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Research Article
Nicole Arevalo1, M. Ryan Mettetal2, Francisco Javier Quinones3, Diego Restrepo1, Daniel Ramirez-Gordillo3
1Department of Cell and Developmental Biology,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Mechanical Engineer/NeuroTechnology Center / Machine Shop,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Neurosurgery Department,University of Colorado Anschutz Medical Campus
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
이 프로토콜은 go/no-go 후각 행동 실험을 위한 후각계의 구성을 설명합니다. olfactometer의 성공적인 구성을 보장하기 위해 이미지와 함께 단계별 지침이 제공됩니다. 프로세스 중에 발생하는 문제를 해결하기 위한 정보도 포함되어 있습니다.
후각 작업 중 설치류의 행동과 뇌 활동을 연구하기 위해 후각계를 사용하는 것은 뇌 회로를 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 정교한 장치를 통해 연구원들은 냄새 자극을 정밀하게 제어하고 전달할 수 있으므로 설치류의 복잡한 후각 과정을 조사할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 후각계는 편리하지만 기술적 문제가 발생할 때 종종 비용이 많이 드는 지원이 필요하고 잠재적으로 연구 일정을 방해할 수 있는 문제가 있습니다. 이 기사에서는 마우스 후각 행동 실험을 위해 특별히 설계된 맞춤형 후각계의 구성에 대해 자세히 설명하며, 포괄적인 부품 목록과 단계별 지침을 제공합니다. 후각계는 MATLAB을 통해 제어되어 연구자에게 사용자 친화적인 인터페이스를 제공합니다. 중요한 것은 오픈 소스 코드를 통해 사용자가 시스템을 수정하고 조정하여 특정 실험 요구 사항에 맞게 행동 작업을 조정할 수 있다는 것입니다. 맞춤형 후각계를 구축하면 사용자가 맞춤형 실험 설계 및 문제 해결을 독립적으로 수행할 수 있는 지식과 기능을 갖추게 되어 시간과 자원을 모두 절약할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 연구 유연성을 향상시킬 뿐만 아니라 장비의 기능에 대한 더 깊은 이해를 촉진하여 궁극적으로 설치류에 대한 보다 강력하고 신뢰할 수 있는 후각 연구로 이어집니다.
후각적 의사 결정의 기저에 있는 복잡한 메커니즘은 뇌의 감각 처리 체계 1,2,3의 놀라운 복잡성에 대한 흥미로운 통찰력을 제공합니다. 생쥐의 후각구 내에는 약 2,200개의 후각 감각 뉴런이 모여 있으며, 각 사구체는 동일한 후각 수용체4를 발현하는 뉴런에 의해 신경분포되어 있습니다. 놀랍게도, 단일 합성 냄새 물질조차도 마우스에서 약 1,100 개의 후각 수용체의 상당 부분을 자극 할 수 있습니다 5,6. 그러나 문제는 초기 냄새 물질 감지에 그치지 않습니다. 냄새 맡기의 리드미컬한 행위에 영향을 받는 냄새 맡기의 시간적 역동성은 뇌가 해독할 수 있는 정보의 층을 추가하여 감각 풍경을 더욱 풍부하게 합니다. 수백 가지 냄새 물질을 함유하고 있는 동종 소변과 같은 자연 자극의 복잡성으로 인해 후각 시스템은 다양한 냄새를 구별하기 위해 복잡한 사구체 활성화 패턴을 풀어내야 하는 만만치 않은 작업에 직면해 있습니다 7,8.
이 문제를 해결하기 위해 뇌는 이상피질(piriform cortex), 외측내후피질(lateral entorhinal cortex), 해마(hippocampus), 후각결절(olfactory tubercle), 전전두엽(prefrontal cortex), 심지어 소뇌(9,10,11,12,13,14)를 포함한 여러 영역에 걸쳐 신경 활동을 조율합니다. 이러한 회로 내에서 이상피질(piriform cortex)의 피라미드 세포(pyramidal cell)는 승모세포(mitral cell)에 의해 전달되는 정보를 통합하고 조절하는 반면, 다른 뇌 영역은 후각 지각을 형성하는 데 독특한 역할을 합니다 15,16,17. 더욱이, 후각 자극에 대한 뇌의 처리는 상황적 요인에 의해 역동적으로 영향을 받으며, 이는 후각 의사 결정 과정의 적응력과 정교함을 강조합니다.
이 기사에서는 go/no-go 작업에 참여하여 자유롭게 움직이는 마우스의 행동 수행에 대한 컴퓨터 제어 평가를 가능하게 하는 맞춤형 후각계의 구성에 대해 설명합니다. 이 연상 학습 과제에서 물이 부족한 쥐는 냄새 전달 노즈콘 안에 있는 물 전달 주둥이를 핥아 시험을 시작합니다. 두 가지 냄새 물질 중 하나는 동물이 실험을 시작한 후 1-1.5초 후에 전달됩니다. 냄새 유발 물질이 보상(S+) 냄새 유발 물질인 경우, 마우스는 4개의 0.5초 시간 창(히트)에서 각각 한 번 이상 핥으면 물 보상을 받습니다. 그렇지 않으면 마우스는 보상을 받지 못합니다(Miss). 동물이 보상받지 않은 냄새 물질(S-)을 투여하면 보상이 전달되지 않으며, 마우스가 4개의 시간 창(False Alarm, FA) 각각을 핥으면 다음 시험이 시작되기 전에 시간 지연이 부과됩니다. 동물이 시간 창 중 하나에서 핥지 않으면 시험은 올바른 거부(CR)로 계산되고 시간 지연이 적용되지 않습니다. 올바른 성능의 백분율은 20개의 시도 창에서 마우스가 히트 또는 CR을 점수 매긴 시도의 백분율로 계산됩니다.
정확도 = 100 ((히트 + CR) / 20)
진행/불이행 후각 행동을 평가하도록 설계된 후각계의 적절한 기능을 보장하기 위한 두 가지 주요 문제가 있습니다. 첫째, 후각계는 쥐의 반응을 실시간으로 모니터링하여 그에 따라 냄새 및 수분 보상을 제공해야 합니다. 이 후각계는 물기둥과 챔버 바닥 사이의 저항을 측정하거나 커패시턴스18을 감지하여 릭을 모니터링하여 달성됩니다. 그런 다음 MATLAB 프로그램은 이 정보를 사용하여 냄새 물질 전달 및 물 보상에 대한 결정을 내립니다. 두 번째 문제는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 부취제 전달의 필요성입니다. 이 후각계는 냄새 물질이 포화된 공기를 운반 공기와 평형을 이루는 밸브를 작동시켜 달성되며, 이 공기는 노즈 콘으로 전달됩니다. 공기는 미네랄 오일로 희석된 냄새 용액을 통해 거품을 일으킴으로써 냄새 물질과 평형을 이룹니다. 냄새 물질의 농도는 광이온화 검출기로 측정되며 Williams와 Dewan18,19에 의해 설명된 절차에 따라 증기압 및 활성 계수를 기반으로 계산할 수 있습니다.
모든 실험은 University of Colorado Anschutz Medical Campus Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물은 사극 이식 당시 2개월이 된 수컷 CaMKIIα WT 마우스였습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.
1. 단극, 단스로우(SPST) 순간 푸시 버튼의 보드 및 납땜
2. 전원 공급 장치
3. 핥기 센서 보드
4. 공기와 물 공급
5. olfactometer를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어를 설치하십시오.
6. 동물 실험
여기에 설명된 프로토콜에 따라 후각계를 설정하여 냄새를 구별하는 마우스의 go/no-go 동작을 테스트할 수 있습니다. 그림 6A 는 에틸 아세테이트를 S+ 냄새 물질로, 에틸 아세테이트와 프로필 아세테이트의 조합을 S-로 사용하여 go/no-go 과제 훈련 첫날 마우스의 행동을 보여줍니다. 정답률은 마우스가 적중 또는 정답 거부를 기록한 시도의 백분율로 계산됩니다. 처음에 쥐는 두 가지 냄새 물질에 반응하여 핥았기 때문에 50% 정확도로 시작했습니다. 그러나 몇 번의 시도 끝에 S+에 대해서만 핥는 법을 배웠고 S-에 대해서만 핥는 것을 멈췄다. 그림 6B 는 동물이 80% 이상의 수행 능력을 달성한 전진 방향의 go/no-go 작업의 마지막 날에 대한 정확도 백분율을 보여줍니다. 이 시점에서, 에틸 아세테이트를 S- 취취제로 사용하고 에틸 아세테이트와 프로필 아세테이트의 조합을 S+로 하여 냄새 유발 물질을 역전(REV)시켰습니다. 그림 6C 는 go/no-go 작업의 첫 번째 날에 마우스 성능이 10%로 떨어진 반대 방향의 정확도 백분율을 보여줍니다. F 는 반전의 마지막 날에 마우스의 성능을 보여 주며, 여기서 마우스는 다시 숙련도를 달성했습니다.

그림 1: 후각계의 화이트보드 앞면 및 배선. (A) 후각계 치수는 22" W x 16" H x 8.5" D이며, 기계 작업장에서 배송된 대로 배선 또는 인터페이스/핥기 보드 없이 표시됩니다. 냄새 밸브, 온도계, 물 및 최종 밸브, 물 주사기, 냄새 병 랙, 냄새 밸브 랙 및 마우스 챔버에 구멍이 미리 뚫려 있습니다. (B) 후면 왼쪽에 SSR8-RACK을 장착하는 데 필요한 48개의 볼트가 준비된 후각계. (C) 부착된 릴레이를 포함하여 SSR48-RACK이 장착된 후각계. (D) 12V, 5V 및 접지에 대한 지정된 섹션이 있는 후각계에 나사 단자 스트립 블록이 추가되었습니다. (E) SPST 순간 푸시 버튼 스위치를 위한 드릴 구멍이 있는 제어 블랙 박스, 밸브 제어로 각 버튼에 테이프 라벨링. (F) 노출된 영역을 보호하기 위해 납땜된 두 개의 색상으로 구분된 수축 튜브 와이어가 있는 SPST 순간 푸시 버튼 스위치. (G) SPST 순간 푸시 버튼 스위치는 제어 블랙 박스에 장착되고 포함된 육각 너트로 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 냄새 밸브 및 회로도. (A) 냄새 밸브는 슬롯에 단단히 장착되고 나사로 고정됩니다. (B) SSR48-RACK 및 나사 단자 스트립 블록에 대한 냄새 밸브 배선의 개략도. (C) 제어 블랙박스, 전원 공급 장치, SSR48-RACK 및 나사 단자 스트립 블록의 배선도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 전원 공급 장치가 있는 물 및 최종 밸브 설정. (A) 물 및 최종 밸브를 후각계의 지정된 슬롯에 추가하고 나사로 고정합니다. (B) 후각계에 전원을 공급하기 위해 연결된 전원 공급 장치 배선. (C) SSR48-RACK용 전원 배선. (D) 저항기, 전선, LED 및 연산 증폭기를 포함한 연결된 구성 요소가 있는 센서를 핥습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 유량계 및 튜브가 있는 공기 공급 시스템. (A) 나사로 랙에 부착된 유량계. (B) 튜브에 연결된 수족관 펌프, T-조인트와 결합. (C) 개별 레귤레이터에 연결된 출력에 튜브가 부착된 탄소 필터. (D) 유량계 입력에 연결된 조절기의 튜브. (E) 유량계 출력에 부착된 튜브. (F) 매니폴드에서 최종 밸브 입력까지의 튜빙. (G) 후각계 냄새 포트에 연결된 튜브가 있는 최종 밸브. (H) 물을 채운 5mL 주사기, 18G 바늘에 튜브를 부착합니다. (I) 물 밸브 입력에 연결된 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 최종 급수 밸브 연결 및 시스템 개요. (A) 물 밸브 출력에서 olfactometer의 lixit까지의 튜브. (B) 암-암 케이블을 사용하여 후각계를 DIO96H/50에 연결합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 마우스에 대한 go/no go 작업의 동작 성능 예. 각 세션의 정답 비율은 다음에 대해 표시됩니다: (A) 전방 컨디셔닝 첫날(S+: 1% 이소아밀 아세테이트, S-: 미네랄 오일). (B) 포워드 컨디셔닝의 마지막 날. (C) 반전 후 첫날(S+: 미네랄 오일, S- : 1% 이소아밀 아세테이트). (D) 역컨디셔닝의 마지막 날. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 냄새 포트에서 이소아밀 아세테이트의 농축 시간 경과. 광이온화 장치(PID)를 사용하여 냄새 포트에서 10% 이소아밀 아세테이트(광유에 희석됨)의 농도를 측정했습니다. 세로선은 냄새 전달의 시작과 끝을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 재정적 이해관계도 없습니다.
이 프로토콜은 go/no-go 후각 행동 실험을 위한 후각계의 구성을 설명합니다. olfactometer의 성공적인 구성을 보장하기 위해 이미지와 함께 단계별 지침이 제공됩니다. 프로세스 중에 발생하는 문제를 해결하기 위한 정보도 포함되어 있습니다.
이 연구는 NIH 보조금 K01 NS127850-01, R25 NS080685, R01 NS081248 및 DC000566의 보조금으로 지원되었습니다. Restrepo와 Ramirez-Gordillo 연구실의 모든 구성원의 지원에 감사드립니다.
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