Method Article

미세아교세포(Microglia)를 이용한 망막 오가노이드 조립

DOI:

10.3791/67016

⸱

July 26th, 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미세아교세포는 망막에 존재하는 독특한 면역 세포로, 다양한 망막 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 모델을 생성하면 망막 질환의 발병 기전 및 발병 진행 상황을 더 잘 이해할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 망막의 접근성이 제한적으로 인해 망막 오가노이드(RO)는 인간 망막 질환을 연구하는 데 가장 적합한 모델이며, 이를 통해 망막 발달 메커니즘과 망막 질환의 발생을 밝힐 수 있습니다. 미세아교세포(MG)는 망막과 중추신경계(CNS)에 있는 독특한 대식세포로, 중요한 면역 기능을 수행합니다. 그러나 망막 오가노이드는 분화 기원이 난황낭이기 때문에 미세아교세포가 없습니다. 이러한 망막 질환에서 미세아교세포의 구체적인 발병 기전은 불분명합니다. 따라서 미세아교세포에 통합된 망막 오가노이드 모델의 확립이 필요한 것으로 밝혀졌습니다. 여기에서 우리는 인간 줄기세포에서 유래한 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 모델을 성공적으로 구축했습니다. 이 기사에서는 미세아교세포를 분화한 후 초기 단계에서 망막 오가노이드와 공동 배양했습니다. 면역 세포의 통합으로서 이 모델은 망막 및 CNS 관련 질환의 발병 기전 및 치료에 대한 심층적인 연구를 용이하게 하기 위해 망막 질환 모델링 및 약물 스크리닝에 최적화된 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 망막의 제한된 소스로서 인간 줄기 세포를 3차원(3D) 망막 오가노이드로 분화하는 것은 망막1을 시뮬레이션하기 위한 유망한 in vitro 모델을 나타냅니다. 망막에는 광수용체(photoreceptor), 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell), 양극성 세포(bipolar cell), 뮐러 세포(Müller cell), 수평 세포(horizontal cells), 성상교세포(astrocyte) 등 다양한 세포 유형이 포함되어 있다2. 이 모델은 망막 발달 메커니즘과 망막 질환의 발병 기전을 모방하고 연구할 수 있게 합니다. 그러나 방향성 분화 방법으로 인해 망막 오가노이드는 신경외배엽3에서 파생되었으며, 난황낭의 미세아교세포 및 중배엽 4,5,6의 혈관 주위 세포와 같이 다른 생식층에서 유래하는 다른 많은 세포 유형이 부족했습니다.

현재 색소성 망막염7, 녹내장8, 망막모세포종9와 같은 많은 망막 질환이 망막 내 미세아교세포와 밀접한 관련이 있는 것으로 입증되었습니다. 그러나 적절한 연구 모델이 없기 때문에 미세아교세포와 이러한 질병 사이의 관계를 설명하는 구체적인 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 마우스는 망막 질환을 연구하는 데 유리한 모델로 사용되었지만, 최근 연구에서는 수명, 증식 속도 및 인간 상동 유전자의 부재 측면에서 마우스와 인간 미세아교세포 간의 중요한 차이점을 강조했습니다10,11. 이러한 발견은 마우스 모델에서 도출된 결론이 완전히 신뢰할 수 없을 수 있음을 시사하며, 미세아교세포를 포함하는 인간 망막 오가노이드를 구성하는 것의 중요성을 강조합니다.

지난 수십 년 동안 망막 오가노이드의 3D 분화를 위한 다양한 방법이 개발되었습니다12,13. 망막 오가노이드 내에서 미세아교세포의 공동 배양 작업을 촉진하기 위해, 우리는 부착 배양에서 현탁 배양으로의 전환을 포함하는 분화 방법을 선택했습니다. 이 접근법은 미세아교세포를 망막 오가노이드에 성공적으로 통합하여 최소 60일 동안 유지할 수 있도록 합니다14.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Capital Medical University의 Beijing Tongren Hospital의 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. HESCs 세포주 H9는 WiCell Research Institute에서 생산되었습니다. 실험 전에 세포 배양 배지를 실온(RT)에서 30분 동안 사전 예열합니다.

1. 인간 미세아교세포의 생성

  1. 세포 밀도가 80%-90%에 도달할 때까지 줄기 세포 배지에서 hESC를 배양합니다. 각 웰에 최소 1 x 106 세포를 파종합니다.
  2. 줄기 세포 배지를 흡입하고 1x DPBS(1mL/6웰 플레이트의 웰)로 세포를 헹굽니다. 다음 단계에는 2 x 107-1 x 108 셀이 필요합니다. 충분하지 않은 경우 2-5개의 웰 셀을 결합하여 다음 단계를 수행합니다.
  3. 37°C 인큐베이터(1mL/6웰 플레이트의 웰)에서 0.5mM EDTA 용액을 사용하여 약 5분 동안 줄기 세포 콜로니를 해리합니다.
  4. 5분 후 콜로니 형태를 확인합니다. 콜로니 가장자리가 느슨한 틈으로 약간 말려 올라가면 세포가 분화되어 EDTA를 흡인할 준비가 된 것입니다. 그렇지 않은 경우 37°C에서 1-2분 더 세포를 배양합니다. 8분 이상 배양하지 마십시오.
  5. 6 mL의 배지 A(표 1)와 6 μL의 10 mM ROCK inhibitor Y-27632 용액을 사용하여 각 웰의 세포를 부드럽게 헹굽니다. 접시 바닥을 가볍게 두드려 세포를 헹굽니다. 요일을 0일로 설정합니다.
    알림: 세포를 파이펫팅하지 마십시오. 세포는 다음날 배아체(EB)를 형성합니다.
  6. 24시간 후 현미경으로 세포를 관찰하여 EB 형성을 확인합니다. 10mL 피펫이 있는 15mL 원심 튜브에 EB를 모으고 5분 내에 EB가 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다.
  7. 상층액을 조심스럽게 흡입하고 6mL의 새로운 배지 A로 EB를 재현탁시킨 다음 6웰 플레이트의 새로운 저접착 웰로 옮깁니다. 37 °C 인큐베이터에서의 배양.
    알림: 1일차에 웰 이송의 목적은 세포 성장 상태에 영향을 줄 수 있는 EB 형성 과정에서 많은 수의 죽은 세포의 영향을 줄이는 것입니다.
  8. 4일째까지 매일 신선한 배지 A를 새로 고칩니다(6mL/웰 플레이트의 경우 웰).
  9. 4일째에는 10cm 접시에 0.1% 생선 젤라틴 용액 3mL를 5% CO2, 37°C 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 코팅합니다.
    알림: 코팅 시간이 1시간 미만인 경우 다음 단계를 수행하기 어렵습니다.
  10. 10mL 피펫이 있는 15mL 원심 튜브에 EB를 조심스럽게 모으고 EB가 5분 내에 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다.
  11. 0.1% 젤라틴 용액을 제거하고 10cm 접시를 5-6mL의 1x DPBS로 한 번 헹굽니다. DPBS를 제거합니다.
  12. 15mL 원심 튜브에 15mL의 배지 B(표 1)로 EB를 부드럽게 재현탁시키고 코팅된 10cm 접시에 옮깁니다. 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 1주일 동안 배양.
    알림: 처음 7일 동안은 접시를 움직이지 마십시오.
  13. 49일째(15mL/10cm 접시)까지 일주일에 한 번 신선한 배지 B로 새로 고치고 일주일에 한 번 현미경으로 세포를 검사합니다.
    참고: 49일 이후에는 배양 접시의 상층액에서 여러 분비 세포가 발견될 수 있습니다.
  14. 상층액 세포를 RT에서 5분 동안 200 x g 으로 원심분리합니다.
  15. 상층액을 조심스럽게 흡인하고 2mL의 신선한 배지 B로 세포를 재현탁시킨 다음 6웰 플레이트의 새로운 저접착 웰로 옮깁니다. 5% CO2, 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다.
    알림: 다음 7일 동안 접시를 움직이지 마십시오. 미세아교세포는 접착력이 낮은 우물의 바닥에 부착될 수 있습니다.
  16. 56일째 되는 날에 배지 C(표 1)(6-웰 플레이트의 2mL/웰)로 교체합니다. 미세아교세포는 접착력이 낮은 웰의 바닥에 잘 부착되며 현미경 아래에서 가지가 갈라진 것처럼 보입니다.
    참고: 배지 C를 3일마다(6웰 플레이트의 경우 2mL/웰) 교체함으로써 미세아교세포를 배지 C에서 약 15일 동안 배양할 수 있습니다.

2. 인간 RO의 생성 및 미세아교세포와의 RO를 공동 배양

  1. 세포 밀도가 80%-90%에 도달할 때까지 줄기 세포 배지에서 hESC를 배양했습니다. 각 웰에 최소 1 x 106 세포를 파종합니다.
  2. Dispase(1mL/6웰 플레이트의 웰)를 배양 셀에 추가합니다. 37 °C에서 5 분 동안 배양합니다. 우물에서 Dispase 용액을 흡입합니다.
  3. 배지 D(표 1)(1mL/6웰 플레이트의 웰)를 웰에 추가합니다. 10μL 피펫으로 세포를 작은 조각으로 자릅니다.
  4. 모든 세포 조각과 배지를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 조심스럽게 수집합니다.
  5. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
  6. 200 μL의 콜드 매트릭스에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. 1.5 마이크로 원심분리기 튜브를 인큐베이터로 20분 동안 이동합니다. 매트릭스가 실온(RT)에서 응고되기 때문에 빠르게 작동하십시오. 인큐베이터에서 20분 후에 매트릭스가 응고됩니다.
  7. 15mL 배지 D로 10cm 접시를 준비합니다. 매체 D로 매트릭스를 재현탁하고 페트리 접시를 부드럽게 흔듭니다.
  8. 그런 다음 접시를 인큐베이터에 5일 동안 넣으십시오. 접시를 움직이지 마십시오. 요일을 0일(RO)로 설정합니다. 세포는 3 일 안에 부착됩니다.
  9. 5일차(RO) 및 10일차(RO)에 매체를 매체 D로 새로 고칩니다.
  10. 12일째(RO)에 배지를 제거하고 각 접시에 5분 동안 3mL의 Dispase를 추가합니다.
  11. Dispase를 흡입하고 15mL의 배지 E를 추가합니다(표 1).
  12. 미세아교세포 채취: 56일째(MGs)에 배지 C를 부드럽게 흡입하고 Accutase(6웰 플레이트의 1mL/웰)를 추가한 다음 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
  13. 미세아교세포를 5mL 피펫이 있는 15mL 원심 튜브에 수집합니다. RT에서 5분 동안 200 x g 의 원심분리기 셀.
  14. 상층액을 부드럽게 흡인하고 1mL의 배지 E로 미세아교세포를 현탁시킵니다. 12일째에 분해된 RO에 미세아교세포를 추가합니다.
    참고: 12일째(RO)에는 셀이 접착됩니다. 13일째(RO)에 세포는 배지 E에서 부유하는 것이 발견됩니다. 매체가 12일(RO)에서 19일(RO)로 노란색으로 바뀌면 매체 E로 매체를 새로 고칩니다.
  15. 19일째(RO)에는 플레이트를 부드럽게 휘둘러 오가노이드를 접시 중앙으로 응집합니다. 배지 E를 부드럽게 흡입하고 배지를 매체 F로 새로 고칩니다.
  16. Medium F를 사용하여 오가노이드를 새 현탁액 접시로 옮깁니다.
  17. 일주일에 한 번 배지를 교체하고 실험을 위한 오가노이드를 선택합니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막 오가노이드를 생성하는 절차는 이전 연구15에 설명되어 있습니다. 여기에서는 미세아교세포와 공동배양 미세아교세포와 망막 오가노이드의 대표적인 결과를 보여줍니다.

여기에서는 미세아교세포 분화의 각 단계를 보여줍니다(그림 1A). 0일은 줄기 세포 배양 단계를 나타냅니다. 그런 다음, 줄기세포를 절단하고 배양하여 EB 형성을 시켰다. 프로세스의 처음 4일 동안 세포는 EB를 형성합니다(그림 1B). 그 후, 현탁된 EB를 접착된 10cm 접시로 옮깁니다. 약 7일 후, 세포는 그림 1C에 표시된 것과 유사합니다. 배양이 진행됨에 따라 부착 세포는 조혈 전구 세포를 상층액으로 분비합니다(그림 1D). 이 프로세스는 약 45일이 걸립니다. 이 시점에서 상층액에서 세포를 채취하여 6-웰 플레이트로 옮길 수 있습니다. 다음 7일 동안 미세아교세포는 성숙하고(그림 1E) 추가 실험을 할 준비가 됩니다.

망막 오가노이드 분화 12일차에 부착 세포를 현탁 배양으로 분해하고 미세아교세포가 함유된 배지 E를 망막 오가노이드에 첨가합니다. 미세아교세포는 망막 오가노이드로 이동합니다. 미세아교세포의 형태를 명확하게 관찰하기 위해 hESC에 EGFP-렌티바이러스 transfection을 첨가하여 분화된 미세아교세포가 자가형광(녹색)을 갖도록 했습니다(그림 2A-C). 또한 50일 동안 분화 후 미세아교세포 공동 배양 망막 오가노이드에서 면역형광 분석을 통해 광수용체 세포 마커 CRX 및 미세아교세포 마커 IBA1을 사용하여 미세아교세포와 공동 배양된 망막 오가노이드의 조직 구조를 조사했습니다(그림 2D).

figure-results-1
그림 1: hESC에서 유래한 미세아교세포의 개략도 및 타임라인. (A) 프로토콜은 6웰 플레이트에서 hESC의 해동 및 패시징으로 시작합니다. (B) 배지 A를 함유하여 형성된 균질한 EB를 (C) EB는 코팅된 접시로 옮겨지고, 조혈 전구세포는 4-56일에 형성됩니다. (D,E) 56일째에 세포가 있는 상층액을 수집하고(D) 저접착 6웰 플레이트로 옮겨 63일째(E)에 미세아교세포를 형성합니다. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 중 타임라인을 따른 대표 이미지. (A) EGFP-hESC에서 유래한 미세아교세포의 대표 이미지. (B) 18일 동안 분화 후 EGFP+ 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양. (C) 30일 동안 분화 후 EGFP+ 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양. 척도 막대: 300 μm. (D) CRX(photoreceptor cell marker; 빨간색) 및 IBA1(microglial marker; 녹색)을 사용하여 50일 분화 후 미세아교세포와 공동 배양된 망막 오가노이드의 조직 구조를 검출했습니다. DAPI(파란색)는 핵을 염색합니다. 스케일 바: 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 본 연구에 사용된 매체의 구성. 각 배지의 500mL 부피를 준비하는 데 필요한 성분이 표에 나열되어 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 망막의 가용성이 제한되어 있기 때문에 현재 망막 염증 반응에 대한 우리의 이해는 거의 동물 모델에서 비롯된 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막 오가노이드를 분화했습니다. 망막 오가노이드 모델의 개발은 질병 모델링 및 치료법 개발을 위해 인간 망막의 복잡성을 요약하는 것을 목표로 하는 활발한 연구 분야입니다. 여러 연구에서 인간 만능 줄기 세포 1,2,12,13에서 망막 오가노이드를 성공적으로 생성했다고 보고했습니다. 그러나 이러한 모델의 대부분은 망막 발달 및 질병 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 미세아교세포의 존재가 부족합니다. 최근 연구에서는 미세아교세포를 망막 오가노이드 또는 뇌 오가노이드 모델 16,17,18에 통합하려고 시도했지만 자세한 방법은 불분명합니다. 여기에서는 초기 단계에서 동일한 hESC 라인에서 파생된 망막 오가노이드와 미세아교세포를 공동 배양하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 일부 연구에서는 동물 모델 또는 세포 배양 시스템을 사용하여 망막 질환에서 미세아교세포의 역할을 탐구했지만7,8,9 여기에 제시된 공동 배양 모델은 미세아교세포-망막 상호 작용 및 질병 발병에 미치는 영향을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 인간 기반 시스템을 제공합니다.

중요한 단계는 인간 줄기 세포의 세포 상태와 미세아교세포와 망막 오가노이드의 분화입니다. Microglia와 RO는 단계별로 구별해야 하며 올바른 시약과 접시(조직 배양 처리 접시 또는 현탁 접시)를 다른 단계에서 사용해야 합니다. 이 모델은 미세아교세포가 망막 질환의 발생에 어떻게 기여하는지 과정을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 미래의 약물 스크리닝 및 질병 메커니즘에 대한 연구에 중요한 의미를 지닙니다. 그러나 현재 게시하는 방법에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 미세아교세포의 분화 기간이 길고 적절한 동결 보존 방법이 없기 때문에 공동 배양을 위한 미세아교세포 및 망막 오가노이드 분화를 위한 시간을 현명하게 계획해야 합니다.

망막 오가노이드 외에도 면역 세포를 다른 오가노이드 모델에 통합하면 오가노이드 발달을 촉진할 수 있다고 생각합니다. 따라서 다른 오가노이드 시스템을 테스트하는 것이 중요합니다. 다양한 세포 유형과 오가노이드를 통합하여 완전한 장기를 형성하는 것은 미래를 위한 유망한 모델입니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 연구의 객관성에 영향을 미칠 수 있는 소속, 회원 자격, 보조금 또는 재정적 보유에 대해 알지 못합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82101145)과 베이징 자연 과학 재단 (Z200014)의 지원을 받았습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02항체; 제조사 지침에 따른 희석
Anti-IBA1Abcamab5076항체; 제조사 지침에 따른 희석
B27Life 기술17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibco C141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBS생물학 산업04-002-1A
젤라틴시그마G7041-100G고체
글루타맥스Gibco35050-061
H9 세포주WiCell 연구소
IL-3RD 시스템 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
매트릭스코닝356231
M-CSFRD 시스템 216-MC-500 
MEM 비필수 아미노산 솔루션SigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pen/strepGibco15140-122
줄기세포 매체 Stemcell Technologies5990
타우린시그마T-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-메르캅토에탄올Life Technologies21985-023

References

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