폴리올 기반 기술을 사용한 화장품 응용을 위한 페놀 화합물 및 항산화제의 마이크로파 보조 추출

요약

이 프로토콜은 페놀 화합물 및 천연 항산화제를 추출하기 위한 폴리올 기반 마이크로파 보조 추출 방법의 활용에 대해 자세히 설명하며, 즉시 사용 가능한 추출물 개발에 대한 실용적이고 환경적으로 지속 가능한 접근 방식을 나타냅니다.

초록

식물 재료에서 생체 활성 화합물을 추출하기 위한 녹색 용매로 폴리올을 사용하는 것은 식물 생체 활성 화학 물질에 대한 안전성 및 불활성 거동으로 인해 주목을 받고 있습니다. 이 연구는 글리세린, 프로필렌 글리콜(PG), 부틸렌 글리콜(BG), 메틸프로판디올(MPD), 이소펜틸디올(IPD), 펜틸렌 글리콜, 1,2-헥산디올 및 헥실렌 글리콜(HG)과 같은 폴리올 기반 용매와 함께 마이크로파 보조 추출(MAE) 방법을 사용하여 커피 실버스킨에서 페놀 화합물 및 천연 항산화제의 지속 가능한 추출을 탐구합니다. 총 페놀 함량(TPC), 총 플라보노이드 함량(TFC) 및 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 라디칼 소거 분석(DPPH), 2,2′-azino-bis(-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 라디칼 소거 분석(ABTS) 및 철 환원 항산화력 분석(FRAP)과 같은 항산화 활성과 같은 매개변수를 포함하여 MAE의 생체 활성 화합물에 미치는 영향에 중점을 두고 기존 및 비전통적 용매 추출에 대한 비교 분석을 수행했습니다. TPC는 수성-1,2-헥산디올 추출(52.0 ± 3.0mg GAE/g 샘플), TFC와 수용성-1,2-헥산디올 추출(20.0 ± 1.7mg QE/g 샘플), DPPH와 수성-HG 추출(13.6 ± 0.3mg TE/g 샘플), ABTS와 수성 펜틸렌 글리콜 추출(8.2 ± 0.1mg TE/g 샘플) 및 FRAP와 수성-HG 추출(21.1 ± 1.3mg Fe(II) E/g 샘플)에서 가장 높은 값이 관찰되었습니다. 이 연구는 천연 식물 성분을 통해 친환경 추출 기술을 발전시키고, 유해 화학 물질 사용을 최소화하는 동시에 시간과 에너지 소비를 줄임으로써 지속 가능성을 촉진하는 것을 목표로 하며, 화장품에 적용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

오늘날 뷰티 산업에서 환경 인식에 대한 세계적인 추세가 나타나고 있으며, 이로 인해 제조업체는 지속 가능한 대안을 사용하여 식물 성분을 추출하기 위한 녹색 기술에 집중하고 있습니다¹. 일반적으로 에탄올, 메탄올 및 헥산과 같은 전통적인 용매는 식물 페놀 성분과 천연 산화 방지제를 추출하는 데 사용됩니다². 그럼에도 불구하고, 식물 추출물 내에 용매 잔류물의 존재는 인체 건강에 잠재적인 위험을 초래하며, 특히 화장품에 의도된 적용과 관련하여 피부 및 눈 자극을 유발합니다3. 결과적으로, 추출물에서 이러한 용매 잔류물을 제거하는 것은 어려운 일이며, 이는 시간, 에너지 및 인적 자원에 상당한 투자를 요구하는 과정입니다⁴. 최근에는 과가열수, 이온성 액체, 심층 공융 용매, 바이오 유래 용매가 녹색 용매 추출을 위한 유망한 접근법으로 부상하고^{있다 5}. 그러나 이들의 사용은 여전히 수성 기반 공정에서 제품 분리로 인해 제한됩니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 바로 사용할 수 있는 추출물의 개발이 실행 가능한 솔루션으로 떠오르고^{있습니다 6}.

폴리올은 양호한 극성과 환경으로부터 수분을 유지하는 능력 때문에 화장품 제형에서 습윤제로 자주 사용됩니다⁷. 또한 글리세린, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 메틸프로판디올, 이소펜틸디올, 펜틸렌 글리콜, 1,2-헥산디올 및 헥실렌 글리콜과 같은 폴리올을 식물 추출에 사용할 수 있습니다. 그들은 식물 추출에 사용하기 위해 무독성, 생분해성, 환경 친화적, 비 반응성 및 안전한 용매로 간주됩니다⁸. 또한, 폴리올은 높은 끓는점과 극성으로 인해 마이크로파 보조 추출(MAE) 중에 발생하는 열을 견딜 수 있습니다⁹. 이러한 폴리올은 일반적으로 미국 식품의약국(FDA)에서 안전한(GRAS) 화학 물질로 인정됩니다. 에탄올 또는 메탄올과 같은 기존 용매와 달리, 잠재적으로 유해한 영향으로 인해 추출물에서 엄격한 제거가 필요할 수 있는 폴리올은 용매 제거 공정과 관련된 에너지, 시간 및 비용을 최소화하는 이점을 제공합니다¹⁰. 이는 추출 공정을 간소화할 뿐만 아니라 추출 방법의 전반적인 효율성과 지속 가능성을 향상시킵니다. 이전 연구에서는 프로필렌 글리콜 및 부틸렌 글리콜과 같은 폴리올을 Camellia sinensis 꽃¹⁰ 및 커피 펄프¹¹에서 생체 활성 화합물을 추출하는 용매로 사용했으며, 이는 식물 추출 공정에서 지속 가능한 대체 용매로서의 역할에 대한 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 따라서 폴리올-물 용매 시스템의 지속적인 개발 및 최적화는 녹색 화학 및 지속 가능한 산업 관행에서 상당한 발전의 잠재력을 가지고 있습니다.

일반적으로 식물에서 발견되는 생체 활성 화합물은 2차 대사 산물로 합성됩니다. 이들 화합물은 테르펜 및 테르페노이드, 알칼로이드 및 페놀 화합물¹²의 세 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있다. 식물에서 특정 생체 활성 화합물을 분리하기 위해 다양한 조건에서 다양한 추출 방법이 사용됩니다. 식물 재료로부터의 생체 활성 화합물은 통상적인 또는 비전통적인 기술을 사용하여 추출할 수 있습니다. 전통적인 방법에는 침용, 환류 추출 및 수소 증류가 포함되는 반면, 비전통적인 방법에는 초음파 보조 추출, 효소 보조 추출, 마이크로파 보조 추출(MAE), 펄스 전기장 보조 추출, 초임계 유체 추출 및 가압 액체 추출로 구성됩니다¹³. 이러한 비전통적인 방법은 보다 안전한 용매 및 보조제를 사용함으로써 안전성을 향상시키고, 에너지 효율을 개선하며, 생체 활성 성분의 분해를 방지하고, 환경 오염을 줄이도록 설계되었다¹⁴.

또한 MAE는 식물에서 생체 활성 화합물을 추출하기 위한 정교한 녹색 기술 중 하나입니다. 기존의 추출 절차는 상당한 양의 시간, 에너지 및 고온을 필요로 하며, 이는 시간이 지남에 따라 열에 민감한 생체 활성 화합물을 저하시킬 수 있습니다¹³. 기존의 열 추출과 달리 MAE는 시료 내에서 국부적인 가열을 생성하고, 세포 구조를 파괴하고, 질량 전달을 향상시켜 화합물 추출의 효율성을 높임으로써 생체 활성 화합물의 추출을 용이하게 합니다. 열은 마이크로파에 의해 식물 세포 내부에서 전달되며, 마이크로파는 식물 구성 요소 내의 물 분자에서 작동합니다¹³. 또한, MAE는 활성 화합물의 추출 및 분리를 개선하고, 제품 수율을 높이고, 추출 효율성을 향상시키고, 화학 물질을 더 적게 요구하고, 시간과 에너지를 절약하는 동시에 생체 활성 화합물의 파괴를 방지하기 위해 발전했습니다¹⁵.

이 연구는 다양한 유형의 폴리올을 용매로 사용하여 MAE(Microwave-Assisted Extraction)를 통해 식물 페놀 화합물 및 천연 항산화제를 추출하는 데 중점을 둡니다. 폴리올 기반 MAE 추출물의 총 페놀 함량(TPC), 총 플라보노이드 함량(TFC) 및 항산화 활성(DPPH, ABTS 및 FRAP)을 측정합니다. 또한 폴리올 기반 MAE는 물 및 에탄올과 같은 기존 용매를 사용하여 MAE와 비교됩니다. 이 연구는 화장품 산업의 잠재적 응용 분야를 위해 유해 화학 물질에 대한 의존도를 줄이고 가공 시간을 단축하며 원료 생산에서 에너지 소비를 최소화함으로써 지속 가능성을 촉진함으로써 환경적으로 지속 가능한 천연 성분 추출 기술 개발에 기여할 것으로 기대됩니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험적 준비

1. 식물 시료 전처리
   1. 신선한 커피은피(Coffea arabica)를 수집하여 트레이 건조기에서 60°C에서 72시간¹¹분 동안 건조합니다.
   2. 건조된 커피은피(CS)를 그라인더를 사용하여 고운 가루로 분쇄하고 추가 분석을 위해 실온에 보관합니다¹¹.
      참고: 이 연구에서는 태국 치앙라이 Mae Suai District의 Baan Doi Chang에서 신선한 CS(C. arabica)를 수집했습니다. CS는 체리를 가공하여 외부 과일 층(¹⁶)을 제거한 후 건조된 커피 원두에서 양피지 층을 제거하는 껍질을 벗기는 과정에서 얻어지는 부산물입니다.
2. 화학 물질
   1. 실험에서 용매를 제외한 분석 등급 품질의 화학 시약을 사용하십시오.
      참고: 실험에는 화장품 등급 용제가 사용되었습니다.
   2. MAE로 CS를 추출하기 위해 용매(물, 에탄올, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 이소펜틸디올, 1-2 헥산디올, 펜틸렌 글리콜 및 메틸프로판디올)를 사용합니다.

2. 추출 과정

1. 시료 및 용매 준비
   1. 이전에 보고된 프로토콜⁹ 에 따라 약간의 수정을 가하여 MAE 절차를 위한 샘플과 용매를 준비합니다.
   2. 각 용매 60mL를 증류수로 희석하고 부피를 100mL로 조정하여 삼중 추출을 위해 각 용매를 60% 농도로 준비합니다.
      알림: 물 추출에는 100% 증류수를 사용하십시오.
   3. 0.67g의 CS를 칭량하고 MAE용 반응 용기(그림 1A)에서 각 추출 용매 20mL와 1:30 비율로 혼합합니다.
      참고: 각 용기의 최대 고체-액체 양은 샘플 2g과 용매 20mL입니다.
   4. 각 용기에 마그네틱 교반기를 추가하여 시료 내 열과 용매의 균일한 분포를 보장하여 추출 공정의 효율성을 높이고 추출 수율을 향상시킵니다.
      알림: 추출 공정에 비극성 용매를 적용하는 경우 마그네틱 교반기 바 대신 테프론 교반기 막대를 사용하여 마이크로파 시스템을 통해 효과적인 가열을 전달할 수 있습니다.
   5. 특수 도구(그림 2)로 각 용기를 단단히 닫고 모든 용기를 MAE 챔버에 넣습니다(그림 1B).
2. 마이크로파 보조 추출 기기 및 절차 설정
   1. 참조 프로토콜에 따라 추출 절차를 수행하고 일부 수정 사항을 사용합니다⁹.
   2. 모니터 화면을 열고 상단 표시줄의 툴박스 아이콘을 클릭하고 액세서리 섹션에서 SK eT 로터 를 선택하여 방법을 설정합니다(그림 3A, B).
   3. 교반기 섹션을 클릭하고 20%를 입력하여 교반기 막대의 교반 속도를 선택합니다(그림 4A).
      알림: 교반 속도는 0%에서 100%까지 선택할 수 있습니다.
   4. 도어 잠금 섹터를 클릭하고 80°C를 초과하는 온도에서 활성화되도록 설정합니다(그림 4B).
      알림: 이 설정은 내부 온도가 80°C를 초과할 때 챔버 도어가 자동으로 닫히도록 합니다.
   5. 상단 표시줄(그림 5A)에서 표 아이콘을 클릭하고 온도 구배(T1)를 추출 시간 10분, 마이크로파 전력을 1800W, 온도를 120°C로 설정합니다.
   6. 녹색 표시등이 나타날 때까지 교반기 버튼을 클릭하여 교반기를 활성화합니다.
   7. 송풍기 팬 속도를 레벨 3(최대)으로 설정합니다(그림 5B).
   8. 추출 시간을 유지하려면 추출 시간을 2분으로, 마이크로파 전력을 1800W로, 온도를 120°C로 설정하여 원하는 추출 온도(T2)를 선택합니다.
   9. 섹션 2.2.6 및 2.2.7(그림 5A,B)에 설명된 대로 교반기와 팬 속도를 설정합니다.
      알림: 최대 온도 및 마이크로파 전력은 260°C 및 1800W입니다.
   10. 화면 왼쪽 하단의 냉각 버튼을 클릭하고 10분의 지속 시간을 선택하여 냉각 시간을 설정합니다(그림 6).
   11. 화면 오른쪽 상단 모서리에 있는 저장 아이콘을 클릭하여 Method를 저장합니다(그림 7A).
   12. Method 조건을 저장한 후 추출 조건 그래프가 오른쪽 하단 모서리에 재생 버튼과 함께 화면에 표시되는지 확인합니다(그림 7B).
   13. 사용된 용기의 수를 선택하여 추출 공정을 시작합니다(그림 7C).
       참고: 한 번의 추출에 최대 15개의 vessel을 사용할 수 있으며, 원하는 수의 vessel을 사용하는 경우 챔버에 vessel을 균형 있게 배치해야 합니다.
   14. 추출 후 냉장 원심분리기를 사용하여 추출물을 4°C, 9072 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
   15. 10mL 유리 피펫(그림 8)으로 상층액을 수집하고 추가 연구를 위해 -20°C의 냉동실에 보관합니다.
       참고: 식물 잔류물의 입자 크기와 밀도에 따라 추출물은 더 긴 원심분리 시간(20-30분)이 필요합니다.

3. 페놀 화합물의 측정

1. 총 페놀 함량의 측정
   1. CS 추출물의 총 페놀 함량을 측정하려면 몇 가지 변형이 있는 프로토콜을 참조하여¹⁷을 사용합니다.
   2. 증류수로 희석하여 샘플을 10배 희석합니다.
   3. 희석된 샘플 10μL를 희석되지 않은 Folin-Ciocalteu 시약 20μL와 혼합하고 3분 동안 반응시킵니다.
   4. 다음으로, 100 % Na₂CO₃ 용액 100 μL를 96 웰 플레이트의 각 웰에있는 혼합물에 첨가합니다.
   5. 증류수로 희석하여 갈산 표준 농도 범위( 표 1 및 표 2 참조)에 대해 다른 농도를 준비합니다.
   6. 20μL의 Folin-Ciocalteu 시약과 혼합하고 3분 동안 반응시킵니다.
   7. 다음으로, 100 % Na₂CO₃ 용액 100 μL를 96 웰 플레이트의 각 웰에있는 혼합물에 첨가합니다.
   8. 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 반응을 배양합니다.
   9. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 765nm에서 반응 용액의 흡광도를 측정합니다(그림 9A).
   10. 765nm에서 표준물질과 흡광도의 농도를 사용하여 표준 검량선을 플롯합니다(그림 10A).
   11. 결과를 샘플의 g당 갈산 당량(GAE)의 mg으로 표현하고 다음 방정식¹⁸을 사용하여 계산합니다.
       참고: 시료 g당 갈산 당량(GAE) mg = [((A₇₆₅ - c) / m)) μg 갈산 당량× 반응 웰의 총 부피(mL) x 희석 × 건조 시료 중량(1g) x 추출물의 결과 부피(mL)] / [(각 웰에 추가된 샘플의 부피(mL) x 건조 샘플의 실제 중량(g) × μg에서 mg(1000)으로의 변환 계수]
       여기서, c = y절편, m = 기울기
2. 총 플라보노이드 함량의 측정
   1. 약간의 수정을 가하여 프로토콜에 따라 CS 추출물의 총 플라보노이드 함량을 결정한다¹⁷.
   2. 증류수로 희석하여 샘플을 5배 희석하여 준비합니다.
   3. 희석된 샘플 50μL를 5% NaNO₂ 15μL에 넣고 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 15μL의 10% AlCl₃ 용액을 반응과 혼합하고 실온에서 6분 동안 유지합니다.
   5. 그런 다음 100μL의 1M NaOH 용액을 반응에 첨가하고 10분 더 배양합니다.
   6. 510nm에서 혼합물의 흡광도를 측정합니다(그림 9B).
   7. 다양한 농도의 퀘르세틴 표준 범위( 표 3 및 4 참조)를 5%_NaNO2 15μL에 첨가하고 어두운 곳에서 5분 동안 배양하여 준비합니다.
   8. 15μL의 10% AlCl₃ 용액을 반응과 혼합하고 실온에서 6분 동안 유지합니다.
   9. 100μL의 1M NaOH 용액을 반응에 첨가하고 10분 동안 더 배양합니다.
   10. 510nm에서 표준물질의 흡광도를 측정합니다(그림 9B).
   11. 510nm에서 표준물질과 흡광도의 농도를 사용하여 표준 검량선을 플롯합니다(그림 10B).
   12. 결과를 다음과 같이 방정식¹⁹ 로 계산된 샘플의 g당 퀘르세틴 당량(QE)의 mg으로 표현합니다.
       참고: 시료 g당 퀘르세틴 당량(QE) mg = [((A₅₁₀ - c) / m)) μg 퀘르세틴 당량× 반응 웰의 총 부피(mL) x 희석 × 건조 시료 중량(1g) x 추출물의 결과 부피(mL)] / [(각 웰에 추가된 샘플의 부피(mL) x 건조 샘플의 실제 중량(g) × μg에서 mg(1000)으로의 변환 계수]
       여기서, c = y절편, m = 기울기

4. 항산화 활성의 결정

1. 1,1-Diphenyl-2-Picryl-Hydrazil (DPPH) 라디칼 소거 분석
   1. 프로토콜에 따라 CS 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 결정하고 약간의 수정을 가합니다¹⁷.
   2. 샘플을 증류수로 희석하여 10배 희석할 수 있도록 준비합니다.
   3. 희석된 샘플 20μL를 135μL의 0.1mM DPPH 용액과 혼합합니다.
   4. 135μL의 0.1mM DPPH 용액과 혼합하여 Trolox 표준 농도 범위( 표 5 및 6 참조)의 다양한 농도를 준비합니다.
   5. 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   6. 517nm에서 결과의 흡광도를 측정합니다(그림 9C).
   7. 표준물질 농도와 % 억제의 농도를 사용하여 표준 검량선을 플롯합니다(그림 10C).
   8. 다음과 같이 DPPH 분석의 % 억제를 계산합니다.
      % 억제 = [(대조군 흡광도 − 시료 흡광도)/ 대조군 흡광도] × 100
   9. 결과를 다음 방정식²⁰으로 계산된 시료 g당 Trolox 등가 항산화 용량의 mg으로 표현합니다.
      참고: 시료 g당 Trolox 당량(TE) mg = [((% inhibition-c) / m) in μg Trolox equivalent × 반응 웰의 총 부피(mL) x 희석 × 건조 시료 중량(1g) x 추출물의 결과 부피(mL)] / [(각 웰에 추가된 샘플의 부피(mL) x 건조 샘플의 실제 중량(g) × μg에서 mg(1000)으로의 변환 계수]
      여기서, c = y절편, m = 기울기
2. 2,2′-Azino-Bis-3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulphonic acid(ABTS) 라디칼 소거 분석
   1. CS 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 몇 가지 수정 사항이 있는 참조의 프로토콜을 사용하여 결정합니다¹⁷.
   2. 7mM ABTS와 2.45mM 과황산칼륨(1:2)을 혼합하여 ABTS·+ 원액을 준비하고 실온에서 16시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
   3. 5mL의 ABTS·+ 원액과 100mL의 탈이온수를 혼합하여 작업 용액을 준비합니다.
   4. 160μL의 ABTS·+ 작업 용액을 10배 희석된 시료 또는 Trolox 표준물질 10μL와 다양한 농도로 혼합합니다( 표 7 및 표 8 참조).
   5. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 반응을 배양합니다.
   6. 734nm에서 혼합물의 흡광도를 측정합니다(그림 9D).
   7. 표준물질 농도와 % 억제율의 농도를 사용하여 표준물질 검량선을 플롯합니다(그림 10D).
   8. 다음 공식을 사용하여 ABTS 분석의 % 억제를 계산합니다.
      % 억제 = [(대조군의 흡광도 - 시료의 흡광도) / 대조군의 흡광도] × 100.
      1. 결과를 다음 방정식²¹을 사용하여 계산된 시료 g당 Trolox 등가 항산화 용량의 mg으로 표현합니다.
         참고: 시료 g당 trolox 당량(TE)의 mg = [(((% 억제 - c) / m)) in μg Trolox 당량 × 반응 웰의 총 부피(mL) x 희석 × 건조 시료 중량(1g) x 추출물의 결과 부피(mL)] / [(각 웰에 추가된 샘플의 부피(mL) x 건조 샘플(g)의 실제 중량 × μg에서 mg으로의 변환 계수(1000)]
         여기서, c = y절편, m = 기울기
3. 철 환원 항산화 파워 어세이(FRAP)
   1. 프로토콜에 따라 CS 추출물의 철 환원 항산화 활성을 측정하고 약간의 수정을 가하여¹⁷.
   2. pH 3.6에서 30mM 아세테이트 완충액을 사용하여 FRAP 시약을 준비하며, 이는 40mM HCl 및 20mM FeCl 3.6H_2O용액에 10mM TPTZ 용액을 10:1:1의 비율로 혼합한 것입니다.
   3. 필요할 때까지 FRAP 시약을 호박색 병에 넣습니다.
      알림: FRAP 시약이 갈색인지 확인하십시오. 금속 이온 또는 기타 반응성 화합물에 의해 오염된 경우 시약이 자주색으로 변하므로 폐기해야 합니다. 갓 준비한 시약만 사용하십시오.
   4. 샘플을 증류수로 희석하여 5배 희석을 준비합니다.
   5. 희석된 샘플 10μL 또는 다른 표준 농도(표 9 및 표 10)에서 20μL의 FeSO_{4.7H 2O}를 FRAP 용액 180μL에 추가합니다.
   6. 실온에서 4분 동안 반응을 배양합니다.
   7. 593nm에서 혼합물의 흡광도를 평가합니다(그림 9E).
   8. 593nm에서 표준물질과 흡광도의 농도를 사용하여 표준 검량선을 플롯합니다(그림 10E).
   9. 결과를 다음 방정식²¹을 사용하여 계산된 시료 g당 FeSO₄의 mg으로 표현합니다.
      참고: g 샘플당 mg_FeSO4 당량(Fe (II) E) = [((A₅₉₃ - c) / m)) in μg FeSO4 당량 × 반응웰 내 총 부피(mL) x 희석 × 건조 샘플의 중량(1g) x 추출물의 결과 부피(mL)] / [(각 웰에 추가된 샘플의 부피(mL) x 건조 샘플의 실제 무게(g) × μg에서 mg(1000)으로의 변환 계수]
      여기서, c = y절편, m = 기울기
4. 각 샘플의 모든 분석(TPC, TFC, DPPH, ABTS 및 FRAP)을 삼중으로 수행합니다. 이 연구에서는 에탄올이 배경 흡광도를 해결하기 위해 블랭크 역할을 한 DPPH를 제외하고 대부분의 분석에서 물을 블랭크로 사용했습니다.

5. 통계 분석

1. SPSS 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터의 통계 분석을 수행합니다.
2. Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 정규성 검정을 수행합니다.
3. Duncan의 다중 범위 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 폴리올 기반 MAE CS 추출물과 기존 용매 기반 MAE CS 추출물의 생체 활성 물질 및 항산화 활성을 비교합니다.
4. 모든 데이터를 평균 ± SD(n = 3)로 표현하고 p < 0.05에서 유의 수준을 정의합니다.

결과

총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH, FRAP 및 ABTS 항산화 분석에 대한 폴리올 용매 및 기존 용매의 효과
용매 극성은 식물에서 생체 활성 물질의 추출 효율을 향상시키기 위해 표적 활성 분자의 극성과 호환되어야 합니다²². MAE 커피 실버스킨 추출물의 생체 활성 화합물 및 항산화 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해 다양한 용매(물, 에탄올, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 메틸프로판디올, 이소펜틸디올, 펜틸렌 글리콜, 1,2-헥산디올 및 헥실렌 글리콜)를 사용하여 실험을 수행했습니다.

폴리올 용매와 기존 용매가 총 페놀 함량에 미치는 영향
서로 다른 용매를 가진 각 추출물의 총 페놀 함량을 분석했습니다. 가장 높은 페놀 함량은 수성 -1,2-헥산디올이 있는 샘플(52.0 ± 3.0 mg GAE/g 샘플)에서 수득된 반면, 가장 낮은 TPC는 물 추출 샘플(31.4 ± 4.3 mg GAE/g 샘플)에서 나타났으며, 이러한 값은 다른 모든 조건의 값과 유의하게 달랐습니다. 펜틸렌 수용성 글리콜이 포함된 시료는 두 번째로 높은 TPC 값을 수출했으며, 수성 부틸렌 글리콜, 메틸프로판디올 및 기타 용매 시스템이 포함된 시료가 그 뒤를 이었습니다(그림 11A). 기존 용매(물 및 수성 에탄올 시스템)를 사용한 샘플과 폴리올 기반 용매를 사용한 샘플을 비교할 때 TPC 값의 상당한 차이를 관찰할 수 있습니다(p < 0.05).

폴리올, 용매 및 기존 용매가 총 플라보노이드 함량에 미치는 영향
서로 다른 용매를 가진 각 추출물의 총 플라보노이드 함량을 분석했습니다. 가장 높은 플라보노이드 함량은 수성-1,2-헥산디올(20.0 ± 1.7mg QE/g 샘플)이 있는 샘플에서 생성되었으며, 이는 다른 모든 추출물의 샘플과 상당한 차이를 보여주었습니다. 수성-이소펜티디올을 사용한 샘플은 가장 낮은 TFC 값(8.8 ± 0.7 mg QE/g 샘플)을 나타냈으며, 이는 수성-메틸 프로판디올 및 수성-에탄올 추출물과 크게 다르지 않았습니다. 또한, 두 번째로 높은 TFC 값은 수성 펜틸렌 글리콜이 있는 샘플에서 발견되었으며, 수성 헥실렌 글리콜, 수성 프로필렌 글리콜, 수성 부틸렌 글리콜 및 수성 글리세린이 그 뒤를 이었습니다(그림 11B).

폴리올 용매와 기존 용매가 항산화 분석에 미치는 영향
폴리올 및 기존 용매를 사용한 추출물의 항산화 활성은 DPPH, ABTS 및 FRAP 분석을 사용하여 평가했습니다. DPPH 분석에서 가장 높은 값은 수성 헥실렌 글리콜이 있는 샘플(13.6 ± 0.3 mg TE/g 샘플)에서 측정되었고 가장 낮은 값은 수성 에탄올이 있는 샘플(4.5 ± 0.2 mg GAE/g 샘플)에서 측정되었으며, 이러한 값은 다른 추출물과 유의하게 달랐습니다(p < 0.05). 두 번째로 높은 DPPH 값은 수성 -1,2-헥산디올이 있는 샘플에서 관찰되었으며, 수성 펜틸렌 글리콜, 수성 메틸 프로판디올 및 기타 용매 시스템이 그 뒤를 이었습니다(그림 11C).

가장 높은 ABTS 값은 수성 펜틸렌 글리콜이 있는 샘플(8.2 ± 0.1 mg TE/g 샘플)에서 측정되었고 가장 낮은 값은 물을 사용한 샘플(5.6 ± 0.04 mg GAE/g 샘플)에서 측정되었으며, 이 값은 다른 추출물과 유의하게 달랐습니다(p < 0.05). 두 번째로 높은 ABTS 값은 수성 부틸렌 글리콜 및 수성 1,2-헥산디올에서 검출되었으며, 그 다음은 수성 글리세린, 수성 메틸 프로판디올 및 기타 용매 시스템이 있는 샘플이었습니다(그림 11D).

가장 높은 FRAP 값은 수성 헥실렌 글리콜이 있는 샘플(21.1 ± 1.3 mg Fe(II) E/g 샘플에서 관찰되었으며 가장 낮은 값은 물 추출(11.5 ± 0.2 Fe(II) E/g 샘플)에서 관찰되었으며, 이러한 값은 나머지 용매에 대해 유의하게 다릅니다(p < 0.05). 또한, 두 번째로 높은 FRAP 값은 수성 펜틸렌 글리콜이 있는 샘플에서 발견되었으며, 그 다음은 수성 부틸렌 글리콜, 수성 글리세린 및 기타 용매 시스템이 그 뒤를 이었습니다(그림 11E).

샘플의 항산화 활성을 기존 용매(물 및 수성 에탄올)와 비교할 때, 폴리올을 함유한 샘플은 모든 항산화 분석(DPPH, ABTS 및 FRAP)에서 훨씬 더 높은 항산화 활성을 나타냈습니다(p < 0.05).

그림 1: 실험 용기 및 MAE 챔버에서의 반응. (A) 샘플과 용매를 추출하기 전에 테프론 용기의 흰색 층간 용기에 첨가합니다. (B) 각 용기는 추출을 시작하기 전에 마이크로파 챔버 내부에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 반응 용기를 닫기 위한 특수 도구. 테프론 용기에 샘플과 용매를 첨가한 후 뚜껑을 용기 상단에 적용하고 용기 홀더에 놓고 도구를 사용하여 단단히 고정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 추출 방법. (A) 방법 섹션을 입력하여 생성된 추출 방법. (B) SK eT 액세서리는 MAE 공정에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 교반 속도 및 도어 잠금 기능 설정. (A) 각 용기 내부의 마그네틱 교반기 막대는 교반 속도를 선택하여 활성화할 수 있습니다. (B) 도어 잠금 기능은 온도를 제한하여 추출 후 챔버를 열 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 추출 조건 설정. (A) 표 아이콘을 입력하고 시간, 온도, 마이크로파 전력과 같은 추출 조건을 설정합니다. (B) 교반기 버튼을 열고 송풍기 속도를 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 냉각 시간 설정. MAE 챔버의 내부 온도를 낮추기 위해 냉각 시간을 적용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 추출 프로세스 시작 (A) 추출을 위해 생성된 Method를 저장합니다. (B) 재생 아이콘을 클릭하여 추출 프로세스를 시작합니다. (C) 추출을 시작할 용기의 수를 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: MAE를 사용하여 추출한 후 최종 추출물의 사진. 원심분리 후 상층액을 얻는 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 추출물의 TPC, TFC, DPPH 소기 활성, ABTS 소기 활동 및 FRAP 분석을 측정하기 위한 96개의 웰 플레이트. (A) 2.5-75 μg/mL 농도 및 샘플 추출물로부터 갈산 표준판에 대한 TPC를 측정합니다. (B) 2.5-50 μg/mL 농도에서 퀘르세틴 표준판에 대한 TFC를 측정하고 시료 추출물을 측정하기 위한 TFC 분석. (C) 0.25-12.5 μg/mL 농도에서 Trolox 표준 플레이트와 샘플 추출물의 DPPH 소기 활성 검출 플레이트에 대한 DPPH 소기 활성을 측정합니다. (D) 0.25-5 μg/mL의 농도에서 Trolox 표준 플레이트와 시료 추출물의 ABTS 소기 활성 검출 플레이트에 대한 ABTS 소기 활성을 측정합니다. (E) 0.25-10 μg/mL 농도에서 FeSO₄ 표준 플레이트에 대한 FRAP 분석 및 샘플 추출물의 FRAP 분석 검출 플레이트를 결정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: TPC, TFC, DPPH 소기 활성, ABTS 소기 활동 및 FRAP 분석에 대한 표준 검량선 . (A) A₇₆₅에서 갈산 표준물질의 농도와 흡광도로 표시된 TPC를 결정하기 위한 표준 곡선. (B) A₅₁₀에서 퀘르세틴 표준물질의 농도와 흡광도로 표시된 TFC를 결정하기 위한 표준 곡선. (C) DPPH 소거 활성을 결정하기 위한 표준 곡선으로, Trolox 표준 농도 및 % 억제로 표시됩니다. (D) ABTS 소거 활성을 결정하기 위한 표준 곡선으로, Trolox 표준물질의 농도 및 % 억제로 표시됩니다. (E) A₅₉₃에서 황산제일철 표준물질의 농도와 흡광도로 표시된 FRAP 분석을 측정하기 위한 표준 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 커피 실버스킨의 MAE에서 TPC, TFC, DPPH 소기 활성, ABTS 소기 활성 및 FRAP 분석에 대한 용매 유형의 효과. (A) 총 페놀 함량에 대한 용매 유형의 영향. (B) 총 플라보노이드 함량에 대한 용매 유형의 영향. (C) DPPH 소기 활성에 대한 용매 유형의 영향. (D) ABTS 소기 활성에 대한 용매 유형의 영향. (E) FRAP 분석에 대한 용매 유형의 영향. 값은 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. 위 첨자가 다른 값은 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다(p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Gallic acid 표준 곡선 준비. 96웰 플레이트에서 2.5-75μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. B = 블랭크, 1-7 = 96웰 플레이트의 웰 수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 갈산 표준물질의 최종 농도 계산. 2.5-75 μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. 그에 따라 갈산의 최종 농도(μg/mL)가 계산됩니다. 최종 농도(μg/mL) = (초기 농도(mg/mL) × 초기 부피(μL) / 최종 부피(μL)) ×(1000μg/1mg). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 퀘르세틴 표준 곡선 준비. 96웰 플레이트에서 2.5-50μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. B = 블랭크, 1-7 = 96웰 플레이트의 웰 수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 퀘르세틴 표준물질에 대한 최종 농도 계산표. 2.5-50 μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. 그에 따라 퀘르세틴의 최종 농도(μg/mL)가 계산됩니다. 최종 농도(μg/mL) = (초기 농도(mg/mL) × 초기 부피(μL) / 최종 부피(μL)) ×(1000μg/1mg). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 0.25-12.5 μg/mL 농도 범위의 Trolox 표준 곡선 준비. 96웰 플레이트에서 0.25-12.5μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. B = 블랭크, C = 컨트롤, 1-7 = 96웰 플레이트의 웰 수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 6: DPPH 분석을 위한 Trolox 표준물질의 최종 농도 계산. Trolox의 최종 농도(μg/mL)를 포함하여 0.25-12.5μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. 최종 농도(μg/mL) = (초기 농도(mg/mL) × 초기 부피(μL) / 최종 부피(μL)) ×(1000μg/1mg). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 7: 0.25-5 μg/mL 농도 범위의 Trolox 표준 곡선 준비. 96웰 플레이트에서 0.25-5μg/mL의 스톡 표준 농도 범위를 준비합니다. B = 블랭크, C = 컨트롤, 1-7 = 96웰 플레이트의 웰 수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 8: ABTS 분석을 위한 Trolox 표준물질의 최종 농도 계산. Trolox의 최종 농도(μg/mL)를 포함하여 0.25-5μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. 최종 농도(μg/mL) = (초기 농도(mg/mL) × 초기 부피(μL) / 최종 부피(μL)) ×(1000μg/1mg). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 9: FeSO₄ 표준물질에 대한 최종 농도 계산표. FeSO₄의 최종 농도(μg/mL)를 포함하여 2.5-100μg/mL의 표준 농도 범위의 준비를 준비합니다. 최종 농도(μg/mL) = (초기 농도(mg/mL) × 초기 부피(μL) / 최종 부피(μL)) ×(1000μg/1mg). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 10: FeSO₄ 표준 곡선 준비. 96웰 플레이트에서 0.25-10μg/mL의 표준 농도 범위를 준비합니다. B = 비어 있음. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

플랜트 구성 요소의 식물 화학적 함량, 추출 시간, 온도, 마이크로파 전력, 고액 비율 및 용매 농도와 같은 다양한 요인이 MAE의 성공적인 구현에 중요한 역할을 합니다¹³. 식물은 일반적으로 식물 화학 물질의 다양한 프로필을 나타냅니다. 따라서 항산화제와 페놀 화합물이 풍부한 천연 식물을 선택하는 것이 필수적입니다²³. 또한, 뚜렷한 생체 활성 성분은 사용된 용매에 따라 다양한 극성을 나타냅니다. 마찬가지로, 용매는 서로 다른 극성을 나타냅니다. 용매의 극성이 원료로부터 생리활성 화합물 추출의 효능을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때, 용매의 극성이 표적 생리활성 분자(²⁴)의 극성과 일치해야 합니다.

이 연구에서는 MAE를 사용하여 커피 실버스킨에서 폴리페놀과 항산화제를 추출하기 위해 다양한 폴리올을 활용했습니다. 폴리페놀은 주로 극성이며, 극성이 높은 용매는 일반적으로 페놀 화합물의 수율을 향상시킵니다²⁵. 물과 에탄올을 사용한 샘플과 비교했을 때, 다른 폴리올을 사용한 샘플은 TPC, TFC 및 DPPH, ABTS 및 FRAP와 같은 항산화 분석을 포함한 모든 측정 반응에서 더 높은 효율성을 보여주었습니다. 이전 연구는 수성 폴리올 혼합물이 수성 에탄올 혼합물 ^9,10,11에 비해 생체 활성 화합물의 추출 수율을 향상시킬 수 있다는 발견을 뒷받침합니다. 다른 폴리올을 비교할 때 특정 수성 폴리올 시스템을 가진 샘플은 가장 높은 값을 생성하지 못했습니다. 그러나 수성 1,2-헥산디올이 포함된 샘플이 TPC 및 TFC 분석에서 가장 높은 값을 산출했다는 점은 흥미롭습니다. 한편, 수성 헥실렌 글리콜을 가진 것들은 DPPH 및 FRAP 분석에서 가장 높은 값을 나타냈고, 수성 펜틸렌 글리콜 추출물은 ABTS 분석에서 가장 높은 값을 나타냈다. 수성 폴리올 시스템 내에서 TPC, TFC, DPPH, ABTS 및 FRAP와 같은 다양한 분석에서 얻은 값의 변화는 사용된 폴리올의 고유한 특성을 포함하여 여러 요인에 기인할 수 있습니다. 폴리올은 점도, 극성 및 끓는점의 차이를 나타내어 식물 재료에서 생체 활성 화합물을 추출하는 효능에 직접적인 영향을 미칩니다²⁶. 한 가지 잠재적인 설명은 "like는 like를 용해한다"의 원리에 기인할 수 있으며, 여기서 특정 용매 시스템은 특정 생체 활성 화합물(²⁷)의 질량 전달을 용이하게 하는 데 가장 적합하다. 이는 표적 생체 활성 화합물의 극성과 일치하는 극성을 가진 용매를 선택하는 것의 중요성을 강조합니다.

또 다른 가능한 이유는 용매에 존재하는 수산기(-OH)의 수의 차이가 페놀 화합물(²⁸)의 수율에 상당한 영향을 미친다는 사실일 수 있다. 이러한 폴리올 중 글리세린만 3개의 -OH 그룹을 포함하고 본 연구에서 나머지 폴리올은 2개의 -OH 그룹을 포함합니다. -OH 그룹의 수가 많은 용매는²⁹개 미만의 용매에 비해 더 높은 점도를 나타내는 경향이 있습니다. 점도가 높아지면 추출 과정에서 활성 화합물의 효율적인 전달을 방해하여 전체 수율을 감소시킬 수 있습니다. 또한, 극성과 밀접하게 연결된 용매의 유전 상수는 극성 또는 비극성 용질을 용해시키는 능력을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 유전 상수가 높은 용매는 극성 용질을 용해하는 데 더 능숙하고, 더 낮은 용매는 비극성 용질에 더 적합하다³⁰. 폴리올 중 글리세린은 41.14의 비교적 높은 유전 상수를 나타내는 반면, 헥실렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜 및 1,2-헥산디올은 각각 25.86, 17.31 및 15.45의 낮은 유전 상수를 보여줍니다^31,32. 이 연구의 결과는 샘플 내의 생체 활성 화합물이 저극성 성분을 포함할 수 있음을 시사합니다.

용매의 선택 및 조성을 최적화하여 추출 효율을 향상시킬 수 있으며, 가장 적합한 용매 시스템을 식별하기 위해 추가 실험이 필요할 수 있습니다. 이 연구는 잠재력을 보이지만 폴리올을 사용한 마이크로파 보조 추출에만 초점을 맞추고 추출 기간, 온도, 용매 농도, 고액 비율 및 추출력을 포함한 다른 변수에 대한 제한된 평가로 인해 한계가 있습니다. 또한, 다양한 유전 상수로 인해 폴리올이 어떻게 기능하여 극성 또는 비극성 용질의 용해도에 직접적인 영향을 미치는지 이해하기 위해 기계론적 연구가 필요합니다. 폴리올 간의 유전 상수의 차이는 생체 활성 화합물을 추출할 때 폴리올의 특정 메커니즘을 조사하는 것의 중요성을 강조합니다. 이러한 연구는 용매-용질 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 효율적인 추출 공정을 위한 용매 시스템의 최적화 및 선택에 도움이 될 것입니다.

MAE 프로세스와 관련하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. MAE는 급속 가열을 제공할 수 있지만, 정밀한 온도 제어는 어려울 수 있으며, 잠재적으로 과열 및 열에 민감한 화합물의 분해로 이어질 수 있다⁽³³). 그러나 그래디언트 및 추출 온도에 대한 마이크로파 전력 설정은 추출 중 온도 저하를 방지하기 위해 동일한 마이크로파 전력으로 설정할 수 있습니다. 또한 MAE는 열에 민감한 플랜트 구성 요소에 대한 제한이 있습니다. 그러나 고급 Ethos X MAE 기술은 유전체 가열(dielectric heating)³⁴을 사용하여 더 짧은 시간 동안 효과적인 가열을 지원함으로써 성능 저하 위험을 최소화할 수 있습니다. MAE 챔버의 각 용기에는 고유한 제한된 최대 고체 및 액체 용량이 있습니다. 이 제한에 대한 고체-액체 비율은 또한 추출물(¹¹)의 농도에 큰 영향을 미칠 수 있다. 용매와 용질 사이의 용해는 교반기 바를 사용하여 촉진될 수 있으며, 잠재적으로 효과적인 추출과 더 높은 수율로 이어질 수 있다³⁵. 또한, 추출물 내에서 추출된 페놀 및 플라보노이드 화합물은 액체 크로마토그래피 삼중 사중극자 질량 분석법(LC-QQQ) 및 액체 크로마토그래피 사중극자 비행 시간 질량 분석법(LC-QTOF)과 같은 추가 분석을 통해 검증하여 특정 생체 활성 화합물의 존재 및 각각의 양을 확인할 수 있습니다³⁶.

MAE를 통해 수성 폴리올을 사용하여 커피 실버스킨에서 폴리페놀 및 항산화제를 추출한 결과, 물 및 수성 에탄올 추출물에 비해 높은 효율을 보였습니다. CS 추출물의 폴리올 기반 MAE에서 파생된 결과를 기반으로 수성 헥실렌 글리콜, 수성-1,2-헥산디올 및 수성 펜틸렌 글리콜 시스템을 사용하면 생체 활성 화합물의 추출 수율과 항산화 능력이 크게 향상되는 것으로 관찰되었습니다. 더욱이, 이러한 발견은 후속 조사 분석을 위해 이러한 추출된 화합물을 활용할 수 있는 잠재력을 강조합니다. MAE를 통해 식물 재료에서 생체 활성 화합물을 추출하기 위한 녹색 용매로 폴리올을 활용하면 환경적 이점과 생체 활성 화합물 수율 향상을 약속하며, 화장품 응용 분야에 사용할 수 있는 지속 가능한 접근 방식을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,2-Hexanediol	Chanjao 장수 Co., 주식 회사
2,2 -Azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt (ABTS)	Sigma	A1888
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)	Sigma	D9132
2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ)	Sigma	93285
2-Digital balance	Ohaus		Pioneer
4-Digital balance	Denver	SI-234
6-하이드록시-2,5,7,8 테트라메틸크로만 -2-카르복실산(트롤록스)	시그마	238813
96웰 플레이트	SPL 생명 과학
절대 에탄올	RCI Labscan	64175
아세트산	RCI Labscan	64197
염화알루미늄	로바 케미	898
자동 피펫	Labnet		Biopett
부틸렌 글리콜	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Ethos X 고급 마이크로파 추출	Milestone Srl, Sorisole, Italy
산철	: Ajex, Finechem	3850
Folin-Ciocalteu의 시약	Loba Chemie	3870
Freezer SF	Sanyo	C697(GYN)
Gallic acid	Sigma	398225
Grinder	Ou 하드웨어 제품 유한 공사
헥실 렌 글리콜	Chanjao 장수 유한 공사
염산 (37 %)	RCI Labscan	AR1107
철 (III) 염화	Loba Chemie	3820
Isopentyldiol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
메탄올	RCI Labscan	67561
메틸프로판디올	공급자:Chanjao Longevity Co., Ltd.
펜틸렌 글리콜	Chanjao Longevity Co., Ltd.
과황산 칼	Loba Chemie	5420
프로필렌 글리콜	Chanjao Longevity Co., Ltd.
케르세틴	시그마	Q4951
냉장 원심분리기	Hettich
아세트산나트륨	로바 케미	5758
탄산나트륨	로바 케미	5810
수산화나트륨	RCI Labscan	AR1325
아질산나트륨	로바 케미	5954
SPECTROstar 나노 마이크로플레이트 리더	BMG- LABTECH
SPSS 소프트웨어	IBM SPSS 통계 20
트레이 건조기	프랑스 Etuves	XUE343