방법 논문

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

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DOI:

10.3791/67042

⸱

2024년 11월 29일

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

이 논문에서

요약

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

초록

활성 혈소판은 주로 외막 표면에 전응고제인 인지질 포스파티딜세린(PS)을 노출시키고 원래 세포의 원래 막 구조와 세포질 구성 요소를 유지하는 PS 발현 미세소포를 방출하여 응고를 촉진합니다. 포스파티딜세린의 접근성은 주요 응고 인자의 결합을 촉진하여 응고 효소의 촉매 효율을 크게 증폭시키는 반면, 미세소포 방출은 세포 간 신호전달의 중추적인 매개체 역할을 합니다. 프로응고제 혈소판은 지혈 중 혈전 안정화에 중요한 역할을 하며, 혈류에서 혈소판의 비율이 증가하면 혈전증 위험이 증가합니다. 또한 혈소판 미세소포는 상처 치유와 염증 조절을 촉진하는 성장 인자가 풍부하다는 것이 밝혀졌습니다. 유세포 분석을 사용하여 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 분석하는 것은 크기가 작고 관심 마커에 대한 양성 이벤트의 수가 제한되어 있기 때문에 상당한 어려움이 있습니다. 지난 10년 동안 상당한 발전이 이루어졌음에도 불구하고 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 평가하는 방법은 여전히 진행 중인 연구로 남아 있습니다. 불행히도 보편적으로 적용 가능한 단일 프로토콜은 존재하지 않으며 각 특정 애플리케이션에 가장 적합한 방법론을 결정하기 위해 여러 요소를 평가해야 합니다. 여기에서는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리한 후 콜라겐 및/또는 트롬빈 활성화를 통해 응고제 혈소판을 특징짓는 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 측정하는 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 혈소판이 풍부한 혈장의 초기 준비와 세척된 혈소판의 분리를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 마지막으로, 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출은 유세포 분석으로 정량화되어 응고제 혈소판을 식별할 수 있습니다.

서론

혈소판 프로코응고제 형성은 지혈을 유지하는 데 매우 중요합니다 1,2,3. 이 과정은 혈소판막에서 인지질의 작용제 유도 발현을 포함하며, 이는 테나아제 및 프로트롬비나제 복합체 1,3,4의 조립에 필수적입니다. 혈소판 활성화 후, 혈소판 미세소포도 지속적으로 방출된다 5,6. 미세소포(직경이 50nm에서 1μm 이상)는 원래 세포의 막 구조와 세포질 구성 요소를 모두 캡슐화합니다 7,8. 미세소포는 세포간 신호전달의 중요한 매개체이며9,10 상처 치유와 염증 조절을 촉진하는 성장 인자의 저장소이기도 하다11,12. 또한 미세소포는 활성 혈소판보다 50-100배 더 많은 응고력을 가지고 있는 것으로 제안되었다13. 특히, 최근의 증거에 따르면 저장된 혈소판이 활성화되어 미세소포가 생성되며, 이는 혈소판 수혈 요법에 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다. 미세소포의 확장된 저장 기간과 증가된 응고 활성은 수혈 응용 분야에서 혈소판의 유망한 대체품으로 만듭니다14.

건강 및 질병 상태에서 혈소판 프로코아응고제 형성을 직접 및 간접적으로 평가하기 위한 방법론적 혁신이 이루어졌다 4,14,15. 정제된 혈소판을 사용한 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출 평가는 다양한 인간 질병에서 혈소판 응고 반응이 어떻게 교란되는지에 대한 새로운 데이터를 제공했습니다 1,4. 이 성장하는 연구 분야는 또한 치료적 개입을 위한 길을 열어줍니다 1,4. 그러나 혈액에서 정제된 혈소판을 분리하고 분석하는 것은 시간이 많이 걸리고 전문 실험실 장비가 필요하므로 현재로서는 일상적인 임상 진단에 적용할 수 없습니다16,17. 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 분석하는 것도 크기가 작고 관심 마커에 대한 양성 이벤트의 수로 인해 어렵습니다18,19.

형광 Annexin-V 결합을 활용하는 유세포 분석은 20년 전 시작된 이래로 혈소판 및 미세소포에서 PS 발현을 평가하는 데 있어 초석이 되어 왔습니다20. 그것은 procoagulant 혈소판 및 microvesicles21,22의 검사에서 널리 수용되었습니다. 따라서 Cazenave의 그룹23에서 개발한 기술을 사용하여 혈액 샘플에서 정제된 혈소판을 분리하고 혈소판 활성화24 후 유세포 분석에 의한 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출의 후속 특성 분석에 사용할 수 있는 최적화된 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜은 관심 있는 임상 집단에서 응고제 혈소판에 대한 추가 연구와 심층적인 특성 분석을 용이하게 할 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 지침을 따르며 보르도 대학병원 인간 연구 윤리 위원회(University Hospital of Bordeaux Human Research Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 혈액 샘플은 정보에 입각한 동의를 제공한 건강한 지원자로부터 얻었으며 이 샘플은 기관 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 혈소판 기능에 영향을 줄 수 있는 물질을 복용한 기증자는 실험 전 10일 이내에 해당 물질을 복용한 경우 제외되었습니다. 건강한 자원 봉사자로부터 혈액을 채취하고 데이터를 게시하기 위해 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 세척된 혈소판의 채혈 및 준비

  1. 처음 3mL를 버린 후 활성 항응고제인 Tri-sodium Citrate with Citric Acid and Dextrose(ACD)가 포함된 수집 튜브에 말초 정맥혈을 수집합니다.
  2. 채취 후 튜브를 부드럽게 뒤집어 혈액을 ACD와 혼합하고 혼합물을 원심분리하기 전에 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다.
  3. 원심분리를 위한 올바른 속도를 결정하기 위해 원심분리 전에 자동 세포 카운터를 사용하여 혈소판을 계수합니다(표 1). 혈소판 회복을 최적화하기 위해 브레이크를 걸지 않고 실온(RT)에서 10분 동안 250 x g 에서 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 준비합니다.
    참고: 이 단계는 샘플에 3개의 층을 생성합니다: 혈장, 혈소판 및 백혈구의 작은 부분을 포함하는 상층; 백혈구가 풍부한 중간층; 그리고 적혈구로 구성된 바닥층. 적혈구와 백혈구로 오염되지 않도록 상층에서 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 PRP를 조심스럽게 옮깁니다.
  4. PRP에 1mL의 ACD-A( 표 2 참조)와 9mL당 6.25μL의 아피라아제를 추가합니다.
    참고: 0.02U/mL 농도의 아피라제는 혈소판에서 분비되는 미량의 ATP 또는 ADP를 저하시켜 혈소판 ADP 수용체의 탈감작을 방지하고 혈소판 모양을 유지합니다25. 프로스타사이클린 PGI2 억제제(0.5μM)도 혈소판 활성화를 방지하기 위해 아피라아제와 함께 포함될 수 있습니다.
  5. 실온에서 1100 x g 으로 10분 동안 원심분리하여 혈소판 펠릿을 준비합니다. 파스퇴르 피펫과 같은 부드러운 방법을 사용하여 PPP(Platelet Poor Plasma)를 함유하는 상층액을 흡입하고 펠릿을 1mL의 세척 완충액에 재현탁시킵니다( 표 3 및 표 4 참조). 피펫으로 부드럽게 균질화한 다음 세척 완충액 3-4mL를 추가합니다.
    참고: 칼슘 수치는 혈장에 존재하는 응고 인자와의 응고를 방지하기 위해 감소합니다. 이 단계에서 혈소판이 부족한 혈장이 완전히 제거되어 트롬빈 생성에 의한 혈전 형성 및 혈소판 활성화를 방지합니다.
  6. RT에서 1100 x g 으로 10분 동안 다시 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 펠릿을 1mL의 세척 완충액에 재현탁시킵니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 혈소판 현탁액의 150μL를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 3-4mL의 세척 완충액으로 펠릿을 재현탁시킵니다.
  7. 1100 x g 에서 10분 동안 최종 원심분리를 수행합니다(RT에서). 상층액을 흡인하고 혈소판 펠릿을 반응 완충액의 부피( 표 5 및 표 6 참조)에 재현탁시켜 5 x 1011 혈소판/L의 최종 농도를 달성합니다.
  8. 세척된 혈소판을 실험 전에 최소 30분 동안 그대로 두어 잔류 억제제가 마모되고 혈소판이 완충액에 적응할 수 있도록 합니다.

2. 분석 준비

  1. 반응 완충액에서 모든 작용제와 형광 색소를 준비합니다. 완충액 45μL에 트롬빈 5μL를 첨가하고(희석 1:10) 완충액 495μL에 이오단 5μL를 첨가합니다(희석 1:500).
    1. 내부 분석의 경우, 단일 및 이중 작용제로 치료받은 혈소판에 대해 활성화되지 않은 혈소판을 벤치마킹합니다. (i) 반응 완충액 10μL, (ii) 희석되지 않은 콜라겐 3μL(최종 농도 30μg/mL), (iii) 희석된 트롬빈 10μL(0.5IU/mL), (iv) 비희석된 콜라겐 3μL + 사전 희석된 트롬빈 10μL, (v) 사전 희석된 이오단단 10μL(최종 농도 2μM)에 50 x 10 9혈소판 /L에서 세척된 혈소판 100μL를 첨가하고, 이는 앞서 언급한 바와 같이 세포 내 칼슘 수치를 직접 증가시키는 것으로 알려져있다 26.
      참고: A23187 또는 ionomycin과 같은 칼슘 이온단을 사용한 처리는 광범위한 인지질 막 스크램블링을 유도하고 PS 외부화를 강화하기 때문에 매우 중요합니다.
    2. 각 부분 표본을 손으로 부드럽게 흔들고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 작용제 배양이 길면(30분) 유세포분석 분석 과정에서 혈소판 집단을 더 잘 구별할 수 있습니다.
  2. 각 마이크로튜브에 5μL의 희석되지 않은 Annexin-V FITC를 첨가하고 어두운 곳에서 10분 동안 실온에서 배양합니다.
    참고: 혈소판 특이적 수용체 중 하나인 GPIX(CD42b) 또는 αIIb integrin(CD41, GPIIb)에 대한 단클론 항체도 혈소판 세포를 더 잘 식별하기 위해 포함될 수 있습니다.
  3. 500μL의 반응 완충액을 추가하여 공정을 중지하고 유세포분석기를 사용하여 시료 분석을 진행합니다.

3. 유세포분석법(FC)에 의한 응고제 혈소판 및 미세소포의 특성 분석

참고: 신뢰할 수 있는 혈소판 기능 분석을 위해 확립된 표준27에 따라 구성된 유세포 분석(FC) 기기를 사용하십시오. 기기는 전방 산란(FSC) 및 하나 이상의 형광 신호를 감지할 수 있어야 합니다. light scatter and fluorescence detectors를 logarithmic gain으로 설정합니다. FC에 적합하게 샘플을 희석하여 느린 데이터 수집 속도로 개별 혈소판만 계수되도록 합니다.

  1. 유세포 분석기를 최소 10,000 혈소판 이벤트의 임계값을 가진 '느린' 유속으로 설정합니다. FITC용 패스 필터를 사용하여 형광 방출을 모니터링합니다.
  2. 전방 산란(FSC)을 사용하여 혈소판 집단을 게이트합니다. 혈소판과 방출된 미세소포를 크기에 따라 검사합니다. 밀도 플롯을 사용하여 휴지 및 자극 혈소판 모두에 대한 혈소판과 방출된 미세소포를 식별합니다. 각 게이트 모집단을 독립적으로 분석합니다.
  3. FL1 축에 따라 응고제 혈소판을 구별합니다. 휴지 상태(즉, 반응 완충액이 있는 경우)에 있는 혈소판 집단의 맨 오른쪽에 음수 컷오프를 배치합니다. 혈소판 활성화 후, 이 컷오프의 오른쪽에 국한된 모든 이벤트를 포스파티딜세린을 노출시키는 혈소판으로 분류합니다.
  4. 혈소판보다 작은 미세소포를 고유한 광 산란 특성으로 구별합니다. 휴지 혈소판 집단에서 관찰된 가장 낮은 FSC 값으로 컷오프를 설정합니다. 활성화 후 이 임계값 아래로 떨어지는 포스파티딜세린 양성 이벤트를 미세소포로 분류합니다.
    참고: 필요한 경우 컷오프를 조정하여 혈소판 크기의 개인차를 고려하십시오. 미세소포의 1% 미만이 휴지 상태에 있는지 확인합니다.

결과

프로응고제 혈소판 및 미세소포의 정량화는 Annexin-V 염색을 사용하여 이루어지며, 시료당 최소 50,000개의 이벤트가 기록됩니다. 단계 2.2에서 설명한 바와 같이, 기준선 혈소판 측정은 그림 1A에 나타난 바와 같이 반응 완충액으로 배양된 샘플에서 수행되었습니다. 혈소판 크기는 중앙값 순방향 산란(FSC) 값을 사용하여 측정하였다. FSC는 다양한 요인에 의해 영향을 받지만, 혈소판을 포함한 세포 크기 추정을 위한 일반적인 대용물로 남아 있습니다. 면적의 밀도 플롯(그림 1A)을 사용하여 휴지 혈소판과 방출된 미세소포를 식별하고 게이트했습니다.

비활성화 혈소판의 경우, Annexin-V 염색에 의해 측정된 포스파티딜세린(PS)이 2.9% 미만으로 나타났습니다. 콜라겐 단독으로 또는 트롬빈 또는 칼슘 이온단단과 함께 세척된 혈소판을 활성화하면 PS 노출이 눈에 띄게 증가했습니다. 콜라겐만으로도 PS 양성 혈소판이 26.7% 증가했습니다. 트롬빈은 PS 노출에 대한 영향은 미미했지만(9.1%), 콜라겐과 연관되었을 때 PS 노출 혈소판의 비율을 36.2%로 증가시켰습니다. 참고로 2μM 이오노포를 사용한 치료는 혈소판의 49.6%가 응고가 되는 결과를 보였습니다.

그림 1 은 건강한 개인에서 세척된 혈소판의 미세소포의 기준선 비율이 최소(0.3%)임을 보여줍니다. 트롬빈과 콜라겐은 미세소포 형성을 최소한으로 증가시켰지만, 콜라겐과 트롬빈의 조합만으로 미세소포 형성이 유의하게 증가했습니다(그림 1D; 11.4%). 2μM 이온단을 첨가하면 대조군 혈소판에 의해 형성된 미세소포의 44.0%가 PS에 노출되었습니다.

그림 2 는 이 공정에서 예상되는 변동, 반복성 및 재현성에 대한 정보를 제공합니다.

figure-results-1
그림 1: 휴지 및 활성화된 대조군 혈소판에서의 PS 노출 및 미세소포 형성. 혈소판은 30μg/mL 콜라겐(B), 0.5U/mL 트롬빈(C), 콜라겐과 트롬빈(D)과 2μM 이온단을 조합하여 활성화 또는 비활성화(휴지)(A)했습니다. 대표적인 점도표는 혈소판 크기(전방 산채(FSC 로그))와 Annexin-V 결합을 표시합니다. 수평선과 수직선(E)은 혈소판 음성 인구를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: ionophore로 배양한 후 PS 노출 및 미세소포 형성의 반복성 및 재현성. 시트레이트(칼슘 킬레이트제)로 처리 또는 처리되지 않은 세척된 혈소판에서 2μM 또는 5μM 이온단으로 배양 한 후 PS 노출 및 미세소포 형성 분석: (A) 4가지 다른 건강한 대조군에서; (B) 5 번 반복 된 하나의 건강한 대조군에서; (C) 두 명의 다른 기술자가 준비한 두 개의 건강한 대조군에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전혈 혈소판 수(mL당10-9 )상대 원심력(g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

표 1: 전혈의 혈소판 수와 관련된 혈소판이 풍부한 혈장 준비를 위한 상대 원심력.

시약분량
구연산 일 수화물 (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 지
구연산 삼 나트륨 이수화물 (Na3C6H5O7.2 H2O, 61 mM)180 그램
포도당 (C6H12O6, 136 mM)24.6 지
용액의 pH를 조정해서는 안 됩니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.

표 2: acid-citrate-dextrose(ACD) 1L 수용액의 제조.

시약분량
구연산 일 수화물 (C6H8O7. H2O, 36 mM)7.56 지
NaCl (103 mM)6 지
나오4 지
MgCl2.6H 2O (1 mM)0.203 지
pH를 6.5로 조정합니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.

표 3: 세척 완충액의 원액 제조.

시약분량
30% 소 혈청 알부민(BSA)583 마이크로리터
CaCl2, 0.25 미터400 μL
포도당40의 mg의
아피라제31.5 마이크로리터

표 4: 원액에서 Washing Buffer의 50mL 즉석 용액 제조.

시약분량
NaCl (137 mM)8 지
KCl(2.7mM)0.2 지
MgCl2.6H 2O (1 mM)0.203 지
헤페스(5mM)1.19 지
NaHCO3 (12 mM)1 그램
NaH2PO4.2H 2O; 0.3 mM0.05 지
pH를 7.4로 조정합니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.

표 5: 반응 완충액의 원액 제조.

시약분량
30% 소 혈청 알부민(BSA)167 μL
CaCl2, 0.25 미터400 μL
포도당50의 mg의

표 6: 원액으로부터 반응 완충액의 50mL 즉석 용액의 제조.

토론

프로응고제 혈소판에 대한 최근 연구는 여러 질병 1,28,29에서 혈소판의 변화를 강조하고 있으며, 이에 대한 상세한 분석 및 특성화의 중요성을 강조하고있다 30,31,32. 혈소판 프로코아응고제 형성을 평가하기 위한 현재 임상 시험은 제한적이지만, 지난 20년 동안 임상적 관심이 크게 증가했습니다. 예를 들어, 칼슘 의존성 스크램블라제 TMEM16F(ANO6)은 프로응고제 포스파티딜세린(PS) 노출에 관여한다(33). TMEM16F의 변이체는 스콧 증후군(Scott syndrome) 33,34,35)과 관련이 있으며, 이는 인지질 스크램블링(phospholipid scrambling) 장애 및 활성화된 혈소판에서의 트롬빈 생성 감소를 특징으로 하는 희귀 출혈 질환이다(36). 또한, 혈소판 응고제 수치 상승은 혈전성 뇌졸중 및 관상동맥 질환과 관련이 있어 혈소판 응고제 활성을 억제하기 위한 치료법에 대한 관심을 불러일으킨다37. 현재 프로코응고제 혈소판 형성을 평가하는 데 사용할 수 있는 방법 중 Annexin-V 결합 및 미세소포 방출에 의한 PS 노출 평가는 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다38,39.

여기에 설명된 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 PS 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 인간 정제 혈소판의 분리와 응고제 혈소판의 특성 분석을 가능하게 합니다. 건강한 지원자에게 혈액 채취 전 최소 10일 동안 혈소판 기능에 영향을 줄 수 있는 약물을 복용하지 않도록 조언하는 것이 중요합니다. 혈액 채취는 트롬빈 생성과 혈소판 활성화를 유발할 수 있으므로 정맥 외상이나 과도하게 느린 흐름을 피하기 위해 주의가 필요합니다. 소듐시트레이트-항응고혈혈은 세척된 혈소판을 제조하는 데 권장되지 않는데, 이는 잔류 칼슘이 원심분리 중에 트롬빈 생성과 혈소판 활성화를 가능하게 할 수 있기 때문이다17. ACD-항응고혈혈은 pH가 6.5이고 구연산염 농도가 22mmol/L로 더 높은데, 이는 구연산염 항응고혈혈의 pH 7.5 및 13mmol/L 구연산염 농도에 비해 높다17. ACD-항응고 혈액의 산성 pH와 낮은 세포외 칼슘 농도는 혈소판 응집을 방지한다24. 채취 과정에서 트롬빈 생성을 최소화하는 것이 중요합니다. 정맥 정체 또는 과도한 압력을 방지하기 위해 최소 21G 바늘을 사용하는 비외상성 정맥 천자가 권장됩니다. 또한, 처음 몇 밀리리터의 혈액은 조직 인자와 미량의 트롬빈으로 오염되지 않도록 버려야한다 17. 장기간 혈액 저장은 혈소판 활성화로 이어질 수 있으므로 정맥 천자와 샘플 처리 사이의 시간을 최소화하는 것도 필수적이며, 이로 인해 PS 노출 및 미세소포 방출이 증가할 수 있습니다40. 전처리 과정 자체에서 발생할 수 있는 자발적인 혈소판 재활성화를 방지하기 위해 전체 혈소판 전처리 절차 동안 특별한 주의를 기울여야 한다41,17. 또한, 정제된 혈소판을 분리하기 위해서는 다른 혈액 세포에 의한 오염을 주의 깊게 피해야 한다17. 여기에는 깨끗한 준비를 보장하기 위해 혈소판을 원심분리한 후 상층액을 완전히 흡입하는 것이 포함됩니다. 펠릿은 일반적으로 눈에 보이고 튜브 벽에 단단히 부착되어 있기 때문에 피펫 팁을 사용하여 상층액을 쉽게 흡입할 수 있습니다.

원심분리 세척 단계에서 혈소판은 생리학적 조건을 시뮬레이션하는 완충액에 재부유됩니다. 세척된 혈소판을 생리학적 완충액에 사용하면 항응고제 및 혈장으로부터 혈소판을 분리하여 트롬빈 매개 아티팩트를 방지할 수 있습니다. PRP(Platelet-rich Plasma)는 높은 혈소판 농도를 빠르게 얻을 수 있는 방법이지만, 항응고제에 의한 pH 변화와 혈장 활성화에 영향을 줄 수 있는 혈장의 세포외 칼슘 및 단백질 함량으로 인해 기능 연구에 대한 사용이 제한됩니다17. 또한, 혈소판 활성화 중에 생성되는 높은 수준의 PS는 PRP에서 혈장 응고 복합체의 조립, 후속 트롬빈 파열 및 혈전 형성을 촉진하기에 충분하여 실험 결과를 해석할 수 없게 만듭니다. 대조적으로, ATP 및 ADP의 분해를 통한 퓨린성 수용체의 탈감작을 방지하여 혈소판 기능을 유지하기 위해 아피라아제를 함유하는 완충액에서의 재현탁이 권장됩니다42,43. 반복적인 원심분리 및 세척 단계가 더 많은 시간을 필요로 하지만, 이 방법에 의해 제조된 세척된 혈소판의 현탁액은 1-3시간 이하로 안정한 구연산 PRP 제제에 비해 더 큰 안정성(5-8시간)의 이점을 제공한다23.

이 연구는 유세포 분석으로 미세소포를 정량화하는 것의 타당성과 단순성을 보여줍니다. 그러나 미세 소포 생성은 기계의 파편과 소음으로 인해 손실될 수 있습니다. 따라서 유세포 분석기가 광범위한 세척을 거쳤으며 사용된 완충액에 유세포 분석 중에 높은 배경현상을 유발할 수 있는 오염 입자가 포함되어 있지 않은지 확인하는 것이 중요합니다. 또는 작은 입자 검출 기능을 갖춘 특수 유세포 분석기를 사용하여 미세소포 형성을 식별할 수 있습니다. 멤브레인 PS 함량의 기능으로서의 플루오레세인 표지 Annexin-V의 결합도 연구되었으며, 이는 Annexin-V 결합 및 프로코아응고제 혈소판 반응을 위한 완충액 내 충분한 칼슘 농도의 중요한 역할을 강조했습니다44.

시간 경과에 따른 혈소판 샘플의 안정성을 뒷받침하는 데이터는 현재로서는 부족합니다. 여러 실험실에서는 포름알데히드 함유 완충액과 같은 고정 용액을 첨가하여 샘플을 안정화하여 이 문제를 해결했습니다. 갓 채취한 혈소판 검체에 고정제를 추가하면 나중에 분석할 수 있도록 검체를 보존할 수 있는 장점이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 포름알데히드 고정은 인위적으로 증가된 Annexin-V 결합을 유발할 수 있습니다. Rochat et al.은 저농도의 무칼슘 포름알데히드 용액을 사용한 혈소판 고정이 Annexin-V 양성 혈소판의 비율을 변경하지 않는다는 것을 입증했다45. 그러나 고정이 필요한 연구자는 인위적으로 변경된 결과를 유발하지 않도록 특정 프로토콜을 최적화해야 합니다. 그렇지 않으면 샘플을 즉시 처리해야 합니다.

PS에 노출될 수 있는 또 다른 경로는 순환 중인 혈소판 수명을 조절하는 것으로 알려진 과정인 내재적 세포자멸사(intrinsic apoptosis)와 관련이있다 46. pro-apoptotic BAK 및 BAX 단백질을 활성화하면 caspase 활성화가 일어나 PS의 외부화를 촉진하여 혈소판의 in vivo clearance를 유도합니다. 최근에는 Annexin-V 외에 다른 혈소판 표면 마커인 P-selectin/CD62P를 사용하여 procoagulants와 apoptotic platelet을 구별하는 것이 제안되었다47. 프로코아응고제 혈소판은 PS 및 P-셀렉틴 마커 모두에 대해 양성일 것으로 예상되는 반면, 자가사멸 혈소판은 Annexin-V에 대해 양성이지만 P-셀렉틴에 대해서는 음성입니다. 그러나, 시간은 또한 프로코아응고제와 세포사멸 혈소판 사이의 구별 요인이다47. in vitro 에서 프로응고제 혈소판을 생성하는 것은 빠른 과정인 반면, 내인성 세포사멸은48시간이 걸리는 느린 과정입니다. 이러한 맥락에서, 응고제 혈소판을 평가하기 위해 추가 마커를 사용할 필요가 없어 분석법이 단순화됩니다. 세포 내 Ca2+ 및 프로코아응고제 혈소판 형성의 지속적인 증가는 이온단과 같은 매우 강력한 작용제 또는 콜라겐 및 트롬빈과의 결합 활성화로 몇 분 내에 발생하는 반면, BCL-XL 억제제(또는 BH3 모방)는 pro-apoptotic BAK 및 BAX를 활성화하여 자가사멸 혈소판의 형성을 유발하여 미토콘드리아 외막 투과화, 시토크롬 C 방출을 유발하고, 및 카스파제 활성화49.

결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 표준 실험실 장비 및 유세포 분석을 사용하여 정제된 혈소판의 분리 및 응고제 활성에 대한 후속 특성 분석을 용이하게 합니다. 이 절차는 환자 혈액 샘플의 프로코아응고제 혈소판에 대한 향후 연구를 위한 길을 열었으며, 희귀한 스콧 증후군50의 진단과 같은 임상 실습에서의 잠재적인 응용 분야를 제공합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(CD42b, GPIX) APC벡크만 쿨터B13980
ACD-A 혈액 채취 튜브BD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen 560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
소 혈청 알부민 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
구연산 일수화물Merck5949-29-1
콜라겐 Stago86924
포도당 시그마-알드리치G8270
헤페스 시그마-알드리치H3375
이오노포어 Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
탄산수소Merck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trisodium citrate dihydrate 시그마-알드리치G8270Na3C6H5O7*2H2O
α IIb 인테그린(CD41, GPIIb) PC7벡크만 쿨터6607115
나트륨

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