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방법 논문

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

1.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67020

⸱

2024년 9월 27일

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

초록

미토콘드리아와 리소좀과 같은 세포 소기관은 동적 구조를 나타냅니다. 구조 분석을 위한 투과 전자 현미경의 해상도가 더 높음에도 불구하고, 광학 현미경은 표적별 라벨링을 통한 동적 소기관의 시각화에 필수적입니다. 다음 프로토콜은 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 관찰하기 위해 이중 색상 상관 광과 전자 현미경(CLEM)을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 연구에서 미토콘드리아는 mEosEM(Mito-mEosEM)으로, 리소좀은 TMEM192-V5-APEX2로 표지되었습니다. CLEM 이미지에서 얻은 결과를 통해 외부 스트레스 조건에서 미토콘드리아와 리소좀 사이의 상호 작용 변화를 관찰할 수 있습니다. 리소좀 기능을 억제하는 바필로마이신(BFA)을 처리하면 미토콘드리아와 리소좀 사이의 접촉이 증가하여 리소좀 내부에 갇힌 단편화된 미토콘드리아가 형성되었습니다. 반대로, 리소좀에서 콜레스테롤 방출을 억제하는 U18666A 처리하면 리소좀이 미토콘드리아로 둘러싸여 뚜렷한 형태의 상호 작용을 나타냅니다. 이 연구는 고정된 세포에서 미토콘드리아와 리소좀 사이의 상호 작용을 관찰하는 효과적인 방법을 제시합니다. 또한 이중 색상 프로브를 사용한 CLEM 이미징은 향후 소기관 역학 및 세포 기능 및 병리학에 미치는 영향에 대한 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서론

미토콘드리아와 리소좀은 세포 항상성 유지에 필수적인 주요 막 결합 소기관입니다. 미토콘드리아는 핵분열 및 핵융합 이벤트에 의해 조절되는 매우 동적인 세포 소기관입니다1. 일반적으로 미토콘드리아는 세포의 발전소라고 하며 산화적 인산화, ATP 생산 및 칼슘2와 같은 대사 산물 저장에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 미토콘드리아는 에너지 대사에서의 역할 외에도 apoptosis3,4, calcium signaling5,6 및 lipid metabolism7,8 등 여러 다른 세포 신호 전달 과정에 관여합니다.. 마찬가지로, 리소좀은 단백질 분해, 자가포식, 세포내이입 및 식세포작용9를 통해 세포 청결을 유지하기 위해 세포 재활용 센터로서 다양한 역할을 하는 매우 동적인 세포 소기관입니다. 분해에서의 역할 외에도 리소좀은 영양소 감지, 항상성10, 지질 대사11 및 세포 역분화12와 같은 세포 생리학에서도 역할을 합니다.

개별 세포 소기관의 기능에 대한 수많은 연구가 존재함에도 불구하고, 우리의 최근 연구는 세포 생리학과 병리학 모두에 영향을 미치는 것으로 입증된 미토콘드리아와 리소좀 사이의 잘 알려지지 않은 혼선에 집중되었습니다. 미토콘드리아와 리소좀 사이의 접촉은 암세포, 뉴런 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 세포13을 포함한 다양한 세포 유형에서 관찰되었으며, 주로 세포 스트레스 또는 파킨슨병13,14 및 샤르코-마리-투스병15와 같은 신경 퇴행성 질환에서 관찰됩니다. 미토콘드리아와 리소좀 사이의 접촉은 두 세포 기관 사이의 이온(예: Ca2+)16, cholesterol17 및 iron18)의 교환을 통해 대사 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 미토콘드리아와 리소좀 사이의 접촉은 세포 소기관의 품질 관리에 중요한 역할을 합니다. 예를 들어, 손상된 미토콘드리아는 자가포식소체(autophagosomes)에 의해 삼켜지고 분해를 위해 리소좀(lysosome)으로 전달되는 미토파지(mitophagy) 과정을 통해 분해의 표적이 될 수 있습니다. 결과적으로, 기능 장애가 있는 미토콘드리아가 세포나 정상적인 미토콘드리아에 추가 손상을 일으키기 전에 제거가 촉진될 수 있습니다. 미토콘드리아와 리소좀 사이의 이러한 상호 작용은 세포 항상성을 유지하고 기능 장애 소기관의 축적을 방지하는 데 중요합니다. 따라서 손상된 미토콘드리아만 선택적으로 제거되어 건강한 미토콘드리아가 세포 내에서 최적으로 기능할 수 있습니다.

Correlative light and electron microscopy (CLEM)는 광학 현미경 (LM)과 전자 현미경 (EM)의 장점을 결합하여 다양한 스케일에서 상세한 구조 정보를 제공하는 연구 방법으로 최근 주목받고있는 이미징 기술입니다. CLEM에서는 먼저 LM을 사용하여 샘플을 이미지화하여 특정 관심 영역을 식별한 다음 고정, 탈수 및 임베딩과 같은 EM 샘플 준비 단계를 수행합니다. 그런 다음 전자 현미경으로 동일한 샘플을 관찰합니다. 최근 라이브 셀 CLEM 방법이 보고되었지만19,20,21,22, 매우 동적인 생물학적 샘플의 광학 이미지를 고정된 세포의 전자 현미경 이미지와 단일 평면으로 정확하게 결합하는 것은 여전히 어렵습니다. 미토콘드리아 및 리소좀과 같은 매우 동적인 소기관의 경우, 광학 현미경으로 실시간으로 관찰됨에 따라 정확한 위치가 변경될 수 있으며, 고정에 필요한 짧은 지연 시간 동안에도 계속 움직입니다.

따라서 이 프로토콜에서는 고정액 내에서도 활성 상태를 유지하는 두 개의 서로 다른 분자 태그를 사용하여 이온 교환을 통해 대사 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 미토콘드리아와 리소좀 간의 상호 작용을 시각화했습니다(예: Ca2+)16, cholesterol17 및 iron18 이 세포 기관 사이. TMEM192-V5-APEX2 및 Mito-mEosEM 구축물을 사용하여 EM 및 LM 수준 모두에서 배양된 세포에서 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 관찰했습니다. 미토콘드리아의 경우, mEosEM 태그는 고착 용액 및 OsO423에서 EM 시료 준비 중 형광 신호를 보존할 수 있는 능력 때문에 선택되었습니다. 리소좀의 경우, 약 28kDa의 단백질인 APEX2 태그를 사용하여 EM 및 LM 수준에서 특정 단백질의 국소화를 연구했습니다24. 과산화수소가 있는 경우 APEX2의 기질인 Amplex-Red는 태그 대상 위치에서 컨포칼 현미경으로 관찰할 수 있는 불용성 폴리머를 형성합니다. 이 프로토콜에서는 이중 색상 CLEM을 사용하여 고정 세포에서 리소좀과 미토콘드리아 간의 상호 작용 구조를 시각화했습니다.

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프로토콜

샘플 준비를 위한 단계별 워크플로우는 그림 1.

1. 세포 배양 및 transfection

  1. 37°C에서 10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM과 100U/mL의 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 35mm 유리 격자 바닥 배양 접시에서 1 × 105개의 세포 밀도로 HeLa 세포를 배양합니다.
  2. 세포를 시딩한 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 트랜스펙션 시약을 사용하여 TMEM192-V5-APEX2 및 Mito-mEosEM 플라스미드와 30%-40% 밀도로 세포를 동시 트랜스펙션합니다(TMEM192-V5-APEX2 및 Mito-mEosEM 플라스미드 DNA 각각 1μg과 3μL의 트랜스펙션 시약). 형질주입 후 DMSO 또는 U18666A(2μg/mL) 및 바필로마이신 A1(100nM)으로 18시간 동안 세포를 처리합니다.

2. 컨포칼 현미경 이미징

  1. 세포를 Bafilomycin으로 처리하고 18시간 동안 U18666A한 후 배양 배지를 제거하고 즉시 250μL의 따뜻한(30°C-37°C) 고정액(0.1M 카코딜산나트륨 용액[pH 7.0]에 2.5% 글루타르알데히드 및 2% 파라포름알데히드)을 부드럽게 피펫팅하여 첨가합니다. 즉시 정착제를 제거하고 1.5mL의 새 정착제로 교체한 다음 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액 1mL로 3 x 10분 동안 세포를 세척합니다.
    참고: 알데히드 연기는 독성이 있습니다. 모든 실험은 환기가 되는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
  2. 차가운 20mM 글리신 용액 1mL를 첨가하여 알데히드를 담금질하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 차가운 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액에서 3 x 10분 세척합니다.
  3. 0.1 M 카코딜레이트 용액에 10 mM H2O2를 첨가하여 300 μM Amplex-Red를 함유하는 새로운 용액을 준비합니다. 샘플 접시에 500μL의 Amplex-Red 용액을 추가하고 얼음에서 5분 동안 배양합니다.
  4. Amplex-Red 용액을 제거하고 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 3 x 10분을 헹굽니다.
  5. Amplex-Red 염색 후 컨포칼 현미경을 사용하여 3 x 3 타일 스캔 모드에서 관심 세포 주변 영역을 이미지화합니다. 미분 간섭 대비(DIC)와 형광 신호를 모두 캡처하여 40x(또는 60x) 대물렌즈를 사용하여 그리드 접시의 그리드와 문자를 식별하고 기록합니다.
    참고: 이러한 개요 이미지는 플라스틱이 내장된 표본에서 특정 표적 세포를 식별하기 위한 지도 역할을 합니다.
  6. 40x(또는 60x) 대물렌즈를 사용하여 고배율로 표적 세포를 이미지화하고 Z 스택 이미지를 획득합니다.
    참고: 이 고배율 이미지는 전자 현미경 이미지에 중첩되어 상관 이미지를 생성합니다.

3. EM 블록에 대한 샘플 준비

  1. LM 이미징 후, 1% 환원된 오스뮴 테트록사이드 1mL(동일한 부피의 2% 사산화오스뮴 수용액과 동일한 부피의 0.3M 카코딜레이트 완충액에 3% 페로시아나이드칼륨을 함유하여 제조)를 4°C에서 1시간 동안 후고정한 다음 4°C에서 증류수로 3 x 10분 동안 헹굽니다.
    참고: 사산화오스뮴 연기는 독성이 있습니다. 모든 실험은 환기가 되는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
  2. 실온에서 증류수로 3 x 10 분을 헹군 다음 실온에서 매번 15 분 (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % 및 100 %) 동안 등급이 매겨진 에탄올 시리즈로 탈수합니다.
  3. 에탄올과 에폭시 수지를 3:1, 1:1, 1:3의 부피 비율로 혼합하여 각 혼합물을 총 300μL씩 준비합니다. 각 에폭시 수지를 접시에 붓고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 100% 에폭시 수지를 사용하여 하룻밤 동안 함침시킵니다.
  4. 새 에폭시 수지로 채워 임베딩 캡슐 또는 PCR 튜브를 준비하고, 관심 영역에 튜브 또는 캡슐을 거꾸로 놓고 60°C의 오븐에 48시간 동안 넣어 중합합니다.

4. 절편 및 TEM 이미징

  1. 에폭시 수지가 완전히 중합된 후 액체 질소에 담가 폴리머 블록에서 바닥 유리를 분리합니다.
  2. 표본 블록을 초박 절편기의 샘플 홀더에 놓고 트리밍 블록에 놓습니다. 면도날을 사용하여 수지를 관심 물체 주위의 사다리꼴 또는 직사각형 모양으로 자릅니다.
  3. 트리밍된 시편 블록을 샘플 홀더에 놓고 다이아몬드 블레이드를 조정합니다. 시편 블록의 앞쪽 가장자리가 다이아몬드 블레이드의 가장자리와 완벽하게 평행한지 확인하십시오.
  4. 초박 절편을 사용하여 편평하게 삽입된 세포에서 약 60-70nm 떨어진 초박형 부분을 자릅니다. formvar 코팅된 슬롯 그리드에서 일련 섹션을 수집하고 핫 플레이트에서 건조시킵니다.
  5. 콘트라스트 얼룩이 있는 부분을 2분 동안 염색하고 구연산납을 1분 동안 염색합니다.
  6. 관찰을 위해 TEM 샘플 홀더에 그리드를 놓습니다. 광학 현미경의 DIC 이미지를 기반으로 관심 대상 세포를 식별합니다. 1,700배 배율로 바둑판식으로 배열된 중첩 이미지를 사용하여 전체 세포 영역을 이미지화합니다.

5. imageJ Fiji를 사용한 이미지 스티칭.

  1. 이미지 스티칭을 시작하려면 imageJ Fiji25를 시작하고 File(파일) | 신제품 | TrakEM2 (공백) | 새 TrakEM226 프로젝트를 만들려면 스토리지 폴더를 선택합니다(그림 2A1).
  2. 원시 타일 이미지 데이터를 작업 공간으로 끌어다 놓아 타일 이미지 데이터셋을 엽니다(그림 2A2).
  3. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Align (정렬) | 이 레이어의 모든 이미지를 몽타주 | elastic(비선형 블록 대응)을 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭하여 기본값 나머지 매개변수(그림 2A3)를 수락합니다.
  4. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Export(내보내기) | Make flat image(플랫 이미지 만들기)를 클릭하여 스티치된 이미지를 만든 다음 File(파일) | 다른 이름으로 저장(Save As)을 클릭하여 이미지를 저장합니다.

6. 형광 이미지 크기 조정

  1. 사진 확대 소프트웨어를 엽니다(자료 표 참조). File(파일) | 형광 이미지를 열고 선택합니다.
  2. 전자현미경 이미지와 같은 크기로 너비와 높이를 입력하고 크기 조정 방법(그림 2B1)에서 적용할 알고리즘을 선택합니다.
  3. File(파일) | 다른 이름으로 저장하여 크기가 조정된 이미지를 저장합니다.

7. Big Warp 플러그인을 사용한 랜드마크 기반 이미지 등록

  1. ImageJ Fiji를 열고 크기가 조정된 형광 현미경 사진(FM 이미지)과 스티칭된 전자 현미경 사진(EM 이미지)을 끌어다 놓습니다.
  2. Plugins(플러그인) | BigData 뷰어 | Big Wrap을 클릭하여 등록을 시작한 다음 드롭다운 메뉴를 클릭하여 FM 이미지를 동영상 이미지로 선택하고 EM 이미지를 대상 이미지로 선택합니다(그림 2C1).
    참고: 각 FM 및 EM 이미지에는 랜드마크를 표시하는 세 개의 새로운 팝업 창(BigWrap 이동 이미지, BigWrap 고정 이미지 및 랜드마크)이 있습니다.
  3. 줌(마우스 휠), 이미지 회전(왼쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스 이동), 이동(오른쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스 이동) 등의 기능을 사용하여 FM 및 EM 이미지를 비교한 다음 키보드의 스페이스 바를 눌러 랜드마크 모드를 켜고 마우스 왼쪽 버튼을 눌러 FM 및 EM 이미지에서 식별된 랜드마크를 3개 이상 표시합니다( 그림 2C2, 분홍색 점 및 빨간색 화살표).
  4. 식별된 모든 랜드마크를 표시한 후 파일 | 동영상 내보내기 | 확인되고 변환된 FM 이미지(그림 2C3).
    와 함께 새 팝업 창이 나타납니다. 참고: 새로 생성된 팝업 창은 랜드마크를 기준으로 변환된 FM 이미지입니다. 정렬을 검토하고 필요한 경우 랜드마크를 추가 또는 수정하고 변환을 다시 계산하여 조정합니다.
  5. File(파일) | 다른 이름으로 저장하여 변환된 FM 이미지를 저장합니다.

8. CLEM 이미지 오버레이

  1. ImageJ에서 변환된 FM 이미지와 스티칭된 EM 이미지를 끌어다 놓습니다.
  2. 이미지를 클릭하십시오 | 유형 | LM 및 EM 이미지에 대해 동일한 이미지 유형을 설정하는 8비트 색상(그림 2D1).
    참고: EM 이미지는 8비트 -> RGB 색상 -> 8비트 색상 순서로 두 번 변환해야 합니다.
  3. 이미지를 클릭하십시오 | 색상 >| Merge Channels(채널 병합)를 사용하여 드롭다운 메뉴에서 FM 및 EM 이미지를 각각 선택하여 이미지를 합성 이미지로 결합합니다(그림 2D2).
  4. File(파일) | 다른 이름으로 저장을 클릭하여 CLEM 이미지를 저장합니다.

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결과

이 이색 CLEM 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아와 리소좀 사이의 상호작용을 시각화하기 위해, Mito-mEosEM과 TMEM192-V5-APEX2를 사용하였습니다. 고정된 세포를 먼저 광학 현미경으로 촬영한 후, EM 샘플링 및 촬영을 진행하였습니다. 상관 이미지 결과는 그림 3A,B 및 그림 4A에 제시되어 있습니다. 앞서 설명한 프로토콜에 따라, 외부 스트레스 하에서 미토콘드리아와 리소좀 간의 상호작용 변화를 관찰할 수 있는지 확인하였습니다.

리소좀 V-ATPase 억제제인 BFA로 세포를 처리하면 오토파지가 억제되어 미토콘드리아의 품질이 저하되고 미토콘드리아와 리소좀 간의 상호작용이 증가합니다27. DMSO 처리 대조군 세포(그림 3A)와 비...

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토론

이 프로토콜은 유전적으로 인코딩된 mEosEM 및 APEX2 태그를 사용하여 고정 세포에서 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 관찰하기 위한 이중 색상 CLEM을 설명합니다. 지난 수십 년 동안 현미경의 발전으로 소기관 네트워크의 변화를 관찰하는 능력이 크게 향상되었으며32,33, 소기관 상호 작용에 대한 연구가 점점 더 흥미로워졌습니다. 초고해상도 현미경은 미토콘드리아와 리소좀 사이의 매우 역동적인 접촉의 변화를 관찰하는 데 사용되었습니다 34,35,36. 그러나 초고해상도 현미경을 사용함에도 불구하고 내부 및 외부 미토콘드리아 막(약 22nm)과 크리스타 접합부(약 28nm)의 두께 변화를 구별하기 어렵습니다37....

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 과학기술정보통신부 지원으로 한국뇌연구원을 통한 KBRI 기초연구 프로그램의 지원을 받았다(24-BR-01-03). TMEM192-V5-APEX2 plasmids는 이현우 교수(서울대학교)에서 제공하였습니다. TEM 데이터는 KBRI 뇌연구핵심시설에서 취득하였다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemicals and reagents
25% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16200알데히드 연기는 매우 독성이 있습니다. 흄 후드에서만 사용하십시오.
30% 과산화수소 용액Merck107210
4% 파라포름알데히드 용액BiosesangPC2031-100-00데히드 연기는 독성이 매우 높습니다. 흄 후드에서만 사용하십시오.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812전자 현미경 과학14120
에탄올Merck100983
Fugene HDPromegaE2311플라스미드 형질주입
글리신SIGMAG8898
Lead Citrate 3%Electron Microscopy Sciences22410
오스뮴 테트록사이드 4% 수용액전자 현미경 과학16320매우 독성이 있습니다. 흄 후드에서만 사용하십시오.
칼륨 헥사시아노페레이트(II) 삼수화물 SIGMAP3289
소듐 카코딜레이트 트리하이드레이트Sigma-AldrichC0250-500G
우라닐 아세테이전자 현미경 과학22400
UranyLess EM stain전자 현미경 과학22409
Plasmid construction
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  외.해당 없음:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um 주사기 필터Sartorius16534
35mm Gridded coverslip dishMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM 임베딩 캡슐Ted Pella130
Formvar 지원 단일 슬롯 구리 그리드Ted Pella01705
다이아몬드 나이프DiATOMEDU4530
초소형 절편기LeicaARTOS 3D
Microscopes
Inverted confocal microscopyNikonA1 Rsi/Ti-E
Transmission electron microscopyFEITecnai G2
Software and 알고리즘 < / strong>
Fiji / Image JNIH / 오픈 소스
https://imagej.nih.gov/ij/ ImageJ BigWarp 소프트웨어 패키지NIH / 오픈 소스https://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

대체 소프트웨어
이미지 크기 조정기 : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 크기 조정 : https://www.on1.com/products/resize-ai/
트

참고문헌

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