이미징과 전기생리학을 결합하여 마우스의 확산 탈분극을 시각화하고 기록합니다.

요약

이 프로토콜은 경미한 외상성 뇌 손상 후 성인 마우스에서 확산되는 탈분극을 안정적으로 감지하기 위해 이미징과 전기 생리학의 조합을 보여줍니다.

초록

SD(Spreading Depolarizations)는 회백질을 통한 느린 전파로 인해 종종 감지되지 않는 뇌의 대규모 이벤트입니다. SD 감지는 애매할 수 있기 때문에 여러 방법을 사용하여 최적으로 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 대부분의 실험실에서 안정적이고 쉽게 채택할 수 있는 방식으로 SD를 검출하기 위해 이미징과 전기생리학을 결합하는 방법을 설명합니다. SD는 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 지주막하 출혈, 허혈 및 편두통 전조 후에 발생합니다. 역사적으로 SD는 DC 증폭기를 사용하여 기록되었으며, 이는 느린 세포 외 이동과 고주파 활동의 우울증을 해결할 수 있습니다. 그러나 DC 증폭기는 만성 생체 내 녹음에 사용하는 것이 거의 불가능합니다. 이 프로토콜은 SD의 전파파를 감지하는 데 필요한 비침습적 이미징과 함께 고주파 우울증을 확인하기 위해 생체 내 전기생리학 기록을 위한 일반적인 AC 증폭기를 사용합니다. 이러한 방법은 뇌 손상 후 SD의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 대부분의 실험적 접근 방식에 대해 안정적으로 채택 및/또는 수정할 수 있습니다.

서론

확산 탈분극(SD)은 외상성 뇌 손상(TBI), 뇌졸중, 지주막하 출혈, 허혈 및 편두통 전조를 포함한 다양한 신경학적 상태와 관련이 있습니다¹. SD는 뇌졸중 및 TBI에서 조직 손상의 진행과 관련이 있습니다². 조직 손실 진행의 기저에 있는 정확한 메커니즘은 불분명합니다^3,4. 그러나 SD는 ATP 의존성 나트륨-칼륨 펌프의 기능이 이온 구배를 유지하기에 부적절해지기 때문에 뉴런의 대사 요구가 충분한 산소와 포도당으로 충족되지 않을 때 발생합니다. 조직 손실에서 SD의 역할을 이해하려면 SD를 측정하고 연구할 수 있는 정확한 기술이 필요하며, 이는 과학적 지식을 발전시키는 데 매우 중요합니다. SD는 실험 설계 및/또는 기기 제한으로 인해 종종 감지되지 않을 수 있는 중요한 신경학적 사건입니다.

손상 진행에서 확산 탈분극(SD)의 역할은 현재 밝혀지고 있지만, 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)에서의 역할은 불분명합니다. 이 원고에 설명된 기술을 사용한 최근 연구는 명백한 조직 손상이나 출혈이 없는 경우에도 폐쇄형 두개골 mTBI 마우스 모델에서 SD가 시작됨을 보여주었습니다^{5, 6}입니다. 이러한 연구는 SD가 급성 신경 장애와 신경 염증에 기여할 수 있음을 시사합니다. 또한 mTBI로 인한 SD의 존재는 급성 행동 결핍과 밀접한 관련이 있습니다^6,7. 따라서 SD는 모든 TBI 모델에서 시작될 가능성이 높지만 확인 없이는 그 역할을 확인하기 어렵습니다. SD의 존재 여부를 확인하는 것은 mTBI의 결과를 정확하게 평가하는 데 중요합니다.

확산 탈분극(SD)은 "DC 이동"으로 알려진 세포 외 전위의 현저한 감소와 고주파 활성의 저하로 식별됩니다⁸. "DC shift"는 일반적으로 해결하는 데 몇 초가 걸립니다(~10초)⁹. "DC shift"를 캡처하려면 DC 증폭기와 은선 전극이 필요합니다. 그러나 생체 내 전기 생리학은 일반적으로 저주파 이벤트를 필터링하여 모션 아티팩트를 줄이도록 설계된 AC 증폭기를 사용하여 수행됩니다. 불행히도 이 저주파 필터링은 "DC shift"도 제거합니다. 또한 은은 독성이 있어 만성 녹음에 적합하지 않습니다. 일반적으로 사용되는 AC 증폭기는 고주파 활동의 저하를 감지할 수 있지만 수반되는 "DC 이동"이 없으면 SD의 존재를 확인하기가 어렵습니다.

확산 탈분극(SD)도 다양한 이미징 기술을 사용하여 감지할 수 있습니다. 가장 일반적으로 SD는 손상되지 않은 두개골을 통한 대뇌 혈류를 측정하는 레이저 스페클 대비 이미징으로 이미지화됩니다¹⁰. SD는 대뇌 혈관 구조와 혈류에 큰 영향을 미칩니다. 생쥐를 제외한 대부분의 종에서 SD는 SD^{11의 선행 가장자리와 함께 이동하는 과관류의 전파 파동을 유도}합니다. SD는 칼슘 또는 글루타메이트 형광 지시자^{12를 사용하여 이미지화할 수도} 있지만, 이를 위해서는 염료 또는 유전적으로 암호화된 형광 지시약으로 조직을 로드해야 합니다^12,13. 흥미롭게도 SD는 SD^{14와 관련된 고유 광학 신호(iOS)로 인해 육안으로 관찰할 수 있습니다}. iOS는 NAD(P)H 및 FADH와 같은 자가형광 분자로 구성된 복잡한 신호입니다^15,16, 조직 팽창¹⁷ 및 뇌 혈류의 잠재적 변화. 복잡성에도 불구하고 iOS 신호는 신뢰할 수 있으며 야생형 마우스에서 캡처할 수 있습니다¹⁸. 이 프로토콜은 특수 바이러스나 형질전환 동물 없이도 모든 실험실에서 구현할 수 있기 때문에 iOS 이미징 방법을 설명합니다.

이 방법의 전반적인 목표는 동시 이미징 및 전기 생리학을 사용하여 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI) 후 확산 탈분극(SD)의 존재 여부를 실험적으로 확인하는 것입니다. 고급 증폭기에 의해 촉진되는 생체 내 전기 생리학은 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그러나, 이러한 증폭기는 특징적인 "DC shift"를 검출할 수 없다.따라서, 이 프로토콜에 기술된 바와 같은 이미징 기술은 SD의 존재 또는 부재를 자신 있게 확인하기 위해 채택된다. 이미징과 전기생리학을 결합하는 것의 장점은 이미징은 SD의 전파를 감지할 수 있는 반면, 전기생리학은 관련된 고주파 우울증을 식별할 수 있다는 것입니다.

전반적으로 이 방법은 외상성 뇌 손상(TBI) 후 확산 탈분극(SD)의 존재를 조사하는 데 적합합니다. 이 응용 프로그램은 TBI 및 SD 후 피질 네트워크 기능에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 닫힌 두개골 충격 모델에서 제어된 피질 충격, 유체 타악기 또는 체중 감소와 같은 다른 모델로 조정할 수 있습니다. 여러 실험실에서 이 프로토콜을 구현하면 다양한 TBI 중증도에서 SD의 역할을 설명할 수 있습니다. 확립된 모든 TBI 모델을 사용할 수 있으며, 이어서 이 프로토콜에 설명된 iOS 이미징 및 전기 생리학 절차를 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 뉴멕시코 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따라 수행되었습니다. C57BL/6J 마우스는 상용 공급원에서 얻었습니다. 동일한 수의 수컷과 암컷 마우스가 8-14 주의 연령 범위 내에서 사용되었습니다. 모든 마우스의 무게는 약 20g이었습니다. 이 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 보충 파일 1에는 약어 목록이 포함되어 있습니다.

1. 이미징 및 전기 생리학을 위한 두개골 준비

1. 100% 산소에 2%-3% 이소플루란이 포함된 이소플루란 유도 상자에서 동물을 마취하여 앞발이 꼬여도 움찔하지 않고 적절한 마취 깊이를 보장합니다.
2. 동물을 정위 골격에 넣기 전에 수술 전 진통제(서방형 부프레노르핀, 3.25mg/kg, SQ)를 투여하고 마취(2% 이소플루란)를 유지합니다.
3. 안과 연고를 바르고 체온 피드백이 있는 발열 패드로 동물의 체온을 유지합니다.
4. 절개 부위가 있을 두개골 위의 수염을 안구 열구에서 람다까지 정중선을 따라 면도합니다.
5. 잘린 머리카락을 제거한 후 소독 및 소독제 스크럽과 용액으로 피부를 살균하십시오. 70% 에탄올로 마무리하고 멸균 수술 부위를 보장하기 위해 세 번 반복합니다.
6. #10 메스 날을 사용하여 주부에서 꼬리까지 정중선을 따라 절개한 다음 즉시 절개 부위에 의료용 시아노아크릴레이트 접착제를 바릅니다. 두개골이 드러나도록 피부를 옆으로 펼칩니다.
7. 두개골에 시아노아크릴레이트 접착제를 한두 방울 더 바르면 두개골을 추가로 보호할 수 있습니다.
   참고: 접착제 적용은 10초 이상 공기에 노출되면 두개골이 불투명해지기 시작하므로 시간에 민감합니다. 이렇게 하면 이미징 방법을 통한 SD의 시각화가 모호해집니다.
8. 접착제가 마르는 동안 멸균 수술용 가위를 사용하여 소뇌 위의 절개 크기를 늘립니다. 접착제가 굳으면 두개골 나사 전극 이식을 시작합니다.
   1. 이식하기 전에 비드 살균기로 두개골 나사를 20-30초 동안 살균하십시오.
   2. 열린 시각적 창을 유지하기 위해 SD 시작 부위에서 멀리 떨어진 영역에 두개골 나사를 놓습니다.
      참고: 1차 시각 피질의 만성 기록을 위해 3개의 두개골 나사가 사용됩니다. 첫 번째 나사는 소뇌의 브레그마에서 약 y = -6.00mm 떨어진 곳에 위치하며 기준 전극 역할을 합니다. 기록 전극은 왼쪽 및 오른쪽 반구 내에서 브레그마에서 y = -2.79mm, 정중선에서 x = ±2.5mm에 위치합니다.
   3. 0.8mm 크기의 드릴 비트를 사용하여 두개골을 통해 파일럿 구멍을 뚫습니다. 기저 조직이 손상되지 않도록 하려면 z에서 -0.5mm가 이상적입니다. 스테인리스 스틸 와이어로 금핀에 미리 납땜된 #00-90 나사를 사용하십시오.
   4. 나사를 두개골 안으로 아래로 돌립니다.1.5-2 바퀴를 완전히 돌리면 나사가 두개골을 통과하여 피질 표면과 접촉합니다.
   5. 여분의 와이어를 나사 주위에 감아 헤드 스테이지 나중에 배치하기 위해 와이어를 약간 느슨하게하십시오.
   6. 동일한 절차를 사용하여 다른 두개골 나사를 끼웁니다.
   7. 모든 두개골 나사가 제자리에 고정되면 모든 금색 핀을 원하는 헤드스테이지 커넥터에 꽂습니다. 입체식 암을 사용하여 커넥터를 제자리에 잡고 전선이 닿지 않도록 하면서 커넥터 핀을 나사 머리 위에 가깝게 잡습니다.
   8. 시아노아크릴레이트 접착제로 전체 영역을 밀봉하고 두개골 나사 앞의 이미징 영역을 방해하지 않도록 합니다.
   9. 금핀 바닥 주위에 치과용 시멘트를 구축하여 두개골 나사의 금핀이 헤드 스테이지의 금핀에 연결되지 않도록 합니다.
   10. 헤드스테이지 커넥터를 제거하기 전에 치과 시멘트가 경화되도록 하십시오.
   11. 정위 안경테에서 동물을 제거하고 회복을 위해 가정용 케이지에 다시 넣습니다. 표준 수술 후 관리를 따르고 마취에서 회복하는 동안 동물을 발열 패드에 두십시오.
       참고: 수술 후, 동물들은 한 집에서 지내며 매일 통증을 모니터링했습니다. 진통제에 대한 지역 기관 지침을 따르십시오. 서방형 부프레노르핀을 사용하는 경우 통증에 대한 모니터링 및 잠재적으로 72시간에 추가 용량을 제공하십시오.
9. 하우징 및 농축을 포함하여 전극에 걸릴 수 있는 모든 물체를 제거하십시오. 음식과 물을 이용할 수 있는 표준 침구를 사용하십시오.
   참고: 수술과 기록 사이에 이틀의 회복 기간을 두십시오.

2. 고유 광 신호(iOS) 이미징 및 AC-전기생리학으로 확산 탈분극 감지

1. 100% 산소에 2% 이소플루란으로 동물을 마취합니다.
   참고: 이 절차의 이미징 부분은 ~5분이 소요되어야 하며 이소플루란 노출량은 일정해야 합니다.
2. 동물을 입체 안경테에 놓습니다. 코 콘을 통해 산소에 1%-2% 이소플루란을 유지하십시오.
   참고: 이소플루란은 SD를 감소시키는 것으로 알려져 있으므로 적절한 마취 깊이를 유지하는 것이 중요합니다. 실험 내내 60-70 호흡/분을 유지하는 것이 좋습니다.
3. 동물을 카메라 아래에 놓고 초점 링을 조정하여 카메라가 피질 표면에 초점을 맞추도록 합니다.
4. 이미징 영역에 미네랄 오일을 바르면 투명도가 높아집니다.
5. 컴퓨터, LED 배전반 및 전기생리학 장비를 켭니다.
   참고: LED 패널보드는 머리 위 조명이 꺼져 있는 동안 이미징 창을 비추기 위해 동물 앞에 배치할 때 가장 잘 작동합니다. 조명은 4000K의 냉각 온도 설정으로 ~2,400lux(95% 전력)로 설정되었습니다.
6. Micro-Manager^{19,20,21,22를 사용하여 iOS용 로드 설정}.
   1. Live를 눌러 view 카메라 아래에 마우스를 놓고 동물의 두개골을 카메라 아래 중앙에 놓습니다. "라이브" 창을 닫습니다.
   2. Multi-D Acq를 누릅니다.
   3. 다차원 획득 창에서 원하는 시점을 선택합니다.
      참고: 250ms 간격으로 750개의 이미지를 계산하는 것이 좋습니다.
   4. 원하는 파일 경로 및 이름 접두사에 이미지를 저장합니다.
7. 동물의 금핀을 헤드스테이지 커넥터에 연결한 다음 헤드스테이지에 연결합니다.
8. Intan 소프트웨어에 대한 로드 설정.
   1. 파일 형식 선택 아이콘을 클릭하고 팝업 창에서 신호 유형 형식당 하나의 파일을 선택합니다. 이렇게 하면 MATLAB에서 나중에 사용할 수 있도록 파일이 ".dat"로 저장됩니다.
   2. 하드웨어 대역폭의 BW 탭에서 0.13-500Hz의 증폭기 대역폭을 선택합니다.
   3. Filter Display Selector(필터 디스플레이 선택기)에서 WIDE(와이드)를 선택하여 가장 넓은 범위의 신호를 커버합니다.
   4. 저장할 파일 경로를 선택하려면 파일 이름 선택 아이콘을 클릭합니다.
9. 전자기 충격기를 사용하여 충격을 가합니다.
   알림: 임팩터 설정은 4m/s의 충격 속도와 5mm 처짐입니다.
   1. 임팩터를 켜고 3방향 토글을 튕겨 팁을 후퇴시키고 팁을 확장하여 팁이 적절하게 수축 및 확장되는지 확인합니다. 동물을 팁 아래에 놓기 전에 팁을 확장해야 합니다.
   2. 빠르게 움직여 동물을 거품 침대에 놓고 침대 끝을 아래로 밀어 넣습니다.
   3. 임팩터 팁을 정중선과 브레그마 1mm 길이에 맞춥니다.
   4. 동물의 머리 꼭대기에 단단히 닿을 때까지 임팩터 팁을 내립니다.
      알림: 팁을 머리로 밀어 넣지 마십시오.
   5. 레버를 밀어 임팩터 팁을 집어넣은 다음 임팩트 레버를 활성화하기 전에 수동으로 5mm 내립니다.
   6. 즉시 폼 베드에서 동물을 제거하고 충격으로 SD가 시작되므로 5초 이내에 이미징을 위해 동물을 카메라 아래에 놓습니다.
10. Multi-Dimensional Acquisition 창에서 Acquire!를 클릭하여 iOS 이미징을 시작합니다. 전체 SD를 캡처하기 위해 4분 동안 이미지.
11. Intan 소프트웨어에서 녹음 아이콘을 클릭하여 전기생리학 기록을 시작합니다.
12. 폼 패드에서 동물을 제거하고 동물이 탁 트인 경기장이나 가정용 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다.
    참고: 피질 네트워크 기능이 회복될 수 있도록 최소 1시간 동안 전기생리학을 기록하는 것이 좋습니다.
13. 녹음이 완료되면 헤드스테이지와 커넥터에서 동물의 플러그를 뽑고 동물을 케이지에 다시 넣습니다.
    알림: 각 임팩트와 녹화 세션 사이에 24시간을 허용하는 것이 좋습니다. 동물은 녹음 세션 이외의 전체 시간 동안 집 우리에 머물 수 있습니다.

3. iOS 이미지 시각화 및 수량화

1. ImageJ^{19,20,21,22에서} 파일 > 이미지 가져오기 시퀀스를 클릭하여 이미지 스택> 엽니다.
2. 이미지를 수동으로 스크롤하여 움직임이나 다른 아티팩트가 없는지 확인합니다.
3. SD의 플롯을 생성하려면 커서를 사용하여 정사각형을 그려 ROI를 생성합니다.
   참고: 30 x 30픽셀 정사각형을 사용하는 것이 좋습니다. 어떤 모양이나 크기도 사용할 수 있지만 ROI 크기가 동물에 따라 변경되지 않도록 합니다.
4. Image > Stacks > Plot Z-axis Profile을 클릭하여 플롯을 만듭니다. 새로 생성된 그래프에서 라이브 버튼을 클릭합니다. SD의 이미지 스택으로 돌아가서 그래프에 SD 곡선이 표시될 때까지 ROI를 이동합니다. 플롯은 초기 상승 후 기준선 아래로 떨어지고 몇 분 내에 기준선으로 천천히 복귀하는 죄악의 파동처럼 보여야 합니다.
   참고: 플롯은 임의 단위(AU) 또는 처음 몇 개의 이미지를 기준선 평균으로 사용하여 백분율 기준선으로 표현할 수 있습니다.
5. 생성된 플롯에서 목록을 클릭하여 다른 그래프 생성 소프트웨어 또는 Matlab에 표시할 수 있는 값 목록을 생성합니다.
6. 시각화를 위해 ImageJ by Image > Lookup Tables > Fire에서 회색조 이미지를 조회 테이블로 변환합니다.

4. 전기생리학 분석

참고: 전기생리학 데이터를 시각화하고 분석하는 데 Buzsaki 연구실의 전문 지식과 MATLAB에서 생성한 코드를 많이 활용하는 것이 좋습니다. 분석을 위해서는 GitHub(https://github.com/buzsakilab/buzcode)를 통해 기관 활성화 코드 및 Buzsaki lab "Buzcode" zip 파일이 포함된 MATLAB을 다운로드해야 합니다.

1. Intan 전기생리학 소프트웨어에서 내보낸 원시 데이터가 ".dat" 형식으로 저장되었는지 확인합니다.
   참고: Matlab은 MathWorks 웹 사이트에서 설치할 수 있습니다. 기관 또는 개인 활성화 코드는 Matlab의 구매 및 사용에 필요합니다. 이 분석을 수행하려면 Matlab에서 코드를 실행한 경험이 있어야 합니다.
2. Buzaki 코드 bz_LoadBinary 함수를 사용하여 데이터를 Matlab.
   로 불러옵니다. 참고: 예시 "'data' = bz_LoadBinary ('full data file path','frequency', sampling frequency, nChannels, number of channels);
3. 60Hz를 중심으로 하는 노치 필터를 사용하여 AC 잡음을 필터링합니다.
   참고: 예시 notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, 데이터);
4. 확산 탈분극(SD)을 분석하고 시각화하기 위한 COSBID 그룹의 권장 사항에 따라 0.5-100Hz 범위의 대역통과 필터를 사용하여 고주파 활동을 분리합니다.
5. MatLab에서 pspectrum 명령을 사용하여 파워 스펙트로그램을 계산합니다.
6. 시각화하려면 고주파수 스펙트로그램과 파워 스펙트로그램을 동일한 시간 스케일에 하나의 열에 플로팅합니다.
   참고: 플롯에서는 고주파 강하와 전력 손실이 확장될 것입니다.

결과

그림 1은 실험 설정을 그래픽으로 보여줍니다. 기록하는 두개골 나사는 1차 시각 피질에 위치하며, 하나의 두개골 나사 전극은 접지 전극으로 소뇌 vermis에 배치됩니다. 두개골 나사와 금핀은 시아노아크릴레이트 접착제와 치과용 시멘트를 사용하여 두개골에 고정됩니다. 치과 시멘트를 두개골의 꼬리 부분으로 제한하여 충격과 이미징을 위한 공간을 확보하는 것이 중요합니다. 정중선을 중심으로 브레그마까지 약 1mm 높이의 충돌 위치는 그림 1에 표시되어 있습니다.

대표적인 고유 광 신호(iOS) 이미지는 그림 2A. 회색조 이미지는 확산 탈분극(SD)의 시각화를 향상시키기 위해 Fire Lookup Table을 사용하여 변환됩니다. iOS는 NAD(P)H, FADH 및 조직 반사를 포함한 다양한 신호를 포함하므로 이러한 신호의 해석 및 비교가 어렵습니다. 큰 용기는 슈퍼 글루 창(화살표로 표시)을 통해 명확하게 볼 수 있어야 하며, 그림 2A는 SD의 전파파를 표시합니다. SD는 실시간으로 관찰하기 어렵지만 이미지의 속도를 높이면 더 분명해집니다(보충 비디오 1 참조). 일부 작은 가지는 혈관 수축으로 인해 "사라지는" 것처럼 보일 수 있습니다(그림 2A). 이미지 스택에서 추출한 작은 관심 영역(ROI)은 그림 2B와 유사한 Z축 플롯을 생성해야 합니다. 전기생리학 기록에서 추출된 고주파 신호는 그림 2C,D. 이러한 기록은 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI) 직후에 시작되었으며, 동물은 iOS 이미징의 4분 동안 이소플루란 마취 상태를 유지했습니다. 이소플루란이 제거되면 그림 2C(빨간색 상자)에서 볼 수 있듯이 가짜 동물에서 고주파 활성이 1분 이내에 빠르게 회복되어야 합니다. 반대로, SD가 발생하면 고주파 활동은 복구되기 전에 몇 분 동안 억제된 상태로 유지됩니다(그림 2D, 빨간색 상자). 그림 2C,D의 하단 패널은 각 고주파 플롯에 대해 계산된 전력(V²)을 표시합니다. 이러한 전력 플롯은 전력의 급격한 상승(빨간색 상자의 오른쪽 가장자리로 표시)에 의한 고주파 활동의 억제 및 복구를 식별하는 데 도움이 됩니다.

그림 1: 충격 및 두개골 나사의 실험적 설정 및 위치. 두개골의 등쪽 표면은 피부 절개를 통해 노출됩니다. 두개골과 피부는 투명도를 높이기 위해 시아노아크릴레이트 접착제로 밀봉되어 있습니다. 지면용 버 구멍은 브레그마에서 y = -6.00 및 x = 0으로 뚫립니다. 전극을 기록하기 위한 버 구멍은 브레그마에서 y = -2.79 및 x = ±2.5에 배치됩니다. 스테인레스 스틸 나사는 두개골을 통해 나사산을 끼우고 코팅되지 않은 스테인레스 스틸 와이어로 금 핀에 납땜됩니다. 충격과 이미징을 위한 적절한 공간을 확보하기 위해 치과 시멘트로 두개골 표면을 과도하게 덮지 않도록 주의를 기울입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 대표적인 iOS 이미지 및 AC 녹음.(A) 혈관을 나타내는 화살표가 있는 대표적인 iOS 이미지. 그레이스케일 이미지는 향상된 시각화를 위해 ImageJ의 Fire 조회 테이블로 변환됩니다. 검은색 점선은 전파되는 SD를 나타내며, iOS에서 증가된 강도의 파동으로 시각화됩니다. SD는 전체 이미지 스택을 빠르게 스크롤할 때 명확하게 볼 수 있습니다. iOS 신호는 NAD(P)H 및 FADH의 미토콘드리아 생성, 신경 부종 등 SD와 관련된 다양한 생리적, 대사적 변화를 반영합니다. 블랙 박스는 (B)에서 트레이스를 생성하는 데 사용되는 관심 영역(ROI)을 강조 표시합니다. 스케일 바: 1mm. (B) 기준선의 백분율로 표시되는 iOS SD의 대표 트레이스. iOS 신호가 상승하고 약 60초 이내에 기준선 근처로 돌아갑니다. iOS 신호의 변화는 작지만(약 10%), SD를 식별하기에는 충분합니다. 가짜(C) 및 SD(D) 동물 모두에 대한 AC 녹음에서 상단 트레이스는 고주파 활동을 나타내고 하단 트레이스는 전력(V²)을 나타냅니다. 파란색 상자는 이소플루란 마취 기간을 나타내고, 빨간색 상자는 이소플루란 및 SD로 인한 고주파 활동의 회복 기간을 나타냅니다. SD에 의해 유발된 장기간의 우울증은 이소플루란(isoflurane) 단독 사용 후 활동의 빠른 회복(가짜)과 대조를 이룹니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1: 파동 시각화 전파. 비디오 파일은 전파파의 시각적 식별을 용이하게 하기 위해 약 8배속으로 빨라집니다. 회색조 이미지는 Fire 조회 테이블로 변환되어 ImageJ에 .AVI 파일로 저장되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary File 1: 약어 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

확산 탈분극은 외상성 뇌손상(TBI), 뇌졸중 및 편두통을 포함한 다양한 질병 모델에서 중요합니다¹. SD의 정확한 검출은 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)^23,24 후 급성 행동 결손 및/또는 신경면역 체계 활성화에서의 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 단일 방법을 사용할 때 SD 누락 위험을 완화하려면 SD의 효과적인 시각화 및 기록을 위한 다중 방법 접근 방식이 필요합니다.

기술을 결합하면 확산 탈분극(SD)을 확인할 수 있지만 각 기술에는 잠재적인 함정이 있을 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 이미징 기술은 대부분의 실험실에서 액세스할 수 있으며 Zepeda와 동료들이 자세히 설명합니다²⁵. 불투명한 창은 결정적이지 않은 이미지로 이어질 수 있으므로 두개골 창의 준비는 매우 중요합니다²⁶. 이 문제는 시아노아크릴레이트 접착제를 바르기 전에 두개골이 공기에 노출되는 것을 최소화함으로써 완화할 수 있습니다. 또한 이미징 전에 미네랄 오일 한 방울로 창의 투명도를 향상시킬 수 있습니다. 움직임 아티팩트는 SD 확인을 복잡하게 만들 수도 있으므로 선명한 비디오를 얻으려면 이러한 아티팩트를 최소화하는 것이 필수적입니다. 이 문제를 해결하기 위해 이미징 과정 전반에 걸쳐 동물을 이소플루란 하에 유지하는 것이 중요합니다²⁷. 노즈콘을 사용하면 임팩터와 녹음 설정 사이에서 동물을 효율적으로 이동할 수 있습니다. 가능한 한 많은 SD 전파를 포착하기 위해 충격 후 동물을 코뿔 아래에 신속하게 다시 배치하는 것이 중요합니다. 이 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI) 모델에서 일반적으로 약 4분 동안 기록하면 전체 SD를 캡처하기에 충분합니다. 그러나 더 심각한 TBI에서는 조직 손상에 의해 자발적인 SD가 생성될 수 있습니다²⁸. 연속 영상은 이러한 자발적인 SD를 감지할 수 있지만 확장된 이소플루란 마취는 고주파 우울증을 관찰하기 어렵게 만들 수 있습니다. 자발적인 SD는 고주파 활동의 추가 억제에 의해 전기생리학으로 감지될 수 있지만 영상 없이는 우울증과 SD 사이의 관계를 확인하는 것이 어렵습니다.

Open-Ephys 및 Intan 증폭기의 개발로 이제 많은 실험실에서 생 체 내 전기생리학에 접근할 수 있습니다. 모든 전기생리학적 기록에는 두개골 나사 및/또는 전극의 이식이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 회복을 지원하기 위해 두개골 나사 이식과 기록 사이에 2일의 잠복 기간이 있습니다. 이 기간은 뇌가 이식에서 완전히 회복하기에 충분하지 않을 수 있지만 두개골 나사가 뇌 조직을 관통하지 않기 때문에 손상이 최소화되어야 합니다. 또한 시아노아크릴레이트로 밀봉된 두개골의 투명도는 시간이 지남에 따라 감소하므로 최적의 투명성을 얻으려면 가능한 한 빨리 이미징을 수행해야 합니다. 전기생리학의 경우 60Hz 노이즈를 최소화하는 것이 중요합니다. 실험 영역이 AC 전원에서 절연되어 있고 Intan 에 적절하게 접지되어 있는지 확인하십시오. 움직임 아티팩트를 완전히 제거할 수는 없지만 헤드 스테이지의 가속도계는 후처리 중에 움직임 기간을 식별하고 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로 이러한 기술은 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI) 후 SD 회복 및 피질 네트워크 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이러한 기술의 한 가지 한계는 동물이 이미징 중에 마취 상태에 있다는 것입니다. 그러나 대부분의 TBI 모델은 마취가 필요하며 연장된 마취가 실험 설계에 큰 영향을 미치지 않을 것입니다. 이소플루란은 고주파 활동을 크게 감소시킵니다²⁷. 이소플루란 노출이 이미징 기간을 초과하면 SD 후 고주파 활동 회복 감지가 복잡해질 수 있습니다. 따라서 그림 2와 같이 고주파 활동의 회복을 비교하기 위해 실험 설계에 가짜 또는 이소플루란 단독 그룹을 포함하는 것이 중요합니다. 또 다른 제한 사항은 전기생리학 기록이 DC 이동을 감지하지 못한다는 것입니다. DC 이동의 진폭과 지속 시간은 SD²⁸의 조직 건강 및 회복을 나타내는 지표입니다. 그럼에도 불구하고 이러한 기술로 SD를 확인하면 TBI 연구에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

모든 TBI 모델이 확산 탈분극(SD)을 생성할 가능성이 높기 때문에 모든 TBI 연구자는 여기에 설명된 기술의 이점을 누릴 것입니다. TBI 분야는 부상, 부상 진행, 신경면역 활성화 및 회복에서 SD의 역할을 이해함으로써 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 SD는 행동 결함에 기여하고 신경 장애의 기본 메커니즘일 수 있습니다 ^5,7. 이 프로토콜에 설명된 기술은 TBI와 SD 사이의 연관성을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 기술의 향후 적용은 뇌졸중, 간질 및 편두통을 포함한 다른 연구 분야로 확장될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#00-90 x .118 기계 나사	US 마이크로 나사	00.90-118-M-SS-P, 아마존
0.8 mm 지름 드릴 비트	PCB 드릴 비트	WYTP21, 아마존
16-A 헤드스테이지	인탄	C3335
2.1 mm 버 마이크로 드릴 비트	Fine Science Tools	19007-21
AC 증폭기	Intan	RHD 녹음 시스템
C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소	Jax#000664
CCD 카메라	Mightex	TCE-1304-U
확장 렌즈	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (느린 방출 부프레노르핀)	Midwest Veterinary Supply	제품 번호 267.10000.3
골드 커넥터 핀(암)	A-M Systems	520100
골드 커넥터 핀(수)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
LED 패널 보드	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	기관 또는 개별 활성화 코드
의료 등급 시아 노 아크릴 레이트 접착제	MasterBond	MB287
마이크로 매니저 카메라 소프트웨어	이미지 J	NA
네일 드릴 / 폴리 셔	Makartt 네일 드릴 전기 네일 파일	JD700
옴네틱 커넥터	Omnetics	A79014-001
RHX 데이터 수집 소프트웨어	Intan	NA
스테인리스 스틸 코팅되지 않은 와이어 (0.005")	A-M 시스템	792800
스테레오택시 프레임	Kopf Intruments	1923-B
Teets 'cold cure' 치과용 시멘트	A-M 시스템	525000, 526000
XLR 카메라 렌즈	니콘	NIKKOR 50mm f/1.8-16