망막 색소 상피(RPE) 배양에서 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 새로운 장치를 소개합니다. 이 장치는 플레이트가 표준 세포 배양 인큐베이터에 있는 동안 표준 배지가 있는 표준 세포 배양 플레이트에서 성장한 RPE에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 측정할 수 있습니다.
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방법 논문
고도로 분화된 편광 망막 색소 상피 배양에서 산소 소비율의 장기 모니터링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 대사는 광수용체 생존에 중요한 망막 세포의 단층인 망막 색소 상피(RPE)의 정상적인 기능에 매우 중요합니다. RPE 미토콘드리아 기능 장애는 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반 변성(AMD)과 망막 박리의 실명 합병증인 증식성 유리체 변성증(PVR)의 특징입니다. RPE 퇴행성 질환은 in vivo RPE를 모방하기 위해 고도로 분화되고 분극화된 RPE 배양 시스템에 의해 잘 모델링되었습니다. 그러나 미토콘드리아 기능의 대리물인 산소 소비율(OCR)을 모니터링하는 것은 이상적인 RPE 분극 및 분화를 촉진하는 조건으로 인해 OCR 측정이 쉽지 않기 때문에 이러한 배양 시스템에서는 어려웠습니다.
여기에서는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 최적의 성장 기질 및 생리학적 배양 배지에서 RPE를 유지하면서 잘 분화된 RPE 배양에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 모니터링하는 새로운 시스템인 Resipher를 소개합니다. 이 시스템은 세포 위의 매체에 존재하는 산소 농도 구배를 측정하여 OCR을 계산합니다. OCR을 감지하는 다른 방법에 비해 이 시스템의 장점과 RPE 문화권에서 OCR을 측정하기 위한 시스템을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 시스템 사용에 대한 주요 팁과 요령, 데이터 해석에 대한 주의, 예기치 않은 결과를 해결하기 위한 지침을 다룹니다.
또한 시스템에서 감지한 세포 위의 배지 내 산소 구배를 기반으로 저산소증, 정상산소증 또는 고산소증 RPE 배양 경험을 추정할 수 있는 온라인 계산기를 제공합니다. 마지막으로, PVR 모델에서 RPE 세포의 대사 상태를 측정하고 RPE가 저산소증에 대사적으로 적응하는 방법을 이해하는 시스템의 두 가지 응용 프로그램을 검토합니다. 우리는 고도로 분극화되고 분화된 RPE 배양에 이 시스템을 사용하면 생리학적 및 질병 상태 모두에서 RPE 미토콘드리아 대사에 대한 이해를 높일 수 있을 것으로 기대합니다.
서론
망막 색소 상피(RPE)는 기능적으로 분열 후 고도로 분극된 상피 세포의 단층으로, 망막의 빛에 민감한 광수용체와 혈액 순환 사이에 장벽을 형성하며, 융모혈관이라고 하는 모세혈관층입니다. 신경교세포를 지원하는 뉴런의 역할과 마찬가지로, RPE는 광수용체 외부 분절의 식세포작용, 영양소 수송 및 광수용체의 대사 지원, 필수 성장 인자의 분비 등 광수용체를 지원하기 위한 수많은 기능을 수행하며, 이 모든 기능은 시각 기능 유지에 매우 중요합니다.
RPE의 퇴행은 몇 가지 일반적인 퇴행성 시력 장애의 기초가 됩니다. 전 세계에서 불치의 시력 상실의 가장 흔한 원인 중 하나인 연령 관련 황반 변성(AMD)의 경우 RPE가 죽고 이에 따라 상부에 있는 광수용체가 2차 변성을 겪습니다. 증식성 유리체병증(PVR)에서 RPE는 일반적으로 정지된 유사분열 후 상태를 벗어나 신진대사의 변화와 함께 중간엽 상태(소위 상피에서 중간엽으로의 전환[EMT])로 증식 및 역분화됩니다. RPE 역분화는 광수용체에 대한 RPE 지지의 손실을 유발하는 동시에 더 많은 섬유화 상태를 유발합니다. 그 결과 광수용체 변성과 RPE에 의한 흉터가 발생하며, 둘 다 시력 상실을 유발합니다 1,2
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프로토콜
인간 1차 배양 또는 iPSC-RPE 배양을 확립하기 위한 프로토콜은 다음 참조 15,16,17,18을 참조하십시오. 이러한 프로토콜에 대한 인체 조직의 획득 및 사용은 University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486)에 의해 검토되고 허가되었습니다.
1. RPE 문화에 대한 시스템의 일반적인 적용
- 시스템 호환 가능한 96웰 플레이트에서 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 또는 일차 인간 RPE 세포를 플레이트합니다.
- 24웰 세포 배양 플레이트에서 성장한 기존 성숙한 배양액을 가정하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척한 다음 500μL의 0.25% 트립신-EDTA(Table of Materials)를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 10-40분 동안 배양하고 세포가 둥글고 거의 분리될 준비가 될 때까지 5-10분마다 확인합니다.....
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결과
Resipher 실험을 위한 "샌드위치" 설정은 그림 2A에 나와 있습니다. 96웰 플레이트의 3, 4, 9, 10열에 해당하는 32개의 프로브가 있는 감지 덮개는 셀 플레이트와 장치 사이에 있습니다. 허브에 연결한 후 장치는 모터를 활성화하여 감지 덮개를 위아래로 움직여 셀 단층(일반적으로 1-1.5mm) 위의 높이 범위에서 매체 열의 O2 농도를 측정합니다. 따라서O2 구배는 단층층 위의 이러한 다양한 높이에서O2 농도를 기록하여 연속적으로 측정됩니다. 그래디언트 측정 및 Fick의 확산 법칙 적용에서 이 장치는 프로브 높이 범위 위에서 그 아래까지의 산소 플럭스를 자동으로 계산하며, 이는 셀 단층의 산소 소비율(OCR)입니다. 감지 덮개는 웰이 비어 있는지(공기 전용), 매체로 채워져 있지만 세포가 없는지(매체 전용) 또는 세포 단층 위에 매체가 있는지(매체 + 세포)에 관계없이O2 를 감지합.......
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토론
RPE의 미토콘드리아 대사는 AMD 및 PVR을 포함한 일반적인 실명 망막 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. RPE 미토콘드리아 대사 를 체외에서 모델링하면 신진대사 상태를 주변 조직의 신진대사 상태와 분리할 수 있을 뿐만 아니라 조직을 통제된 방식으로 다양한 질병 시뮬레이션 모욕에 노출시킬 수 있습니다. 이러한 RPE 미토콘드리아 대사의 in vitro 모델링은 in vivo에서 RPE를 밀접하게 근사화하는 데 필요한 적절한 분화 상태 및 극성을 달성하는 고충실도 인간 1차 및 iPSC-RPE 배양의 출현에 의해 촉진되었습니다. 이러한 배양에서 산소 소비율(OCR)을 모니터링하는 것은 미토콘드리아 대사를 모니터링하는 이상적인 방법이지만, OCR 모니터링 설정은 종종 고도로 분극화되고 완전히 분화된 RPE에 필요한 조건에서 배양을 성장시키지 못합니다. 여기에서는 Resipher를 고도로 분화되고 분극화된 RPE 배양에서 OCR의 실시간 장기 평가를 통해 RPE 미토콘드리아 .......
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공개 사항
리처드 A. 브라이언(Richard A. Bryan)과 킨 로(Kin Lo)는 리시퍼 시스템을 제조하는 루시드 사이언티픽(Lucid Scientific)의 직원이다.
감사의 글
우리는 대조군으로 새로운 매체와 조건화된 매체에서 O2 용해도를 테스트하는 아이디어에 대해 Daniel Hass 박사와 Jim Hurley 박사에게 감사드립니다. 원고에 대한 편집에 도움을 주신 Magali Saint-Geniez 박사님께 감사드립니다. Resipher USB 케이블로 저산소증 챔버를 개조해 준 Kellogg Eye Center의 Instrument and Electronic Services Core의 Scott Szalay에게 감사드립니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. Electronic Services Core는 National Eye Institute의 P30 EY007003 의해 지원됩니다. 이 연구는 Research to Prevent Blindness(RPB)의 무제한 부서 보조금으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 건성 연령 관련 황반변성을 위한 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration), E. 마틸다 지글러 시각 장애인 재단(E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind), 에버사이트 안구 은행 보조금, 국립 안과 연구소(National Eye Institute)의 K08EY033420....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | #25-200-056 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T5516 | |
| 32채널 Resipher 뚜껑 | Lucid Scientific | NS32-101A for Falcon | |
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | 전자 전달 사슬의 복합체 III 억제제 |
| BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | 미토콘드리아 호흡 증가를 위한 분리제 |
| DMSO, 세포 배양 등급 | Sigma-aldrich | D4540-100ML | 미토콘드리아 약물 재구성을 위한 차량 |
| 세포외 매트릭스 코팅 기판: Synthemax II-SC | Corning | #3535 | hfRPE용 세포외 매트릭스 |
| 세포 외 매트릭스 코팅 기질: Vitronectin | Gibco | A14700 | iPSC-RPE |
| FCCP | 시그마 | C2920-10MG | 미토콘드리아 호흡 증가를 위한 분리제 |
| 소 태아 혈청(Bio-Techne S11550H) | 바이오 테크네 | S11550H | |
| 하이드로코르티손-사이클로덱스트린 | 시그마 | H0396 | |
| 저산소증 챔버 | Embrient Inc. | MIC-101 | |
| N1 매체 보충제 | Sigma | N6530 | |
| 비필수 아미노산 용액 | Gibco | 11140050 | |
| O2 센서 | 감작 기술 또는 법의학 검출기 | P100 또는 FD-90A-O2 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| 재조합 인간 TGF&베타; 2 | Peprotech | 100-35B | 상피-중간엽 전이를 유도하기 위한 형질전환 성장 인자 베타-2 |
| 로테논 | 시그마 | R8875-1G | 전자수송계의 복합체 I 억제제 |
| 시스템 호환 플레이트 | Corning | #353072 | |
| Taurine | Sigma | T8691 | |
| α MEM (Alpha Modification of Eagle's Media) | 코닝 | 15-012-CV |
참고문헌
- Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibr....
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재인쇄 및 허가
