방법 논문

68ga 표지 나노 분자의 방사선 합성, 품질 관리 및 소동물 양전자 방출 단층 촬영 이미징

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DOI:

10.3791/67048

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2024년 10월 4일

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1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

이 논문에서

요약

이 논문은 새로운 방사성 표지 프로브(즉, 68Ga-표지된 나노바디 NM-02)의 방사선 합성, 제형, 품질 관리 및 이종 이식 모델에서 소동물 PET/CT 이미징에 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

소동물 양전자 방출 단층촬영(PET) 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 이미징 기술은 전임상 암 연구에서 매우 중요하므로 방사성 추적자 합성, 품질 보증 및 생체 내 주입 프로토콜에 대한 세심한 주의가 필요합니다. 이 연구는 소동물 PET 실험의 견고성과 재현성을 향상시키기 위해 맞춤화된 포괄적인 워크플로우를 제시합니다. 68Ga를 사용한 방사화학 실험실의 합성 공정은 상세하며, 각 방사성 추적자 생산에 대한 엄격한 품질 관리 및 보증 프로토콜을 강조합니다. 농도, 몰 활성도, pH 및 순도와 같은 매개변수는 인간 연구에 적용할 수 있는 표준에 따라 엄격하게 모니터링됩니다. 이 방법론은 간소화된 주사기 준비와 마우스에 대한 정확한 정맥 주사를 위해 맞춤형으로 설계된 30G 캐뉼라를 도입합니다. 스캔 중 체온 및 심박수를 포함한 동물 건강을 모니터링하여 절차 전반에 걸쳐 동물의 건강을 보장합니다. PET 및 SPECT 스캔의 선량은 동물 및 연구자에 대한 방사선 노출을 최소화하면서 데이터 수집의 균형을 맞추기 위해 미리 결정됩니다. 마찬가지로, CT 스캔은 방사선 노출을 제한하기 위해 사전 프로그래밍된 설정을 사용하며, 특히 치료 효과를 평가하는 장기 연구와 관련이 있습니다. 이러한 단계를 최적화함으로써 워크플로우는 절차를 표준화하고 변동성을 줄이며 소동물 PET/SPECT/CT 영상의 품질을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 이 리소스는 분자 이미징에서 전임상 조사의 정확성과 신뢰성을 개선하여 궁극적으로 이 분야를 발전시키고자 하는 연구자에게 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서론

가장 관련성이 높은 주제 중 하나는 유방암 분야의 연구입니다. 유방암은 여전히 빈번하게 발생하는 암으로 여성에서 발생하는 모든암의 약 1/3을 차지합니다. 치료는 종양의 생물학적, 조직학적 특성과 질병의 단계에 맞게 조정됩니다. 종양이 이미 전이되지 않는 한 생존 확률은 일반적으로 양호하며, 이 경우 5년 생존율은 약 30%에 불과합니다1. 다른 부인암도 비슷한 운명을 겪고 있는데, 예를 들어 난소암은 1기 종양의 5년 생존율이 95%> 나타났지만, 전이된 4기 종양의 경우 15%에 불과했다 2,3.

비침습적 영상, 특히 양전자 방출 단층촬영(PET)은 신진대사, 수용체 발현 및 치료 반응과 같은 종양 분자 측면에 대한 탁월한 통찰력을 제공하면서 암 연구를 변화시키고 있습니다 4,5,6. 이를 통해 특정 대사 영역의 시각화 및 정량화가 가능하여 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 매우 짧은 시점에서 (새로운) 치료법의 효과를 모니터링할 수 있습니다. 실제로, PET는 1-3회의 치료 주기 후에 반응과 무반응을 평가할 수 있으며, 기존의 컴퓨터 단층 촬영(CT) 영상에서 볼 수 있는 형태학적 변화에 비해 더 빠르고 더 나은 평가를 할 수 있다7. PET의 비침습적 특성은 종단 연구도 가능하게 합니다.

모든 동물 모델은 새로운 (방사성) 의약품의 치료 능력을 철저히 평가하기 위해 최대한의 표준화가 필요하므로 종양 모델 생성과 소동물 PET 이미징/데이터 분석 모두에서 이에 중점을 두어야 합니다. 동물에서 가장 좋은 종양 모델(피하 접종 또는 정소성 이식, 생쥐, 인간 또는 신유전 종양, 일상적인 임상 치료를 동반하거나 동반하지 않음)에 대해 논쟁할 수 있지만, 그것은 이 출판물의 목표를 벗어납니다. 암 연구를 위해 여러 모델이 사용되었으며, 여기에 설명된 모델은 비교적 간단한 피하 모델입니다.

방사화학의 품질 관리는 동물 안전과 치료 효과에 가장 중요합니다. 이것은 방사성 의약품 자체뿐만 아니라 제품 제형에도 영향을 미칩니다. 임상용 방사성의약품 생산에 관한 광범위한 법률이 있으며, 8,9 (현행 법률과 지침에 대한 자세한 개요는 10 참조), 전임상 연구를 위한 방사성의약품의 특성에 대한 몇 가지 지침이 있습니다(자세한 개요는 11 참조). 우리는 임상 및 전임상 응용 모두를 위한 방사성 의약품을 생산하며, 임상 응용 분야를 위한 합성에서 발견되는 고급 품질 관리에서 전임상 응용 분야를 위한 합성으로의 번역을 단순화합니다.

우리의 연구 초점은 지시된 테라노스틱스, 특히 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 양성 암에 대한 것입니다. 따라서 우리는 치료 중 암을 진단하고 모니터링하기 위해 새로운 방사성 의약품을 개발합니다. 성공적인 진단용 방사성 의약품은 다양한 방사성 동위원소를 사용하는 치료용 화합물로도 평가됩니다. 이러한 방사성 의약품의 평가는 먼저 동물 모델에서 수행되며, 유망한 전임상 결과를 얻은 후 임상 번역을 위해 노력하고 있습니다. 이 기사에서는 분자 이미징에서 전임상 조사의 정확성과 신뢰성을 향상시키기 위해 마우스 정맥 주사 및 PET/CT 스캔에 대한 표준 관행뿐만 아니라 품질 관리 및 보증을 보장하기 위해 사용되는 프로토콜(예: One Radiopharmaceutical)을 제시합니다. 프로토콜은 방사화학(추적자 합성 및 품질 관리), 동물 모델 생성(피하 종양 모델) 및 이미징의 세 가지 섹션으로 나뉩니다.

프로토콜

연구 프로토콜은 최고 수준의 동물 복지를 준수하며 RWTH Aachen 대학병원의 동물 관리 지침을 엄격히 준수합니다. 우리는 연구에 관련된 모든 동물에 대한 윤리적이고 인도적인 대우를 보장하기 위해 최선을 다하고 있으며, 절차는 지역 동물 윤리 위원회에서 검토하고 승인합니다. 모든 동물 실험은 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 대한 규정과 함께 동물 보호법을 준수하기 위해 독일 관할 당국(Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV)의 승인을 받았습니다.

참고: 이 연구 전반에 걸쳐 사용된 장비, 재료 및 시약의 전체 목록은 재료 표에 나와 있습니다. 68Ga의 취급은 가능할 때마다 피펫으로 수행해야 하며 철은 라벨링 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로 금속을 피해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 방사성 화학 절차가 완료될 때까지 주사 바늘을 사용하지 말아야 한다는 것을 의미합니다.

1. 방사화학과

  1. 68Ga를 사용한 NM-02-DOTA-GA의 방사성 표지
    주의: 이 프로토콜은 방사성 물질의 취급 및 조작을 포함합니다. 연구자는 방사성 물질 취급에 관한 현지 법률, ALARA(합리적으로 달성 가능한 최소) 관행을 따르고, 납 차폐 작업을 하고, 직접 접촉 시간을 최소화하고, 방사선 노출의 각 단계에서 최대 거리를 유지해야 합니다. 방사능 검출 장치로 실험 절차를 모니터링해야 합니다.
    1. 68Ge/68Ga-Generator를 10mL의 0.6M HCL(1.2GBq/10mL)로 수동 또는 자동으로 용리합니다. 카트리지를 통해 용리액을 통과시켜 PS-H+ 카트리지(크기 M - 0.8mL)에 68Ga를 트랩합니다. 총 1mL의 4M NaCl이 있는 PS-H+ SPE 카트리지를 단계적으로 천천히 마이크로 원심분리기 튜브에 용리합니다.
    2. 용리액의 처음 0.3mL를 버리고 나머지 0.7mL를 다른 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.
    3. 새 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 명시된 대로 NM-02-DOTA-GA의 방사선 라벨링을 진행합니다.
      참고: 나노바디-킬레이터 접합체(NM-02-DOTA-GA)는 이전에 공급업체의 프로토콜에 따라 제조되었습니다. 접합체는 -80°C의 부분 표본에 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 최대 5μL의 3M NH4OAc를 사용하여 제품의 pH를 약 7로 조정합니다.
  2. 품질 관리
    1. 올바른 설정(동위원소로 68Ga, 1 mL 주사기, 기하학적 0.1 mL)에서 활동계를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 농축된 샘플의 활성을 측정합니다. 방사성 화학 수율 (충치 보정)은 40 % 이상이어야합니다.
    2. pH 테스트 스트립(0-14)에 충분한 양을 찾아 pH 테스트 스트립(10-15μL)으로 pH를 측정합니다.
    3. 박층 크로마토그래피(TLC)
      1. 실리카 함침 TLC 스트립에서 방사성 표지 반응 혼합물 1 μL를 발견합니다. 부분 표본을 약 1분 동안 건조시킵니다. 밀폐된 TLC 챔버에서 약 2-3mm로 미리 채워진 시트르산을 이동상으로 사용하여 TLC를 실행합니다. 액체가 스트립 상단에 도달했을 때 챔버에서 TLC 스트립을 제거합니다.
      2. TLC 스트립을 라디오-TLC 스캐너에 놓고 제조업체의 프로토콜에 따라 측정합니다. 생성물은 원점(Rf < 0.2)에 나타나야 하며, 자유 68Ga 양이온은 용매 전면(Rf > 0.9)으로 용리됩니다.
      3. 방사성 크로마토그램을 사용하여 Rf 0.0-0.2의 AUC(Integrated Area Under the Curve)를 총 AUC(Rf 0.0-1.0)로 나누고 100을 곱하여 반응의 방사성 표지 수율을 계산합니다.
    4. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
      1. 모든 라인이 침수될 수 있도록 올바른 용매를 사용하여 HPLC가 최소 10분 동안 작동했는지 확인하고 측정 설정을 조정하십시오. 아세토니트릴(용매 A)과 트리플루오아세트산(1mL) 및 시트레이트 용액(20mL)과 결합된 0.9% NaCl 용액(980mL)의 혼합물을 50:50 혼합물의 등용매 흐름을 사용합니다.B. 280nm에서 UV 흡광도를 측정합니다.
      2. 생성물 5μL를 취하여 15μL의 0.9% NaCl로 희석합니다. 혼합물 15μL를 분석용 방사성 HPLC(5μm SEC-s2000 154 Å 컬럼, 유속: 2mL/분)에 주입합니다.
      3. 아세토니트릴(용매 A)과 트리플루오아세트산(1mL) 및 시트레이트 용액(20mL)과 결합된 0.9% NaCl 용액(980mL)의 혼합물을 50:50 혼합물의 등용매 흐름을 사용합니다.B. 280nm에서 UV 흡광도를 측정합니다. UV와 감마 채널 사이의 머무름 시간에 약간의 변화가 있습니다. 이는 HPLC의 설계 때문입니다(감마 신호는 UV 검출기 뒤에 직렬로 설치됨).
      4. 방사성 화학적 순도는 감마 채널의 피크를 적분하여 측정합니다. 생성물은 이전에 non-radiolabeled 나노바디를 측정하여 결정된 통합 범위에 있어야 합니다. 또한 감마 채널의 다른 모든 피크를 적분하고 불순물로 평가합니다. 순도는 >95%여야 합니다.
    5. 내독소
      1. (인증된) 내독소가 없는 물을 사용하여 총 부피 150μL로 제품을 1:20 희석하여 희석합니다.
      2. 필요한 모든 시약이 시중에서 판매되는 일회용 내독소 카트리지를 내독소 검사 리더기에 삽입하고 각 카트리지 챔버에 희석된 제품 25μL를 로드합니다.
      3. 재생을 누릅니다. PTS는 내부 양성 및 음성 통제가 있으며 최종 보고서에 포함될 것입니다. 테스트는 약 15분 정도 소요됩니다. 내독소 함량이 Vmax = 20mL에서 8.7 EU/mL <인 경우 제품은 내독소가 없는 것으로 간주됩니다.
    6. 후향적 무균
      1. 품질 시료를 주입하고 채취한 후 방사성 의약품을 멸균 바이알에 담아 4°C의 냉장고에 보관합니다.
      2. 10,5 Bq 또는 10 Bq/g의 면제 한도를 초과하지 않는 경우 무균 분석을 위한 인증된 기관(사내 또는 외부 기업)에 샘플을 인계하여12에 따른 무균 테스트를 수행합니다.
  3. 주사기 준비(동물당 1개)
    1. 올바른 설정(동위원소로 68Ga, 주사기 1mL, 기하학의 경우 0.1mL)에서 활동도계를 사용하여 제품의 활성을 측정합니다.
    2. 마이크로 원심분리기 튜브에 생성물 15MBq(약 25μL)를 넣고 0.9% NaCl - 75μL로 부피를 채웁니다.
    3. 주사기에 50μL를 추가하고 올바른 설정(동위원소로 68Ga, 주사기 1mL, 기하학의 경우 0.1mL)에서 활동계를 사용하여 측정합니다. 주사기에는 10MBq의 제품이 들어 있어야 합니다.
      참고: 68Ga 표지 나노바디 NM-02가 형성되는 즉시 68Ga를 취급할 때 플라스틱 피펫 팁이 더 이상 필요하지 않습니다. 여기서부터 프로토콜에서 액체 취급을 언급할 때마다 적절한 주사기(1mL)와 바늘(27-30G)을 사용하십시오.

2. 동물 모델 생성

  1. 동물 사육
    1. 피하 종양 발생을 위해 생후 6-8주령에 암컷 면역결핍 Rj: ATHYM-Foxn1nu/nu 마우스(상용 공급업체에서)를 사용합니다. 도착하면 모든 생쥐를 동물실에 직접 수용하고 순응을 위해 이송 후 최소 1주일을 제공합니다.
    2. 동물을 12시간 조명/12시간 어둠 주기로 수용하고 음식과 물을 무료로 이용할 수 있습니다. 실내 온도와 상대 습도를 각각 20-25 °C 및 45%-65% 사이로 유지하십시오.
  2. 이식을 위한 세포의 준비
    1. 1 x 106 SKOV-3 세포로 세포 배양을 시작하고 T175 세포 배양 플라스크에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 농축된 25mL의 예열 DMEM/F12 배지를 추가합니다.
    2. 37°C 및 5% CO2 의 인큐베이터에서 세포를 배양하고 일주일에 최소 2회 전체 배지를 교체하십시오.
    3. 세포 이식 1주일 또는 늦어도 1일 전에 세포 배양 플라스크에서 배지 20μL를 채취하여 마이코플라스마13을 검사합니다. 세포 주입에는 마이코플라스마 음성 세포만 사용하십시오.
    4. 세포 주입 당일, 전체 배지를 흡인하고 PBS 5mL를 병에 피펫팅합니다. 병을 앞뒤로 여러 번 휘젓어 남은 매체를 씻어냅니다.
    5. 플라스크에 트립신 3mL를 추가하고 37°C 및 5% CO2 의 인큐베이터에서 4분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 세포 배양 플라스크에서 세포가 분리되었는지 40배 배율로 현미경 아래를 확인합니다.
    6. 7mL의 배지를 첨가하여 트립신 활성을 중화하고 세포 현탁액을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    7. 150 x g 에서 5분(실온에서) 세포를 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 상층액을 제거하고 배지 1mL를 첨가하여 세포를 재현탁시킵니다.
    8. 마이크로 원심분리 튜브에 세포 현탁액 12μL를 넣고 동일한 양의 트리판 블루를 추가합니다. 혈구계 챔버에 10 μL의 신중하게 혼합된 세포 현탁액을 로드합니다.
    9. 정의된 영역 내에서 염색되지 않고 생존 가능한 세포를 계수하고 세포 수를 계산합니다. 세포 농도를 5 x 107 cells/mL 배지로 조정하고 세포 현탁액을 1mL의 기저막 매트릭스와 조심스럽게 혼합합니다.
    10. 각 마우스에 대해 1mL 인슐린 주사기에 50% 기저막 매트릭스가 있는 0.2mL 세포 배지에 있는 5 x 106 세포를 채취합니다. 기저막 매트릭스의 응고를 방지하기 위해 주입할 때까지 주사기를 얼음 위에 두십시오.
      알림: 마우스의 무게가 20g 미만인 경우 혼합물을 150μL(15-20g의 경우) 또는 100μL(10-15g의 경우)만 주입하십시오. 피하 적용의 경우 GV-SOLAS에서 권장하는 최대 체중 10mL/kg14를 초과하지 않도록 주의합니다.
  3. 접종 및 후속 조치
    1. 한 손으로 목과 꼬리를 고정하여 깨어 있는 동물의 옆구리에 세포 현탁액을 피하로 주입합니다. 일반적으로 우리는 왼쪽 측면에 주사하는 것을 선호합니다.
    2. 기저막 매트릭스가 굳을 때까지 10-15초 동안 기다린 다음 바늘을 제거합니다.
    3. 디지털 캘리퍼를 사용하여 두 개의 수직 종양 축을 측정하여 이식 후 매일 종양 성장을 모니터링합니다.
    4. 이러한 측정값을 사용하여 다음 공식으로 계산된 종양 부피를 사용하여 종양 성장을 평가합니다.
      VT = L × B2 × π / 6
      여기서 V T는 종양의 부피(mm)3, L은 종양의 길이(mm, 즉, 두 개의 수직 축 중 큰 축), B는 종양의 너비(mm)입니다(즉, 두 개의 수직 축 중 작은 축(15). 이 기술은 피부도 포함하기 때문에 종양의 부피를 과대평가하는 경향이 있습니다.
    5. 종양 질량은 전자 저울에서 측정할 때 마우스의 무게에 영향을 미칩니다. 종양 질량에 대해 보정된 동물의 무게를 계산하려면 다음 공식을 사용하십시오.
      m마우스 -T = m마우스 - 0.82 × VT
      여기서 , m,mouse-T 는 종양 질량을 제외한 마우스 무게(g)이고, m마우스 는 전자 저울에 따른 마우스 무게(g)이며, V, T 는 계산된 종양 부피(mm3)입니다. 숫자 0.82 g / mm3 는 이전 동물 실험에서 분리 된 일련의 종양의 평균값에서 유래 한 것으로, 무게를 측정하고 주어진 공식을 사용하여 부피를 결정했습니다. 이는 평균 종양 밀도를 나타냅니다.
    6. 또한 마우스와 비교하여 종양이 얼마나 큰지 확인하고 다음 공식을 사용하여 종양 부담을 모니터링합니다.
      종양 부담 [%] = (0.82 × VT) / m마우스 × 100
      여기서 종양 부담은 백분율로 표시되며, 0.82 × VT는 g 단위의 종양 질량(즉, VT, 계산된 종양 부피(mm3, 평균 종양 밀도의 곱하기)에 해당하고, m마우스는 g의 척도에 따른 마우스 체중입니다.
    7. 동물의 종양 부피가 200mm3 이상에 도달하면 실험에 따라 비침습적 PET/CT 또는 SPECT/CT로 일정을 잡습니다.

3. 이미징

  1. 주사기 준비(맞춤형 시스템)
    알림: 마우스 꼬리가 작습니다. 따라서 27G 캐뉼라 이하의 사용이 필요합니다(숫자가 클수록 바늘이 작음). 암컷 마우스의 경우, 볼루스 주사를 위해 접근할 수 있는 유일한 정맥은 세 개의 꼬리 정맥입니다. 해부학적으로 등쪽 꼬리 정맥은 두 개의 측면 정맥에 비해 척추에 더 가깝습니다. 의인성 뼈 긁힘을 피하기 위해 이 정맥에 주입하지 마십시오. 경험에 비추어 볼 때 30G 캐뉼라를 사용하면 더 작은 정맥에도 접근할 수 있으므로 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 30G 카테터는 구매할 수 없기 때문에 이 유형은 연구원이 주의해서 제작해야 합니다.
    1. 계획된 투여 경로에 따라 방사성 추적자로 주사기를 준비합니다. 정맥 주사의 경우 25g 마우스에 대해 최대 5mL/kg 체중이 투여되는지 확인하십시오. 이는 최대 주입 부피가 125μL임을 의미합니다.
    2. 30G 카테터를 준비하려면 먼저 30G 바늘을 사용하고 금속 가위로 또는 플라스틱에서 구부려 금속 바늘 샤프트를 제거합니다.
    3. 0.3mm 직경의 PE10 튜브를 허브에서 제거한 샤프트 부분에 수동으로 삽입합니다. 튜브에 구멍이 뚫리지 않도록 주의해야 합니다.
      알림: 다른 유형의 플라스틱도 사용할 수 있습니다. 그러나 PE10은 벽 강성과 유연성 사이에서 최상의 균형을 제공합니다.
  2. 정맥 주사
    참고: 정맥 주사는 깨어 있는 동물에서도 수행할 수 있습니다. 그러나 이것이 필요하지 않은 경우 연구 동물의 부담을 줄이기 위해 동물에게 이소플루란 진정제를 주입해야 합니다.
    1. 30G 카테터를 0.9% NaCl 완충액 또는 기타 원하는 완충액으로 채웁니다.
    2. 마우스를 유도 챔버에 넣고 동물이 오른쪽 반사를 잃을 때까지 산소(또는 의료용 압축 공기)와 기체 이소플루란의 혼합물을 계속 채웁니다. 인덕션의 경우 0.8L/min의 산소 또는 공기 흐름으로 3.5%-5% 이소플루란을 사용합니다.
    3. 즉시 진정제를 투여한 마우스를 콧스코를 통해 이소플루란 진정제를 유지하면서 가열 매트(37-38°C)의 초기 복부 위치에 놓습니다. 마우스에 과열 징후(예: 과도한 스트레칭, 빠른 호흡, 피부 발적)가 있는지 자주 확인하십시오. 마취 유지를 위해 0.8L/min의 산소 또는 공기 흐름으로 1.8%-2.5% 이소플루란을 사용하십시오.
    4. 진정 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 바르십시오. 양쪽 측면 꼬리 정맥을 검사하고 주사에 가장 적합한 정맥을 선택합니다. 정맥의 가시성과 직경을 고려해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 선택한 정맥이 가열 매트와 접촉하도록 꼬리를 약간 회전하고 정맥이 1분 동안 확장되도록 합니다.
    5. 선택한 정맥이 위쪽으로 오도록 전체 마우스를 측면 위치로 돌립니다. 꼬리의 끝과 밑부분을 테이프로 고정합니다.
    6. 주로 사용하는 손으로 30G 카테터를 잡고 주로 사용하지 않는 손의 검지 손가락을 선택한 정맥에 부드럽게 올려 놓아 내부에 혈액을 백업합니다. 백업 부위에서 정맥이 확장되어 작은 혹을 형성합니다.
    7. 주로 사용하는 손으로 30G 카테터를 정맥의 혹을 향하는 꼬리와 평행하게 놓습니다. 주로 사용하는 핸드를 앞으로 움직입니다. 대부분의 경우 이 기술은 직접적인 정맥 천자를 보장합니다.
    8. 정맥 내부로 들어가면 플라스틱 튜브에서 혈액 역류가 보입니다. 주사 중에 바늘이 정맥 내부로 움직이지 않도록 플라스틱 튜브를 고정합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에서 30G 바늘에 연결된 추적 주사기를 삽입합니다.
      참고: 추적자의 동적 분포를 평가해야 하는 경우, 동물을 PET 스캐너 베드에 놓고 PET를 시작한 후 다음 사항을 수행해야 합니다.
    9. 추적 주사기의 내용물을 최소 10초 동안 천천히 주입합니다. 30G 바늘을 30G 카테터 시스템에 연결한 상태에서 추적 주사기만 제거하고 0.9% NaCl 버퍼(또는 기타 원하는 버퍼)가 있는 주사기를 연결하여 카테터를 플러시합니다. 주사 절차 중 호흡을 지속적으로 모니터링하고 이소플루란 농도를 조정하여 약 초당 1회 호흡을 유지합니다.
    10. 꼬리 정맥에서 30G 카테터를 제거하고 멸균 면 찜질을 사용하여 출혈을 멈춥니다.
    11. 남은 활성을 측정하려면 30G 카테터, 완충 주사기, 빈 추적 주사기 및 면 찜질을 측정하십시오.
  3. PET/CT 획득
    참고: 68Ga 표지 나노바디 NM-02의 경우 모든 동물은 작은 동물 PET/CT 시스템으로 이미지화됩니다.
    1. PET 인수
      1. 진정제를 투여한 쥐를 동물 침대의 복부 위치에 놓고 PET 스캐너에 부착합니다. PET의 콧방울로 이소플루란 흐름을 전환하고 0.8L/분의 의료용 공기 중에서 1.5%-2.5% 이소플루란으로 유지하여 스캔 중 동물의 호흡 속도가 분당 75회에서 50회 사이가 되도록 합니다.
      2. 의료용 테이프로 목 뒤의 마우스를 동물 침대에 고정합니다. 필요한 경우 진정 중 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 다시 한 번 바르십시오.
      3. 동물 침대의 가열 패드를 약 80 % 전력으로 켜십시오.이 전력은 약 30 ° C에 해당합니다.
      4. 획득 시간을 45분으로 설정하고 스캔할 관심 영역을 선택합니다. 68Ga 를 연구 동위원소로 선택하고 스캔을 시작합니다. 주입된 활성량, 주입 시간, 빈 주사기의 측정 시간을 입력합니다. 하나의 PET 베드 위치는 160mm로, 전신 마우스 스캔에 충분한 길이입니다.
      5. 추적자의 동적 분포를 평가해야 하는 경우 먼저 PET 스캔을 시작하고 수집을 위해 30초 동안 기다린 다음 3.2.9-3.2.10단계를 진행합니다. 추가 출혈을 방지하기 위해 완충 주사기가 부착된 상태로 마우스에 카테터를 그대로 두십시오. 인공물을 피하기 위해 CT 획득 전에 PET가 끝날 때 카테터를 분리할 수 있습니다.
    2. CT 획득
      1. PET 스캐너에서 동물 침대를 분리하고 즉시 CT 스캐너에 연결하십시오. 필요한 경우 꼬리 정맥에서 캐뉼러를 분리하십시오. 정맥 천자 후 최소 30분 후에는 주사 부위가 이미 응고되어 더 이상 출혈이 발생하지 않습니다.
      2. 이소플루란 흐름을 CT 스캐너의 콧방울로 전환합니다.
      3. PET 이미징을 위해 스캔할 동일한 관심 영역을 선택합니다. 표준 획득 프로토콜 선택: 440 μA, 50 kVp, 32 ms 노출 시간 및 960 노출/360°의 나선형 모드에서 1080° 회전; CT 스캔 시간은 전신 마우스 스캔의 경우 약 7분입니다.
      4. 호흡수를 조절하고 동물 침대의 발열 패드를 켭니다. 스캔하는 동안 호흡을 지속적으로 모니터링하고 분당 75회에서 50회 사이의 호흡 속도를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 조정합니다.

4. 포스트 이미징 동물 관리

  1. 스캔이 끝나면 동물이 깨어나는 데 최소 15분이 걸립니다. 새끼 새끼의 공격을 피하려면 약 15분 동안 또는 원래 수용 케이지에 다시 넣을 때까지 스스로 걸을 수 있을 때까지 동물을 혼자 우리에 가두십시오. 이 기간 동안 저체온증을 피하기 위해 적외선을 사용하십시오.
  2. 처음에는 혈역학적 쇼크를 피하기 위해 동물을 왼쪽(안전한 위치)에 눕힙니다. 안과 연고는 동물이 깨어나면 스스로 제거하므로 그대로 두십시오.

5. PET/CT 재건술

  1. 192 × 192 × 384 매트릭스에서 511keV의 피크에서 0.4mm의 등각 복셀 크기까지 ± 15%의 에너지 창으로 3차원 정렬된 하위 집합 기대값 최대화(즉, 30회 반복되는 OSEM-3D)를 사용하여 PET 재구성을 수행합니다. CT 기반 보정(예: 감쇠 보정, 산란 보정, 데드 타임 및 무작위 이벤트)을 PET 재구성에 적용합니다.
  2. 트레이서의 동적 분포를 평가해야 하는 경우 다중 프레임 재구성을 적용합니다. 예를 들어, 45분 스캔에 사용할 수 있는 프레임은 4 x 30초, 3 x 1분, 5 x 2분, 2 x 5분 및 2 x 10분입니다.
  3. 반복 재구성 알고리즘(즉, ISRA) 재구성 프로세스를 사용하여 200 × 200 × 425 매트릭스에서 0.2mm의 등각 복셀 크기로 CT 표준 획득 프로토콜을 재구성합니다. 공급업체 소프트웨어를 사용하여 다음 공식을 사용하여 CT 값을 Hounsfield 단위(HU)로 변환합니다.
    figure-protocol-1
    여기서 μW 는 물의 선형 감쇠 계수, μA 는 공기의 선형 감쇠 계수, μt 는 조직의 선형 감쇠 계수입니다.
  4. PET 및 CT 이미지는 모세관 팬텀 스캔에서 생성된 매트릭스를 사용하여 재구성 후 자동으로 정렬되었습니다. 재구성된 모든 데이터를 보관하고 필요에 따라 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터베이스 서버로 전송합니다.

6. 이미지 처리 및 분석

참고: 공동 등록된 PET/CT 이미지는 각 하이브리드 스캔이 주제로 저장되는 이미지 분석 소프트웨어의 데이터베이스 서버 내에서 정량화에 추가로 사용됩니다.

  1. CT를 기반으로 종양을 식별하고 이를 관심 영역으로 선택합니다. CT에서 종양 기저를 수동으로 마스킹합니다.
  2. 사용자 독립적인 분할을 달성하려면 PET 또는 SPECT에서 새로 형성된 종양 마스크의 임계값을 설정합니다. PET 사용의 경우 최소 임계값 1.0 표준화 흡수 값(SUV)을 사용합니다. SPECT의 경우, 심장 또는 말단 복부 대동맥에서 측정된 평균 혈액 풀 흡수량보다 높은 최소 임계값을 사용합니다.
  3. 평균, 최대, 가장 인기 있는 10 복셀의 평균(즉, 뜨거운 평균 10) 및 새로 생성된 관심 볼륨의 총 흡수를 기록합니다.
  4. 이러한 값을 사용하여 통계 분석에 추가로 사용될 SUV 및 TBR(Target-to-Background) 값을 생성합니다.

결과

방사성 의약품의 품질 관리에서 가장 중요한 측면 중 하나는 HPLC를 사용하는 것인데, 이는 화학적 및 방사성화학적 순도(이 경우 98.2%)를 보여줄 뿐만 아니라 용출 시간과 피크 모양을 비방사성 참조 화합물과 비교하여 방사성 의약품의 정체를 증명할 수 있기 때문입니다. 이 참조 화합물은 이 경우 라벨링되지 않은 나노바디로, 질량 분석법 또는 핵 자기 공명과 같은 고전적인 기술에 의해 올바른 화합물로 입증되었습니다. 이러한 기술은 방사성 화합물에 직접 적용할 수 없지만(신호를 생성하기에 충분한 질량이 없음) 방사성 화합물을 참조와 비교함으로써 올바른 화합물이 실제로 표지되었으며 합성 중에 변경되지 않았다는 충분한 증거를 수집할 수 있습니다. HPLC 흐름의 연속 측정에 해당하는 방사성 생성물과 그림 1의 참조 항목 사이의 머무름 시간의 사소한 차이에 유의하십시오(UV가 먼저 측정된 다음 일반적인 설정에서 흐름이 방사능 검출기에 도달하는 데 약 0.2분이 필요함).

figure-results-1
그림 1: 68Ga-표지 나노바디 NM-02(GLNM-02)의 품질 관리를 위한 일반적인 분석용 HPLC 크로마토그램. 저온 화합물의 UV 흡광도(즉, 상부 패널)는 280nm에서 측정되며 0.22분의 이동으로 4.18분에서 피크를 보여줍니다. 68Ga 표지 제품의 피크는 감마 검출기 (즉, 하부 패널)에서 볼 수 있습니다. 방사성 화학 수율은 98.2 %입니다. mAU = 밀리 흡광도 단위, NM-02 = 당사 제품, UV = 자외선 채널, nm = 나노미터, 최소 = 분, CPS = 초당 카운트, GLMN-02 = 68Ga-표지 나노바디 NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = 감마 채널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

HPLC가 없거나 HPLC에 추가되는 경우, TLC를 사용하여 최종 제품의 라벨링 수율 및 순도를 결정할 수 있습니다(단, 동일성은 아니며 HPLC만큼 상세하지 않음). 복잡성이 낮기 때문에 TLC는 방사선 합성 경로가 아직 최적화되고 있을 때 이상적입니다. 그림 2 는 68Ga 표지 나노바디 NM-02(겉보기 방사성화학적 순도 99.9%)의 TLC 크로마토그램을 보여줍니다.

figure-results-2
그림 2: 68Ga-표지 나노바디 NM-02(GLNM-02)의 품질 관리를 위한 일반적인 분석 TLC 크로마토그램. 면적 계수는 TLC 플레이트의 용매(구연산염)가 이동한 거리에 대해 표시됩니다. R.f 는 0.2, 방사성 화학 순도는 99.9 %입니다. C = 개수, mm = 밀리미터, GLNM-02 = 68Ga 표지 나노바디 NM-02, TLC = 박층 크로마토그래피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

게시를 위한 이미징 데이터를 준비하는 과정에서 하나 이상의 독립형 CT 및 PET 이미지를 표시하는 것이 표준 관행입니다. 이 접근 방식을 통해 추적자 생체 내 분포를 종합적으로 평가할 수 있습니다. 표준 CT 스케일링은 -1000HU에서 1000HU 사이이며, 이를 통해 단일 창 내에서 모든 연조직을 시각화할 수 있습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 이 방법은 마우스 신장의 경계를 명확하게 구분하는 동시에 뼈 평가를 가능하게 합니다.

PET 스케일의 경우 최소 상한 임계값 1.0을 유지하면서 SUV의 하한 임계값을 0.0으로 설정하고(그림 3B), SUV 계산 중에 체중 정규화를 사용하는 것이 좋습니다(즉, SUVbw). 또한 정량화의 경우 SUVmax에 비해 SUVmean이 선호됩니다. SUVmax를 사용하는 경우 SUVBW 계산에서 가장 뜨거운 단일 복셀의 값 대신 가장 뜨거운 10 복셀의 평균을 사용합니다. CT 및 PET 슬라이스를 병합하여 PET/CT 이미지의 특징 융합을 준비합니다(그림 3C).

또한 독자가 전신 추적자 생체 내 분포를 독립적으로 평가할 수 있도록 PET 절편과 동일한 척도를 사용하여 동일한 PET 스캔의 최대 강도 투영을 제시할 수 있습니다(그림 3D).

figure-results-3
그림 3: 피하 SKOV-3 종양 보유 마우스의 생체 내 PET/CT 이미지. 이미지는 5MBq 68Ga 표지 나노바디 NM-02(GLNM-02)의 정맥 주사 후 3시간 후에 획득되었습니다. (A) CT 이미지는 -1000HU에서 1000HU 사이로 조정되는 반면, (B) PET 이미지는 0.0에서 5.0 사이의 SUV입니다. (C) PET/CT 융합은 동일한 스케일을 사용합니다. (D) 최대 강도 투영(MIP) PET 이미지도 SUV 0.0 및 5.0을 사용하여 확대/축소됩니다. 모든 PET 이미지는 GLNM-02의 양호한 종양 흡수를 보여주며, 신장 청소율이 명확하게 보입니다. CT = 컴퓨터 단층 촬영, PET = 양전자 방출 단층 촬영, MIP = 최대 강도 투영, HU = 하운스필드 단위, SUV = 표준화 흡수 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

68Ga-표지된 나노바디 NM-02의 특정 사례에서는 마우스의 왼쪽 측면에서 현저한 종양 흡수가 관찰될 수 있습니다. 또한 추적자의 신장 청소도 분명합니다. PET 최대 강도 투영을 제시함으로써 방광 활동도 볼 수 있게 되어 추적자의 신장 청소를 강화합니다. 이 특별한 경우에는 신장, 종양 및 방광을 동일한 2D 슬라이스에 표시할 수 없다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 출판물에 최대 강도 투영을 포함하면 추적자의 전체 생체 분포가 동일한 이미지에 표시됩니다.

토론

방사선 합성
여기에 설명된 방사성 합성은 새로운 68Ga-표지 화합물에 대한 전형적 특성으로, 합성 시간이 짧고 적절한 pH에 중점을 두고 가능한 한 금속을 피합니다. 이를 위해서는 구성 요소가 추가되는 순서를 엄격하게 따르는 것이 중요합니다. 어쨌든, 68Ga 용액의 pH 값은 먼저 3 M NH4OAc로 pH 4로 조정해야합니다. 그렇지 않으면 pH가 너무 산성이면 나노바디가 저하될 수 있습니다. 68Ga- 합성의 일반적인 개념은앞서 16 번 설명되었으므로 여기서는 자세히 설명하지 않겠습니다. 자동 합성 모듈은 방사선량 감소와 관련하여 추가 최적화가 필요합니다. 이를 위해서는 여기에 설명된 바와 같이 일반적인 전임상 실험에서 탐색적 연구 범위를 벗어나는 상당한 노력이 필요합니다. 더욱이, 자동화된 합성은 현재 방법(< 1mL)으로 생산할 수 있는 소량을 산출할 가능성이 낮으므로 더 높은 농도의 68Ga와 더 높은 특이적 활성을 허용할 수 있습니다.

품질 관리는 여전히 매우 자세하게 수행되고 등록되어야 합니다. 이 세부 사항에 대한 한 가지 예외는 pH입니다: 임상 합성을 위한 pH 측정은 pH 측정기를 사용하여 매우 정확하게 수행되는 경우가 많지만, 정맥 주사에 대한 요구 사항이 허용하기 때문에 간단한 pH 스트립으로 pH를 측정하는 것으로 충분합니다(6에서 8 사이의 pH가 허용14). 이 간단한 기술은 비용을 줄이고 장비를 방사성 물질로 오염시킬 가능성을 줄입니다.

동물 모델을 위한 제형
추적자의 최종 제형은 추적자의 중요한 측면이며, 이는 전임상 연구에서 잘 설명되지 않는 측면입니다. 방사성 의약품을 포함한 인간 대상 임상시험을 위한 의약품의 제형에 대한 명확한 법률이 있지만, 전임상적으로 용매 또는 제형에 대해 구체적으로 논의하지 않는 가이드라인17,18은 있습니다. 이 지침은 (동물) 윤리 위원회의 승인을 위해 법적으로 요구되는 프로토콜의 초안을 작성하거나 평가할 때 자주 사용되지만(독일: LANUV19), 이러한 문서는 공식화의 중요성을 충분히 강조하지 않습니다. 잘못된 제형은 위(negative) 결과로 이어질 수 있지만, 종양학 분야에서도 여전히 존재하는 지속적인 출판 편향을 고려할 때 이러한 주장을 검증하기 어렵습니다20.

ARRIVE 가이드라인 외에도, 우리는 인간에게 적합한 제형이 일반적으로 설치류에도 적합하다는 가정하에 가능한 한 인간을 위해 설계된 법률을 따르기로 결정했습니다. 가장 큰 차이점은 피험자의 크기와 그에 따라 안전하게 주입할 수 있는 부피의 양입니다. 이를 위해 당사는 대형 화합물을 정제하는 데 효과적인 것으로 입증된 MWCO(molecular weight cut-off) 필터를 사용하여 가능할 때마다 화합물을 정제하기로 결정했습니다21. 이를 통해 일반적인 68Ga-labelled tracer를 선택한 용액과 마우스에 적합한 소량(일반적인 최대 정맥 주사 100 - 150 μL)에 최종적으로 용해시킬 수 있습니다.

독일에서는 GV-SOLAS(Gesellschaft für Versuchstierkunde, 영어: Association for laboratory animals)가 동물 보호와 연구 사이의 중개자 역할을 하여 인간과 동물 모두에게 이익이 됩니다. 따라서 이 협회는 국가 차원에서 동물 관리를 표준화하기 위해 동물 연구의 여러 측면, 특히 종양학 및 마취 분야에 대한 권고안을 마련했다14. 이제부터 대부분의 관할 당국과 국가 윤리 위원회는 이러한 권장 사항에 대한 동물 프로토콜의 준수를 강제합니다. GV-SOLAS에는 대부분의 응용 프로그램 경로의 최대 볼륨에 대한 권장 사항이 있습니다. 정맥 주사의 경우 체중의 최대 5mL/kg이 권장됩니다. 25g 마우스의 경우 이는 150μL와 같습니다. 이러한 이유로 모든 방사성 추적자 생산은 동물당 최대 주입량이 150μL로 설정됩니다. 정맥 주사 시 이 임계값을 초과하면 과혈량증으로 인한 급성 심부전의 위험이 증가합니다. 이 임계값을 초과하는 반복적인 정맥 주사는 유속에 따라 각 주입이 경미한 폐부종을 유발하기 때문에 폐 섬유증의 위험을 증가시킵니다. 이 논문에 제시된 마우스 IV에 해당하는 인간은 75kg의 인간에 대해 총 375mL의 부피를 볼루스에 정맥 주사(10초 이내)하는 것입니다. 표준 임상 치료에서는 500mL의 0.9% NaCl 용액을 1시간 동안 투여합니다. 이는 합병증을 피하기 위해 375mL를 45분 동안 투여한다는 것을 의미합니다.

GV-SOLAS는 종양 부담이 5%를 넘지 않도록 권장합니다. 동물이 치료를 받고 있는 경우 부담이 최대 10%22까지 확장될 수 있습니다. 치료군과 치료받지 않은 군의 이러한 차이는 특히 생존의 경우 치료된 종양 마우스가 구심성 대조군보다 더 높은 종양 부담을 달성할 수 있기 때문에 연구 편향을 유발할 가능성이 있습니다. 이러한 경우를 피하기 위해서는 치료 동물에 대해서도 5%의 종양 부담을 고정해야 합니다. 그러나 이는 소위 인도적 종말점에 도달하기 전에 연구 동물을 죽이는 것에 대한 윤리적 딜레마로 이어질 수 있으며, (바람직하게는) 구심성 대조군의 경우 10%로 증가한 것이 편견을 피하기 위해 윤리적으로 근거가 있다고 주장할 수 있습니다.

종양 부담은 비침습적 방식으로 매일 계산해야 하므로 교정 계수(즉, 0.82)를 적용하여 매일 계산된 종양 부피를 종양 무게로 변환합니다. 프로토콜에 따라 동물을 죽이기 전에 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 직경을 측정하고 나중에 저울을 사용하여 실제 종양 무게를 측정하여 이 계수를 계산했습니다. 이 보정 인자는 측정된 종양 부피에 피부도 포함되기 때문에 종양 조직의 밀도와 다릅니다. 따라서 이 인자는 측정된 종양 부피가 실제 종양 부피보다 크기 때문에 아마도 < 1.0일 것입니다. 우리가 무게를 잰 종양이 상대적으로 컸기 때문에, 평가가 실험의 마지막 날에 이루어졌기 때문에, 이 요인은 실제로 작은 종양의 무게를 과대평가한 것이다. 종양 부하의 평가에만 사용해야 합니다.

GV-SOLAS 권장사항의 또 다른 측면은 마우스의 경우, 15mm의 고정된 종양 직경이 인도적 종말점으로 설정된다는 것이다17. 종양은 종양 세포가 포함된 용액 후에 공기나 마개를 주입하지 않으면 피하 주사에 의해 만들어진 바늘관을 따라 빠르게 자라는 경향이 있습니다. 따라서 15mm는 특정 적용 경로에 더 빨리 도달합니다. 경험에 비추어 볼 때, 일부 종양은 타원형으로 자라기 때문에, 우리는 서로 다른 적용 경로를 편견 없이 비교하기 위해 위에서 언급한 종양 부피 공식을 조정하고 사용했습니다.

우리가 사용하는 동물 모델은 ARRIVE17 및 PREPARE18 지침에 따라 설계되어 실험적으로 쉽게 재현할 수 있습니다. 이 모델은 종양 성장 속도가 마우스마다 다르기 때문에 표준화 및 해석을 처리하기가 더 어렵기 때문에 어느 정도의 변동이 있을 수 있습니다. 그러나 이러한 변화는 암 환자에게 존재하는 종양내 및 종양간 이질성을 반영한다23.

이 프로토콜에 제한이 없는 것은 아닙니다. 동물은 주사 중, 특히 PET/CT 스캔 중에 진정제를 투여해야 합니다. 특히 이소플루란을 사용한 진정제는 혈류에 영향을 미치고 동물은 저체온증에 걸릴 수 있으므로 가열 매트를 사용하고 진정제의 깊이를 모니터링해야 합니다. 이 문제는 깨어 있는 동물을 스캔하여 피할 수 있습니다. 그러나 이를 위해서는 전문적인 사내 소프트웨어와 전문 지식이 필요한데, 이러한 소프트웨어는 종종 사용할 수 없습니다.

또 다른 한계는 방사선 선량입니다. 동물이 받은 선량은 단일 스캔에 대해 무시할 수 있지만 여러 스캔을 수행하면(즉, 특히 10개 이상인 경우) 상당한 누적 선량이 발생하여 잠재적으로 종양 성장에 영향을 미칠 수 있습니다. 종양 성장이 판독 매개변수인 경우, 비교 가능한 그룹을 보장하기 위해 모든 동물이 동일한 수의 스캔 및 투여를 받는 것이 필수적이며, 이로 인해 전체 프로젝트의 작업량이 추가됩니다. PET/CT 시스템 대신 PET/MRI 시스템을 사용하면 방사선 노출을 줄일 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식에는 스캔 시간이 길어지고, 추가 비용이 발생하며, 해부학적 정보를 얻는 다른 방법이 필요합니다.

독일의 GV-SOLAS와 같은 복지 기관의 권장 사항을 준수하고 ARRIVE 및 PREPARE와 같은 확립된 지침을 따름으로써 동물 모델을 표준화하고 실험 프로토콜의 변동성을 최소화하기 위해 노력하고 있습니다. 이러한 노력은 전임상 연구의 신뢰성과 재현성을 보장하는 데 매우 중요하며, 궁극적으로 유망한 방사성 의약품을 벤치에서 병상으로 번역하는 것을 용이하게 합니다.

공개 사항

FMM은 NanoMab Technology Ltd. 및 Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH의 의료 자문사입니다. 그는 최근 NanoMab Technology Ltd., Siemens 및 GE Precision Healthcare LLC로부터 기관 보조금을 받았습니다. 또한 그는 CURIOM과 중재 연구 계약을 맺고 있습니다.

감사의 글

저자는 기술 지원에 대해 Susanne Allekotte에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Activity meter ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
원심분리기 MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
내독소 테스트 Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Heating
block NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
HPLC 시스템, 무선 검출기포함 Knauer & Raytest-Image
분석 소프트웨어 Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-Small
animal PET/CT system β-CUBE 및 X-CUBEMolecubesNV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materials
0.3 mm diameter PE10 tube Fisherscientific22-204008
30G needleB|Braun4656300
원심 필터; 10 kDa MWCO, 0.5 mLMilliporeUFC501008
크로마토그래피 종이 스트립 iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Endotoxin 카트리지, 0.05 EU/ml 감도 Charles RiverPTS-2005
HPLC Column Biosep SEC-s2000Phenomenex-Microcentrifuge
tube (1.5 mL)Eppendorf0030125150
pH strip 0.0 - 6.0Merck KGaA109531
pH strip 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ SPE cartridgeMacherey Nagel GmbH &; Co. KG731861
멸균 바이알 10mLALK 생명 과학 솔루션SEV100
시약
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-Ammoniumacetate
Merck KGaA101116
구연산Merck KGaA
염산Merck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
나노바디 NM-02방사성 섬유 테라노스틱스-
P-SCN-Bz-DOTA-GACheMatechC115
트리플루오아세트산Merck KGaAT6508
초순수Merck KGaA
100241101262

참고문헌

  1. American Cancer Society. Cancer facts & figures 2024. , https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2024-cancer-facts-figures.html (2024).
  2. Cancer Research UK. Ovarian cancer survival. , https://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/ovarian-cancer/survival (2021).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Altunay, B., et al. Her2-directed antibodies, affibodies and nanobodies as drug-delivery vehicles in breast cancer with a specific focus on radioimmunotherapy and radioimmunoimaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 48 (5), 1371-1389 (2021).
  5. Altunay, B., Morgenroth, A., Mottaghy, F. M. Use of radionuclide-based imaging methods in breast cancer. Semin Nucl Med. 52 (5), 561-573 (2022).
  6. Mcgale, J., et al. Pet/ct and spect/ct imaging of her2-positive breast cancer. J Clin Med. 12 (15), 4882(2023).
  7. Zhang-Yin, J. State of the art in 2022 pet/ct in breast cancer: A review. J Clin Med. 12 (3), 968(2023).
  8. USFD Administration. Pet drug products - current good manufacturing practice (cgmp). , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pet-drug-products-current-good-manufacturing-practice-cgmp (2018).
  9. Official Journal of the European Union, L238. 60, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ:L:2017:238:TOC (2017).
  10. Korde, A., et al. Position paper to facilitate patient access to radiopharmaceuticals: Considerations for a suitable pharmaceutical regulatory framework. EJNMMI Radiopharm Chem. 9 (1), 2(2024).
  11. Korde, A., et al. Practical considerations for navigating the regulatory landscape of non-clinical studies for clinical translation of radiopharmaceuticals. EJNMMI Radiopharm Chem. 7 (1), 18(2022).
  12. European Pharmacopeia. , (2023).
  13. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Brorson, K. A., Chizhikov, V. E. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 25 (2-3), 69-77 (2011).
  14. Dülsner, A., et al. Technical information from the Committee for Animal Welfare Officers (GV-SOLAS) and Working Group 4 in the TVT Recommendation on substance administration to laboratory animals. GV-SOLAS. , (2017).
  15. derived xenograft (pdx) protocols at the jackson laboratory. , Available from: https://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/live/www/html/SOCHelp.html (2020).
  16. Velikyan, I. 68ga-based radiopharmaceuticals: Production and application relationship. Molecules. 20 (7), 12913-12943 (2015).
  17. Percie Du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the arrive guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  18. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. Prepare: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  19. Landesamt Für Natur UUVN. Tierversuche. , https://www.lanuv.nrw.de/verbraucherschutz/tierversuche (2024).
  20. Herrmann, D., et al. Statistical controversies in clinical research: Publication bias evaluations are not routinely conducted in clinical oncology systematic reviews. Ann Oncol. 28 (5), 931-937 (2017).
  21. Johnsen, E., et al. A critical evaluation of amicon ultra centrifugal filters for separating proteins, drugs and nanoparticles in biosamples. J Pharm Biomed Anal. 120, 106-111 (2016).
  22. TVT-Veröffentlichungen zum Download. , Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS). Available from: https://www.tierschutz-tvt.de/alle-merkblaetter-und-stellungnahmen/ (2024).
  23. Bedard, P. L., Hansen, A. R., Ratain, M. J., Siu, L. L. Tumour heterogeneity in the clinic. Nature. 501 (7467), 355-364 (2013).

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PET68GaHPLCPET CT

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