/mL 범위의 5-7회 희석액을 연속으로 만드는 것이 좋습니다.
2. 495 nm의 여기 파장과 535 nm의 방출 파장에서 사전 보정된 마이크로플레이트 리더에서 표준물질의 형광 강도를 측정합니다.
3. 형광 강도 결과를 사용하여 선형 회귀를 계산하여 표준 곡선을 만듭니다.
4. 인큐베이터에서 오가노이드 유래 2D 단층이 있는 세포 배양 삽입물이 포함된 플레이트를 검색합니다. 평가할 오가노이드 유래 2D 단층이 들어 있는 세포 배양 삽입물의 정점 및 기저측 챔버에서 단층 배양 배지를 제거합니다.
5. 각 챔버를 각각 200μL(정점 챔버) 및 500μL(기저측 챔버)의 사전 예열된 PBS로 2번 부드럽게 세척합니다.
6. 정점 챔버에서 세척 용액을 제거하고 PBS의 0.5mg/mL 4kDa FITC-dextran 추적자 200μL를 세포 배양 삽입물의 정점 챔버에 적용합니다.
7. 37 °C 및 5 % CO₂ 의 가습 인큐베이터에서 20 분 동안 배양합니다.
8. 배양된 24웰 플레이트의 기저측 챔버에서 50μL를 샘플링하고 마이크로플레이트 리더 호환 96웰 플레이트로 옮깁니다.
9. 샘플링된 웰의 기저측 챔버에서 50μL의 신선한 PBS를 교체합니다.
10. 사전 보정된 마이크로플레이트 리더에서 495nm의 excitation wavelength와 535nm의 방출 파장에서 즉시 형광 강도를 측정합니다.
11. 4.6분까지 4.4.10-20분마다 120단계를 반복합니다. 분석이 끝날 때 2D 단층의 보존이 필요한 경우 정점 챔버와 기저측 챔버를 모두 새로운 PBS 2x로 헹구고 새로운 단층 배양 배지로 교체한 다음 배양합니다.
    참고: 2D 단층의 추가 평가, 즉 TEER 측정, 면역형광 염색 등을 수행할 수 있습니다. 그러나 잔류 형광 추적자가 있을 가능성이 있고 분석에 영향을 줄 수 있으므로 권장하지 않습니다.
12. 다음 공식을 사용하여 겉보기 투과성 계수(P_app)를 결정합니다.
    
    ΔQ / Δt = 특정 기간 동안 단층을 세포 배양 삽입체의 기저측 챔버로 통과시킨 형광 추적자의 농도로, 형광 강도로 측정되고 표준 곡선을 통해 μg/mL로 외삽됩니다.
    A = 세포 배양 삽입물의 표면적
    C_o = 세포 배양 삽입물의 정점 챔버에 추가된 형광 추적자의 농도(μg/mL)

5. 오가노이드 유래 2D 단층의 면역형광 염색

1. 진공 흡입으로 세포 배양 삽입물에서 단층 배양 배지를 제거하고 200μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 세포 고정을 위해 실온에서 15-30분 동안 배양합니다.
2. 진공 흡입으로 PFA를 제거하고 100μL의 PBS 2x로 세척합니다.
3. PBS의 2% 소 혈청 알부민(BSA)에 0.3% Triton X-100 100μL를 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 투과시킵니다.
4. 진공 흡입으로 상층액을 제거하고 100μL의 PBS 2x로 세척합니다.
5. 상층액을 제거하고 PBS에서 2% BSA로 교체하고 차단을 위해 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 상층액을 제거하고 PBS에서 2% BSA로 희석된 1차 항체 100μL를 적용하고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
   참고: 사용된 1차 항체의 농도는 재료 표에 나와 있습니다. 지정하지 않는 한 제조업체의 권장 사항을 따릅니다.
7. 상층액을 제거하고 100μL의 PBS 3x로 세척합니다.
8. PBS에서 2% BSA로 희석된 2차 항체 100μL를 적용하고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
   참고: 사용된 1차 항체가 형광 프로브와 결합되는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다. 사용된 2차 항체의 농도는 재료 표에 나와 있습니다. 지정하지 않는 한 제조업체의 권장 사항을 따릅니다.
9. 상층액을 제거하고 100μL의 PBS 3x로 세척합니다.
10. 선택 사항: F-액틴 및 핵(DAPI)의 카운터 염색을 위해 PBS에서 두 프로브를 적절한 희석(제조업체 권장 사항에 따라)으로 혼합하여 준비하고 100μL를 적용한 다음 실온에서 30분 동안 배양합니다. 상층액을 제거하고 100μL의 PBS 3x로 세척합니다.
11. 세포 배양을 조심스럽게 잘라내고 메스 블레이드로 멤브레인을 삽입한 다음 장착 용액이 있는 유리 슬라이드에 장착합니다. 커버 슬립을 놓고 관찰하십시오.

이 프로토콜은 소장 및 대장에서 강력한 소 장 오가노이드 유래 2D 단층을 안정적으로 생성하여 생체 내 장 상피의 복잡성을 모방합니다. 이 방법은 최적화된 조건에서 배양된 건강한 소의 장낭 표본에서 개발된 성숙한 오가노이드를 활용합니다. 흥미롭게도, 오가노이드 유래 2D 단층에 대한 성공적이고 반복 가능한 조건은 장 분절에 고유합니다(표 1). 이는 관심 장내 분절에 최적화된 배양 기법을 보유하는 것의 중요성을 강조합니다.

해리된 성숙한 오가노이드를 세포 배양 삽입물에 파종한 후 1일 후에 2D 단층이 형성되는 것처럼 보였습니다(그림 2A). 그러나 이러한 초기 출현에도 불구하고 회장 및 직장 단층 모두에 대한 TEER 측정은 이 단계에서 낮게 유지되었습니다(그림 1C). 또한, 파라세포 투과성 분석을 통해 배양 1일만에 단층이 세포층을 가로질러 4kDa FITC-dextran tracer를 통과시킬 수 있음을 밝혔습니다(그림 1C). 배양 3일 째까지 두 가지 유형의 오가노이드 유래 2D 단층은 모두 상당한 성숙을 보였으며, 이는 TEER 값 증가와 4kDa FITC-dextran 추적자에 대한 내성으로 입증되었으며, 이러한 추세는 배양 5일차까지 계속되었습니다.

특히 주목할 만한 것은 종 간 변동성으로, 유사한 조건 12,13,14,15에서 인간 및 개 배양물에 비해 소 오가노이드 유래 2D 단층 배양물의 TEER 값이 낮음에도 불구하고 멤브레인의 무결성이 그대로 유지됩니다. 이 결론은 투과성 분석에서 단층의 적절한 반응에서 도출된 것으로, 소 샘플의 낮은 TEER 값이 반드시 장벽 기능의 부족을 반영하는 것은 아니라는 것을 시사합니다. 이러한 무결성은 기능적 상피 장벽에 매우 중요하며 TEER 측정과 함께 투과성 분석 결과의 신중한 해석을 통해 효과적으로 입증됩니다.

주사 전자 현미경을 사용하여 2D 단층의 정점 표면에서 세포 경계와 잘 발달된 미세 융모를 시각화하고 특수 미세해부학적 구조를 표시하여 회장 및 직장 오가노이드 유래 2D 단층의 성숙을 더욱 강화했습니다(그림 2B). 또한 2D 단층의 면역형광 염색을 통해 회장(그림 3A) 및 직장(그림 3B) 오가노이드 유래 2D 단층 모두에서 정점 브러시 경계, 기저외측 부착 접합부 및 점액 생성 잔 세포의 존재를 확인했습니다. 이러한 결과는 개발된 2D 단층이 구성과 형성이 복잡하여 온전한 장 상피의 주요 특징을 표현할 뿐만 아니라 다중 계통 세포 집단으로 구성되어 있음을 강조합니다.

성공적인 2D 단층 개발은 세포가 ECM에 부착하고 합류를 위해 성장하여 온전한 상피층을 만드는 데 달려 있습니다. 특히, 세포 배양 삽입물에서 배양 중 불균일한 ECM 분포 또는 최적이 아닌 조건으로 인해 세포층의 부분적인 분리가 발생할 수 있으며, 특히 가장자리를 따라 두드러질 수 있습니다(그림 4Ai). 이 문제는 세포가 최적 밀도보다 높은 밀도로 파종되거나 파종 세포가 배양 표면 전체에 고르게 분포되어 있지 않은 경우 더욱 복잡해지며, 이러한 시나리오는 종종 오가노이드가 단일 세포 현탁액으로 불완전하게 분리되어 발생합니다. 이러한 불균일한 분포는 세포 배양 삽입물에서 단층 및/또는 3D 형태 형성 내에 틈을 형성할 수 있습니다(그림 4Aii). 대조적으로, 세포의 과소 파종은 예상 배양 기간 동안 단층 개발이 실패하거나 지연되는 결과를 초래할 수 있으며, 이는 의도치 않게 2D 단층 시스템을 활용하는 후속 연구의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다(그림 4Aiii). 또한, 배양 시스템의 오염은 단층 내에 틈을 형성하여 배양의 후반 단계에서 한 번 형성된 합류 단층을 파괴할 수도 있습니다(그림 4Aiv). 지속적인 TEER 값과 세포주위 투과성 반응은 앞서 언급한 잠재적 실패 원인이 이러한 분석 이전에 발생하지 않은 경우에도 공격적인 세척 또는 취급 기술로 인한 세포층의 교란에 의해 영향을 받을 수 있습니다(그림 4B). 따라서 단층 형성 또는 파괴에 대한 신중한 세포 취급 및 평가는 문제 해결 전략의 효과적인 적용을 통해 오가노이드 유래 2D 단층의 성공적인 개발을 위해 가장 중요합니다.

그림 2: 소 회장 및 직장 오가노이드 유래 2D 단층의 현미경 특성화. (A) 세포 배양 삽입물에서 배양 1일차 및 3일차(D1 및 D3)의 2D 단층의 대표적인 위상차 현미경 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (B) 더 낮은(왼쪽) 및 더 높은(오른쪽) 배율을 가진 2D 단층의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지. 미세융모를 포함한 상세한 세포 표면 구조는 회장(상단) 및 직장(하단) 단층 모두에서 감상할 수 있습니다. 왼쪽 눈금 막대 = 10 μm, 오른쪽 눈금 막대 = 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 회장 및 직장 오가노이드에서 파생된 2D 단층의 면역형광 특성 분석. (ᅡ, 나) 패널 (A)은 회장을 나타내고 패널 (B)은 직장 오가노이드를 보여줍니다. 왼쪽에서 F-actin 섬유는 Phalloidin(빨간색)으로 강조되어 세포골격 구조와 정점 브러시 테두리 형성을 보여줍니다. 중간 이미지는 E-cadherin(녹색)으로 표시된 부착 접합부의 기저측 국소화를 캡처하며, 이는 세포-세포 접착 및 단층 무결성을 나타냅니다. 오른쪽에는 SNA(녹색)로 점액을 생성하는 잔 세포의 존재가 표시되며, 회장 단층에서 점액의 정점 분비를 묘사하는 z-stack 이미지가 있습니다. 모든 이미지의 핵은 DAPI(파란색)로 대조염색되었습니다. 또한 모든 이미지에 대한 z-stack 이미징은 배양 삽입물 내에서 단일 세포 층의 형성을 추가로 보여줍니다. 눈금 막대 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 차선의 2D 단층 형성의 특성화. (A) (i) 세포 배양 삽입물의 가장자리를 따라 단층이 부분적으로 분리되는 것을 보여주는 대표적인 위상차 이미지; (ii) 3D 파생물의 발달 및 단층 내 틈의 형성; (iii) 세포의 고르지 못한 부착으로 표시된 최적의 파종 밀도보다 낮기 때문에 불완전하거나 지연된 단층 형성; (iv) 나중 단계에서 한 번 형성된 2D 단층 내에 틈이 형성되며, 이는 의심되는 오염으로 인해 발생할 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) 3일차 이후 투과성 프로파일 증가와 함께 TEER 측정 감소는 안정적이고 기능적인 상피 장벽을 구축하지 못했음을 나타냅니다. 결과는 두 번의 기술 반복을 사용한 단일 실험의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: ECM 기반 하이드로겔에서 소 장 오가노이드 배양물의 밀도 변화. ECM 기반 하이드로겔에서 배양된 소 장 오가노이드; (A) 고밀도 및 (B) 저밀도. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 요약된 조직 기증자 신호. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.