방법 논문

레티닐리덴 단백질 생성에서 비타민 A 막 수용체 및 옵신 단백질과 리간드의 상호 작용을 연구하기 위한 방법론

DOI:

10.3791/67036

⸱

2024년 10월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 비타민 A 막 수용체와 광 수용체 옵신과 각각의 생리학적 리간드와 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 두 가지 정량적 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식이 비타민 A/전-트랜스 레티놀(ROL)이 몸 전체에 분포하는 것은 말초 조직에서 레티노이드 기능을 유지하고 시각 기능을 위한 레티닐리덴 단백질을 생성하는 데 중요합니다. RBP4-ROL은 혈액에 존재하는 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)와 ROL의 복합체입니다. 간에서 레티놀 결합 단백질 4 수용체 2(RBPR2)와 눈에서 레티노산 6 레티놀(STRA6)에 의해 STimulated 된 두 개의 막 수용체는 순환계 RBP4와 결합하며 이 메커니즘은 ROL을 세포에 내재화하는 데 중요합니다. 수용체-리간드 동역학을 조사하는 방법을 확립하는 것은 레티노이드 항상성에 대한 비타민 A 수용체의 생리학적 기능을 이해하는 데 필수적입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 사용하여 생리학적 리간드 RBP4와 함께 비타민 A 막 수용체의 결합 친화도 및 운동 매개변수를 분석할 수 있습니다.

이러한 방법론은 비타민 A 결핍의 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 RBPR2 및 STRA6의 RBP4 결합 모티프에 대한 새로운 구조 및 생화학적 정보를 밝힐 수 있습니다. 눈에서 내재화된 ROL은 광수용체의 옵신과 결합하여 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 형성하는 시각적 발색단인 11-시스 레티날로 대사됩니다. 빛의 흡광도는 11-시스 레티널의 cis-to-trans 이성질체화를 일으켜 로돕신의 구조적 변화를 유도하고 그에 따른 광전달 캐스케이드의 활성화를 유발합니다. 혈청 및 안구 ROL의 농도 감소는 레티닐리덴 단백질 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 로돕신 국소화 오류, 아포단백 옵신 축적, 야맹증 및 광수용체 외부 분절 변성을 유발하여 색소성 망막염 또는 레베르 선천성 색소변증을 유발할 수 있습니다.

따라서 망막에서 G 단백질 결합 수용체 opsin-11-cis 망막 복합체를 정량화하기 위한 분광광도계 방법론은 위에서 언급한 병리학적 상태에서 망막 세포 변성의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이러한 포괄적인 방법론을 통해 조사관은 인간의 시각 기능을 유지하는 데 중요한 광수용체에서 레티닐리덴 단백질 농도를 생성하고 유지하는 데 중요한 전신 및 안구 레티노이드 항상성을 유지하는 데 있어 식이 비타민 A 공급을 더 잘 평가할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식이요법으로 얻은 비타민 A/all-trans 레티놀/ROL은 시각 기능에 중요한 역할을 하는 구성 요소입니다 1,2. 식이 비타민 A의 대사 산물인 발색단 11-시스 레티날은 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 옵신에 결합하여 광수용체에서 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 생성합니다. 빛이 눈에 내리쬐면 로돕신의 구성은 11-cis-retinal 구성 요소가 all-trans-retinal로 전환됨으로써 근본적인 변화를 겪습니다. 이 구성 변화는 간상 광수용체 내에서 광전달 캐스케이드를 유발하여 빛을 전기 신호로 변환하고, 이 신호는 시신경 3,4,5,6,7,8,9,10을 통해 뇌의 시각 피질로 전달됩니다 . 혈청 및 안구 ROL의 농도 감소는 레티닐리덴 단백질 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 다시 옵신 국소화 오류, 아포단백 옵신 축적, 야맹증 및 광수용체 OS 변성을 유발하여 색소성 망막염 또는 Leber 선천성 무뇨증을 유발할 수 있으며, 이는 실명을 유발할 수 있습니다 3,10.

All-trans 레티놀은 식이 비타민 A의 기본 수송 형태이며 모든 기능성 레티노이드 및 식이 비타민 A 대사 산물이 파생되는 공급원입니다. 간은 식이 비타민 A를 저장하는 주요 기관 역할을 합니다. 간 레티놀은 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)와 복합체로 혈청을 통해 운반됩니다. 주로 간에서 발현되는 RBP4는 레티놀 기질과 트랜스티레틴(TTR)과 함께 홀로그램 복합체를 형성하여 순환계(11,12,13,14,15,16,17)로 들어갑니다. 1970년대에 RBP4에 대한 세포 표면 수용체에 대한 보고는 막 수송 단백질이 레티노이드의 세포 안팎으로의 수송을 돕는다는 가설로 이어졌습니다. RBP4 결합 레티놀(RBP4-ROL)의 세포 표면 수용체는 눈의 망막 색소 상피(RPE)에서 레티노산 6 레티놀(STRA6)에 의해 STimulated된 것으로 확인되었습니다. STRA6는 순환성 holo-RBP4 복합체에 결합하고 RBP4-bound 레티놀을 RPE를 통해 셔틀하여 광수용체에 의해 활용되도록 합니다18,19. STRA6의 돌연변이는 안구 ROL 농도 감소와 관련된 수많은 질병 및 표현형을 유발할 수 있습니다. 발달 중 STRA6 돌연변이는 Matthew-Wood 증후군 20,21,22,23,24,25,26,27과 관련된 표현형과 겹치는 무안구증, 소안구 및 기타 비안구 증상을 유발할 수 있습니다. STRA6는 눈의 RPE와 같은 다른 장기 및 조직에서 발현되지만 모든 조직에서 발현되는 것은 아닙니다26,27. 레티노이드 저장의 주요 부위는 간이지만, STRA6는 간에서 발현되지 않습니다.

Alapatt와 동료들은 레티놀 결합 단백질 4 수용체 2 (RBPR2)가 높은 친화력으로 RBP4와 결합하고 RPE28의 STRA6와 유사하게 간에서 RBP4 결합 레티놀의 흡수를 담당한다는 것을 발견했습니다. RBPR2는 STRA6 29,30,31과 구조적 상동성을 공유하는 것으로 보고되었습니다. RBP4는 RBPR2와 STRA6 사이뿐만 아니라 29,30,31 사이에서 부분적으로 보존된 아미노산 결합 도메인인 RBPR2의 잔기 S294, Y295 및 L296에 결합하는 것으로 제안됩니다. 이러한 연구에서 하나 이상의 세포외 결합 잔기/도메인을 포함하는 STRA6 및 RBPR2와 같은 비타민 A 막 수용체가 순환 RBP4-ROL과 상호 작용하는 것으로 제안되었습니다. 따라서 막 수용체는 간과 눈과 같은 표적 조직으로의 ROL 내재화를 위해 순환 RBP4에 대한 수용체 결합에 중요한 역할을 합니다.

이 연구의 첫 번째 부분에서는 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 사용하여 두 개의 비타민 A 막 수용체(RBPR2 및 STRA6)와 생리학적 리간드 RBP431의 상호 작용을 조사했습니다. 리간드 복합체에 대한 단백질의 결합 친화도 및 결합/해리 역학은 SPR을 사용하여 실시간으로 측정할 수 있습니다. 이 방법론은 비타민 A 결핍증31,32의 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 RBPR2 및 STRA6의 RBP4 결합 모티프에 대한 중요한 역학적, 구조적 및 생화학적 정보를 제공하는 것을 목표로 했습니다. 위에서 언급한 바와 같이, 순환 ROL은 STRA6를 통해 RPE에 내재화되어 발색단 11-시스 망막을 생성하고, 이 발색단은 옵신에 결합하여 광수용체(33)에서 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 생성합니다. 우리는 분광광도법 방법론을 사용하여 쥐 망막 용해물에서 GPCR-opsin 및 그 리간드 11-시스 망막 복합체를 정량화했으며, 이는 색소성 망막염 또는 Leber 선천성 무모증 안구 병리학적 상태에서 감소된 레티닐리덴 단백질, 로돕신의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다34. 일반적으로 이러한 프로토콜은 전신 및 안구 비타민 A 항상성에 영향을 미치는 돌연변이 RBP4, STRA6 또는 RBPR2의 생리학적 결과 또는 돌연변이 로돕신 또는 레티노이드 주기 단백질이 시각 기능에 미치는 영향을 시험관에서 연구하는 데 적용할 수 있습니다35,36.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법론

  1. 마우스 RBP4 단백질의 준비 및 정제
    1. 전장 마우스 RBP4(msRBP4) cDNA(NCBI 참조 서열: NM_001159487.1)를 생성하기 위한 프라이머를 설계합니다. msRBP4 cDNA를 pET28a His-tag 카나마이신 내성 발현 벡터로 클로닝하고 BL-21 DE3 세포에서 발현합니다(재료 표).
    2. BL-21 DE3 유능한 세포(제조업체의 프로토콜에 따름)를 ligated msRBP4-pET28a 벡터로 형질전환한 다음 Kanamycin 50μg/mL30,37을 함유한 Luria-Bertani(LB) 브로스 한천 플레이트에 플레이트합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 플레이트를 배양하고 다음 날 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
    3. 단일 콜로니를 선택하고 카나마이신 50μg/mL를 함유한 LB 육수 5mL에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
    4. 카나마이신 50μg/mL를 함유한 LB 육수 500mL에서 2차 배양의 경우 1% 부피의 1차 배양액(1.1.3단계에서)을 사용하고 37°C에서 3-4시간 동안 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 확인하십시오. 이상적으로는 OD 값이 0.6과 1 사이인 경우 진행하여 하룻밤 동안 24°C에서 0.5mM IPTG로 단백질 발현을 유도합니다.
    5. 0.1-1 mM 및 16-30 °C 온도 범위의 여러 IPTG 농도를 사용하여 msRBP4 발현 및 안정성을 최적화합니다.
    6. 배양액을 16,000× g 에서 10분 동안 원심분리하고(1.1.5단계에서) 상층액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 유지합니다.
    7. 용해 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1%(v/v) Triton X-100, 10% 글리세롤, 0.5mM PMSF 및 프로테아제 억제제[pH 8.0])로 펠릿을 균질화합니다. 250 와트 출력 및 40-50 % 20 kHz 출력 주파수의 균질화기를 사용하여 15 초 ON 및 30 초 OFF 사이클 동안 용해물을 초음파 처리합니다. 5회 반복합니다.
    8. 세포 파편과 용해되지 않은 세포를 16,000×g에서 20 분 동안 원 심분리하여 제거합니다. 용해물의 상층액을 완충액 평형 니켈 NTA 컬럼을 통과시킵니다.
    9. 30mM 이미다졸을 함유한 용해 완충액(1.1.8단계)으로 컬럼을 세척합니다.
    10. 250mM 이미다졸을 함유한 완충액을 사용하여 결합된 msRBP4 단백질을 분획으로 용리합니다. 용리된 분획을 실행하고 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 단백질 양을 육안으로 모니터링하고, 메탄올:물:아세트산(45:45:10) 용액에서 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하고 Coomassie 염색 메탄올:물:아세트산(45:45:10)이 없는 용액으로 탈색합니다.
    11. 사용하지 않는 분획을 합동하고 10kDa MWCO의 10K 투석 카세트로 합동된 분획을 투석합니다.
    12. 12% SDS-PAGE 겔에서 투석된 분획의 품질을 평가하고 단백질 농도를 정량화합니다.
      참고: Apo-RBP4 단백질이 SPR 분석에 사용되었습니다. holo-RBP4 (RBP4-retinol)를 생성하기 위해, 다른 곳에 게시된 상세한 프로토콜을 참조하라36,37.
  2. 트립토판 형광 분석 및 원형 이색법(CD) 분광법에 의한 구조 및 상호 작용에 대한 RBP4를 사용한 RBPR2 및 STRA6 펩타이드의 초기 검증
    1. 트립토판 형광 분석
      1. 온라인 단백질 조성 분석 도구(https://web.expasy.org/protparam/)를 사용하고 아미노산 염기서열을 한 글자 코드에 붙여넣어 재조합 RBP4 단백질의 구조적 조성과 RBPR2 및 STRA6의 개별 펩타이드를 평가하여 개별 펩타이드 및 단백질의 트립토판 아미노산 잔기를 측정합니다(재료 표).
      2. 파라미터 계산 버튼을 클릭하고 트립토판(Trp) 잔류물에 대한 아미노산 조성을 평가합니다.
        참고: 트립토판 잔류물은 분석 중인 개별 펩타이드 또는 단백질에 존재해야 합니다.
      3. 개별 RBPR2 및 STRA6 펩타이드를 다양한 마이크로몰 농도로 희석하고 실온에서 5분 동안 96웰 플레이트에 3μg msRBP4로 개별적으로 배양합니다. 290nm에서 혼합물을 excitation하고 300nm에서 400nm 파장의 방출을 스캔합니다.
      4. Blank(완충액만, 펩타이드 및 단백질 없음) 및 펩타이드 제어 조건(단백질 없음)을 사용하여 데이터를 정규화하고 플롯합니다.
        참고: 낮거나 높은 펩타이드 농도에 노출될 때 트립토판 형광 증가는 두 개의 개별 펩타이드와 RBP4 단백질 사이에 긍정적인 상호 작용이 있음을 시사합니다.
    2. Circular dichroism (CD) 분광법
      1. 개별 펩타이드와 재조합 RBP4 단백질을 1x PBS 완충액(pH 7.0)에 희석합니다. 아래 설명과 같이 다양한 농도의 RBPR2 및 STRA6 펩타이드와 RBP4 단백질을 0.1 - 10 μg/mL로 사용하여 품질을 확인합니다.
      2. 0.1cm 경로 길이의 큐벳에 개별 희석된 펩타이드와 단백질을 추가하고 CD 분광광도계(195-250nm)를 사용하여 CD 흡광도/타원도를 측정합니다. 아래 공식을 사용하여 평균 잔차 타원도(θ)를 계산합니다.
        [v] = (S × mRw) / (10cl)
        S는 CD 신호를 mθ 단위로 나타냅니다. mRw는 평균 잔류 질량을 나타냅니다. c는 단백질의 농도를 mg/mL 단위로 나타냅니다. l은 경로 길이(cm)를 나타냅니다.
      3. CD 분광법(https://bestsel.elte.hu)에 의한 단백질 폴드 예측에 대한 BeStSel 2차 구조 분석을 사용하여 분자 구조의 변화율을 계산합니다.
        참고: 2차 구조는 상호 작용 연구 및 상호 작용 결과에 중요한 적절한 접기 및 보존된 확인을 나타냅니다. 영역의 예측된 구조를 검사하고 상호 작용 연구를 계속 진행합니다.

2. 생리학적 리간드 RBP4와 비타민 A 막 수용체(RBPR2 및 STRA6)의 결합 친화도 및 운동 매개변수를 결정하기 위한 SPR 분석

  1. CM5 칩 표면 설정에서 RBP4의 고정을 위해 금 표면에 공유 결합되어 ~100nm 크기로 확장된 카르복시메틸 덱스트란 링커를 운반하는 SPR 센서 칩을 사용합니다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC)이 있는 경우 N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 칩 표면의 카르복실기를 N-하이드록시숙신이미드 에스테르로 변환하여 아미노산 및 단백질의 아민기와 자발적으로 반응하여 리간드가 칩 표면에 공유 결합하도록 합니다(재료표).
    1. 정제된 msRBP4 단백질을 센서 칩에 고정시킵니다(그림 1 및 그림 2). 소프트웨어 실행 메뉴에서 마법사를 선택하고 고정 옵션을 진행합니다. 고정화 완충액(10mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.0)에 리간드(1.1단계에서 얻은 msRBP4 단백질)를 10μg/mL(리간드 4μL + 완충액 396μL)로 희석하고 커플링 시약을 바이알에 분주합니다. 소프트웨어 제어에서 Immobilization Setup 마법사 창을 열고 CM5 Chip을 선택한 다음 Kinetic Study and Wash solution에서 Rmax 30 RU를 달성하기 위한 Immobilize flow cell 2 및 1,200 Response Unit (RU)의 목표 수준: Ethanolamine을 선택합니다. RBP4라는 이름을 입력하고 다음을 클릭합니다.
      참고: 선택 사항: 실행 중인 버퍼 PBST(0.05% Tween 20 세제 용액이 포함된 인산염 완충 식염수)를 사용한 프라이밍을 이전에 수행한 경우 실행 전 프라임 옵션에 대한 시스템 준비 대화 상자가 필요하지 않습니다.
    2. Rack position(랙 위치) 대화 상자에서 Eject Rack(랙 꺼내기)을 클릭합니다. 랙을 가져와서 각 시약에 대해 할당된 부피(156μL의 msRBP4, 177μL의 에탄올아민, 89μL의 EDC, 89μL의 NHS 및 빈 바이알)가 있는 바이알을 놓습니다. 샘플 바이알이 있는 랙을 삽입하고 OK(확인)와 Next(다음)를 클릭합니다.
    3. Prepare Run Protocol(실행 프로토콜 준비) 대화 상자에서 Start and Save(시작 및 저장)를 클릭합니다.
  2. RBPR2 및 STRA6 펩타이드 kinetic assay setup
    1. 마우스 RBPR2, 돌연변이 RBPR2 및 STRA6 펩타이드(이전에 화학적으로 합성되고 이전에31 번 및 재료 표에 나열됨)를 0.8-26.6μM 범위의 러닝 버퍼에서 직렬로 희석합니다.
    2. 제어 소프트웨어를 열고 Kinetics/Affinity wizard를 선택합니다. 파일 | 템플릿을 열고 Kinetics/Affinity를 선택합니다. 주입 시퀀스 대화 상자 흐름 경로 2-1(플로우 셀 2는 활성, 플로우 셀 1은 참조)을 입력하고 칩 유형 CM5를 확인한 후 다음을 클릭합니다. 설정 대화 상자에서 Run startup cycles(시작 주기 실행)를 확인하고 Solution: buffer and cycles:(솔루션: 버퍼 및 주기:)를 입력한 후 Next(다음)를 클릭합니다.
    3. 주입 파라미터 대화 상자에서 샘플 파라미터 값을 입력합니다: 접촉 시간: 120초, 유량 30μL/min, 해리 시간 300초; 재생 파라미터: 재생 솔루션 이름: Glycine-HCl(pH 2.5), 접촉 시간: 30초, 유속: 30μL/min을 입력하고 다음을 클릭합니다.
    4. samples 대화 상자에서 펩타이드의 이름, 분자량 및 농도를 입력하고 next(다음)를 클릭합니다. 랙 위치 대화 상자에서 희석된 펩타이드를 1 - 100 μM 및 ~230 μL의 완충액, ~120 μL의 완충액, ~1,000 μL의 글리신, pH 2.5의 다양한 농도의 개별 ~120 μL 샘플로 랙의 위치에 할당합니다. Eject Rack(랙 추출)을 클릭하고 모든 바이알을 삽입합니다. Next(다음)를 클릭하고 Prepare Run Protocol(실행 프로토콜 준비) 대화 상자에서 Start(시작)를 클릭하고 파일 이름을 입력한 다음 Save(저장)를 클릭합니다(그림 2).
    5. 소프트웨어에서 시작 메뉴를 클릭하고 평가를 선택합니다. 소프트웨어에서 파일 열기를 선택하고 드롭다운 선택 메뉴에서 Fc2-1을 선택하여 msRBP4 및 돌연변이 msRBPR2 및 msSTRA6 펩타이드의 결합 및 해리 단계에 대한 참조 셀 빈 값 활성 센서그램을 분석합니다.
    6. Kinetics/Affinity 드롭다운을 클릭하고 Surface bound를 선택합니다. Select Curves 대화상자를 열려면 테이블에 include column을 선택하고 Next를 클릭합니다. 데이터 선택 대화 상자를 선택하여 비어 있는 센서그램을 표시합니다. 운동학(Kinetics) 및 선호도(Affinity)를 클릭하고 기본 매개변수를 유지한 다음 커브 피팅을 위한 맞춤(Fit) 옵션을 클릭합니다. 보고서 탭에서 평형 해리 상수 Kd 및 Ka 또는 K를 연관 속도에서 검사하고 Kd 또는 K 에서 해리 속도를확인합니다. Kinetics 데이터 센서그램.txt 탭으로 구분된 형식으로 저장하고 값을 사용하여 그래프를 그립니다(그림 3).
    7. 친화성 역학 상수 Kd (평형 상태에서 수용체의 절반에 결합하는 리간드 농도)를 결정하기 위해 소프트웨어에 사용된 XY 플롯에 대한 평가에서 생성된 .txt 형식 파일의 데이터 열을 복사하여 붙여넣습니다. 분석 및 비선형 회귀 분석(곡선 맞춤)을 클릭하고 데이터 열을 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 매개 변수 대화 상자에서 Binding saturation 및 One site Specific binding fitting model 을 클릭하여 다음 공식을 확인합니다.
      Y= (B최대*X)/(Kd + X)
      여기서 Bmax는 결합 부위의 최대 수(반응 단위), X는 펩타이드의 농도, Y는 결합 부위(반응 단위)입니다(그림 3).

3. 망막 용해물에서 GPCR-11- 시스 망막 단백질 복합체(레티닐리덴 단백질 로돕신)를 정량화하는 분광광도법 방법론

  1. 성체 WT-C57BL/6J 마우스로 구성된 미리 결정된 마우스 그룹을 암실로 운반합니다.
  2. 12-16 시간 동안 밤새 생쥐를 어둡게 적응시키고 빨간불 아래에서 생쥐를 안락사 챔버에 넣고 조절기의 CO2 가스 밸브를 ~ 5 분 동안 5L / min으로 엽니 다. 뒤로 당겨진 목과 꼬리에 압력을 가하여 사망을 보장합니다(경추 탈구).
  3. 안구를 절삭하고 20mM 비스-트리스 프로판(1,3-bis(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판)을 함유한 얼음처럼 차가운 완충액에서 눈을 균질화합니다. BTP) pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 프로테아제 억제제 포함(재료표).
  4. 4 ° C에서 16000 x g 에서 15 분 동안 균질액을 원심 분리하고 수용성 세포질 단백질을 함유 한 상층액을 버립니다. 20mM n-dodecyl-β-d-maltoside(DDM), 20mM bis-tris propane(BTP) pH 7.4, 100mM NaCl, 1mM EDTA를 함유하고 회전 플랫폼에서 4°C에서 1시간 동안 프로테아제 억제제를 포함하는 완충액에 펠릿화된 멤브레인 및 멤브레인 단백질을 재현탁 및 용해시킵니다.
  5. 16000 x g, 4 °C에서 1시간 동안 재용해된 멤브레인 분획을 원심분리합니다. 상층액을 30μL의 Rho 1D4 항체 비드와 혼합하고 회전 플랫폼에서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 사용하여 풀다운을 분리하고 상층액을 버리고 완충액 20mM 비스트리스 프로판(BTP) pH 7.4, 500mM NaCl 및 2mM DDM으로 비드를 세척합니다.
  7. 완충액 20mM 비스-트리스 프로판(BTP) pH 7.4, 100mM NaCl, 0.2mg/mL 1D4 펩타이드(-TETSQVAPA)를 포함하는 2mM DDM을 사용하여 실온에서 5-10분 동안 배양하여 로돕신 단백질을 용리합니다(그림 4 및 그림 5).
  8. 경사 광도계를 사용한 빠른 스캔 설정에서 직사각형, 서브 마이크로, 석영, 2mm 조리개, 10mm 경로 길이, 50μL 큐벳을 사용하여 200nm에서 800nm까지의 흡광도에 대한 용리를 분석합니다.
    알림: 고품질 Quartz 큐벳만 사용하십시오(그림 4).
  9. 품질을 검증하고 결정하려면 용리를 확인하고 1분 동안 밝은 빛에 노출시킨 다음 3.8단계를 반복합니다.
  10. Blank 흡광도를 빼고 11-cis 망막 결합 옵신의 경우 500nm, 빛에 노출된 all-trans 망막 결합 opsin의 경우 380nm, 리간드가 없는 Apo-Opsin 단백질의 경우 280nm에서 흡광도를 가진 분석된 흡광도 스펙트럼의 비율을 계산합니다(그림 6). 리간드 망막이 없는 자유 옵신은 500nm에서 기준선 흡광도를 제공합니다.
  11. 로돕신 농도를 정량화하려면 Beer-Lambert의 법칙을 사용하십시오.
    답=ε· C·l 또는 C=A/ε·l
    여기서 A 는 흡광도이고 ε 몰 흡광 계수 (로돕신 ε500 = 40,600 M−1 cm−1 유리 Apo Opsin ε280 = 81,200 M−1 cm−1), C 는 농도이고 l 경로 길이입니다.
  12. 리간드 옵신을 백분율로 정량화하려면 A280/A500의 비율을 사용하십시오.
  13. 공백 빼기 흡광도 스펙트럼을 플로팅하고 자유 옵신 값32를 계산합니다.
  14. 흡광 계수 ε500 = 40600 M−1 cm−1을 사용하여 로돕신의 농도를 계산합니다. 리간드가 없는 옵신의 농도는 흡광 계수ε 280 = 81,200 M−1 cm−1을 사용하여 Beer-Lambert 법칙으로 계산됩니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

비타민 A 막 수용체와 광수용체 옵신과 각각의 생리학적 리간드와의 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위해 정량적 방법이 설명되어 있습니다. 재조합 마우스 RBP4는 E. coli 에서 발현되어야 하며 정제된 단백질은 SPR 칩에서 접합 리간드로 사용되어야 합니다. ~40 아미노산 펩타이드의 화학적으로 합성된 RBPR2, STRA6 및 돌연변이 S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 상호 작용 세포 외 부위"는 다양한 농도에서 결합 및 평형 포화도Kd 역학의 역학을 측정하기 위해 분석물로 사용됩니다(그림 1 및 그림 2).

RBPR2 및 STRA6의 리간드인 재조합 RBP4 단백질은 각각 Kd ~22.38 μM 및 ~26.73 μM에서 측정된 이들 펩타이드의 상호 작용 부위에 대한 결합 친화력을 보여주었습니다. 아미노산 모티프 "SYL"은 RBPR2 및 STRA6 모두에서 이러한 상호 작용을 안정화하는 데 필수적인 역할을 하며, 예측된 대로 돌연변이 펩타이드 S294A는 Kd 가 ~114.9μM로 증가했으며, 이는 결합 포화에 도달하기 위한 돌연변이 RBPR2 펩타이드 요구 사항의 복제 수가 증가했음을 시사합니다(그림 3). STRA6를 통해 눈에서 레티놀을 흡수하고 다양한 레티노이드로 전환하여 로돕신의 잔기인 라이신 296에 결합하여 11-시스 레티널을 염색단으로 최종 전환하면 광자 감지 및 시력을 위한 기능적 수용체가 만들어집니다. 로돕신을 형성하기 위해 단백질 옵신(Opsin)에 결합하는 11-시스 망막 공유 결합은 특정 특징적인 흡광도 특징을 나타냅니다. 단백질 흡수율은 280nm에서 발생하고 유리 레티놀 흡수율은 ~325nm입니다. 그러나 11-cis 망막 또는 로돕신 흡광도를 가진 holo-Opsin은 500nm 파장에서 발생합니다.

낮은 전신 레티놀로 인한 이러한 복합체 형성의 결함 또는 RBPR2 또는 STRA6의 돌연변이에 의한 레티놀 흡수의 결함은 발색단 11-시스 레티날이 없는 Free Opsin 또는 apoprotein opsin의 축적으로 이어져 특성 흡광도가 500nm에서 낮은 흡광도로 변경됩니다. 흡광도를 정량화하고 흡광도 280nm 및 500nm 파장의 비율을 사용하여 리간드 Opsins 또는 Rhodopsin을 추정할 수 있습니다. 짧은 빛 노출을 통해 500nm에서 11-cis 망막 결합 Opsin 흡광도의 광 이성질체화와 380nm에서 모든 trans-retinal-bound Opsin(Meta II 로돕신) 흡광도를 교차 확인할 수 있습니다(그림 4, 그림 5 및 그림 6). 실험 설정에서는 인공물과 오염 물질이 발생할 가능성이 높습니다. 발견된 아티팩트의 두 가지 주요 원인은 기기에서 의도하지 않은 빛 노출과 RPE 또는 렌즈에서 오염 물질 분자를 제거하지 못하는 저농도 염 세척입니다(그림 7).

figure-results-1
그림 1: 표면 플라즈몬 공명 작업 공간. 필요한 자료 및 SPR 기기 개요. (A) SPR 칩 하역장. (ᅡ') -NH2, -SH, -CHO, -OH 또는 -COOH 그룹을 통한 고정화를 위해 카르복시메틸화 덱스트란이 공유 결합으로 부착된 금 표면이 있는 CM5 칩. (B) 샘플 로딩 로봇 인젝터 랙. (B') 유형 3 고무 캡. (B'') 시료 부분 표본용 7mm 플라스틱 바이알. (씨,디) 평형/실행 완충 저장소 및 폐기물 수집 탱크. (E) Biacore 소프트웨어 제어판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: Surface Plasmon Resonance의 개략도 및 센서그램 획득 단계. 1단계: 1,200개의 반응 단위를 목표로 RBP4 단백질로 고정된 CM5 칩 표면. 2 단계 : 다양한 농도의 RBPR2 펩타이드가 분석물로 실행되며, 이러한 생체 분자 상호 작용은 금 칩 표면의 전자 전하 밀도를 변화시켜 특정 각도 또는 공진각에서 광 반사의 변화/감소를 유도합니다. 3단계: 세척은 표면 플라즈몬 현상을 역전시켜 반사 강도를 역전시키고 센서그램을 기준선으로 떨어뜨립니다. 이러한 상호 작용의 동역학은 연관성 해리 상수 및 상호 작용의 강도를 결정하는 데 추가로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 생리학적 리간드 RBP4를 사용한 개별 비타민 A 수용체 결합 도메인 펩타이드의 표면 플라즈몬 공명 결합 연구. (A) CM5 칩 표면에서 RBP4의 달성된 고정을 보여주는 소프트웨어 프롬프트. (나, 씨, D) 다양한 농도에서 펩타이드-리간드 RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 및 돌연변이 S294A RBPR2-RBP4 상호 작용의 센소그램. (B',C',D') 결합 역학 및 평형 Kd 측정은 결합 패턴의 차이와 근접성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: Opsin-11-cis 망막 흡광도 작업 공간 및 기기 개요. (A) 냉장 탁상용 원심분리기, 모든 LED 표시기는 빨간색 테이프로 덮여 있습니다. (B) UV 가시광선 분광 광도계, 빨간 테이프로 덮인 하나의 LED 표시기; (나') 직사각형 초소형 셀, 석영 큐벳 및 마그네틱 스탠드. (C) 스캔 응용 프로그램 소프트웨어; (D) 분광 광도계 컴파트먼트 커버 슬라이드 열림, 분석용 큐벳 홀더, 컴파트먼트 커버 닫힘. (E) 단일 적색 광원에서 시료 준비를 위해 모니터를 끈 상태에서 조명 끄기 설정. (F) 시료 준비 및 용해를 위한 냉장 회전자. (G) 시료 흡광도 측정을 위한 모니터가 켜진 상태에서 조명 OFF 설정. (H) XY-Plot의 흡광도 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: Opsin-11-cis 망막 흡광도 방법론의 워크플로우 개요. 1단계: 단일 적색 광원 아래에서 어둡게 적응된 마우스의 망막을 분리, 균질화 및 용해하여 망막막 분획을 얻습니다. 2-4 단계 : 일련의 원심 분리에서, 펠릿은 세제가없고 DDM 세제 완충액이 존재 할 때 용해됩니다. 5-6 단계 : 망막 광수용체 및 기타 막 단백질을 포함하는 용해화된 펠릿은 항체 풀다운 및 정제를 위해 준비되었습니다. 7 단계 : VAPA 1D4-펩타이드를 사용한 용출된 Opsin은 흡광도 분석을 위해 준비되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 로돕신 흡광도 스펙트럼. (A) 500nm 피크 흡광도를 보여주는 1D4 정제 로돕신을 사용한 어두운 적응 마우스 레티나 추출물, (B) 380nm 피크 흡광도를 보여주는 1D4 정제 로돕신을 사용한 광 노출 레티나 추출물. (C) 1D4 로돕신 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 로돕신 정제 품질 및 크기 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 로돕신 흡광도 스펙트럼 아티팩트. (A) 어둡게 적응된 눈 추출물의 흡광도 스펙트럼의 아티팩트는 380nm에서 흡광도 피크와 함께 표시됩니다. 기기 LED 표시기의 의도하지 않은 빛 노출 또는 암실 도어 라이트 블로커의 고장으로 인해 로돕신 단백질이 표백됩니다. (B) 고염 완충액을 사용한 세척이 충분하지 않으면 RPE, 렌즈 또는 기타 눈 추출물의 오염 물질이 축적되어 높은 흡광도 스펙트럼 확산 및 아티팩트가 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 비타민 A 막 수용체(RBPR2 및 STRA6)와 Opsin 단백질과 각각의 리간드(RBP4 및 11-cis 레티널) 간의 상호 작용을 나타내는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 S1: Intrinsic tryptophan fluorescence intensities(고유 트립토판 형광 강도). 다양한 농도의 RBPR2 및 STRA6 펩타이드와 상호 작용할 때 RBP4의 고유 트립토판 잔기의 상호 작용 및 방향 변화에 대한 예비 증거. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 S2: RBPR2 및 RBP4 단백질-단백질 도킹 및 상호 작용. 계면 잔류물은 PyMOL에서 시각화되고 멤브레인 내 RBPR2의 방향은 서버 도구 https://opm.phar.umich.edu/ 를 사용하여 시각화됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 S3: 단백질-단백질 도킹 상호 작용 및 가능한 접촉 부위의 인실리코(in-silico) 분석을 위한 파이프라인. 분석 파이프라인은 1단계부터 6단계까지 Python 스크립트 실행 순서와 PyMOL 명령줄 사용을 보여 주어 상호 작용 사이트 획득의 신뢰성을 보장합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 S4: RBP4, RBPR2 및 STRA6 펩타이드의 조성을 보여주는 CD 분광법 2차 구조 분석. 파이 그래프는 분자에 존재하는 2차 구조의 점유율을 보여줍니다. BeStSel Secondary Structure 도구를 사용하여 https://bestsel.elte.hu(Circular Dichroism Spectroscopy)에 의한 단백질 폴드 예측을 분석했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 중요한 단계
SPR 방법론
인실리코 모델링 및 도킹 분석: RBPR2(https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) 및 STRA6의 예측된 구조와 msRBP4 PDB 데이터베이스(RSCB PDB ID: 2wqa)에 대해 알려진 구조를 도킹 연구29,31에 사용해야 합니다. 또한 비타민 A 수용체(RBPR2 및 STRA6)에 대한 추정 결합 부위와 리간드(RBP4)29,31의 상호 작용을 확인하기 위해 시험관 내 방법(세포 배양)을 사용해야 합니다(보충 그림 S1, 보충 그림 S2 및 보충 그림 S3). CD 분광법을 사용하여 펩타이드의 품질을 측정합니다. 이전에는 원자외선 CD 스펙트럼의 경우 1mm 직사각형 셀 0.1μg/μL ~200μL(3-4μg RBP4 단백질, 32μM RBPR2 및 32μM STRA6 펩타이드)를 사용했습니다31(보충 그림 S4). 질소 가스 흐름은 방출 크세논 램프에서 유해한 오존 형성을 방지하고 200-300nm에서 배경 흡수율을 줄이는 데 사용해야 합니다. 기본 매개변수를 사용하여 스펙트럼은 185nm에서 300nm까지 측정되었습니다. 기준선은 Blank로 빼기로 수정해야 합니다. 알파 나선 및 베타 시트 함량은 222nm에서 알파 나선의 음의 피크와 같은 흡광도 특성에 따라 계산됩니다.

데이터베이스(https://www.uniprot.org)에서 RBPR2 및 STRA6 단백질과 토폴로지 도메인 데이터를 분석하고, 세포외 영역에서 이전에 알려진 가능한 상호 작용 부위를 확인하고, 서열 ~40-50 아미노산을 사용하여 펩타이드를 화학적으로 합성합니다. 이 연구는 수용체-리간드 상호 작용을 연구하기 위해 제안된 RBP4 결합 잔기를 포함하는 정제된 재조합 마우스 RBP4(msRBP4) 단백질과 화학적으로 합성된 RBPR2 및 STRA6 펩타이드가 필요합니다 18,19,29,31. 펩타이드를 후보 목록에 올리기 전에, 상호 작용하는 비타민 A 수용체 단백질의 세포외 펩타이드 서열은 인실리코(컴퓨터 기반 단백질-리간드 도킹) 분석을 사용하여 결정해야 합니다31. SPR 분석은 수용체-리간드 상호 작용의 동역학을 이해하기 위해 수행됩니다. 인실리코(in-silico) 컴퓨터 기반 분석 또는 체외 분석을 통해 예측된 상호작용 부위를 파악하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 설계된 펩타이드는 RBP4와 상호 작용하는 것으로 알려진 막 단백질 RBPR2 및 STRA6의 세포외 영역을 참조합니다. 정확한 결과를 보장하고 잠재적인 아티팩트 및 음성 SPR 센서그램을 방지하려면 완충액, 펩타이드 농도 및 용해도를 표준화하는 것이 중요합니다. 로돕신 흡광도 연구의 경우, 망막 용해물 분리는 아티팩트 및 원치 않는 흡광도 피크를 피하기 위해 엄격한 어두운 조건과 세척 단계를 필요로 합니다(그림 7).

RBP4, RBPR2, STRA6 및 돌연변이 S294A-RBPR2 펩타이드(31 )와 결합하는 비타민 A 수송체에 대한 SYL 모티프의 중요성을 이해하기 위해 두 아미노산 사이의 카르복실기와 아미노기의 축합 반응을 사용하여 화학적으로 합성했습니다. 이 프로토콜은 앵커링 레진에 순차적 아미노산을 정밀하게 단계적으로 첨가하는 방법을 따랐습니다. 아미노산 합성 과정은 N-말단 아미노산 단위의 보호 및 탈보호의 화학적 변형을 거쳐 합성 및 펩타이드 폴리머 형성을 가능하게 합니다. 완료되면 펩타이드는 수지에서 회수되고 정제됩니다. RBP4 단백질과 비타민 A 수용체 펩타이드 상호 작용의 초기 검증은 내부 트립토판 형광 분석을 사용하여 확인하고 CD 분광계를 사용하여 확인해야 합니다(보충 그림 S1). 마우스 STRA6(msSTRA6), 마우스 RBPR2(msRBPR2) 및 대조 펩타이드와 재조합 RBP4 단백질의 초기 상호 작용 품질은 고유 트립토판 형광 분석을 사용하여 확인해야 합니다(보충 그림 S1). intrinsic tryptophan fluorescence assay는 수용체와 리간드에 결합할 때 형광을 위해 단백질에서 트립토판 아미노산 잔기의 담금질 또는 강화를 평가하기 위한 중요한 실험 절차입니다. 측정된 형광은 상호 작용의 결과로 인한 국소 환경의 변화를 직접 나타냅니다.

방법의 수정 및 문제 해결
러닝 버퍼로 SPR 최적화: 1x 인산염 완충 식염수(Tween 20) 또는 1x HEPES(P20). 침전물을 방지하려면 희석된 펩타이드를 사용하기 전에 원심분리하고 여과해야 합니다. 다양한 고염 완충액(300-500mM NaCl)으로 로돕신 흡광도를 표준화합니다. 500nm의 어두운 곳에서 로돕신 흡광도 피크를 확인하려면 샘플을 30초 동안 빛에 노출시키고 측정을 반복하여 380nm로의 흡광도 피크 이동을 통한 품질과 풀다운의 효능을 보장합니다.

방법의 한계
SPR은 두 단백질의 상호 작용에 대한 특정 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 상호 작용에 세 번째 알 수 없는 구성 요소가 필요한 경우 데이터를 이해하기가 복잡해질 수 있습니다. 분자 형태의 변화는 상호 작용에서 확인되지 않은 상태로 유지됩니다. RBP4 단백질은 레티놀(apo-RBP4)이 없는 상태에서 제조되기 때문에 apo-RBP4와 수용체의 결합을 측정합니다. 따라서, 레티놀 부하 RBP4 (holo-RBP4)는 apo-RBP435,36에 비해 RBPR2 및 STRA6 수용체에 대한 변화된 친화력을 가질 수 있다. 흥미롭게도, STRA6에 대한 apo- 및 holo-RBP4에 대한 친화도는 이전에 마이크로몰 범위 모두에서 나타났으며, STRA6 수용체(35)에 대한 apo- 및 holo-RBP4의 결합 간에 통계적 차이는 관찰되지 않았습니다. 로돕신 흡수 방법은 눈에서 비리간드 옵신(apoprotein opsin)의 존재를 식별할 수 있지만 원인 기전은 식별할 수 없습니다.

로돕신 흡광도 스펙트럼
중요 체크포인트: 11-시스 망막에서 모든 트랜스 망막으로의 광이성질체화는 매우 민감하고 즉각적이다32. 로돕신(holo-Opsin)의 정량화는 어두운 곳(500nm) 또는 Meta II 로돕신(380nm)과 같은 빛에 적응된 조건에서 적절한 옵신 및 11-시스 망막 함량을 측정하기 위해 엄격한 어두운 조건에서 수행해야 합니다32. 따라서 마우스는 표백되지 않은 로돕신32를 측정하기 위해 12-16시간 동안 어두운 방에서 어둡게 적응해야 합니다. 이를 위해 암실은 완전히 어두워야 하며 출입문은 암막 천으로 덮여 있고 모든 장비의 외부 LED 광원은 빨간색 테이프로 덮여 있어야 합니다. 노트북 화면을 빨간색 플라스틱 시트로 덮고 필요할 때까지 닫아 두십시오. 머리 위의 적색 광원도 필요합니다.

중요 단계: 300-500 nm 파장 흡광도를 가지며 옵신 흡광도 측정을 방해할 수 있는 렌즈 또는 RPE 단백질 또는 분자 오염 물질을 제거하기 위해 다양한 고농도의 염에서 세척 단계를 표준화합니다.

기존/대체 방법에 대한 방법의 중요성
레티놀 분포 메커니즘에 대한 레티놀 결합 단백질 수용체의 전신 레티노이드 활용, 다중 조직 기여도 및 돌연변이의 영향을 연구하기 위한 실현 가능한 접근법은 없습니다. 이 프로토콜은 RBPR2-RBP4 수용체-리간드 상호 작용을 통한 Apo-Opsin 및 간 레티노이드 저장 활용을 통한 광수용체의 레티놀 고갈에서 누락된 연결을 이해하고 채우기 위해 두 가지 필수 기술을 사용합니다(그림 3, 그림 6 및 그림 8).

특정 연구 분야에서의 이 방법의 중요성과 잠재적 응용성
SPR 및 흡광도 기반 로돕신 분광법 분석은 레티닐리덴 단백질(로돕신) 생성을 위한 전신 및 안구 비타민 A 항상성 메커니즘을 연구하기 위한 의미 있는 전략을 제공합니다. 요약하면, 이러한 기술과 실험적 접근법은 식이 레티노이드가 간을 통해 눈으로 이동하는 막 수용체 의존성 수송의 동역학을 규명할 수 있으며, 이를 통해 로돕신의 생성을 촉진할 수 있습니다(그림 8). 또한 비타민 A 수용체와 옵신 단백질의 돌연변이, 특히 각각의 리간드에 결합하는 데 있어 돌연변이의 메커니즘과 안구 결과를 이해하는 데 도움이 됩니다. 이러한 상호 작용은 시각 기능에 중요한 레티닐리덴 단백질의 생성에 영향을 미칠 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다. 자금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고를 작성할 때, 또는 결과를 출판하기로 결정할 때.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 로돕신 흡착 프로토콜에 대한 조언을 해준 Beata Jastrzebska 박사(오하이오주 케이스 웨스턴 리저브 대학교 약리학과)에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NIH-NEI 보조금(EY030889 및 3R01EY030889-03S1)과 미네소타 대학의 G.P.L.에 대한 창업 자금의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-D Quant KitCytiva80648356
아민 커플링 키트CytivaBR100050
Biacore 평가 소프트웨어Biacore S200버전 1.1
Biacore 센서 칩 CM5CytivaBR100530
Bis tris 프로판SigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 역량 셀Thermo ScientificEC0114
CD 분광광도계JascoJ-815 분광광도계
글리신 HCL피셔 바이오시약BP381-1
GraphPad 프리즘;모델 피팅, 데이터 분석
LB 국물Fisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
플라스미드 정제 키트Qiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
슬라이드-A_Lyzer 10K 투석 카세트Thermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis 분광광도계Agilent Cary 60 UV-Vis
펩타이드 이름펩타이드 서열HPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%일치
마우스 Rbpr2 돌연변이 S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%일치

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

A

관련 논문