Method Article

설치류 후각 행동 연구를 위한 후각계 구축

DOI:

10.3791/67049

⸱

April 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Mechanical Engineer/NeuroTechnology Center / Machine Shop, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Neurosurgery Department, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 go/no-go 후각 행동 실험을 위한 후각계의 구성을 설명합니다. olfactometer의 성공적인 구성을 보장하기 위해 이미지와 함께 단계별 지침이 제공됩니다. 프로세스 중에 발생하는 문제를 해결하기 위한 정보도 포함되어 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

후각 작업 중 설치류의 행동과 뇌 활동을 연구하기 위해 후각계를 사용하는 것은 뇌 회로를 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 정교한 장치를 통해 연구원들은 냄새 자극을 정밀하게 제어하고 전달할 수 있으므로 설치류의 복잡한 후각 과정을 조사할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 후각계는 편리하지만 기술적 문제가 발생할 때 종종 비용이 많이 드는 지원이 필요하고 잠재적으로 연구 일정을 방해할 수 있는 문제가 있습니다. 이 기사에서는 마우스 후각 행동 실험을 위해 특별히 설계된 맞춤형 후각계의 구성에 대해 자세히 설명하며, 포괄적인 부품 목록과 단계별 지침을 제공합니다. 후각계는 MATLAB을 통해 제어되어 연구자에게 사용자 친화적인 인터페이스를 제공합니다. 중요한 것은 오픈 소스 코드를 통해 사용자가 시스템을 수정하고 조정하여 특정 실험 요구 사항에 맞게 행동 작업을 조정할 수 있다는 것입니다. 맞춤형 후각계를 구축하면 사용자가 맞춤형 실험 설계 및 문제 해결을 독립적으로 수행할 수 있는 지식과 기능을 갖추게 되어 시간과 자원을 모두 절약할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 연구 유연성을 향상시킬 뿐만 아니라 장비의 기능에 대한 더 깊은 이해를 촉진하여 궁극적으로 설치류에 대한 보다 강력하고 신뢰할 수 있는 후각 연구로 이어집니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

후각적 의사 결정의 기저에 있는 복잡한 메커니즘은 뇌의 감각 처리 체계 1,2,3의 놀라운 복잡성에 대한 흥미로운 통찰력을 제공합니다. 생쥐의 후각구 내에는 약 2,200개의 후각 감각 뉴런이 모여 있으며, 각 사구체는 동일한 후각 수용체4를 발현하는 뉴런에 의해 신경분포되어 있습니다. 놀랍게도, 단일 합성 냄새 물질조차도 마우스에서 약 1,100 개의 후각 수용체의 상당 부분을 자극 할 수 있습니다 5,6. 그러나 문제는 초기 냄새 물질 감지에 그치지 않습니다. 냄새 맡기의 리드미컬한 행위에 영향을 받는 냄새 맡기의 시간적 역동성은 뇌가 해독할 수 있는 정보의 층을 추가하여 감각 풍경을 더욱 풍부하게 합니다. 수백 가지 냄새 물질을 함유하고 있는 동종 소변과 같은 자연 자극의 복잡성으로 인해 후각 시스템은 다양한 냄새를 구별하기 위해 복잡한 사구체 활성화 패턴을 풀어내야 하는 만만치 않은 작업에 직면해 있습니다 7,8.

이 문제를 해결하기 위해 뇌는 이상피질(piriform cortex), 외측내후피질(lateral entorhinal cortex), 해마(hippocampus), 후각결절(olfactory tubercle), 전전두엽(prefrontal cortex), 심지어 소뇌(9,10,11,12,13,14)를 포함한 여러 영역에 걸쳐 신경 활동을 조율합니다. 이러한 회로 내에서 이상피질(piriform cortex)의 피라미드 세포(pyramidal cell)는 승모세포(mitral cell)에 의해 전달되는 정보를 통합하고 조절하는 반면, 다른 뇌 영역은 후각 지각을 형성하는 데 독특한 역할을 합니다 15,16,17. 더욱이, 후각 자극에 대한 뇌의 처리는 상황적 요인에 의해 역동적으로 영향을 받으며, 이는 후각 의사 결정 과정의 적응력과 정교함을 강조합니다.

이 기사에서는 go/no-go 작업에 참여하여 자유롭게 움직이는 마우스의 행동 수행에 대한 컴퓨터 제어 평가를 가능하게 하는 맞춤형 후각계의 구성에 대해 설명합니다. 이 연상 학습 과제에서 물이 부족한 쥐는 냄새 전달 노즈콘 안에 있는 물 전달 주둥이를 핥아 시험을 시작합니다. 두 가지 냄새 물질 중 하나는 동물이 실험을 시작한 후 1-1.5초 후에 전달됩니다. 냄새 유발 물질이 보상(S+) 냄새 유발 물질인 경우, 마우스는 4개의 0.5초 시간 창(히트)에서 각각 한 번 이상 핥으면 물 보상을 받습니다. 그렇지 않으면 마우스는 보상을 받지 못합니다(Miss). 동물이 보상받지 않은 냄새 물질(S-)을 투여하면 보상이 전달되지 않으며, 마우스가 4개의 시간 창(False Alarm, FA) 각각을 핥으면 다음 시험이 시작되기 전에 시간 지연이 부과됩니다. 동물이 시간 창 중 하나에서 핥지 않으면 시험은 올바른 거부(CR)로 계산되고 시간 지연이 적용되지 않습니다. 올바른 성능의 백분율은 20개의 시도 창에서 마우스가 히트 또는 CR을 점수 매긴 시도의 백분율로 계산됩니다.

정확도 = 100 ((히트 + CR) / 20)

진행/불이행 후각 행동을 평가하도록 설계된 후각계의 적절한 기능을 보장하기 위한 두 가지 주요 문제가 있습니다. 첫째, 후각계는 쥐의 반응을 실시간으로 모니터링하여 그에 따라 냄새 및 수분 보상을 제공해야 합니다. 이 후각계는 물기둥과 챔버 바닥 사이의 저항을 측정하거나 커패시턴스18을 감지하여 릭을 모니터링하여 달성됩니다. 그런 다음 MATLAB 프로그램은 이 정보를 사용하여 냄새 물질 전달 및 물 보상에 대한 결정을 내립니다. 두 번째 문제는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 부취제 전달의 필요성입니다. 이 후각계는 냄새 물질이 포화된 공기를 운반 공기와 평형을 이루는 밸브를 작동시켜 달성되며, 이 공기는 노즈 콘으로 전달됩니다. 공기는 미네랄 오일로 희석된 냄새 용액을 통해 거품을 일으킴으로써 냄새 물질과 평형을 이룹니다. 냄새 물질의 농도는 광이온화 검출기로 측정되며 Williams와 Dewan18,19에 의해 설명된 절차에 따라 증기압 및 활성 계수를 기반으로 계산할 수 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험은 University of Colorado Anschutz Medical Campus Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물은 사극 이식 당시 2개월이 된 수컷 CaMKIIα WT 마우스였습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 단극, 단스로우(SPST) 순간 푸시 버튼의 보드 및 납땜

  1. 그림 48A에 표시된 냄새 밸브, 유량계, SSR1 보드 및 기타 구성 요소용 랙을 고정할 수 있는 구멍이 있는 맞춤형 흰색 베이스보드를 구합니다.
    참고: 이 연구에 사용된 흰색 베이스보드는 CU Anschutz Medical Campus의 신경기술 센터의 기계 공장에서 생산되었습니다(그림 1A). 설계 파일은 다음에서 사용할 수 있습니다.
  2. SSR1-RACK을 배치하기 위해 3인치 나사와 48/4인치 스페이서를 추가합니다. 나사는 화이트보드 뒷면의 오른쪽 상단에 있습니다(그림 1A).
  3. SSR48-RACK을 장착합니다. SSR48-RACK은 화이트보드 뒷면 왼쪽 상단에 있습니다(그림 1C).
  4. 화이트보드 뒷면에 나사 단자 스트립 블록을 놓을 수 있는 구멍(0.4cm)을 만듭니다. 나사 단자 스트립 블록은 화이트보드 뒷면의 오른쪽 중앙에 있습니다(그림 1D).
  5. 위에서 아래로: 처음 4개의 나사 단자 스트립 블록은 24V용 전선을 연결하는 데 사용됩니다. 다음 나사 단자 스트립 블록은 5V 전선에 사용됩니다. 하나의 나사 단자 스트립 블록을 비워 두고 마지막 4개의 나사 단자 스트립 블록을 접지선을 연결하는 데 사용합니다.
  6. SPST 순간 푸시 버튼 스위치를 배치하기 위해 컨트롤 박스에 구멍(0.8cm)을 뚫습니다. 컨트롤 박스는 화이트보드의 전면 하단에 있습니다(그림 1E).
  7. SPST 순간 푸시 버튼 스위치를 설정합니다. 두 개의 전선을 SPST 순간 푸시 버튼 스위치에 납땜합니다. 빨간색과 검은색 또는 녹색과 같은 두 가지 색상을 사용하는 것이 좋습니다(그림 1F).
  8. SPST 순간 푸시 버튼 스위치를 컨트롤 박스에 부착합니다. 푸시 버튼은 제어 블랙 박스에 부착하는 데 사용되는 너트와 함께 제공됩니다(그림 1G).
  9. 전선을 꼬거나 테이프로 고정하여 전선을 함께 고정하고 정리하십시오.
    알림: 24V 전원은 핀치 밸브와 냄새 밸브에 전원을 공급하는 데 사용되며 5V 전원은 핥아 회로에 사용됩니다.
  10. 냄새 밸브를 화이트보드 중앙에 있는 냄새 밸브 랙의 슬롯에 놓습니다(그림 2A).
    1. 밸브에서 나오는 전선을 벗기고 각 밸브의 전선 하나를 더 두꺼운 전선에 납땜합니다. 화이트보드 뒷면에 있는 나사 단자 스트립 블록의 접지에 한 개의 와이어를 삽입하고 두 번째 와이어를 SSR48-RACK의 해당 핀에 연결합니다. 예를 들어, 냄새 밸브 1은 핀 1로, 냄새 밸브 2는 핀 2로 이동합니다(그림 2B).
    2. SSR1-RACK의 핀 8-48을 각각 두 개의 핀치 밸브(광유 평형 바이알용 입력 및 출력 밸브)에 연결합니다. 각 밸브에 대해 푸시 버튼의 한 와이어를 24V 전원에 연결하고 다른 와이어를 밸브에 연결된 SSR48-RACK의 핀에 연결합니다. 다른 와이어는 밸브에서 접지로 연결됩니다. 그림 2B, C를 참조하여 전선을 제자리에 배치하십시오.
    3. 물 밸브와 최종 밸브를 밸브 플레이트의 해당 슬롯에 놓습니다. 슬롯은 화이트보드 중앙에 있습니다. 그림 1 의 밸브 플레이트와 그림 3A의 밸브 배치를 참조하십시오.
    4. 물 밸브와 최종 밸브를 SSR17-RACK의 접지 및 핀 18과 48에 각각 연결합니다. 푸시 버튼을 24V와 핀 17 및 18에 연결합니다(그림 2B).

2. 전원 공급 장치

  1. 전원 공급 장치와 연장 코드를 구입하십시오. 특정 유형의 전원 공급 장치에 대한 정보는 재료 표에서 찾을 수 있습니다. 전원 공급 장치는 24V(V3) 및 5V(V1) 출력을 제공하고 후각계에 접지합니다.
  2. 전원 공급 장치의 전원 코드 플러그를 차단하십시오. 특히, 연장 코드의 암 부분입니다. 절단되면 세 개의 전선을 볼 수 있습니다. 녹색 와이어는 전원 공급 장치의 G(접지)에 연결되고 다른 두 와이어(흰색 및 검은색)는 전원 공급 장치에 대한 120V AC 입력의 L 및 N에 각각 연결됩니다(그림 3B).
    주의 : 120V 전원선이 노출되어 감전으로 인한 부상의 위험이 있습니다. 절연체로 덮는 것이 가장 좋습니다.
  3. SSR48-RACK에 전원을 공급하는 와이어의 한쪽 끝을 자릅니다. 전선 중 하나를 전원 공급 장치의 G 나사에 연결하고 두 번째 전선을 전원 공급 장치의 V1에 연결합니다(그림 3C).
  4. 전원 공급 장치에서 G2의 와이어 하나를 나사 터미널 스트립 블록의 접지에 연결합니다(그림 2C).
  5. 전원 공급 장치에서 V1의 와이어 하나를 5V 나사 단자 스트립 블록에 연결합니다(그림 2C).
  6. 전원 공급 장치에서 V3의 와이어 하나를 24V 나사 단자 스트립 블록에 연결합니다(그림 2C).

3. 핥기 센서 보드

  1. 400개의 타이 포인트 브레드보드를 구하고 타이 포인트 B7에서 B15까지 연결하는 와이어를 배선합니다(그림 3D).
  2. 와이어의 한쪽 끝을 브레드보드의 타이 포인트 6+에 연결하고 다른 쪽 끝을 타이 포인트 C22에 연결합니다(그림 3D).
  3. 한쪽 끝을 D16에 연결하고 두 번째 끝을 브레드보드의 G22에 연결합니다(그림 3D).
  4. 전선의 한쪽 끝을 슬롯 I22에 연결하고 두 번째 끝을 브레드보드의 29-에 연결합니다(그림 3D).
  5. 전선의 한쪽 끝을 브레드보드의 슬롯 20A에 연결하고 두 번째 끝을 브레드보드의 29A에 연결합니다(그림 3D).
  6. 전선의 한쪽 끝을 브레드보드의 21B에 연결하고 두 번째 끝을 브레드보드의 28B에 연결합니다(그림 3D).
  7. 전선의 한쪽 끝을 브레드보드의 슬롯 1+에 연결하고 두 번째 끝을 나사 단자 스트립 블록의 5V에 연결합니다(그림 3D).
  8. 전선의 한쪽 끝을 브레드보드의 슬롯 1-에 연결하고 두 번째 끝을 나사 단자 스트립 블록의 접지에 연결합니다(그림 3D).
  9. 와이어의 한쪽 끝을 브레드보드의 슬롯 C7에 연결하고 두 번째 끝을 SSR-48RACK의 핀 27에 연결합니다(그림 3D).
  10. 와이어의 한쪽 끝을 브레드보드의 슬롯 28C에 연결하고 두 번째 끝에는 물기둥의 금속 부분에 연결할 앨리게이터 클립이 부착되어 있습니다(그림 3D).
  11. 전선의 한쪽 끝을 브레드보드의 슬롯 20B에 연결하고 다른 쪽 끝을 전위차계의 중간 단자에 연결합니다(그림 3D). 전위차계의 저항 요소에 연결된 두 개의 단자는 접지 및 5V에 연결됩니다. 중간 단자는 브레드보드에 연결됩니다.
  12. 21mΩ 저항기를 얻습니다. 첫 번째 것의 경우 한쪽 끝을 19A에 연결하고 두 번째 끝을 20D에 연결합니다. 두 번째 경우 한쪽 끝을 22C에 연결하고 다른 쪽 끝을 21D에 연결합니다. 전위차계에 연결합니다(그림 3D).
  13. 하나의 kΩ 저항을 얻습니다. 한쪽 끝을 14C에 연결하고 두 번째 끝을 19C에 연결합니다. 전위차계에 연결합니다(그림 3D).
  14. 120 Ω 저항기 하나를 구합니다. 한쪽 끝을 7D에 연결하고 두 번째 끝을 7H에 연결합니다(그림 3D).
  15. LED 조명을 얻으십시오. 색상은 중요하지 않습니다. 하나의 LED 와이어를 7J에 연결하고 두 번째 와이어를 6-에 연결합니다(그림 3D).
  16. 두 개의 연산 증폭기(연산 증폭기)를 얻습니다. 첫 번째 연결부는 E10 - E16, F10 - F16 (그림 3D)입니다.

4. 공기와 물 공급

  1. 유량계 홀더에 두 개의 유량계(2L/min 및 50cc/min)를 놓습니다. 그림 4A 는 전체 기류 시스템을 보여주고 그림 4B 는 유량계의 확대 보기를 보여줍니다.
  2. 2L/min의 공기 흐름을 제공하는 수족관 펌프를 구하십시오. 여기에 사용된 수족관 펌프 모델에는 두 개의 출력이 있습니다(재료 표 참조). 수족관 펌프의 두 출력 각각에서 T 커넥터의 두 입력으로 작은 튜브 조각을 연결합니다(그림 4B).
  3. T 커넥터의 출력에서 활성탄 필터의 입력으로 튜브 조각을 연결합니다(그림 4B).
  4. 탄소 필터의 출력에서 T 커넥터로 튜브를 연결하고 커넥터의 두 출력을 볼 밸브에 연결하여 공기 흐름 속도를 조정합니다(그림 4C).
  5. 각 볼 밸브의 출력을 유량계의 입력에 연결합니다(그림 4D).
  6. 50cm/min 유량계의 출력을 상단 매니폴드에 연결하여 미네랄 오일에 희석된 냄새 물질로 40mL 냄새 평형 바이알에 공기를 공급합니다(그림 4E).
  7. 각 냄새 바이알의 출력을 하단 매니폴드의 해당 입력에 연결합니다.
  8. 냄새 바이알을 매니폴드에 연결하는 튜브는 두 개의 개별 핀치 밸브에 의해 열리는 핀치 밸브 튜브입니다. 튜브를 핀치 밸브에 넣습니다.
  9. 2L/min 유량계의 출력을 하부 매니폴드의 측면 입력 입력에 연결합니다.
  10. 하부 매니폴드의 출력을 최종(전환) 밸브의 입력에 연결합니다(그림 4F).
    1. 최종 밸브의 기본 출력을 go/no-gochamber의 냄새 전달 튜브에 연결합니다. 최종 밸브의 기본 꺼짐 출력을 배기 튜브에 연결합니다(그림 4G). 그 결과 최종 밸브가 꺼질 때 2L/min의 무취 공기 흐름이 지속적으로 발생합니다.
    2. 각 시도에 대해 동물이 핥을 때 최종 밸브가 켜져 공기를 배기 가스로 가져가고 동시에 냄새 밸브가 켜지는지 확인하십시오. 그 결과 배경 공기 흐름에서 냄새가 평형을 이룹니다.
    3. 1-1.5초 후에 최종 밸브가 꺼지고 공기가 챔버로 다시 전환되는지 확인합니다. 그 결과 냄새 농도가 급격히 증가합니다. 2.5초 후 냄새 밸브가 꺼지고 냄새 농도가 0으로 돌아갑니다.
    4. 물 보상을 전달하는 데 사용할 5mL 주사기의 끝에 18G 바늘을 연결합니다(그림 4H).
    5. 바늘 끝에 하나의 튜브(직경 2mm)를 연결합니다(그림 4H).
    6. 튜브의 다른 쪽 끝을 물 밸브의 입력에 연결합니다. 물 밸브의 입력에 맞게 다른 직경의 튜브를 절단해야 할 수도 있습니다(그림 4I).
    7. 물 밸브의 출력에서 핥 스파우트로 튜브를 연결합니다(그림 5A).

5. olfactometer를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어를 설치하십시오.

  1. 48핀 암-암 커넥터를 사용하여 SSR48-RACK을 DIO96H/50에 100H/100에 연결합니다. DIO96/H50의 USB 케이블을 컴퓨터에 연결합니다(그림 5B).
  2. 최신 버전의 mccdaq 소프트웨어 및 드라이버와 InstaCal을 다운로드하십시오.
    참고: InstaCal은 컴퓨터와 DIO96/H50 간의 통신을 테스트하는 프로그램입니다. 여기에서 최신 소프트웨어 및 드라이버를 다운로드하십시오: https://www.mccdaq.com/software-downloads.aspx.
  3. InstaCal을 실행합니다. "범용 직렬 버스"에 보드 #가 올바른 번호(일반적으로 #1 = 보드 #1 USB-DIO96H/50)로 나열되어 있는지 확인합니다.
  4. MATLAB을 다운로드합니다.
  5. MATLAB 프로그램을 다운로드하여 https://github.com/restrepd/dropc 에서 olfactometer를 실행합니다.
  6. 관리자로 MATLAB 을 열고 MATLAB이 프로그램을 인식하도록 경로를 설정합니다. MATLAB 환경의 홈 탭에서 환경 섹션의 경로 설정을 클릭합니다. 그러면 검색 경로에 폴더를 추가할 수 있는 대화 상자가 열립니다.
  7. daqregister('mcc')를 실행합니다. dropcInitializePortsNow.m에서 보드 번호를 변경합니다.
    참고 : handles.dio = digitalio ( 'mcc', 1); %(컴퓨터에 따라 1 또는 0).
  8. 사용자가 핥기 스파우트와 접지된 챔버의 금속 바닥 사이에 전기 루프를 연결하여 각 시도에 "응답"하는 드라이 런을 수행하여 dropcspm.m 을 테스트합니다.
    알림: 이제 후각계를 사용할 준비가 되었습니다. 마우스 훈련 방법에 대한 정보는 Nicole Arevalo et al.20에서 찾을 수 있습니다.

6. 동물 실험

  1. 실험 과정을 시작하기 위해 동물 피험자를 조심스럽게 준비합니다. 보정된 저울을 사용하여 각 마우스의 무게를 개별적으로 측정하고 실험실 로그에 무게를 기록합니다. 연구 전반에 걸쳐 이 중요한 데이터를 모니터링하여 동물의 건강을 추적하고 체중 변화를 즉시 해결하십시오.
  2. 칭량 후 특별히 설계된 마우스 챔버에 마우스를 부드럽게 넣습니다. 후각 구별 작업을 위해 센서와 자극 전달 시스템을 활성화합니다. 챔버가 동물에 가해지는 스트레스를 최소화하는 동시에 실험 조건을 정밀하게 제어할 수 있는지 확인합니다.
  3. 동물이 챔버에서 편안하게 지낼 수 있도록 하십시오. MATLAB 프로그램을 시작하여 냄새 자극(2.5초) 전달, 물 분배, 반응 기록과 같은 실험 파라미터를 제어할 수 있습니다. 실시간으로 데이터를 분석하여 동물의 성과에 대한 즉각적인 피드백을 얻을 수 있습니다.
  4. 동물의 성능을 지속적으로 모니터링하고 분석합니다. 정답의 백분율을 기준으로 계산된 숙련도 점수를 확인합니다. 각 동물이 작업 숙련도의 임계값을 표시하는 80점 이상의 수행 점수를 달성하는 것을 목표로 합니다.
  5. 동물이 지속적으로 80 이상의 숙련도 점수를 달성하면 실험의 새로운 단계를 시작하며, 이는 초기 냄새 쌍 구별의 숙달을 나타냅니다. 냄새 쌍을 역전시켜 이전에 보상받은 향기는 보상되지 않도록 하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
    1. 동물의 인지적 유연성과 연관성을 언러닝하고 다시 학습하는 능력을 테스트하여 마우스의 후각 학습의 가소성에 대한 귀중한 통찰력을 얻습니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 프로토콜에 따라 후각계를 설정하여 냄새를 구별하는 마우스의 go/no-go 동작을 테스트할 수 있습니다. 그림 6A 는 에틸 아세테이트를 S+ 냄새 물질로, 에틸 아세테이트와 프로필 아세테이트의 조합을 S-로 사용하여 go/no-go 과제 훈련 첫날 마우스의 행동을 보여줍니다. 정답률은 마우스가 적중 또는 정답 거부를 기록한 시도의 백분율로 계산됩니다. 처음에 쥐는 두 가지 냄새 물질에 반응하여 핥았기 때문에 50% 정확도로 시작했습니다. 그러나 몇 번의 시도 끝에 S+에 대해서만 핥는 법을 배웠고 S-에 대해서만 핥는 것을 멈췄다. 그림 6B 는 동물이 80% 이상의 수행 능력을 달성한 전진 방향의 go/no-go 작업의 마지막 날에 대한 정확도 백분율을 보여줍니다. 이 시점에서, 에틸 아세테이트를 S- 취취제로 사용하고 에틸 아세테이트와 프로필 아세테이트의 조합을 S+로 하여 냄새 유발 물질을 역전(REV)시켰습니다. 그림 6C 는 go/no-go 작업의 첫 번째 날에 마우스 성능이 10%로 떨어진 반대 방향의 정확도 백분율을 보여줍니다. F 는 반전의 마지막 날에 마우스의 성능을 보여 주며, 여기서 마우스는 다시 숙련도를 달성했습니다.

figure-results-1
그림 1: 후각계의 화이트보드 앞면 및 배선. (A) 후각계 치수는 22" W x 16" H x 8.5" D이며, 기계 작업장에서 배송된 대로 배선 또는 인터페이스/핥기 보드 없이 표시됩니다. 냄새 밸브, 온도계, 물 및 최종 밸브, 물 주사기, 냄새 병 랙, 냄새 밸브 랙 및 마우스 챔버에 구멍이 미리 뚫려 있습니다. (B) 후면 왼쪽에 SSR8-RACK을 장착하는 데 필요한 48개의 볼트가 준비된 후각계. (C) 부착된 릴레이를 포함하여 SSR48-RACK이 장착된 후각계. (D) 12V, 5V 및 접지에 대한 지정된 섹션이 있는 후각계에 나사 단자 스트립 블록이 추가되었습니다. (E) SPST 순간 푸시 버튼 스위치를 위한 드릴 구멍이 있는 제어 블랙 박스, 밸브 제어로 각 버튼에 테이프 라벨링. (F) 노출된 영역을 보호하기 위해 납땜된 두 개의 색상으로 구분된 수축 튜브 와이어가 있는 SPST 순간 푸시 버튼 스위치. (G) SPST 순간 푸시 버튼 스위치는 제어 블랙 박스에 장착되고 포함된 육각 너트로 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 냄새 밸브 및 회로도. (A) 냄새 밸브는 슬롯에 단단히 장착되고 나사로 고정됩니다. (B) SSR48-RACK 및 나사 단자 스트립 블록에 대한 냄새 밸브 배선의 개략도. (C) 제어 블랙박스, 전원 공급 장치, SSR48-RACK 및 나사 단자 스트립 블록의 배선도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 전원 공급 장치가 있는 물 및 최종 밸브 설정. (A) 물 및 최종 밸브를 후각계의 지정된 슬롯에 추가하고 나사로 고정합니다. (B) 후각계에 전원을 공급하기 위해 연결된 전원 공급 장치 배선. (C) SSR48-RACK용 전원 배선. (D) 저항기, 전선, LED 및 연산 증폭기를 포함한 연결된 구성 요소가 있는 센서를 핥습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 유량계 및 튜브가 있는 공기 공급 시스템. (A) 나사로 랙에 부착된 유량계. (B) 튜브에 연결된 수족관 펌프, T-조인트와 결합. (C) 개별 레귤레이터에 연결된 출력에 튜브가 부착된 탄소 필터. (D) 유량계 입력에 연결된 조절기의 튜브. (E) 유량계 출력에 부착된 튜브. (F) 매니폴드에서 최종 밸브 입력까지의 튜빙. (G) 후각계 냄새 포트에 연결된 튜브가 있는 최종 밸브. (H) 물을 채운 5mL 주사기, 18G 바늘에 튜브를 부착합니다. (I) 물 밸브 입력에 연결된 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 최종 급수 밸브 연결 및 시스템 개요. (A) 물 밸브 출력에서 olfactometer의 lixit까지의 튜브. (B) 암-암 케이블을 사용하여 후각계를 DIO96H/50에 연결합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 마우스에 대한 go/no go 작업의 동작 성능 예. 각 세션의 정답 비율은 다음에 대해 표시됩니다: (A) 전방 컨디셔닝 첫날(S+: 1% 이소아밀 아세테이트, S-: 미네랄 오일). (B) 포워드 컨디셔닝의 마지막 날. (C) 반전 후 첫날(S+: 미네랄 오일, S- : 1% 이소아밀 아세테이트). (D) 역컨디셔닝의 마지막 날. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 냄새 포트에서 이소아밀 아세테이트의 농축 시간 경과. 광이온화 장치(PID)를 사용하여 냄새 포트에서 10% 이소아밀 아세테이트(광유에 희석됨)의 농도를 측정했습니다. 세로선은 냄새 전달의 시작과 끝을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

악취 연관 작업을 위해 설계된 후각계를 구성하기 위한 포괄적인 단계별 가이드는 문헌에서 찾을 수 있습니다. 연구원은 장치의 조립 및 작동 중에 다양한 문제에 직면할 수 있지만 다행히도 이러한 문제를 해결하기 위한 확립된 문제 해결 방법이 있습니다. 적절하게 구성되고 보정되면 후각계는 후각과 관련된 실험을 수행하는 과학자들에게 매우 유용한 도구 역할을 하여 냄새 자극을 정밀하게 제어하고 전달할 수 있습니다.

중요한 단계
작성된 코드가 이 버전과 호환되므로 다운로드한 MATLAB 버전은 2015여야 하며, 다른 버전을 사용하면 문제가 발생할 수 있습니다. 인스타콜에서 올바른 보드가 선택되었는지 확인하는 것이 중요합니다. mcc.dill은 MATLAB 관리자로 로그인한 상태에서 daqregister('mcc')를 실행하여 설치할 수 있습니다.

문제 해결
각 교육 주간이 시작될 때 보정 소프트웨어(InstaCal)를 실행하여 PC와 후각계가 올바르게 인터페이스하고 있는지 확인하십시오. 이 프로그램을 열고 보드를 클릭한 다음 디지털 보정을 클릭합니다. 공기 흐름 속도를 확인해야 합니다. 백그라운드 기류는 2L/분이어야 하며 냄새 평형 바이알까지의 흐름은 50mL/분이어야 합니다. 후각계의 출력에서 기류 속도를 정기적으로 확인하는 것이 매우 중요합니다.

마우스를 배치하기 전에 다음 매개변수를 테스트하는 것이 중요합니다.(1) 냄새 밸브: 냄새 밸브는 블랙 박스의 버튼을 누를 때 클릭해야 합니다. 에어 튜빙은 튜빙에 미네랄 오일이 갇히지 않은 상태에서 미네랄 오일로 거품이 일어야 합니다. (2) 냄새 튜브: 냄새로 인해 기포가 생성되지 않으면 일반적으로 밸브 근처에서 꼬집는 튜브가 막힐 수 있습니다. 튜빙 교체가 필요할 수 있습니다. (3) 최종 밸브 및 물 밸브: 최종 밸브는 튜브가 제대로 작동하는지 확인한 상태에서 올바르게 열려야 합니다. 물 밸브의 경우 물 흐름을 차단하는 모든 공기를 제거하여 물이 lixit로 흐를 수 있도록 해야 합니다. (4) 기류: 유량계는 적절하게 보정되고 배치된 것처럼 보여야 합니다. (5) 릴레이 조명: 실험 중에 릴레이의 "조명"이 올바르게 활성화되는지 확인합니다. (6) 물 보상 릴레이: 물 보상이 분배될 때 물 위의 릴레이가 보상을 분배할 때 깜박여야 합니다. (7) 냄새 및 물 보상 릴레이: 냄새가 물 보상과 쌍을 이루면 해당 밸브 번호 위의 빨간색 릴레이가 보상 중에 빨간색으로 깜박여야 합니다.

제한
go/no-go 작업은 2가지 냄새를 테스트하는 마우스의 능력을 테스트합니다. 작업을 실행하려면 동물이 여러 세션을 통해 실행되어야 합니다. 이것은 냄새 구별을 테스트하기 위한 고처리량 기술이 아닙니다. 후각계는 후각 자극을 테스트하도록 설계되었습니다. 다중 감각 테스트 장치가 아닙니다. 그러나 다른 감각 입력을 테스트하기 위해 수정할 수 있습니다.

이 문서에서는 50mL/분의 속도로 미네랄 오일에 희석된 냄새 물질을 통해 버블링되는 공기가 2L/분의 배경 공기 흐름과 사전 평형을 이루는 액체 희석 후각계에 대해 설명합니다. 이 냄새 전달 설계의 경우, 캐리어 기류에서 악취 희석의 역학은 배경 기류에서 악취 농도의 증가 속도를 결정합니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 농도는 200ms 이내에 최종 농도의 절반으로 증가하는 반면 농도 변화 속도는 30초 이상 느려집니다. 이 구성은 악취 농도의 제곱 단계 변화를 일으키지 않지만, 악취 구별 및 감지를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다21. 실험 프로토콜에서 악취 농도의 단계적 변화가 필요한 경우, 취기 물질 전달을 위한 설계를 2개의 배경 기류 채널 중 2개의 배경 기류로 부취제가 지속적으로 전달되는 3개의 연속 2L/min 백그라운드 기류 채널로 수정해야 합니다. 세 번째 공급 채널은 미네랄 오일로 평형 된 공기를 공급합니다. 이 경우 전환 밸브를 사용하여 두 가지 냄새 물질 중 하나 또는 냄새가 없는 공기를 냄새 포트로 전환합니다. 이것은 냄새 포트에서 냄새 물질 농도의 단계적 증가를 초래할 것입니다 (이전 보고서19, 22). 그럼에도 불구하고 광이온화 검출기를 사용하여 악취 농도 변화에 대한 시간 경과를 문서화하는 것이 중요합니다.

여기에 설명 된 후각계는 쥐 행동 실험 용으로 설계되었지만 과거에는 쥐에 사용되었습니다. 가장 큰 차이점은 쥐를 사용한 연구를 위해 챔버의 크기를 늘려야한다는 것입니다23. 마지막으로, 이 후각계는 단일 마우스의 후각 행동을 평가합니다. 다수의 마우스를 시험하기 위해 고처리량 자동 후각계(automated olfactometer)가 설명되었다24.

중요성
이 프로토콜은 사용 가능한 다른 방법에 비해 비용을 절감하는 맞춤형 후각계를 설명합니다.

미래의 응용 분야
olfactometer는 생쥐와 함께 사용하도록 특별히 설계되었으며 쥐와 같은 다른 동물과 함께 사용하려면 수정이 필요합니다. 다중 전극 녹음 시스템(예: 다중 전극 녹음 보드), Arduino Uno 보드 또는 카메라와 같은 추가 기능도 통합할 수 있습니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 재정적 이해관계도 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIH 보조금 K01 NS127850-01, R25 NS080685, R01 NS081248 및 DC000566의 보조금으로 지원되었습니다. Restrepo와 Ramirez-Gordillo 연구실의 모든 구성원의 지원에 감사드립니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 1/8' ’ 모듈형 IC 브레드보드 소켓발견 날짜: amazon.comASIN ‏: B004MCSOQY조명에 전원을 공급하고 검열을 핥습니다.
500 피스 모듬 탄소 필름 저항기 1/4 와트에서 발견 날짜 amazon.com
브랜드:bojack		저항기는 BreadBoard 소켓에 연결됩니다.
50k-옴 선형 테이퍼 전위차계브랜드:TWTADE
발견: Amazon.com		후각계의 구성 요소 허용

전원 공급 장치: Ac 220v-6A
변속 직경: 6mm/0.2"
샤프트 길이: 15mm/0.59" 장착 스레드.

손잡이 크기 15/17mm/0.6 x 0.67" (d*H)
전력  조정;
5mm 적색 LED발견 위치: Amazon.com
브랜드:EDGELEC		저항기가 내장되어 사전 배선되었습니다. 5mm 원형 상단 전구 및 유선 LED 3-6V DC 드라이브 연결, 7.9인치 길이 전선.

와트: 1와트
6 위치 이중 행 BRRIER 스트립발견 위치: Digikey.com기본 제품 번호
1546306		연결 방법에 따라 전원 및 접지에 사용됩니다
정격 전압: 300v
정격 전류(암페어): 20A
와이어 게이지: 12-22AWG
96 고전류 50핀 커넥터 암-암발견 위치: Amazon.com
브랜드: ‎ IIVVERR		부품 번호:‎ f5c953ee65a980d무게: 109G
피치: 2.54mm
총 크기: 50x6.4cm/2x2.5인치
수족관 펌프 -AAPA7.8L 125 GPH, 2 콘센트 3W발견 on:Amazon.com
브랜드: 하이드로팜 스토어		이것은 이중 개방형 냉수 하우징에 연결되며 기계의 공기에 전력을 공급하는 데 사용됩니다
가시 티 커넥터 폴리에틸렌 1/4"발견 위치: Uplastic.com상품 번호:62200서로 다른 공기 호스를 서로 연결합니다.
가시 티 커넥터 폴리에틸렌 3/16"발견 위치: Uplastic.com상품 번호:62063서로 다른 공기 호스를 서로 연결합니다.
BD 일반 사용 정밀 글라이드 피하 주사 바늘 18 G & frac12;발견 위치: Medneedles.com품목 번호: BD 305195급수 시스템에 사용
블랙박스/수동 제어 상자브랜드:Otdorpatio
발견: 아마존		해당 사항 없음컨트롤 박스로 사용
크기: 3.94x2.68x1.97
케이블, PC 전원 공급 장치 내부 연결 10피트발견 날짜: Amazon.com전원 공급 장치에 연결

40와트
Cflex 튜빙, 흰색 & frac14; ” ID x 3/8" 외경 발견 된 on:uplastic.com상품 번호:54033공기 시스템에 사용되는 튜브
냄새 밸브, 유량계, SSR48 보드용 랙을 고정하기 위한 구멍이 있는 맞춤형 흰색 베이스 보드CU Anschutz Medical Campus에 있는 신경 기술 센터의 기계 공장 
전환 밸브— 소형 불활성 액체 밸브, 3방향on:Radwell.com 발견부품 번호:003-0258-9001/8 BARB
24VDC
최대 1500 SCCM
4.2W
파란색 섬프가 있는 이중 개방형 냉수 하우징발견 on:GRAINGER.COM
브랜드PENTAIR/PENTEK		호환 가능한 제조업체 모델 번호150295; 150578; 151117; 151118; 151120; 155003; 244043; 244686; 244687
Fisherbrand 유리 EPA 바이알발견 위치: fishersci.com제품 번호 02-912-379냄새에 사용
피팅 감속기 1/4" x 1/8"발견 날짜: uplastic.com품목 번호: 64370공기 계통 호스에 사용되는 어댑터입니다.
하드 튜빙, 의료용 폴리에틸렌,  0.045 (ID) 1 x 100
고적외선 LEDamazon.com
에서 발견 브랜드: gikfun		메모리 클럭 속도 1mhz
Ic 연산 증폭기 gp 4 회로 14dip발견 위치: Amazon.com
브랜드:BOJACK		작동 전압 50 볼트
최대 전압 50 볼트
점퍼 와이어 키트발견 위치: Amazon.com
브랜드:Elegoo		품목 크기 LxWxH: 0.04 x 8.27 x 0.04인치
미니 spst 순간 스위치브랜드:Radioshack
발견: Amazon.com		B000TLWZM6냄새 밸브에 사용
작동 전압: 250V
정격 전류: 1암페어
멀티 미터발견 날짜 Amazon.com
브랜드:AstroAl		AC/DC 전류, AC/DC 전압, 정전 용량, 주파수, 듀티 사이클, 저항, 다이오드, 연속성 및 온도를 정확하게 측정
바늘 코발견 on:amazon.com
브랜드:WorkPro		와이어를 구부리는 데 사용됩니다.
냄새 밸브on:Radwell.com 발견SKU: 192833415
부품 번호:225T031		냄새 바이알에서 냄새를 펌핑합니다.
30 PSIG
12 VDC
포토트랜지스터발견 위치: Amazon.com
브랜드:HILETGO		전압: 1.3-1.5V
수신 범위: (NM) 400-1000
헤드 크기: 5mm x 5mm / 0.2" x 0.2"(D*L)
포토트랜지스터와 LED 쌍
파이프 어댑터 3/4" x 1/4"발견 날짜: uplastic.com품목 번호: 64807공기 계통 호스에 사용되는 어댑터입니다.
워터 하우징 펌프용 파이프 어댑터 - m ¾ x1/4"Usplastic.com품목 번호: 64807온도 범위 -50F에서 275F
최대 압력: 150psi
Weoght 0.0015lbs
전원 공급 장치 12v 30A 360W발견 위치: Amazon.com
브랜드:ALITOVE		기계의 주 전원.
  입력 전압: 220볼트
출력: 최대 DC 12V 30A
PTFE 튜빙Amazon.com 에서 발견
일반 끝이 있는 RITEFLOW 유량계(장착되지 않음)발견 on:Globalindustrial.com
모델 번호: t9FB3075514		상품 번호: H40407-0075후각계의 공기 흐름 모니터링
150mm 스케일, 크기 2
제조업체 부품 번호:H40407-0075
스크류 드라이버발견 위치: Amazon.com
브랜드:Sharden		후각계의 나사에 사용
새우 랩/튜브(전나무 18-22 게이지 와이어까지 다양한 크기발견 위치: Amazon.com
브랜드:eventronic		재질 : 폴리올레핀으로 제작, 수축률 : 2 : 1 (공급 직경의 1/2로 수축)
실리콘 튜브 0.030 x 0.065발견 on:Amazon.com
상표:과학 상품		냄새 바이알용 튜브
납땜 - 납 포함on:Uline.com 발견S-25294납땜 인두와 함께 사용됩니다.
납땜on:Uline.com 발견모델 번호 H-10799컨트롤 박스 및 기타 연결부에 Bottons를 납땜하는 데 사용됩니다.
솔리드 스테이트 릴레이 모듈 쿼드 출력 – 빨강발견 위치: https://www.sealevel.com/부품: OB5Q    모델: DC 출력 QSSR 모듈정전 용량: 8pF
치수: 2.4"(L) x 1.1"(W) x 3.1"(H)
# I/O: 4개 출력
최대 라인 전압: 60VDC
최대 온스테이트 전류: 3A
최소 라인 전압: 3VDC
작동 온도: -30° C에서 80° C (-22° F에서 176°까지; F)
출력 절연: 4000 Vrms
보관 온도: -40° C에서 100°까지; C (-40° F에서 212°까지; F)
SPST 푸시 버튼 스위치브랜드:Apiele
발견: Amazon.com		해당 사항 없음컨트롤 박스 제어 워터 밸브 및 최종 밸브 내부에 사용됩니다.
작동 전압 250v
정격 전류: 1암페어, 3암페어
Ssr랙 48on:Radwell.com 발견SKU: 83105002후각계의 모든 연결을 처리하고 쿼드형 수이드 상태 릴레이와 함께 작동합니다.
스테인레스 스틸 공급 튜브
팁 티너 및 클리너발견 위치: Amazon.com
브랜드:Thermaltronics		모델 번호: FBA-TMT-TC-2
밸브 볼 PVC 1/4" 미늘 부나발견 날짜: uplastic.com상품 번호: 62281
워터 밸브발견 날짜: Ph.parker.com부품 #: 003-0257-900챔버로 물을 펌핑합니다
최대 유량: 1500 sccm
전압(VDC): 24
최대 작동 압력: 50psi, 3.44bar
와이어 22awg상표:tuofeng
발견: Amazon.com		해당 사항 없음후각계의 다양한 구성 요소를 배선하는 데 사용됩니다
재질: 구리
게이지 30.0
와이어 스닙발견 됨 on:Amazon.com
브랜드:Billbotk		전선을 자르는 데 사용됩니다.
브랜드: PTFE부품 #036663601452냄새 물질을 전달하는 데 사용합니다.
https://medschool.cuanschutz.edu/neurotechnologycenter/Cores/machine-shop

References

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