방법 논문

생쥐 뇌에서 독소의 림프 제거 자극을 위한 수면의 뇌파 제어 하에서의 광생물 조절

DOI:

10.3791/67035

⸱

2024년 6월 28일

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1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 자연적인 깊은 수면 동안 노화되고 마취되지 않은 BALB/c 수컷 마우스의 뇌에서 독소(예: 수용성 아밀로이드 베타)를 자극 림프적으로 제거하기 위한 뇌파 제어 하에 경두개 광생물 조절의 비침습적 및 휴대용 기술을 제시합니다.

초록

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수막 림프관(MLV)은 뇌에서 독소를 제거하는 데 중요한 역할을 합니다. MLV 기능 자극을 위한 혁신적인 기술 개발은 알츠하이머병 및 파킨슨병, 뇌종양, 외상성 뇌 손상 및 두개내 출혈을 포함하여 MLV 이상과 관련된 다양한 뇌 질환의 치료 진행에 있어 유망한 방향입니다. 수면은 뇌의 배수 과정이 가장 활발하게 일어나는 자연스러운 상태입니다. 따라서 수면 중 뇌의 배수 및 MLV를 자극하는 것이 가장 뚜렷한 치료 효과를 가질 수 있습니다. 그러나 이러한 상용 기술은 현재 존재하지 않습니다.

이 연구는 노화된 BALB/c 마우스의 뇌에서 독소(예: 용해성 아밀로이드 베타(Aβ))를 광자극하여 제거하도록 설계된 수면의 뇌전도(EEG) 제어 하에 경두개 광생물 조절(tPBM)의 새로운 휴대용 기술을 제시합니다. 이 기술은 마취 없이 가정용 케이지의 자연스러운 상태에서 사용할 수 있어 마우스의 운동 활동을 유지할 수 있습니다. 이러한 데이터는 MLV 기능 및 뇌 배수 과정의 노화 관련 변화를 교정하고 대사 산물 및 독소로부터 뇌 조직을 효과적으로 청소하기 위한 비침습적이고 임상적으로 유망한 사진 기술을 개발할 수 있는 새로운 전망을 제시합니다. 이 기술은 잠자는 뇌의 기능에 대한 전임상 연구와 수면 관련 뇌 질환에 대한 임상적으로 관련된 치료법을 개발하기 위한 것입니다.

서론

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수막 림프관(MLV)은 뇌 조직에서 독소와 대사 산물을 제거하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3. 종양, 외상성 뇌 손상, 출혈 및 신경 퇴행성 과정을 포함한 다양한 뇌 질환에서 MLV의 손상은 MLV 기능의 감소를 동반하여 이러한 병리의 진행을 유발합니다 1,2,3,4,5,6 . 따라서 MLV의 자극 방법 개발은 뇌 질환 치료를 위한 효과적인 기술의 출현에 새로운 지평을 엽니다. 최근에는 효과적인 경두개 광생물 조절(tPBM)을 위한 비침습적 기술이 제안되어 MLV를 자극하고 뇌에서 혈액 및 Aβ와 같은 독소를 제거합니다 5,7,8,9,10,11,12. 깊은 수면이 뇌의 림프 배출 과정을 활성화하는 자연스러운 요소라는 점은 흥미롭습니다13,14. 이러한 사실에 기초하여, 수면 중 MLV의 tPBM이 깨어 있을 때보다 더 효과적인 치료 효과를 가질 수 있다고 가정하는 것이 논리적이다 9,11,12,15. 그러나 현재 수면16 중 tPBM에 대한 상용 기술은 없습니다. 또한, tPBM의 치료 효과를 연구하기 위한 동물실험은 뇌에 빛을 정확하게 전달하기 위해 필요한 마취 하에 진행됩니다. 그러나 마취는 뇌의 배출에 큰 영향을 미쳐 연구 결과의 질을 떨어뜨린다17.

Aβ는 정상적인 신경 활동의 대사 산물이다18. 배양된 쥐의 대뇌 피질 뉴런에서 확립된 바와 같이, Aβ는 그들로부터 높은 속도로 세포외 공간(Aβ의 경우 2-4개의 분자/뉴런/초)으로 방출됩니다19. 세포외 및 혈관 주위 공간에 위치한 Aβ의 용해된 형태가 뉴런과 시냅스에 가장 독성이 있다는 증거가 있다20. 용해성 Aβ는 1-2.5 h21 동안 인간의 뇌에서 빠르게 제거됩니다. MLV는 나이가 들면서 감소하는 뇌 1,7에서 용해성 Aβ를 제거하기 위한 터널로, 노화된 뇌 1,22에 Aβ가 축적됩니다. 뇌의 Aβ 수준의 세포 외 이상이 노화의 인지 능력과 상관 관계가 있으며 알츠하이머병(AD)의 발병과 관련이 있다는 증거가 있습니다23,24. 따라서 늙고 늙은 설치류는 AD25,26을 포함한 아밀로이드증 연구를 위한 형질전환 모델의 대안으로 간주됩니다.

이 연구는 뇌에서 말초 림프계(심부 경부 림프절, dcLN)로 Aβ의 림프 청소를 자극하기 위해 다양한 연령의 마취되지 않은 수컷 BALB/c 마우스에서 깊은 또는 비빠른 안구 운동(NREM) 수면의 뇌파검사(EEG) 제어하에 있는 독창적이고 휴대용 tPBM 기술을 제시합니다.

프로토콜

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모든 절차는 "실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드", 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU, 그리고 사라토프 주립 대학의 생명윤리 위원회(의정서 번호 7, 22.09.2022).

1. 하드웨어 조립

  1. 1.5mm 두께의 호일 텍스처톨라이트 조각을 1.5mm x 2mm 치수로 자릅니다. 이 부분을 발광 다이오드(LED) 인쇄 회로 기판(PCB)이라고 합니다(그림 1C).
  2. 그림 1과 같이 LED를 PCB에 납땜합니다.
  3. 두 개의 연선을 LED 핀에 납땜한 다음 슬리브로 덮습니다.
  4. 프레임의 3D 모델을 인쇄합니다(그림 1A). 프레임에 LED(그림 1B)와 자석(그림 1D)을 놓습니다. 마우스의 머리에 와셔(그림 1E)를 놓습니다.
  5. 회로를 조립하려면(그림 2) 다음 단계를 따르십시오.
    1. 먼저 저항기를 연결합니다(그림 2; R1) LED 양극과 Arduino의 5V 포트 사이.
    2. 다음으로, LED 음극을 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET)에 연결합니다(그림 2; Q1) 물기를 뺀다. 그런 다음 MOSFET 소스를 접지에 연결합니다.
    3. 풀다운 저항기를 연결합니다(그림 2; R2) MOSFET 게이트와 접지 사이. 마지막으로 MOSFET 게이트를 Arduino의 핀 3에 연결합니다.
  6. 액정 디스플레이(LCD) 키패드 실드를 Arduino에 연결합니다.
  7. 케이스의 3D 모델, 커버 플레이트 및 버튼을 인쇄합니다. 그림 3과 같이 LCD 키패드 실드, MOSFET 및 LED 커넥터가 있는 Arduino 보드를 케이스에 삽입합니다.

2. 소프트웨어 가이드(그림 4)

  1. 아두이노 스케치(.ino 파일)를 다운로드하여 아두이노 통합 개발 환경(IDE)을 통해 엽니다(보충 코딩 파일 1).
  2. 올바른 통신(COM) 포트를 선택하고 펌웨어를 플래시합니다.
  3. 인터페이스에는 두 개의 열이 있습니다. 왼쪽 및 오른쪽 버튼을 사용하여 이러한 열 사이를 이동합니다. 선택 표시기는 열 왼쪽에 있습니다.
  4. 화면의 왼쪽 열은 펄스 폭 변조(PWM) 듀티 사이클 선택 필드입니다. Up 및 Down 버튼을 사용하여 듀티 사이클을 조정합니다. 17분 세션에서 해당 2%/4%/6% PWM 듀티 사이클로 PBM의 10/20/30 Dj/cm2 용량을 달성합니다.
  5. 화면의 오른쪽 열은 RUN/Off 필드입니다. 이 열을 선택하려면 키패드의 오른쪽 단추를 누른 다음 선택을 누릅니다. 프로세스가 실행 중일 때 활동 표시기가 깜박이고 RUN 버튼의 텍스트가 OFF로 변경됩니다.
    메모. 마우스는 EEG 전극 이식, 형광 Aβ 주입을 위한 우측 심실에 만성 카테터 이식, PBM용 플레이트 배치를 포함하여 10일 동안 실험을 준비합니다.

3. EEG 기록 시스템 이식(그림 5)

  1. 마우스의 무게를 측정하고 Zoletil 100과 Xylanite(각각 100mg/kg, 10mg/kg)의 혼합물로 허벅지에 근육 주사로 마취합니다.
  2. 뒷발 후퇴 반사와 꼬리 꼬집기 반응이 멈추면 마우스를 가열 패드 위의 입체 프레임에 놓습니다(그림 5A).
  3. 수술 중 안구가 건조해지는 것을 방지하기 위해 눈꺼풀에 안과 연고를 바릅니다. 필요할 때마다 이 절차를 반복합니다.
  4. 코뼈에서 후두골에 이르는 부위의 머리를 면도기로 면도하고 노출된 피부는 먼저 알코올로 소독합니다.
  5. 직선 해부 가위를 사용하여 두피를 잘라 마이크로 송곳으로 잡고 근막에서 두개골을 청소하고 면봉으로 건조시킵니다. 필요한 경우 지혈제를 사용하십시오.
  6. 직경이 1.3mm인 드릴을 사용하여 좌표를 따라 양쪽의 측두골에 2개의 구멍을 만듭니다: 첫 번째 나사 쌍의 경우 AP = -1mm, 두 번째 나사 쌍의 경우 AP = -3mm.
  7. 와이어 리드가 있는 EEG 나사를 알코올에 5분 동안 넣습니다. 그런 다음 EEG 나사를 식염수에 넣습니다.
  8. 전극이 있는 은도금 나사 4개를 1mm 깊이로 구멍에 넣습니다(그림 5B).
  9. 치과용 아크릴을 사용하여 두개골 표면의 나사를 고정하여 나사에서 뻗어 나온 전극이 동물의 코를 향하도록 합니다(그림 5C). 치과용 아크릴이 15분 동안 굳어지도록 합니다.
  10. 치과용 아크릴을 사용하여 EEG 기록 센서를 동물의 코에 부착합니다. 치과용 아크릴을 30분 동안 굳힙니다(그림 5D).
  11. 구부러진 핀셋을 사용하여 안륜근 뒤쪽에 EMG 전극을 놓고 치과용 아크릴로 고정합니다. 치과용 아크릴을 15분 동안 굳힙니다(그림 5E).
  12. EEG 전극을 센서의 은도금 홈에 연결하고 납땜 스테이션을 사용하여 납땜합니다. 그런 다음 치과용 아크릴을 사용하여 EEG 전극을 고정합니다(그림 5F).
  13. 수술 후 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열 패드에 올려 놓습니다.
  14. 그 후, 수술 후 10일 동안 진통을 위해 이부프로펜(물 200mL에 40mg/kg)을 넣은 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있는 개별 가정용 케이지에 쥐를 넣습니다.

4. PBM용 플레이트 이식

  1. 마우스의 무게를 측정하고 Zoletil 100과 Xylanite(각각 100mg/kg, 10mg/kg)의 혼합물로 EEG 기록 시스템 이식 7일 후 허벅지에 근육 주사로 마취합니다.
  2. 뒷발 후퇴 반사와 꼬리 꼬집기 반응이 멈추면 마우스를 정위 시스템에 고정합니다.
  3. 수술 중 안구가 건조해지는 것을 방지하기 위해 눈꺼풀에 안과 연고를 바릅니다. 필요할 때마다 이 절차를 반복합니다.
  4. 치과용 아크릴과 Dumont 겸자를 사용하여 두개골의 후두골에 직경 5mm의 금속판을 고정합니다. 치과용 아크릴을 15분 동안 굳힙니다(그림 6).

5. 만성 카테터 준비

  1. 인슐린 바늘에 비스듬한 끝 부분에서 2cm 떨어진 부분을 표시합니다.
  2. 인슐린 바늘을 비스듬한 팁의 측면에서 표시된 부분까지 바늘 홀더에 고정합니다.
  3. 2cm-PE-10 폴리에틸렌 카테터를 바늘의 나머지 전체 길이에 놓습니다.
  4. 카테터에 식염수를 채우고 플라스틱 캡으로 덮어 밀봉합니다.

6. 만성 카테터를 우측 심실에 이식

  1. PBM용 플레이트를 이식한 후 드릴을 사용하여 AP = -0.5mm 및 ML = 1.2mm 좌표에 직경 1.5mm의 트레파네이션 구멍을 만듭니다.
  2. PE-10 폴리에틸렌 카테터를 정위 홀더에 넣고 마우스 두개골(DV = 2mm)에 삽입합니다. 그런 다음 치과용 아크릴을 사용하여 고정합니다. 치과용 아크릴을 15분 동안 굳힙니다(그림 7).
  3. 수술 후 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열 패드에 올려 놓습니다.
  4. 그 후, 수술 후 10일 동안 진통을 위해 이부프로펜(물 200mL에 40mg/kg)을 넣은 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있는 개별 가정용 케이지에 쥐를 넣습니다.

7. NREM 수면의 EEG 제어 하에 있는 tPBM

  1. 모든 상용 EEG 기록 시스템을 마우스 헤드의 커넥터에 연결하고 PWM 듀티 사이클의 요구 사항 값을 설정합니다.
  2. EEG 신호를 모니터링하고 델타 리듬 활동을 기다립니다. NREM 수면이 보이면 PBM 프로세스를 시작하고 NREM 수면이 REM(Rapid Eye Movement) 수면 또는 각성으로 전환되면 프로세스를 중지합니다. 투여량은 필요한 값에 도달할 때까지 각 상호 작용에 따라 증가합니다.
  3. 필요한 PBM 투여량을 얻으면 세션이 종료됩니다.

8. 마우스 뇌에서 Aβ의 림프 제거에 대한 컨포칼 이미징

  1. 10cm 카테터를 인슐린 바늘에 연결합니다.
  2. 29G 바늘이 있는 Hamilton 주사기를 사용하여 카테터에 5μL 부피의 형광 베타 아밀로이드(FAβ)를 주입합니다. 카테터를 Hamilton 주사기에 그대로 두십시오.
  3. 쥐의 손을 고정하고 바늘을 통해 카테터를 이식된 만성 카테터에 연결합니다.
  4. 카테터를 미세주사기에 연결합니다. 그런 다음 마우스를 개별 상자에 넣으십시오.
  5. 마이크로인젝터 메뉴에서 주입 속도를 0.1 μL/min으로 선택하고 Start 버튼을 누릅니다.
  6. 우측 측심실에 FAβ를 주사합니다.
  7. FAβ 투여 후 알고리즘에 따라 61분 동안 LED를 사용하여 PBM을 만듭니다: 17분 - 밝음, 5분 - 61분 이상 일시 중지.
  8. PBM 후 꼬리를 통해 대뇌 혈관을 라벨링하기 위한 추적자를 정맥 주사합니다.
  9. 주입 후 CO2 안락사 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
  10. 날카롭고 곧은 가위를 사용하여 기관을 따라 피부를 가로 작게 절개하고 날카롭지 않은 직선 핀셋으로 피부를 고정합니다.
  11. 직선 가위를 사용하여 목 전체를 세로로 절개합니다.
  12. 구부러진 핀셋을 사용하여 침샘을 들어 올려 결합 조직에서 조심스럽게 분리합니다. 절개 부위의 열린 부분에 상처 견인기를 놓고 주변 조직을 밀어내는 방식으로 고정합니다.
  13. 목 양쪽에서 두 개의 구부러진 핀셋을 사용하여 기관과 쇄쇄유돌근 사이의 영역을 검사합니다.
  14. 양쪽에서 심부 경부 림프절 (dcLN)이 발견되면 끝이 뭉툭한 직선 핀셋을 사용하여 dcLN을 제거하고 결합 조직에서 잘라냅니다.
  15. 식염수가 있는 페트리 접시에 dcLN을 넣고 수평 방향의 커버 유리(25mm × 50mm × 0.17mm)로 덮습니다.
  16. 상업용 컨포칼 현미경을 사용하여 전체 dcLN의 이미지를 얻을 수 있습니다.

9. 뇌 조직의 용해물에서 Aβ 분석

  1. 분석을 위해 샘플을 준비합니다.
    1. CO2 안락사 챔버를 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.
    2. 쥐의 목을 베고, 머리에서 피부를 제거하고, 두개골에서 근육을 제거합니다.
    3. 대후두공에서 이도까지 날카롭고 곧은 가위로 두 군데를 절개합니다.
    4. 직선 핀셋을 사용하여 두개골의 복부 부분, 후두골 및 중이강을 형성하는 뼈를 분리합니다.
    5. 핀셋을 사용하여 두정골과 전두골에서 뇌를 분리합니다.
    6. 곧은 가위를 사용하여 위턱을 제거하고 후각구를 잘라냅니다.
    7. 뇌를 생리학적 용액에 넣습니다.
    8. 차가운 인산염 완충 식염수로 뇌를 헹구어 과도한 혈액을 철저히 제거하고 균질화하기 전에 무게를 잰다.
    9. 1.5 mm KH2PO4, 8 mm Na2HPO4, 3 mm KCl, 137 mm NaCl 및 0.1 % Tween20, 10 mM EDTA를 포함하는 용해 완충액 pH 7.2를 갓 준비한 프로테아제 억제 혼합물과 함께 준비합니다.
    10. 얼음 위에 유리 균질화기를 사용하여 신선한 용해 완충액(200-500mg 조직 샘플용 용해 완충액 1mL)에서 뇌를 균질화합니다.
    11. 용액이 명확해질 때까지 초음파 세포 교란기로 결과 현탁액을 초음파 처리합니다.
    12. 균질액을 10,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    13. 단일 채널 기계식 피펫(100-1000 μL)을 사용하여 상층액을 수집하고 즉시 분석하거나 분액화하여 ≤-20 °C에서 보관합니다.
  2. 다음 재료를 준비하십시오: 450nm ± 10nm 필터가 있는 마이크로플레이트 리더; 마이크로 원심 분리기 튜브; 높은 정밀도와 일회용 팁을 가진 단일 또는 다중 채널 피펫; microplate를 blotting를 위한 흡수성 종이; 세척 용액을 위한 용기; 0.01 mol/L (또는 1x) 인산염 완충 식염수(PBS); 및 탈이온수 또는 증류수.
  3. 시약을 준비합니다.
    1. 키트와 샘플의 구성 요소를 사용하기 전에 실온(RT; 18-25 °C)으로 가져갑니다.
    2. 표준 희석제 1.0mL로 표준물질을 재구성하고 RT에서 10분 동안 보관한 후 부드럽게 흔듭니다(거품이 나지 않음). 표준 원액은 300pg/mL입니다. 0.6mL의 표준 희석액이 들어 있는 5개의 튜브를 준비하고 삼중 희석 시리즈를 만듭니다.
    3. 희석된 표준물질의 5개 지점(300pg/mL, 100pg/mL, 33.33pg/mL, 11.11pg/mL 및 3.70pg/mL)을 설정하고 마지막 튜브는 표준 희석제(0pg/mL)만 포함하는 빈 튜브로 설정합니다.
    4. 사용하기 전에 검출 시약 A와 검출 시약 B의 원액을 빠르게 스핀다운하십시오. 분석 희석제 A와 B로 100배 희석하여 작업 농도를 준비합니다.
    5. 농축 세척 용액(30x) 20mL를 탈이온수 또는 증류수 580mL에 희석하여 600mL의 세척 용액(1x)을 만듭니다.
    6. 멸균된 팁으로 필요한 용량의 용액을 흡입하고 잔류 용액을 바이알에 다시 버리지 마십시오.
  4. 분석을 수행합니다.
    1. 희석된 표준물질, 블랭크 및 샘플에 대한 웰을 결정합니다.
    2. 표준점용으로 5개의 웰을 준비하고 블랭크용으로 1개의 웰을 준비합니다.
      1. 표준물질, 블랭크 및 시료 희석액을 각각 50μL의 해당 웰에 추가합니다. 그런 다음 50μL의 검출 시약 A를 각 웰에 즉시 추가합니다.
      2. 플레이트를 부드럽게 흔들고(마이크로플레이트 셰이커 권장) 플레이트 실러로 덮습니다. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 검출 시약 A가 뿌옇게 보일 수 있습니다. 용액을 RT로 데우고 균일해 보일 때까지 부드럽게 섞습니다.
    3. 용액을 흡입하고 분출 병, 다중 채널 피펫, 매니폴드 디스펜서 또는 자동 세척기를 사용하여 350μL의 1x 세척 용액으로 각각을 잘 세척합니다. 접시를 1-2분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 플레이트를 흡수성 종이에 끼워 모든 웰에 남아 있는 액체를 완전히 제거합니다. 이 절차를 3번 반복합니다.
    4. 마지막 세척 후 남아 있는 세척 버퍼를 흡입하거나 디캔팅합니다. 접시를 뒤집어 흡수성 종이에 대고 닦아 세척액이 완전히 제거되었는지 확인하십시오.
    5. 각 웰에 100μL의 검출 시약 B 작업 용액을 추가하고 플레이트를 플레이트 밀봉기로 덮은 후 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    6. 총 5분 동안 흡인/세척 단계를 반복합니다.
    7. 각 웰에 90μL의 기질 용액을 추가하고 새 플레이트 실러로 플레이트를 덮습니다. 빛으로부터 보호된 37 °C에서 10-20분 동안 배양합니다(30분을 초과하지 마십시오). 기질 용액을 추가하면 액체가 파란색으로 변합니다.
    8. 각 웰에 50μL의 정지 용액을 추가하여 반응을 종료합니다. 정지 용액을 추가하면 액체가 노란색으로 변합니다. 접시의 측면을 두드려 액체를 섞습니다. 색상 변화가 일정하지 않으면 플레이트를 부드럽게 두드려 완전히 섞이도록 합니다.
    9. 플레이트 바닥의 물과 지문을 완전히 제거하고 액체 표면에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 그런 다음 450nm의 마이크로플레이트 리더에서 플레이트를 즉시 판독합니다.
  5. 결과를 계산합니다.
    1. 각 표준, 대조군 및 샘플에 대한 중복 판독값의 평균을 결정합니다. y축에는 Aβ 1-42 농도의 로그가, x축에는 흡광도가 있는 표준 곡선을 플로팅합니다.
    2. 회귀 분석을 통해 결정할 수 있는 점을 통과하는 최적 맞춤 곡선을 그립니다.
    3. 희석된 샘플을 사용한 경우 표준 곡선에서 얻은 농도에 희석 계수를 곱합니다.
      참고: ELISA의 경우 이 연구에서는 Aβ 1-42를 측정하기 위한 키트를 사용했습니다.

결과

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첫 번째 단계에서 이 연구는 깨어 있는 성인(2-3개월, 26-29g) 남성 BALB/c 마우스에서 뇌에서 형광 Aβ의 림프 제거를 dcLN으로 자극하기 위한 효과적인 광량(1050nm LED)을 설정하는 데 중점을 두었습니다. 광량은 뇌에서 다양한 염료 및 적혈구 제거에 대한 tPBM 효과에 대한 이전 연구를 기반으로 10 J/cm 2, 20 J/cm 2 및 30 J/cm2로 무작위로 선택되었습니다 7,8,9,10,11,12. 그림 8A-E에 제시된 컨포칼 이미징 결과는 뇌에서 dcLN으로 형광 Aβ의 림프 제거에 대한 tPBM의 용량 관련 효과를 명확하게 보여줍니다. 광량 30 J/cm2는 dcLNs에서 Aβ로부터의 형광 신호의 강도가 더 높기 때문에 광량 10 J/cm2 및 20 J/cm2에 비해 가장 효과적인 것으로 결정되었습니다.

두 번째 단계에서는 동일한 용량(30J/cm2)으로 다양한 광 파장(880nm, 1050nm, 1300nm)과 모드(1050nm 연속 및 펄스 영역)를 가진 휴대용 광 플랫폼을 사용하여 성인(2-3개월, 26-29g)의 깨어 있는 BALB/c 수컷 마우스의 뇌에서 형광 Aβ의 림프 제거에 가장 효과적인 파장을 찾는 것을 목표로 했습니다. 그림 9A-E는 테스트 그룹에서 dcLN의 컨포칼 이미징 결과를 보여줍니다. 그 결과, 테스트된 다른 파장(880nm 및 1300nm)과 비교하여 펄스 모드에서 1050nm의 광 파장과 연속 영역에서 1050nm 파장이 뇌에서 dcLN으로 형광 Aβ를 훨씬 더 많이 제거한다는 사실이 밝혀졌습니다.

마지막 단계에서는 펄스 모드에서 1050nm LED가 NREM의 EEG 제어 하에 tPBM의 10일 과정 전후에 노화된 쥐의 뇌에서 용해성 Aβ 수준에 미치는 영향을 연구했습니다. 면역분석 결과, 뇌 내 용해성 Aβ 함량은 성인 남성 BALB/c 마우스(2-3개월, 26-29g)에 비해 고령 수컷 BALB/c 마우스(16-18개월, 30-33g)에서 유의하게 높았다. 깨어 있는 동안이 아닌 깊은 수면 상태에서 tPBM을 10일 동안 투여한 결과, 노화된 쥐의 뇌에서 용해성 Aβ 수치가 성체 쥐의 뇌에서 용해성 Aβ 수준으로 효과적으로 감소했습니다(그림 10).

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그림 1: 하드웨어 조립 공정. (A) 3D 프린팅 프레임, (B) LED, (C) LED 인쇄 회로 기판, (D) 자석, (E) 금속 와셔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: LED 제어 회로. R1 - 전류 조정 저항기, R2 - MOSFET 게이트용 풀다운 저항, Q1 - n채널 MOSFET. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 케이스 3D 보기. (A) 3D 프린팅 커버 플레이트, (B) 3D 프린팅 버튼, (C) 아두이노용 LCD 키패드 실드, (D) 아두이노, (E) 3D 프린팅 케이스, (F) LED 커넥터, (G) 채널 모스펫. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 소프트웨어. (A) 선택 버튼, (B) 왼쪽 버튼, (C) 위/아래 버튼, (D) 오른쪽 버튼, (E) 선택 표시기, (F) PWM 듀티 사이클 선택 필드, (G) RUN/OFF 필드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: EEG 기록 시스템의 이식. (A) 두개골 준비; (B) 나사 이식; (C) 치과 아크릴로 나사를 고정하는 것; (D) EEG 기록 센서의 고정; (E) 안륜근(orbicularis oculi muscle)의 뒤쪽에 근전도 전극의 이식 및 고정; (F) 센서의 은도금 홈에 납땜된 전극. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 두개골의 후두골에 PBM용 플레이트를 고정한 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 만성 카테터를 우측 심실에 이식한 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: 뇌에서 dcLNs로의 형광 Aβ의 림프 제거에 대한 다양한 LED 1050nm 용량의 효과. (A-D) (B) 10 J/cm2, (C) 20 J/cm2 및 (D) 30 J/cm2를 가진 (A) 대조군 및 PBM 그룹의 dcLNs의 대표 이미지; (E) 테스트 그룹의 dcLN에 형광 Aβ가 축적된 정량 분석(n = 8, Duncan 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석, **p < 0.01, *p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9: 뇌에서 dcLN으로 형광 Aβ의 림프 제거에 대한 다양한 LED 파장의 효과. (A-D) 임펄스 모드 1050nm(ImpMode_1050, A), 880nm(ImpMode_880, B), 1300nm(ImpMode_1300, C) 및 연속 모드 1050nm(ContMode_1050 nm, D)를 사용한 PBM 그룹의 dcLN의 대표 이미지; (E) 테스트 그룹의 dcLN에서 형광 Aβ의 축적에 대한 정량 분석(n = 8, Duncan 사후 테스트를 사용한 일원 분산분석, **p < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 10: 성체 및 노령 마우스의 마우스 뇌에서 용해성 Aβ(pg/mL) 수준의 NREM 및 깨어 있는 상태 중 PBM 효과(임펄스 모드의 LED 1050nm, 30J/cm2). Duncan 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석, **p < 0.01, *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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토론

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MLV는 특히 MLV 기능이 저하된 고령 피험자에서 뇌의 배출을 조절하고 뇌에서 세포 파편 및 노폐물을 제거하기 위한 혁신적인 기술 개발의 중요한 대상입니다 1,22. 항상성 상태에서 깊은 수면은 뇌 조직 청소의 자연스러운 활성화와 관련이 있습니다13,14. 그러므로, 깊은 수면 동안에 MLVs의 자극이 깨어 있을 때보다, 더 효과적일 것이라는 것을 기대하는 것은 명백하다15,16. 노화된 수컷 마우스의 뇌에서 용해성 Aβ의 림프 제거 자극을 위한 수면 EEG 제어 하에 있는 tPBM의 새로운 비침습적 휴대용 기술이 여기에 제시되어 있습니다.

포토 플랫폼의 작은 크기(7mm x 11mm)와 가벼운 무게(1g)로 인해 생쥐의 머리에 견고하고 안전하게 장착하여 자연스러운 운동 활동을 유지할 수 있습니다. 이것은 또한 tPBM 중에 마취를 사용할 필요성을 제거합니다. 딥 슬립(deep sleep) 동안의 tPBM은 수면 단계의 EEG 제어를 위해 모든 상용 장치를 사용하여 수행할 수 있습니다. 따라서 우리의 기술을 통해 가정용 케이지에서 연구를 수행할 수 있어 동물을 위한 가장 자연스러운 조건을 보존할 수 있습니다.

첫 번째 단계에서는 깨어 있는 성인(2-3개월) 마우스에서 뇌에서 형광 Aβ를 dcLN으로 림프 제거에 대한 광 효과의 효과적인 투여량 연구를 위해 1050nm의 LED 파장을 무작위로 선택했습니다. 이 파장의 선택은 1267nm 레이저 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34를 사용한 MLV의 효과적인 자극에 대한 이전 데이터와 관련이 있습니다. 이 파장은 뇌 조직과 수막에서 소량의 일중항 산소의 직접 생성을 촉진하며, 이는 MLV 8,28,34의 PBM의 기저에 있는 메커니즘 중 하나입니다. 그러나, 1267 nm 레이저와 LED 1050 nm 모두의 생물학적 효과는 일중항 산소 여기(35)의 생성과 관련이 있다. 실제로 1267nm ± 20nm 레이저와 1065nm ± 15nm LED의 대역은 산소 분자의 바닥 상태에서 일중항 산소의 형성과 관련이 있습니다. 1267nm 레이저 대역은 산소 분자를 첫 번째 여기 단일항 상태로 직접 펌핑하는 반면, 1065nm LED 대역은 매우 빠르게 붕괴하여 환경에 열을 방출하는 추가 진동 에너지에 해당합니다. 또한, 1065nm 파장의 수분 흡수율은 1267nm 파장보다 10배 적기 때문에 생물학 연구에 더 유리하다35. 또한 1050nm LED는 시장에서 상업적으로 이용 가능하며 희귀하고 값비싼 1267nm 레이저에 비해 훨씬 저렴합니다. 이 연구에서 사용된 1050nm LED의 방출 대역은 40nm 너비였으며 일중항 산소 대역과 부분적으로만 겹칩니다. 그러나 1050nm LED(30J/cm2)를 사용하여 뇌에서 dcLN으로 형광 Aβ의 림프 제거에 대한 tPBM의 유의미한 효과를 입증했습니다. dcLN에서 Aβ로부터의 형광 신호의 더 높은 강도를 기반으로 한 광 선량 30 J/cm2 및 20 J/cm2에 비해 광 선량 30 J/cm2가 가장 효과적인 것으로 결정되었습니다. 따라서 1050nm LED는 tPBM 기술을 인간에게 적용하는 데 매우 유용할 수 있으며, 이는 PBM36,37에 레이저 대신 LED를 사용하는 일반적인 추세와 일치합니다.

두 번째 단계에서 이 연구는 깨어 있는 성인 쥐의 뇌에서 형광 Aβ의 림프 제거에 가장 효과적인 광 파장이 무엇인지에 대한 질문에 답하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구 단계는 동일한 선량(30J/cm2)으로 다양한 광 파장(880nm, 1050nm, 1300nm)과 모드(연속 및 펄스 영역에서 1050nm)를 가진 휴대용 사진 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 이러한 파장은 잠재적으로 임상적으로 중요할 수 있는 tPBM(880nm) 및 새로운 고가의 LED(1300nm)에 대한 임상 실습의 광범위한 사용으로 인해 선택되었습니다. 또한 광 자원으로 1050nm LED에 대해서만 펄스 모드와 연속 모드를 비교했습니다. 이러한 데이터는 펄스 모드에서 1050nm LED와 다른 파장에서, 그리고 연속 모드에서 1050nm의 LED만이 뇌에서 dcLN으로 Aβ를 크게 제거한다는 것을 명확하게 보여줍니다. 이러한 결과는 다른 연구자들의 연구 결과와 일치하며, 이들은 또한 생물학적 효과를 효과적으로 달성하기 위해 펄스 PBM을 사용하는 이점을 나타냅니다 38,39,40.

마지막 단계에서 유효 파장, 용량 및 모드를 선택했을 때 NREM 및 각성의 EEG 제어 하에 tPBM의 10일 과정 전후에 노화된 마우스의 뇌에서 용해성 Aβ 수준에 대한 펄스 모드의 1050nm LED의 효과에 대한 연구를 수행했습니다. 면역분석 결과 뇌의 용해성 Aβ 함량은 성인 마우스(2-3개월령)에 비해 노령 마우스(16-18개월령)에서 유의하게 높았습니다. 깨어 있는 동안이 아닌 깊은 수면 상태에서 tPBM을 10일 동안 복용한 결과, 노화된 쥐의 뇌에서 용해성 Aβ 수치가 성체 쥐의 뇌에서 용해성 Aβ 수준으로 효과적으로 감소했다는 점은 흥미롭습니다. 나이가 들면서 건강한 생쥐와 쥐의 뇌 조직에서 Aβ 함량이 증가하는 것은 다른 연구에서도 언급되었는데25,26 이는 MLV 기능의 노화 관련 감소와 관련이 있을 수 있으며, 이로 인해 이 독성 단백질 1,22로부터 뇌 조직을 비효율적으로 청소할 수 있습니다. 깨어 있는 쥐에 비해 잠자는 쥐의 뇌 조직에서 용해성 Aβ를 제거하는 데 더 효과적인 tPBM은 수면 중 뇌 조직 배수의 자연스러운 활성화로 설명할 수 있습니다. MLV 형태는 나이가 들면서 크게 변하여 노화된 뇌에서 대사 산물의 림프 제거가 감소한다22. 그러나 수면 중 tPBM은 노화 마우스의 뇌 조직에서 용해성 Aβ의 림프 제거를 성인 동물 수준으로 회복시키는 데 도움이 됩니다.

빛 에너지가 두개골을 통과할 때 산란되는 것을 고려할 때, tPBM은 뇌 조직 깊숙이 침투하지 않고 MLV에만 미치는 영향을 제한합니다. 그러나 림프관이 아직 인간과 동물의 뇌 조직에서 직접 발견되지 않았음에도 불구하고 대뇌 림프계의 존재를 나타내는 증거가 증가하고 있습니다 41,42,43,44. 이것은 뇌의 깊은 구조 (심실계, 해마)에서 MLV 및 더 나아가 말초 (dcLNs)로 독소 (혈액 및 Aβ)가 제거되었음을 보여주는 결과를 설명합니다 5,7. 한 세기가 지나면서 뇌의 배출과 말초 림프계 사이에 밀접한 관계가 있다는 사실이 밝혀지는 지식이 축적되었다45. 중추신경계에 일반적으로 인정된 림프망이 없는 경우에도, 뇌의 심부에서 주변부로 거대분자가 림프액 제거를 나타내는 사실이 있다 1,2,3,4,5,6,7 이것은 또한 MLV에만 작용하는 tPBM이 뇌로부터 혈액과 Aβ의 청소를 자극하는 이유를 설명한다5, 7.

요약하면, 본 연구는 노화된 마우스의 뇌에서 채취한 용해성 Aβ의 예와 다양한 광학 자원의 치료 효과를 비교할 수 있는 기능을 사용하여 독소 제거를 광자극하도록 설계된 수면 EEG 제어 하에서 tPBM의 휴대용 기술을 제시합니다. 이 기술은 마취 없이 가정용 케이지의 자연스러운 상태에서 사용할 수 있어 생쥐의 자연스러운 운동 활동을 유지할 수 있습니다. 이러한 데이터는 MLV 기능 및 뇌 배수 과정의 노화 관련 변화를 교정하고 대사 산물 및 독소로부터 뇌 조직을 효과적으로 청소하기 위한 비침습적이고 임상적으로 유망한 광 기술의 개발에 대한 새로운 전망을 제시합니다. 뇌의 배액을 광자극하고 뇌에서 독소를 림프액으로 제거하기 위해 제안된 기술은 두개골을 통과할 때 빛 에너지가 산란하기 때문에 MLV에 미치는 영향이 제한적입니다. 따라서 이 기술은 MLV 기능 장애와 관련된 뇌 질환을 치료하는 새로운 방법을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. MLV에 대한 가장 뚜렷한 자극 광 효과는 깊은 수면(NREM)에서 관찰되며, 이를 위해서는 EEG 제어 하에 PBM을 사용해야 합니다. 이것은 깊은 수면의 시작과 빛 노출의 공급을 동시에 제어하기 위해 특정 어려움 (기술적, 프로그래밍)을 만듭니다.

공개 사항

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저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 러시아 과학 재단 (No. 23-75-30001)의 보조금으로 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1% Tween20헬리콘,  러시아SB-G2009-100ML
카테터Scientific Commodities Inc., 미국PE-10, 0.28mm ID × 0.61mm OD
CO2 챔버바인더, 독일CB-S 170
컨포칼 마이크로스코프니콘, 일본A1R MP
치과 아크릴Zermack, 폴란드-러시아Villacryl S, V130V4Z05
DrillForedom, RussiaSR W-0016
Dumont forcepsStoelting, USA52100-07
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA206334
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Switzerland29 G needle
IbuprofenSintez OJSC, RussiaN/A  진
인슐린 바늘INSUPEN, 이탈리아31G, 0.25mm x 6mm
Levomekol 항균 연고NizhpharmD06C 40mg/g의 용량으로 외부 사용, 하루 1회
마이크로 집게Stoelting, 미국52102-02P
마이크로 원심분리기자이로젠, 한국GZ-1312
MicroinjectorStoelting, 미국53311
비샤프 핀셋Stoelting, 미국52108-83P
PINNACLE 시스템Pinnacle Technology, 미국8400-K3-SLEEG(2채널) 및 EMG(1채널) 기록 시스템
BraunSeries 3310s
Single and Multi-channel pipettesEppendorf, Austria Epp3120 000.020, Epp 3122 000.019
염화나트륨Kraspharma, 러시아N/A
납땜 스테이션AOYUE, 중국N/A
입체성 프레임Stoelting, 미국51500
스트레이트 해부 가위Stoelting, 미국52132-10P
테트라사이클린JSC Tatkhimfarmpreparaty, 러시아N/A눈 연고
핀셋Stoelting, USA52100-03
Ultrasonic cell disrupterBiobase, ChinaUSD-500
상처 견인Stoelting, USA52125
XylanitNita-Farm, RussiaN/A근육이완제
Zoletil 100Virbac Sante Animale, FranceN/A전신 마취
통제 마우스 면도기의 기

참고문헌

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