방법 논문

생쥐의 폐경 후 골다공증 치료에서 Xiaoyao 알약의 항염증 효과에 관한 연구

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DOI:

10.3791/67051

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2024년 8월 23일

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

이 논문에서

요약

폐경 후 골다공증은 전 세계적인 공중 보건 문제가 되었습니다. 이 연구의 목적은 이 상태에 대한 중국 전통 의학 Xiaoyao 알약의 치료 효과 및 관련 메커니즘을 탐구하는 것입니다.

초록

골다공증은 노인 및 폐경 후 여성에게 흔한 대사 질환으로, 초기에는 뚜렷한 증상이 없습니다. 이 상태의 후반기에 환자는 골절되기 쉬우며, 이는 환자의 건강과 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. 전 세계적으로 기대 수명이 증가함에 따라 골다공증은 세계적인 관심사가 되었습니다. Xiaoyao 알약은 이전에
우울증 치료에 사용됩니다. 또한, 이 약물은 에스트로겐과 유사한 활성을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이는 초기 조골세포 특이적 마커인 ALP와 뼈 세포외 기질의 주요 구성 요소인 COL-1의 발현에 영향을 미쳤습니다. Xiaoyao 알약은 쥐의 폐경 후 골다공증(PMOM)에 대한 효과를 평가했습니다. Xiaoyao 알약의 각 허브 성분의 대상 정보는 TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology) 데이터베이스를 통해 액세스되었습니다. GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank 및 기타 웹사이트의 정보를 사용하여 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 Cytoscape 및 String 네트워크를 통해 허브 복합체의 조절 네트워크를 구축했습니다. 생쥐를 난소 절제술하고 고용량 및 저용량의 Xiaoyao 알약으로 치료했으며 이를 대조군과 비교했습니다. 그들의 증상은 뼈 조직의 면역세포화학으로 평가되었습니다. 그 결과, 샤오야오 알약이 IL-17 신호전달 경로를 통해 난소절제술을 받은 쥐에서 PMOM 증상을 완화할 수 있는 능력이 있음을 시사했다. 이 약물은 골다공증 치료를 위한 새로운 치료제가 될 가능성이 있습니다.

서론

세계보건기구(WHO)는 골다공증(osteoporosis, OP)을 골량의 감소와 뼈 조직의 미세구조(microstructure)의 저하를 특징으로 하는 질병으로 정의하며, 이로 인해 뼈가 부서지기 쉬워지고 골절의 위험이 증가한다1. 골다공증의 임상적 중요성은 골절로 이어질 수 있다는 것이며, 이는 높은 사망률, 이환율 및 경제적 비용과 관련이 있습니다2. 폐경 후 골다공증(PMOP)은 폐경 후 여성의 에스트로겐 수치가 감소하여 파골세포 활동이 증가하여 뼈 손실과 뼈 미세 구조의 파괴를 초래합니다. 이는 종종 건강에 심각한 영향을 미치는 골다공증을 유발한다3. PMOP에 대한 현재 치료법에는 에스트로겐 대체 요법, 비스포스포네이트 및 부갑상선 호르몬이 포함되지만 부작용의 정도가 다양하고 장기적인 순응도가 불충분하며 비용이 많이 들 수 있습니다4. 따라서 저렴한 약초는 인구의 많은 비율에게 실행 가능한 대안입니다.

샤오야오 알약은 중국 약전5에 포함되어 있으며, 여기에는 Chai Hu, Angelica sinensis, White paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, 감초, 신선한 생강 등 8가지 허브 성분이 포함되어 있습니다. 이 모든 허브는 간을 해독하고 비장을 강화하며 혈액에 영양을 공급하고 월경 주기를 조절하는 데 효과적인 것으로 알려져 있으며 우울증 치료에도 사용되었습니다6. 그러나 골다공증에서 Xiaoyao 알약의 역할은 불분명합니다.

초기 연구에 따르면 염증은뼈 손실로 이어질 수 있으며7 이 과정과 관련된 골밀도 감소는 폐경기에 의해 가속화될 수 있다고 합니다. 또한 골다공증의 발병과 염증 사이에는 강한 관계가 있습니다. 염증 인자인 인터루킨-17(IL-17)은 CD4+ T 림프구의 하위 집합인 Th17 세포에서 분비되는 전염증 인자입니다. 이 세포는 여러 만성 염증성 질환과 관련이 있으며, 류마티스 관절염에서 뼈 파괴 진행에 중요한 역할을 한다8. 또한 IL-17은 골쇄골 형성을 조절하는 핵 인자-κ B 리간드 수용체 활성제(RANKL)를 자극하여 골 형성보다 더 큰 골 흡수를 유도합니다9. IL-17은 TNFα, IL-1, IL-6 및 IL-8과 같은 다른 골쇄골 사이토카인의 발현을 자극합니다. 다른 염증 요인과 시너지 효과를 낼 수 있는 능력이 있어 중요한 염증 효과 인자(inflammatory effector)가 된다10.

연구에 따르면 샤오야오 알약과 염증 사이의 연관성도 밝혀졌습니다. Shi et al.11 및 Fang et al.12 는 최근 Xiaoyao 알약이 각각 IL-6 및 TNF-α 수치를 낮출 수 있음을 확인했습니다. 대사 관련 지방간염에 대한 또 다른 연구에서는 Xiaoyao 알약이 프로피온산의 발현을 상향 조절할 수 있으며, 이는 TNF-α의 발현을 억제하고 항염증 효과를 발휘할 수 있다고 보고되었습니다13. 그러나 현재로서는 샤오야오 알약이 이번 연구의 목적인 IL-17을 통해 염증 반응을 매개하여 PMOM의 발병을 조절할 수 있는지는 알려져 있지 않다.

본 연구는 네트워크 약리학 및 생물정보학 분석을 통해 샤오야오 알약의 표적과 골다공증 관련 유전자의 교차점을 예측하고, 교차하는 유전자를 분석하여 단백질 상호작용, GO, KEGG를 분석하였다. 예측된 결과를 바탕으로 IL-17 신호전달 경로의 핵심 단백질인 Act1 및 IL-6의 발현을 관찰할 수 있으며14,15 뼈 회전율 마커인 ALP(Alkaline Phosphatase) 및 COL-1(Collagen type I)을 관찰하여 PMOM 마우스 모델에서 Xiaoyao 알약의 치료 효능을 관찰할 수 있습니다.

프로토콜

유강의과대학 실험동물윤리위원회는 연구계획서(승인번호: 2022101502)를 승인했다. 10-12주령의 SPF 등급 및 체중(22 ± 2) g의 암컷 C57BL/6 마우스를 Youjiang Medical University for Nationalities의 SPF Class 동물 실험 센터에 수용하였다. 실험동물은 24-26°C의 온도와 55% 내지 60%의 상대습도로 유지하였다.

1. 중국 전통 의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼

참고: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)은 한의학 약리학 플랫폼으로, TCM 성분, ADME 관련 특성, 표적 및 질병에 대한 정보를 포함하고 있다16,17.

  1. TCMSP 웹 인터페이스에 액세스합니다. 허브의 이름을 검색하고 한약의 이름을 입력한 후 검색을 클릭합니다. 검색 결과에서 Latin Name(라틴 이름 )을 클릭합니다. 매개변수 OB ≥ 30% 및 DL ≥ 0.18로 성분 결과에 대한 스크리닝을 수행합니다.
  2. 모든 결과를 복사하여 Chinese Medicine Name_ingredients.txt이라는 TXT 형식으로 저장합니다.
  3. 관련 타겟 탭의 타겟 정보에서 Mol ID(즉, 1.2단계의 결과)를 필터링합니다.
  4. 필터링된 결과를 복사하여 Chinese Medicine Name_targets.txt이라는 TXT 형식으로 저장합니다.
    참고: 위의 단계를 통해 중국 전통 의학(TCM)의 모든 적격 활성 성분 및 해당 목표 정보를 얻었습니다.
  5. 위의 ingredients.txt 파일과 targets.txt 파일을 모두 같은 폴더에 넣고 Perl 스크립트(보충 코딩 파일 1)를 해당 폴더에 넣습니다.
  6. CMD를 열고 cd 폴더 경로를 입력한 다음 Perl 스크립트를 실행합니다. 새 텍스트 파일(allTargets.txt)을 가져옵니다. 이 새 텍스트 파일(allTargets.txt)에는 허브 이름, 성분 이름, 성분 ID 및 목표가 포함되어 있습니다.

2. UniProt 데이터베이스

참고: UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org/)에는 기능 정보가 주석이 달린 인간 단백질 서열이 포함되어 있으며 표적의 이름을 공식 이름18로 정규화하는 데 사용됩니다.

  1. UniProt 웹 인터페이스로 이동합니다. 검색 탭을 클릭하고 UniProtKB를 선택한 다음 검색을 클릭합니다.
  2. 왼쪽 사이드바에서 필터링하고 상태에 대해 검토됨(Swiss-Prot) 을 선택하고 인기 있는 유기체에 대해 인간 을 선택합니다. Download(다운로드)를 클릭하고, Download All(모두 다운로드)을 선택하고, Format(형식)으로 TSV 를 선택하고, Download(다운로드 )를 클릭하여 주석 파일을 다운로드합니다.
  3. 다운로드한 파일을 현재 폴더에 압축 해제하고, 압축을 푼 파일을 열고, ann.txt라는 텍스트 파일에 복사하여 붙여 넣습니다.

3. 약물 타겟 ID 변환

  1. 섹션 1에서 얻은 모든 약물 표적 파일과 섹션 2에서 얻은 UniProt 주석 파일 ann.txt allTargets.txt 폴더에 넣고 Perl 스크립트(보충 코딩 파일 2)를 넣습니다.
  2. CMD를 열고 cd + space + folder path를 입력하고 입력 한 다음 Perl 스크립트를 실행하여 새 텍스트 파일 (allTargets.symbol.txt)을 얻습니다. 이 새로운 텍스트 파일(allTargets.symbol.txt)에는 허브 이름, 성분 ID, 성분 이름 및 유전자 ID가 포함되어 있습니다.

4. 데이터베이스 검색

  1. GeneCards: 인간 유전자 데이터베이스(GeneCards) 데이터베이스
    참고: GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/)는 인간 유전자에 대한 예측 및 주석 정보를 제공합니다. 질병 표적19,20에 액세스하는 데 사용됩니다.
    1. GeneCards 웹 인터페이스로 이동합니다. 검색 상자에 osteoporosis를 입력하고 Search(검색)를 클릭합니다.
    2. 내보내기를 클릭하고 Excel로 내보내기를 선택합니다.
    3. 다운로드한 파일을 열고 관련성 점수가 1≥ 유전자를 복사한 다음 GeneCards.txt이라는 파일에 붙여넣어 저장합니다.
  2. OMIM 데이터베이스
    참고: OMIM 데이터베이스(https://omim.org)에는 인간 유전자, 유전 질환 및 특성이 포함되어 있습니다21.
    1. OMIM 웹 인터페이스로 이동합니다. GENE Map을 클릭하고 검색 상자에 osteoporosis를 입력한 다음 Search를 클릭합니다.
    2. 다른 이름으로 다운로드를 클릭하고 Excel 파일을 선택합니다.
    3. 다운로드한 파일을 열고 Approved Symbol 열의 유전자 이름을 복사하여 붙여넣은 다음 OMIM.txt라는 파일에 저장합니다.
  3. PharmGkb 데이터베이스
    참고: 약물유전체학 지식 기반인 PharmGkb(https://www.pharmgkb.org)에는 약물 라벨 주석, 약물 중심 경로, 약물유전학 요약 및 유전자, 약물 및 질병 간의 관계가 포함되어 있습니다22.
    1. PharmGkb 웹 사이트 인터페이스로 이동합니다. 검색창에 골다공증을 입력하고 검색을 클릭한 후 왼쪽 사이드바에서 유전자 를 선택합니다.
    2. 모든 결과를 수동으로 입력하고 PharmGkb.txt라는 파일에 저장합니다.
  4. TTD: 치료 대상 데이터베이스(TTD) 데이터베이스
    참고: TTD 데이터베이스(https://idrblab.org/ttd/)는 단백질 및 핵산 표적, 표적 질병, 경로 정보 및 각 표적에 대한 해당 약물에 대한 정보를 제공합니다(23).
    1. TTD 웹 인터페이스로 이동합니다. 검색 상자에 osteoporosis를 입력하고 Search(검색)를 클릭합니다.
    2. 결과의 대상 ID 아래에 있는 대상 정보를 클릭하고 대상 이름을 복사하여 붙여넣은 다음 TTD.txt이라는 파일에 저장합니다. 총 33개의 결과를 얻었습니다. 각 결과를 같은 방식으로 저장합니다.
  5. DrugBank Online(DrugBank) 데이터베이스
    참고: DrugBank 데이터베이스(https://go.drugbank.com)에는 약물 및 약물 표적, 약물 상호 작용, 약물 메커니즘 및 약물 대사에 대한 정보가 포함되어 있습니다24.
    1. DrugBank 웹사이트 인터페이스로 이동합니다. 검색 탭에서 Indications(적응증 )를 선택하고 검색 상자에 osteoporosis를 입력한 다음 Search( 검색)를 클릭합니다.
    2. 자세한 내용을 보려면 결과에서 골다공증 항목을 클릭하고, DRUGS AND TARGETS 탭을 클릭하고, 표의 TARGET 열에서 해당 링크를 클릭하십시오.
    3. Protein(단백질)에서 Details(세부 정보)를 클릭하고 Gene Name(유전자 이름)을 복사하여 붙여 넣은 다음 DrugBank.txt이라는 파일에 저장합니다. 각 결과를 같은 방식으로 저장합니다.

5. 벤 다이어그램

  1. 질병 관련 유전자 병합 및 Venn mapping
    1. 저장된 txt 파일과 스크립트를 같은 폴더에 넣습니다.
    2. R 코드(Merge Disease-Related Genes)를 열고 위의 txt 파일이 저장된 경로를 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 복사하여 붙여넣습니다.
    3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 R 코드를 실행하고, 저장합니다. 유전자를 설정하고 파일 이름을 Disease.txt.
    4. Draw Venn Diagram 웹 사이트를 엽니다. 입력 섹션에서 섹션 4에서 8까지 저장된 텍스트 내용을 복사하여 목록에 하나씩 붙여넣고 해당 데이터베이스로 이름을 지정한 다음 Submit을 클릭합니다.
    5. 이미지 아래의 PNG로 이미지 저장 을 클릭하고 텍스트 결과를 동일한 폴더에 저장합니다.
  2. 약물 표적과 질병 관련 유전자의 교차점
    1. 섹션 3에서 얻은 allTargets.symbol.txt 파일과 5.1.3단계에서 얻은 Disease.txt 파일을 같은 폴더에 넣습니다.
    2. R 코드(약물 표적과 질병 관련 유전자가 교차함)를 열고 위의 txt 파일이 저장된 경로를 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 복사하여 붙여넣습니다.
    3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 R 코드를 실행하고, 저장합니다. 유전자를 설정하고 파일 이름을 Drug_Disease.txt.
    4. Draw Venn Diagram 웹 사이트를 엽니다. 입력 섹션에서 allTargets.symbol.txt 및 Disease.txt를 복사하여 목록에 붙여넣고 해당 파일의 이름을 따서 이름을 지정합니다.
    5. 이미지 아래의 PNG로 이미지 저장 을 클릭하고 텍스트 결과를 동일한 폴더에 저장합니다.

6. TCM 컴파운딩의 규제 네트워크 구축

  1. 섹션 3에서 얻은 allTargets.symbol.txt 파일을 Disease.txt 파일 및 해당 Perl 스크립트(보충 코딩 파일 3)와 동일한 폴더에 배치합니다.
  2. CMD를 열고, cd 파일 경로를 입력하고, Enter 키를 누르고, Perl 스크립트를 실행한다. 4개의 새로운 txt 파일(net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt 및 net.type.txt)을 가져옵니다. network.txt 파일에는 TCM 성분 ID, 표적 유전자, 표적 관계 및 성분 이름이 포함되어 있습니다. net.type.txt에는 노드 이름, 속성 및 소속이 포함됩니다. net.geneLists.txt는 유전자의 목록이고, net.molLists.txt는 성분의 목록이다.
  3. 새로 얻은 텍스트 파일을 동일한 새 폴더에 복사합니다.
  4. Cytoscape 3.9.1 소프트웨어를 열고 파일, 가져오기를 차례로 클릭한 다음 네트워크 양식 파일을 선택합니다. net.network.txt 선택하고 Component ID의 첫 번째 열을 Source Node로, Genes의 두 번째 열을 Target Node로, Targeting Relationship의 세 번째 열을 Interaction Type으로 입력한 후 OK를 클릭합니다.
  5. 노드 테이블 창에서 net.type.txt 가져옵니다. 선택 탭을 클릭하고, 노드를 선택하고, ID 목록 파일에서를 선택하고, net.geneLists.txt을 선택하고, 열기를 클릭합니다.
  6. 레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고 각도 정렬된 원 레이아웃(Degree Sorted Circle Layout)을 선택한 다음 선택한 노드만(Selected Nodes Only)을 선택합니다. 노드의 높이와 너비를 모두 70으로 조정합니다.
  7. 높이(Height)에서 두 번째 상자(Second Box)를 클릭하고, 열(Column)에서 degree.layout을 선택하고, 매핑 유형(Mapping Type)에서 연속 매핑(Continuous Mapping)을 선택하고, 현재 매핑(Current Mapping)의 오른쪽에 있는 높이 조정 창(Height Adjustment Window)을 두 번 클릭하여 높이의 상한과 하한을 적절한 범위로 조정합니다.
  8. 너비 옵션을 사용하여 작업을 반복합니다.
  9. 레이아웃(Layout) 탭을 다시 클릭하고 레이아웃 도구(Layout Tools) > 노드가 겹치지 않도록 스케일을 조정합니다.
  10. 소프트웨어의 오른쪽 상단 창을 클릭하여 노드 네트워크를 선택 취소하고 선택 탭을 클릭하고 노드를 선택하고 ID 목록 파일에서를 선택하고 net.molLists.txt 선택한 다음 열기를 클릭합니다.
  11. 레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고, 그룹 속성 레이아웃(Group Attributes Layout)을 선택하고, 선택한 노드만(Selected Nodes Only)을 선택하고, 유형(Type)을 클릭합니다.
  12. 왼쪽 열에서 Label Font Size 를 클릭하고 Default Value를 12로 설정합니다. 왼쪽 열의 이미지/차트 1에서 기본값 을 클릭합니다.
  13. 팝업 창에서 차트를 선택하고 파이 차트를 클릭한 다음 사용 가능한 열 열에서 각도를 제외한 항목을 선택합니다. Layout(레이아웃)을 선택하고 Apply(적용)를 클릭합니다.
  14. 왼쪽 열에서 Border Paint 를 클릭하고 Default Value 를 #003EF8 설정합니다. 왼쪽 사이드바 하단의 가장자리 탭을 클릭하고 너비를 0.8로 설정합니다.
  15. 상단 도구 모음에서 File(파일)을 클릭하고 Export(내보내기)를 선택한 다음 Network to Image(네트워크)를 선택합니다.
  16. 팝업 창에서 형식으로 PNG 형식을 선택하고, 저장 디렉토리를 선택하고, 이미지 네트워크 이름을 지정하고, 이미지 크기 확대를 최대 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 확인을 클릭하여 이미지 저장을 마칩니다.

7. 단백질-단백질 상호 작용 네트워크(PPI) 구성

  1. STRING 웹 사이트(https://string-db.org/)를 열고, Multiple Protein을 클릭하고, 파일 업로드에서 찾아보기를 클릭하고, 5.2.3단계에서 얻은 Drug_Disease.txt 파일을 선택하고, Organisms에서 Homo sapiens 를 선택합니다. Search(검색 )를 클릭하고 Continue(계속)를 클릭합니다.
  2. 설정을 클릭하고, 필요한 최소 상호 작용 점수를 가장 높은 신뢰도(0.900)로 설정하고, 네트워크 표시 옵션에서 네트워크에서 연결이 끊긴 노드 숨기기를 선택합니다. Update(업데이트)를 클릭합니다.
  3. 네트워크 다이어그램의 노드를 조정하여 겹치거나 폐색되지 않도록 합니다.
  4. Exports(내보내기)를 클릭하고 Download(고해상도) 비트맵으로 다운로드를 클릭하여 단백질 인터워킹 네트워크 맵을 PNG 형식으로 가져옵니다. 또한 TSV 파일을 짧은 표 형식의 텍스트 출력으로 다운로드합니다. 두 파일을 모두 통합 폴더에 저장합니다. TSV 파일에는 유전자 이름, STRING 내부 ID 및 다양한 속성에 대한 점수가 포함되어 있습니다.

8. PPI 네트워크 코어 구축

  1. 섹션 7에서 얻은 TSV 파일과 필요한 Perl 스크립트를 새 폴더에 넣습니다.
  2. Cytoscape 3.9.1 소프트웨어를 열고, 파일을 클릭하고, 가져오기를 선택하고, 파일에서 네트워크를 클릭하고, 위의 TSV 파일을 선택하고, 첫 번째 열 node1을 소스 노드로, 두 번째 열 node2를 대상 노드로 입력하고, 확인을 클릭합니다.
  3. 왼쪽 사이드바에서 스타일을 클릭하고 너비에서 기본값 을 클릭한 다음 60으로 설정합니다. 노드들을 드래그 앤 드롭하여 네트워크에 겹치거나 폐색이 없도록 합니다.
  4. 위쪽 도구 모음에서 APPs 를 클릭하고 CytoNCA를 클릭한 다음 Open을 클릭합니다.
  5. 왼쪽 열의 Betweenness(매개체), Closeness(근접성), Degree(정도), Eigenvector(고유 벡터), Local Average Connectivity-based method(로컬 평균 연결성 기반 방법) 및 Network(네트워크)에서 Without Weight(가중치 없음 )를 선택하고 Analyze(분석)를 클릭합니다.
  6. 분석이 완료되면 오른쪽 하단 창에서 노드 테이블을 클릭하고, 내보내기를 클릭하고, 폴더에 저장하고, 이름을 score 1로 지정합니다.
    참고: CytoNCA 플러그인은 Cytoscape 소프트웨어에 설치해야 합니다. 이렇게 하려면 위쪽 도구 모음에서 앱을 클릭하고, 앱 관리자를 클릭하고, 검색 상자에 CytoNCA를 입력하고, 반환된 결과의 중간 열에서 CytoNCA 를 선택하고, 설치를 클릭합니다.
  7. score1을 열고, 이름 열을 첫 번째 열로 조정하고, 테이블의 정보를 복사하고, 새 텍스트 파일에 붙여 넣고, 이름을 score1.txt으로 지정하고, 저장합니다.
  8. R 코드를 열고 score1.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
  9. R 소프트웨어를 열고 수정된 코드를 실행하여 score2.txt와 score2.gene.txt이라는 두 개의 새 파일을 가져옵니다. score2.txt 파일에는 모든 프로그램 점수가 중앙값보다 큰 유전자와 각 프로그램에 대한 특정 점수가 포함되어 있습니다. score2.gene.txt에는 모든 항목에 대해 중앙값보다 높은 점수를 받은 유전자가 포함되어 있습니다.
  10. Cytoscape에서 계속하려면 오른쪽 하단 창에서 분석(Analysis) 패널 1 을 클릭하고, 창 왼쪽에서 파일에서 업로드(Upload From File )를 클릭하고, score2.gene.txt 선택하고, 열기(Open)를 클릭하고, 팝업 창에서 확인(OK )을 누릅니다.
  11. 하단의 Select Nodes 를 클릭하고 팝업 창에서 OK 를 클릭합니다.
  12. 상단 도구 모음에서 파일을 클릭하고, 내보내기를 선택하고, 네트워크를 이미지로를 클릭하고, 이미지 크기의 확대/축소(%)를 최대 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 파일을 동일한 폴더에 저장하고 이름을 network1로 지정합니다.
  13. 하단 창의 오른쪽 사이드바에서 Create Sub-Network 를 클릭하여 하위 네트워크를 생성하고, 하위 네트워크를 분석하고, 상단 도구 모음에서 APPs 를 클릭하고, CytoNCA 를 클릭하고, Open을 클릭합니다.
  14. 왼쪽 사이드바의 Betweenness(간격), Closeness(근접성), Degree(정도), Eigenvector(고유벡터), Local Average Connectivity-based method(로컬 평균 연결성 기반 방법) 및 Network(네트워크)에서 Without Weight(가중치 없음 )를 선택하고 Analyze(분석)를 클릭합니다.
  15. 분석이 완료되면 오른쪽 아래 창에서 노드 테이블을 클릭하고 내보내기를 클릭한 다음 score2라는 새 폴더에 저장합니다.
  16. score2를 열고, 이름 열을 첫 번째 열로 조정하고, 테이블의 정보를 복사하고, 새 텍스트 파일에 붙여 넣고, 이름을 score2.txt으로 지정하고, 저장합니다.
  17. R 코드를 열고 score2.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
  18. R 소프트웨어를 열고 수정된 코드를 실행하여 score3.txt와 score3.gene.txt이라는 두 개의 새 파일을 가져옵니다. score3.txt 파일에는 모든 항목에 대한 중앙값보다 높은 점수를 받은 유전자와 각 항목에 대한 특정 점수가 포함되어 있습니다. score3.gene.txt에는 모든 항목에 대해 중앙값보다 높은 점수를 받은 유전자가 포함되어 있습니다.
  19. Cytoscape에서 계속하려면 오른쪽 하단 창에서 AnalysisPanel 1 을 클릭하고, 창 왼쪽에서 파일에서 업로드 를 클릭하고, score3.gene.txt 선택하고, 열기를 클릭하고, 팝업 창에서 확인을 누릅니다.
  20. 하단의 Select Nodes 를 클릭하고 팝업 창에서 OK 를 클릭합니다.
  21. 상단 도구 모음에서 파일을 클릭하고, 내보내기를 선택하고, 네트워크를 이미지로를 클릭하고, 이미지 크기의 확대/축소(%)를 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 이 단계에서 사용한 것과 동일한 폴더에 파일을 저장하고 이름을 network2로 지정합니다.
  22. 아래 창의 오른쪽 사이드바에서 Create Sub-Network(서브 네트워크 생성 )를 클릭하여 서브 네트워크를 생성합니다.
  23. 맨 위의 도구 모음에서 파일을 클릭하고, 내보내기를 선택하고, 네트워크를 이미지로를 클릭하고, 이미지 크기의 확대/축소(%)를 최대 500%로 조정하고, 투명 배경을 선택하고, 이 단계에서 사용한 것과 동일한 폴더에 파일을 저장하고 이름을 network3으로 지정합니다.

9. 유전자 ID 변환

  1. 필요한 코드 파일과 동일한 새 폴더에 Drug_Disease.txt 파일을 배치합니다.
  2. R 코드(추가 코딩 파일 4)를 열고 Drug_Disease.txt 파일이 있는 경로를 복사하여 R 코드에서 setwd가 있는 줄에 붙여넣습니다.
  3. R 소프트웨어를 열고 org를 사용하여 수정된 코드를 실행합니다. Hs.eg.db 패키지를 사용하여 유전자 ID를 변환하고 새 파일 id.txt 완료된 후 실행합니다. id.txt에는 유전자의 기호와 해당 ID가 포함되어 있습니다.

10. GO 농축 분석

  1. 이전 단계의 id.txt 파일을 GO 농축 분석 코드와 동일한 폴더에 배치합니다.
  2. R 코드(보충 코딩 파일 5)를 열고 작업 디렉토리를 id.txt로 설정하고 GO 코드가 저장된 경로를 설정합니다.
  3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 코드를 실행하고, clusterProfiler, org를 사용합니다. Hs.eg.db 플롯, ggplot2 플롯, GO 강화 분석 히스토그램 및 버블 플롯을 풍부하게 합니다. 실행이 완료된 후 GO.txt, barplot.pdf 및 bubble.pdf의 세 가지 새 파일을 가져옵니다.
    참고: GO.txt은 농축 분류(BP, CC, MF), GO ID, GO 이름, 유전자 비율, 배경 비율, 농축 유의성 p-값, 수정된 p-값(p.adjust, 값), 유전자 ID(이름) 및 각 GO에서 농축된 유전자 수를 포함하는 농축 결과 파일입니다. barplot.pdf는 히스토그램 버블입니다. pdf는 버블 플롯입니다.

11. KEGG 농축 분석

  1. id.txt 파일을 KEGG 농축 분석 코드와 동일한 폴더에 배치합니다.
  2. R 코드(보충 코딩 파일 6)를 열고 작업 디렉토리를 id.txt 및 KEGG 코드가 저장된 경로로 설정합니다.
  3. R 소프트웨어를 열고, 수정된 코드를 실행하고, clusterProfiler, org를 사용합니다. GO 농축 분석 히스토그램, 버블 플롯 및 경로 플롯을 플로팅하는 Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 패키지. 실행은 KEGG.txt, barplot.pdf 및 bubble.pdf의 세 가지 새 파일을 생성하여 완료됩니다.
    참고: KEGG.txt 파일은 경로 ID, 경로 설명, 유전자 비율, 배경 비율, 농축 유의성 p-값, 보정된 p-값(p.adjust, qvalue), 유전자 ID(이름) 및 각 경로에서 농축된 유전자 수를 포함하는 농축 결과 파일입니다. barplot.pdf는 막대 차트이고 bubble.pdf는 거품형 차트입니다.
  4. KEGG.txt 파일에서 IL-17을 검색하십시오. 결과는 경로가 하나뿐임을 보여줍니다. 경로 ID를 복사합니다.
  5. R 코드를 열고, KEGID에 IL-17 경로 ID를 붙여넣고, pathview 패키지를 사용하여 경로 맵에 레이블을 지정합니다. 수정된 R 코드를 실행하고 hsa04657.pathview.png와 hsa04657.png라는 두 개의 새 파일을 가져옵니다.
    참고: hsa04657.png 파일은 경로 맵, hsa04657.pathview.png 레이블이 지정된 경로 맵, 빨간색으로 표시된 파일은 상호 작용 네트워크에 존재하는 유전자입니다.

12. Xiaoyao 알약의 준비

참고: 사용된 제조 방법은 중국 약전5를 참조하십시오.

  1. 차이후 100g, 당귀 100g, 백골 100g, 백 골 100g, 볶음 Atractylodes macrocephala, 포리아 코코스 100g, 기수 감초 준비산 80g, 멘테 허브 20g을 섭취합니다.
  2. 맷돌 분쇄기 또는 분말 기계를 사용하여 허브를 미세한 분말로 분쇄하십시오. 여러 허브를 위의 비율로 결합하고 미세한 분말로 분쇄하여 자연스럽게 섞습니다. 내경이 80 μm ± 180 μm 인 7.6 메쉬 약물 체를 사용하여 분쇄 된 분말을 체로 걸러냅니다. 잘 섞는다.
  3. 생강 100g에 물을 넣고 매번 20분씩 2번 끓인다. 걸러내고 따로 보관하십시오.
  4. 약패를 채취하여 작은 빗자루를 생강 물에 담근 후 플라크에 솔질하고 위의 가루를 취하여 생강수에 뿌린 후 플라크를 뒤집어 분말이 모두 젖도록 하여 공 모양으로 성형할 수 있습니다.
    참고: 약용 플라크의 형성은 TCM 알약을 준비하는 동안 필수적인 단계입니다. 대부분의 모소 대나무는 스트립으로 쪼개져 골격으로 짜여집니다. 대나무 껍질 또는 텡피는 표면에 짜여져 둥글게 됩니다. 플라크의 표면은 텅 오일로 얇게 코팅 한 다음 바니시 층으로 닦아야합니다. 이것은 방수 되도록 건조됩니다. 이런 식으로 만든 알약은 둥글고 매끄럽습니다.
  5. 생강 물을 다시 솔질하고 분말을 뿌리고 플라크를 회전시켜 약물이 점차 둥글고 확대되도록 합니다. 건조를 위해 서늘한 곳에 두십시오.

13. 동물모형의 확립

  1. 7일간의 순응 후 실험용 마우스를 4개 그룹, 즉 가짜 작업 그룹(가짜, 난소 주변의 지방만 제거한 그룹)과 모델 그룹(OVX)으로 구성된 난소 절제술 마우스의 3개 그룹과 저농도 및 고농도 Xiaoyao 알약 투여 그룹으로 무작위로 나눕니다.
  2. 복강내로 주입된 3% 펜토바르비탈나트륨(40mg/kg)으로 마우스를 마취합니다. 전신 근육 이완, 깊고 느린 호흡, 느린 움직임을 관찰하여 쥐가 마취 상태에 들어가는지 확인하십시오. 수술 전에 쥐의 눈에 눈 연고를 바릅니다.
  3. 동물을 엎드린 자세에 놓고 동물 면도기로 등의 신장 부위를 면도합니다. 75% 에탄올로 국소 소독을 수행합니다.
  4. 콩팥의 등쪽 부위에 가까운 양측으로 약 1cm의 세로로 절개하고 근막을 절개하여 근육과 복막을 분리합니다.
  5. 자궁 뿔의 윗부분과 나팔관을 찾아 결찰합니다. 탐색을 위해 절개 부위에 겸자를 삽입하고 밝은 빨간색 콜리플라워 패턴으로 지방 조직으로 둘러싸인 난소를 찾고 난소 아래에 나선형으로 배열된 나팔관이 있어 난소를 자궁 뿔과 연결합니다25. 수술용 가위와 봉합사로 난소를 제거합니다.
  6. 가짜 수술 그룹의 대조군으로 난소 근처의 소량의 지방 조직을 제거합니다. 동물이 의식을 회복할 때까지 관찰하십시오. 수술 후 동물은 완전히 회복될 때까지 별도의 케이지에 넣으십시오.
  7. 감염을 예방하려면 수술 후 3일 동안 쥐에게 겐타마이신을 투여하십시오. 수술 후에는 생쥐의 실제 상태에 따라 정상적인 식단과 양호한 성장 환경을 확보하십시오. 상처 감염이나 식욕 부진 등 이상이 있는 경우에는 즉시 실험동물센터의 강사에게 상담하십시오.

14. 약물 투여

참고: Pharmacology Experimental Methodology26에 따르면, 사용된 인간 및 동물 투여량의 전환은 70kg 성인의 경우 9g의 Xiaoyao 알약으로, 1회 투여량(1회 투여에 대한 투여량)에 해당합니다.

  1. 저용량 및 고용량 그룹의 경우 8마리 그룹에 대해 각각 0.683g/kg 및 2.73g/kg을 사용합니다. 왼손을 사용하여 쥐의 입이 식도와 일직선이 되도록 쥐를 고정시킵니다. 오른손에 gavage 바늘을 잡고 쥐의 입 모서리에서 인두 후벽을 따라 식도에 부드럽게 삽입합니다.
  2. 이 시점에서, 개비젼 바늘의 방향은 유도된 삼킴 작용을 자극하기 위해 약간 변경될 수 있습니다. 약물을 주사합니다. 12주 동안 하루에 한 번씩 이 운동을 하십시오.
  3. 가짜 운영 및 모델 그룹의 경우 12주 동안 하루에 한 번 동물의 체중에 따라 결정된 양으로 식염수를 투여합니다.
  4. 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시키고 뒷다리를 자릅니다. 팔다리를 피부를 벗겨 대퇴골에서 근육을 분리합니다. 생쥐 대퇴골을 EDTA 석회질 제거 용액으로 1개월 동안 치료하고 매일 새 용액으로 교체합니다.

15. Hematoxylin-eosin 염색(HE) 염색

  1. 8분 동안 대퇴 조직을 왁스를 제거한 다음 3분 동안 그라디언트 에탄올에 넣습니다. 흐르는 물로 1분 동안 헹굽니다.
  2. 헤마톡실린 염색 용액을 절편에 한 방울 떨어뜨려 조직을 완전히 덮고 5분 동안 염색한 후 수돗물로 세척합니다.
  3. 슬라이드의 조직에 염산 분화 용액을 추가하여 조직을 완전히 덮도록 합니다. 조직의 변색이 관찰되면 중지하십시오. 수돗물로 헹굽니다.
  4. Eosin 염료 용액을 적가하고 조직을 완전히 덮을 수 있도록 하고 30초에서 2분 동안 작용합니다. 여분의 염료를 흐르는 물로 헹굽니다.
  5. 75% 무수 에탄올로 5분 동안 그래디언트 에탄올 탈수를 수행한 다음 5분 동안 무수 에탄올을 사용하고 3분 동안 탈랍 용액을 사용하여 청소합니다.
  6. 티슈의 크기에 따라 슬라이드에 적당량의 중성 껌을 떨어뜨리고 기포를 피하면서 커버슬립을 조심스럽게 내립니다.

16. Micro-CT 및 면역조직화학 분석

  1. 다른 그룹의 마우스에서 대퇴골 표본 주변의 과도한 근육과 인대를 제거하고 샘플 조직을 4% 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정합니다.
  2. 뼈 조직을 공기 건조시키고 뼈 조직 스캔을 통해 micro-CT를 수행하여 3차원 micro-CT 데이터를 얻습니다.
  3. 보존된 마우스 왁스 블록에서 6μm 두께의 연속 섹션으로 자르고 조각을 70°C -72°C에서 30-60분 동안 굽습니다.
  4. 8분 동안 왁스를 제거한 다음 75% 무수 에탄올 처리를 5분, 무수 에탄올을 5분 동안 처리하고 PBS 헹굼을 5분 동안 3회 헹굼합니다.
  5. EDTA 고압 세척을 15분 동안 수행한 다음 PBS 세척을 5분 동안 3회 세척합니다.
  6. 3% 과산화수소를 조직에 적액 적액하고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 PBS로 5분 동안 3배 세척합니다.
  7. 면역조직화학 펜을 사용하여 원을 그립니다. PBS 워시로 3분 동안 3분 동안 세탁합니다.
  8. 1차 항체(항-ALP rabbit pAb(1:200), anti-COL-1 rabbit pAb(1:200), anti-IL-17 rabbit pAb(1:275), anti-Act1(1:500), anti-IL-6 rabbit pAb(1:500))를 밤새 염색한 후 PBS 완충액을 5분 동안 3회 헹굽니다.
  9. 2차 항체(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000))를 적가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. PBS 버퍼로 3분 동안 3회 세척합니다.
  10. 바로 사용할 수 있는 DAB에서 3-5분 동안 배양한 다음 PBS로 헹굽니다.
  11. 3분 동안 Hematoxylin 재염색을 수행한 다음 PBS 헹굼을 수행합니다.
  12. 분화 용액을 약 10초 동안 사용한 다음 PBS 헹굼합니다.
  13. 반환 파란색 용액을 10초 동안 넣은 다음 PBS 헹굼을 합니다.
  14. 75% 무수 에탄올 처리를 5분 동안, 무수 에탄올을 5분 동안 수행하고, 3분 동안 투명합니다. 슬라이드를 밀봉하기 위해 중성 수지를 사용하십시오.

결과

활성 성분 및 Xiaoyao 알약의 작용 대상
TCMSP 데이터베이스를 검색하고 경구용 생체이용률(OB) ≥ 30% 및 약물 유사 특성(DL) ≥ 0.18 기준에 따라 스크리닝한 결과, 샤오야오 알약에 125가지 활성 성분이 존재하는 것으로 밝혀졌습니다. 그 중 성분 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 및 2는 각각 White Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, 감초 및 생강에서 추출했습니다. 일부 활성 성분은 표 1에 나와 있습니다. 또한, TCMSP 데이터베이스에서 총 879개의 유효활성성분 타겟을 획득하였으며, ID 변환 및 중복값 삭제 후 232개의 타겟이 남아있었다.

TCM의 네트워크 분석 - 활성 성분 - 교차 타겟 - 질병
골다공증이라는 키워드를 사용하여 이 질병과 관련된 유전자에 대한 여러 데이터베이스를 검색했습니다. GeneCards 데이터베이스에서는 관련성 점수 ≥1에 따라 필터링한 후 1692개의 유전자를 얻었습니다. OMIM 데이터베이스에서 총 35개의 유전자를 획득했습니다. PharmGkb, TTD 및 DrugBank 데이터베이스에는 각각 3개, 33개, 386개의 유전자가 있었습니다. 그 후, 이 5개 데이터베이스의 결과를 교차하여 추가 분석을 수행했습니다(그림 1A). 4개의 데이터베이스에 표시된 유전자 중 하나는 CALCR이었습니다. 총 102개의 교차하는 유전자를 질병 관련 유전자를 결합하고 약물 표적과의 교차점을 취한 후 얻어졌습니다(그림 1B). 질병 표적과 약물의 활성 성분 간의 상호 작용을 기반으로 Cytoscape 소프트웨어로 TCM 활성 성분 교차 표적 질환 네트워크를 구축했습니다. 그 결과, 약물의 성분과 질병 관련 유전자 스캔의 다형성 조절 사이의 관계가 얻어졌습니다(그림 2A).

String 데이터베이스에서 질병 유전자와 약물 표적의 교차점에서 단백질 상호 작용을 분석하여 상호 작용 네트워크 다이어그램을 얻은 다음(그림 2B) 가장 중심적인 단백질을 스크리닝했습니다(그림 2C-D). 그 결과, 질병 유전자와 약물 표적 중 FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 및 STAT3 간의 가장 강력한 상호 작용이 나타났습니다(그림 2E).

GO 기능 및 KEGG 경로 농축 분석
GO 농축 분석은 1990개의 생물학적 과정(BP) 항목, 58개의 세포 구성 요소(CC) 항목 및 129개의 분자 기능(MF) 항목을 포함하여 총 2177개의 항목을 보여주었습니다. 혈압에서 유전자는 주로 영양 수준에 대한 반응, 산화 스트레스에 대한 반응, 산화 스트레스에 대한 세포 반응에 초점을 맞췄습니다. MF는 DNA 결합 전사 인자 결합, RNA 중합효소 II 특이적 DNA 결합 전사 인자 결합, 핵 수용체 활성, 리간드 활성화 전사 인자 활성 및 사이토카인 활성에 중점을 두었습니다(그림 3A-B).

KEGG 경로 농축 분석에서는 총 168개의 관련 신호 전달 경로를 얻었으며, 더 중요한 것은 AGE-RAGE 신호 경로, IL-17 신호 전달 경로, TNF 신호 전달 경로, HIF-1 신호 전달 경로 및 Th17 세포 분화였습니다(그림 3C-D). Xiaoyao 알약은 여러 가지 방법으로 PMOM에 치료 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다. 염증은 골다공증과 밀접한 관련이 있으며 폐경기에 의해 가속화될 수 있으며, IL-17은 중요한 염증 인자이다 7. 따라서 다음 계획은 샤오야오 알약이 IL-17과 관련하여 염증 관점에서 골다공증을 치료할 수 있는지 여부를 탐색하는 것입니다.

난소 조직 제거 전후의 뼈 조직의 구조적 변화
HE 염색은 샴 마우스의 대퇴골에서 섬유주가 연속성이 양호하고 섬유주 사이의 작은 틈, 드문 골절 및 골수강의 정상적인 크기로 단단히 배열되어 있음을 보여주었습니다. Sham 그룹과 비교했을 때, OVX 그룹의 대퇴골은 희박하게 배열되어 있었으며, 섬유주의 심각한 골절, 연속성 단절, 골수강이 눈에 띄게 확대되어 전형적인 골다공증성 변화를 보였다(그림 4A).

그룹 간 Micro-CT 비교
OVX 그룹에 속한 마우스의 대퇴골은 Sham 그룹의 마우스에 비해 불완전한 섬유주 그물망, 부분적으로 비어 있는 골수 구멍 및 뼈 피질의 얇아짐을 보여주었습니다. 샴(Sham) 그룹의 마우스는 섬유주가 풍부하고, 연속성이 양호하며, 대퇴골의 골수강이 좁아지는 것을 보여주었다(그림 4B).

생쥐에 대한 Xiaoyao 알약의 행동 효과
연구 기간 동안 OVX 그룹을 제외한 다른 그룹의 모든 마우스는 더 나은 생활 습관, 정상적인 머리 색깔, 높은 이동성 및 양호한 건강을 가지고 있었습니다. 각 쥐의 소변과 대변은 Xiaoyao 알약으로 처리 한 후 1 주일 이내에 정상으로 돌아 왔습니다. 물림, 상처 감염, 위장 폐색, 봉합 박리, 절개 부위의 피부 괴사 또는 쥐의 죽음은 없었습니다. OVX 그룹의 쥐는 탈모, 모발 색이 어두워지고, 운동성이 감소하고, 반사 신경이 길어지고, 배설이 증가하고, 먹고 마시는 것이 감소하는 경향이 있었습니다.

약물 개입 후 마우스의 병리학적 절편에 대한 HE 염색
샴 그룹에서는 대퇴 조직이 조밀하고 망상형이며 규칙적으로 배열되어 있었습니다. 골수강의 크기와 연속성은 정상이었고 인접한 골섬유주 사이의 간격은 상대적으로 작았다. Sham 그룹과 비교했을 때, OVX 그룹의 대퇴 피질과 해면골은 명백한 결함, 섬유주 감소, 틈 증가, 연속성 단절, 구조 얇아짐, 골수 구멍의 넓어짐 및 골 피질의 얇아짐을 보였다. OVX 그룹과 비교했을 때, 약물 처리(저용량 및 고용량) 그룹에서 마우스의 대퇴골 섬유주는 구조적으로 온전한 것으로 나타났으며, 간격이 좁아지고, 연결성이 증가하며, 골수강이 좁아지고, 구조가 조밀해졌습니다(그림 5A).

약물 개입 후 마우스의 이미징 지수 검출
샴 그룹과 비교했을 때, OVX 그룹의 쥐의 대퇴골은 뼈 섬유주가 드문드문 있고 부러졌으며 뼈 피질이 얇아졌습니다. OVX 그룹과 비교했을 때, 고용량 샤오야오 알약 그룹의 마우스는 골섬유주가 덜 골절되었고, 그물망이 복원되었으며, 골수강의 부분적 감소도가 유의했다. 그러나 저용량 Xiaoyao 알약으로 처리 한 쥐는 뼈 섬유주가 증가하고 골수강이 감소했지만 여전히 골절이 있었습니다. 가짜로 운영된 그룹의 뼈 섬유주(bone trabeculae)의 섬유주 구조는 더 많은 연속성과 완전성을 보여주었다(그림 5B).

약물 개입 후 그룹 조직의 면역조직화학적 결과
Act1과 IL-6는 IL-17 신호전달 경로의 핵심 단백질이며, ALP 와 COL-1 은 골형성 유전자입니다. ALP, COL-1, IL-6, IL-17 및 Act1 단백질의 발현은 뼈 조직에 황갈색 또는 노란색 과립을 형성합니다. 면역조직화학 결과, 약물군에서 ALP와 COL-1의 평균 광학 밀도 값이 Xiaoyao 알약으로 처리한 후 OVX 그룹보다 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의한 것으로 나타났습니다(p < 0.05). 약물군에서 IL-17, Act1, IL-6의 평균 광학 밀도 값은 OVX 투여군보다 낮았으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(p < 0.05; 그림 6). 샤오야오 알약은 IL-17 신호 경로에서 여러 핵심 단백질인 IL-17, IL-6 및 Act1의 발현을 감소시키면서 난소 절제술로 인한 ALP 및 COL-1의 감소를 역전시켰으며, 이는 약물이 이 경로를 통해 치료 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다.

figure-results-1
그림 1: 한약 활성 성분과 질병 관련 유전자의 교차점에 대한 네트워크 분석. (A) GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD 및 DrugBank 데이터베이스에서 얻은 질병 관련 유전자의 교차점. 이들은 각각 1692, 35, 3, 33 및 386 개의 유전자를 가진 파란색, 빨간색, 녹색, 노란색 및 갈색으로 표시됩니다. 교차점은 5개의 데이터베이스에 있는 질병 관련 유전자이고, 겹치는 부분은 각 데이터베이스에서 교차하는 유전자의 수를 나타냅니다. (B) 약물 표적(파란색은 이 데이터 세트, 즉 ID 변환 및 중복 제거 후 TCMSP 데이터베이스에서 수집된 약물 작용 표적 유전자 세트)과 질병 관련 유전자(위에서 언급한 5개 데이터베이스의 모든 유전자를 포함하는 이 데이터 세트를 나타내는 빨간색) 교차점이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: TCM의 활성 성분과 질병 관련 유전자 조절 네트워크 및 핵심 단백질의 상호 작용. (A) TCM의 활성 성분 및 질병 관련 유전자의 조절 네트워크는 Xiaoyao 알약의 각 활성 성분에 해당하는 유전자 조절 관계를 보여주며, 각 성분은 조절하는 유전자와 연결되어 있습니다. (B) STRING에서 교차하는 유전자의 단백질-단백질 상호 작용 분석 결과(네트워크 노드는 단백질을 나타내고, 가장자리는 단백질-단백질 연결을 나타내고, 다중 연결은 두 단백질 간의 다중 상호 작용을 나타냄). (C-E) String에 의해 얻어진 단백질 상호 작용은 여러 번 스크리닝되었습니다. (C) 단백질 상호 작용 네트워크는 첫 번째 스크리닝 후에 얻어졌으며 강조 표시된 부분은 핵심 부분입니다. (D) 두 번째 스크리닝 결과와 강조 표시된 부분이 핵심 부분입니다. (E) 단백질 상호 작용 네트워크에서 가장 중심적인 단백질 상호 작용 네트워크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: GO 및 KEGG 농축 분석. (A-B) 교차하는 유전자에 대한 GO enrichment 분석 결과는 BP(Biological Process), CC(Cellular Component), MF(Molecular Function)의 3개 항목으로 나뉘며, 각 항목에는 가장 유의하게 농축된 상위 10개 유전자만 표시됩니다. (C-D) 교차하는 유전자에 대한 KEGG 농축 분석 결과(가장 유의하게 농축된 상위 30개 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 난소 절제술을 받은 마우스 모델의 확립 및 평가. (A) 가짜 수술군과 난소절제술 그룹 간의 metaphyseal 골 형태 비교(10x). OVX 그룹에서는 섬유주 골절이 심하고 연속성이 단절되며 골수강이 크게 확대된 반면, 가짜 그룹에서는 섬유주 골절이 드물었고 골수강 크기는 정상이었다. (B) 가짜 수술 및 난소 절제술 그룹의 대퇴골에 대한 Micro-CT 스캔. OVX 그룹에서는 섬유주 메쉬워크가 불완전했고 골수강이 부분적으로 비어 있었습니다. 샴 그룹에서는 섬유주가 풍부하고 연속적이었으며 골수강은 좁았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: Xiaoyao 알약으로 처리한 후 HE 및 마이크로 CT 분석. (A) Xiaoyao 알약 처리 후 각 그룹에서 마우스의 대퇴골 부분의 HE 염색(10x). OVX 그룹에서는 골섬유주가 감소하고, 연속성이 중단되고, 구조가 희박하고, 골수강이 확장되었습니다. 샴 그룹에서는 골섬유주(bone trabeculae)의 연속성이 좋았고, 대퇴 조직은 구조적으로 밀도가 높았으며, 골수강은 정상이었다. OVX 투여군과 비교했을 때, 약물군의 골섬유주는 구조적으로 온전한 것으로 나타났으며, 연결성이 증가하고, 골수강이 감소했으며, 모델 투여군보다 구조가 조밀한 것으로 나타났습니다. (B) Xiaoyao 알약 치료 후 각 그룹의 쥐 대퇴골의 micro-CT 비교. 난소 절제술을 받은 그룹의 쥐의 대퇴골에 있는 뼈 섬유주는 드문드문 있고 부서진 반면, 샴 그룹은 더 연속적이고 온전한 섬유주를 가지고 있었습니다. 난소 절제술을 한 그룹과 비교했을 때, 고용량 약물 투여군의 마우스는 골섬유주가 더 적었고, 망상 구조가 복원되었으며, 골수강이 부분적으로 감소한 반면, 저용량 약물투여군의 동물은 골섬유주가 더 많았고 골수강이 감소하였으나, 골주절제는 남아 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 골다공증성 마우스에서 IL-17 신호 경로 및 골형성 마커 유전자 단백질 발현에 대한 Xiaoyao 알약의 효과를 검출하기 위한 면역조직화학(40x). ALP, COL-1, IL-6, IL-17 및 Act1 단백질의 존재에 대한 양성 반응은 뼈 조직에 황갈색 또는 노란색 과립이 나타나는 것으로 나타났습니다. 약물군에서 ALP와 COL-1의 발현은 OVX군보다 높았다(p < 0.05). 약물군에서 IL-17, Act1, IL-6의 발현은 OVX군보다 낮았다(p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

중국 전통 의학의 이름분자 ID분자 이름
화이트 paeonia lactifloraMOL001918Paeoniflorgenone
화이트 paeonia lactifloraMOL000211마이린
Atractylodes macrocephalaMOL00002214- 아세틸 -12- 세네시오일 -2E, 8Z, 10E- 아파트 틸렌트리올
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-아세톡시아트랙틸론
멘테 헤르바MOL000471알로에 에모딘
멘테 헤르바MOL005190에리오딕쇰
차이 후MOL000354이소르함네틴
차이 후MOL013187큐브빈
안젤리카 시넨시스MOL000449스티그마스테롤
안젤리카 시넨시스MOL000358베타-시토스테롤
포리아 코코스MOL000282에르고스타-7,22E-디엔-3베타-올
포리아 코코스MOL000283에르고스테롤 퍼옥사이드
감초MOL002311글리시롤
감초MOL0049907,2',4'-트리하이드록시-5-메톡시-3-아릴쿠마린
신선한 생강MOL0061296-메틸진게디아세테이트2
신선한 생강MOL001771poriferast-5-en-3beta-ol

표 1: 선택한 한약의 활성 성분. 첫 번째 열은 중국 전통 의학의 이름, 두 번째 열은 중국 의학의 활성 성분 ID, 세 번째 열은 중국 의학의 활성 성분 이름입니다.

보충 코딩 파일 1: 허브 이름, 성분 및 타겟 ID 병합 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 2: 약물 타겟 ID 변환. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 3: 네트워크 분석용 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 4: 기호에서 유전자 ID로 변환. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 5: GO 농축 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 6: KEGG 농축 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

통계에 따르면 골다공증은 미국에서 매년 150만 건의 골절을 일으키며, 이 중 대다수는 폐경 후 여성에게 발생한다27. 고령 인구가 증가함에 따라 향후 전 세계 고관절 골절의 대다수가 아시아에서 발생할 것으로 예측되며, 2050년에는 전 세계적으로 총 820만 명에 이를 것으로 예상됩니다28. 골절을 예방하는 데 드는 비용은 골절을 치료하는 비용과 거의 같으며, 약물 복용은 필연적으로 부작용을 수반할 수밖에 없다29. 따라서 책임 있는 사회에서 이 문제를 해결할 수 있는 보다 비용 효율적인 방법이 시급히 필요합니다.

Xiaoyao 알약은 8 가지 성분으로 구성되어 있습니다. 골다공증에 대한 성분의 효과에 대한 연구가 진행 중입니다. Poria cocos 는 난소 절제술된 골다공증 유발 마우스 모델30에서 골쇄골 형성 및 골 용해 활성을 억제합니다. 감초와 Shu-di-huang의 두 성분의 조합은 NF-κB 신호전달 경로(31)를 억제함으로써 항산화 효과를 발휘할 수 있다. 중국 전통 약초 강장제인 Danggui buxue tang은 뼈 회전율을 억제하고 시상하부-뇌하수체-성선(HPG) 축의 조절을 조절하여 난소 절제술을 받은 쥐에서 뼈 손실을 예방하는 능력으로 골다공증 치료에 유용할 수 있다32. 이 모든 결과는 샤오야오 알약이 골다공증에 치료 효과가 있을 수 있음을 시사합니다. 이 연구의 결과는 또한 Xiaoyao 알약이 항염증 방식으로 IL-17 신호 경로의 활동을 조절함으로써 항골다공증 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다.

본 연구에서 구축된 약물 표적 및 골다공증 관련 유전자의 조절 네트워크에서 총 168개의 관련 신호전달 경로를 획득하였으며, 본 연구에서는 IL-17 신호전달 경로를 더욱 탐구하였다. IL-17 계열은 IL-17A-F를 포함한 6종으로 구성되어 있으며, 그 중 IL-17A는 최초이자 가장 중요한 것이 발견되었다33. 초기 연구에서 IL-17은 인간의 염증성 및 자가면역 질환과 관련이 있는 것으로 생각되었습니다. 나중에, 연구는 그것이 장벽 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다고 제안했으며, 또한 암과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다15. 그러나 뼈 리모델링에서 생리적 역할을 하지는 않지만 비정상적인 뼈 상태에서는 다르게 작용합니다. 또한 IL-17은 약한 활성제로 작용할 수 있으며 다른 사이토카인과 시너지 효과를 일으켜 에너지 출력을 높입니다. 이는 TNFα15,34와의 동시 활성화로 입증됩니다.

In vitro 실험은 IL-17이 osteoblastic MSCs35의 증식 및 분화를 유도할 수 있으며, 또한 원발성 rat osteoblasts36의 BMP-2 유도 분화를 억제할 수 있음을 입증했습니다. IL-17은 조골세포를 자극하여 RANKL을 발현할 수 있으며, 이는 차례로 골쇄골 형성을 촉진하지만, 이 효과는 조골세포의 존재에 의존하는 것으로 보인다37,38. 이 연구에서 Xiaoyao 알약의 다양한 농도는 특히 더 높은 농도에서 사용되었을 때 PMOM 모델 마우스에 치료 효과를 나타냈습니다. IL-17 신호전달 경로와 상관관계가 있는 IL-17, Act1 및 IL-6은 대조군과 비교할 때 이 마우스에서 유의하게 감소했습니다. 농축 분석 결과를 평가한 결과, 이는 동물을 Xiaoyao 알약으로 치료했을 때 IL-17 경로가 관여했음을 시사했습니다.

이 연구는 또한 일부 뼈 변환 마커를 테스트했습니다. ALP는 조골세포에 의해 분비될 수 있는 사중합체 막 결합 효소로, 광물화 억제제인 피로인산39를 분해하여 뼈와 같은 형성 및 광물화에 중요한 역할을 합니다. 뼈 조직의 세포외 기질에 있는 유기 분획의 약 90%는 COL-1로 구성되어 있으며, 뼈 무기질화 과정에서 콜라겐은 이 과정에서 중요한 역할을 합니다40. 본 연구의 결과, 약물투여군 마우스의 면역조직화학검사에서 관찰된 ALP 및 COL-1 단백질 발현 수준이 모델군보다 높았으며, 이는 골다공증 개선에 샤오야오 알약의 효과가 골다공증 유전자의 지표를 증가시킴으로써 달성될 수 있음을 시사했다. 일부 학자들은 간세포 에스트로겐 수용체(ERα)의 발현과 전사 활성이 Xiaoyao san41에 의해 상향 조절될 수 있음을 입증했습니다. 샤오야오산(Xiaoyao san)에 함유된 안젤리카 시넨시스(Angelica sinensis), 화이트 파이오니아 락티플로라(White Paeonia lactiflora), 감초(Licorice)의 추출물은 에스트로겐과 유사한 활성을 보이는 것으로 나타났습니다. 이 연구에 사용된 Xiaoyao 알약에도 동일한 성분이 존재하며, 이는 현대적인 준비 방법으로 Xiaoyao san의 처방으로 만들어졌습니다. 따라서 Xiaoyao 알약은 조골세포에 에스트로겐과 같은 효과를 발휘하여 활성을 증가시키고 뼈의 질을 개선함으로써 ALP 및 COL-1 과 같은 골형성 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다는 가설을 세울 수 있습니다.

이 연구는 등쪽 난소 절제술로 양쪽 난소를 모두 제거하여 마우스에서 PMOM 모델을 성공적으로 확립했습니다. 동물 모델은 이 연구의 모든 후속 실험의 기초입니다. 마우스의 난소를 수술로 제거할 때는 OVX 및 약물 그룹에서 마우스의 난소를 완전히 제거하는 것이 중요했지만, 가짜 그룹에서는 난소 근처의 지방만 제거했으며 상처 감염을 피하는 것도 중요했습니다.

난소 절제술을 샤오야오 알약으로 처리한 후 생쥐의 골섬유주 수와 연결 밀도가 개선되었는데, 이는 이 약물이 골다공증에 치료 효과가 있음을 시사했다. 이 연구에서 치료의 효능을 평가하기 위해 면역조직화학과 면역세포화학이 사용되었습니다. 다양한 시약의 작용 시간은 절대적이지 않으며, 특히 최상의 결과를 보장하기 위해 실시간 관찰과 적시 반응이 필요한 발색 과정에서 그렇습니다. 항체 배양 중에는 항체 농도 구배가 먼저 설정되고 관찰 및 비교 후 후속 실험에 가장 적합한 농도를 선택합니다.

그러나 이 연구에는 몇 가지 한계가 있었다. 웹 약리학 데이터에는 단일 데이터 소스만 있었고 약물 구성에 대한 분석은 하나의 데이터베이스에서만 이루어졌습니다. 또한, 본 연구에서 샤오야오 알약의 효능은 양성 약물과 비교되지 않았으며, 샤오야오 알약과 현재 치료 방식 간의 구체적인 차이점을 평가할 수 없었다.

PMOM의 경우, 사용 가능한 1차 치료제는 비스포스포네이트입니다. 그러나, 이러한 약물의 사용은 위장 금기 사항을 유발할 수 있으며, 더욱 심각한 비정형 대퇴골 골절 및 턱의 골괴사증을 유발할 수 있다42,43. 2차 치료제로는 데노수맙(denosumab)과 호르몬 요법이 있다. 데노수맙(Denosumab)은 고관절, 척추 및 비척추 골절을 줄이는 것으로 나타났습니다. 그러나, 약물이 중단되면 반동이 발생할 수 있으며, 중단 기간이 길수록 골밀도 손실이 커집니다 42,44,45. 갱년기 호르몬 요법은 골다공증성 척추 골절의 위험을 감소시키지만, 그 효과는 연령에 따라 제한되며, 장기적 위험이 혜택보다 더 큰 것으로 보인다46. 순차적 치료는 PMOM에 대한 장기 치료 옵션으로, 뼈 형성 약물을 사용한 후 흡수 방지 약물을 사용하면 골량을 가장 많이 증가시킬 수 있습니다. 특정 약물은 일반적으로 환자별로 결정된다42.

이러한 점에서, 한약재는 골다공증 치료에 유리한 잠재력을 가질 수 있다고 가정할 수 있다. 한약의 작용방식은 단일한 기전을 통해 작용하기보다는 다중경로(multi-pathway)와 다중표적(multi-target)이다47. 일부 학자들은 일부 한약의 효능과 안전성을 평가한 결과, 한약과 서양 약을 함께 사용할 때 한약만 투여했을 때와 비교했을 때 발생하는 골절 건수가 서양 의학만 투여했을 때보다 적다는 것을보여주었다. 화학 약품에 비해 한약 요법은 부작용이 적고 상대적으로 저렴하며 장기간 사용하기에 적합합니다. 한약 요법은 뼈의 미세구조를 복구하고 뼈의 부피를 증가시킬 뿐만 아니라 요추 약화와 요통의 증상을 줄이거나 없앨 수 있다49. 이번 연구는 새로운 약물과 치료법을 발견하기 위한 가능한 접근법을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

PMOM을 치료하기 위해 Xiaoyao 알약을 적용하는 것은 유망한 것으로 보입니다. 본 연구에서 알약은 염증을 억제함으로써 PMOM 마우스 모델에서 골량과 뼈의 질을 향상시킬 수 있습니다. 일부 학자들은 한의학과 침술을 병행하는 것이 PMOM50의 치료에 효과적일 수 있다고 제안하기도 합니다. 동시에 한의학과 서양의학의 결합이 효과가 있음이 입증되었다51. 이 두 가지 가능한 치료법은 모두 유효하지만, 침술 및 서양 의학과 함께 Xiaoyao 알약을 사용하는 권장 치료법은 임상 시험을 통해 검증되어야 합니다. 골다공증의 임상적 의의는 골절에 있으며, 향후 연구는 골절을 예방하는 데 초점을 맞춰야 합니다.

요약하면, 이 연구는 네트워크 약리학 및 동물 실험을 통해 PMOM 마우스가 Xiaoyao 알약으로 처리한 후 뼈 대사가 크게 개선되고 골량이 증가했음을 입증했습니다. 이 현상에 대한 작용 기전은 IL-17 신호 전달 경로의 억제 및 골형성 인자, ALP 및 COL-1 활성의 향상과 관련될 수 있습니다. 이 연구는 골다공증 관련 질병의 치료에서 Xiaoyao 알약의 임상 적용을 위한 이론적 토대와 실험적 기초를 마련합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

Baise City Scientific Research and Technology Development Program(20224128)이 이 작업을 지원했습니다. 저자들은 원고를 편집해 준 임페리얼 칼리지 런던(Imperial College London)과 YMUN의 데브 수라나(Dev Soorana) 박사에게 감사를 표한다. YYX와 ZYW는 이 연구에 동등하게 기여했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1ml 샘플러Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001쥐
4%polyformaldehyde베이징 Solarbio 과학 & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)P1110: 조직 정착
6-0 흡수성 봉합사 (각진 바늘): Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06수술 후 봉합용
흡수성 면봉WinnerMIANQIU-500g살균 및 지혈용
접착 슬라이드Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105조직 단면화를 위해
Amobarbital시그마 Aldrich (상해) 무역 Co.A-020-1ML마우스 마취용
블루잉 솔루션Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)G1866헤마톡실린 분화 용액 C57BL/6 마우스의 작용 후 세포핵의 청색화
Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)동물 실험에 사용
탄소강 수술 용 블레이드Premier Medical Equipment Co.SP239마우스 수술용
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS 항체bs-6202R조직에서 Act1에 결합
Cole의 Hematoxylin Solution(기존 염색용)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)G1140파라핀 절편 염색용
콜라겐 유형 I 다클론 항체proteintech14695-1-AP조직의 COL-1에 결합
DAB 기판 키트, 20xBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)조직 색상 개발을 위한DA1010
일회용 수술 시트 50*60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777마우스 수술용
EDTA 석회질 제거 용액(pH 7.2)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)E1171-500ml조직 석회질 제거
내인성 과산화효소 블로칭 버퍼Beyotime 생명공학P0100B조직 또는 세포 내인성 과산화효소의 격리
환경 친화적인 탈왁싱 투명 액체ServicebioG1128-1L파라핀 섹션 탈랍용
에틸 알코올CHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)탈수용 파라핀 절편
범용 항체 희석제에피자임 BiotechPS119L항체 희석용
헤마톡실린 분화 솔루션ServicebioG1039-500ML헤마톡실린 염색 후 감별 및 조직에서 과도하게 결합되고 비특이적으로 흡착된 염료 제거
마톡실린 에오신(HE) 염색 키트Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)G1120-3 * 100ml조직 염색 용
고품질 스테인레스 스틸 수술 칼 핸들Premier Medical Equipment Co.SP0088마우스 수술용
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-21차 항체에 결합 및 신호 증폭
IL-17A 폴리클론 항체proteintech13082-1-AP조직 내 IL-17에 결합
IL-6 폴리클론 항체proteintech21865-1-AP조직 내 IL-6에 결합
면역조직화학 펜베이징 Zhongshan Jinqiao 생명 공학 Co.ZLI-9305 (YA0310)면역 조직 화학에서 원 그리기
: 의료 외과 봉합사 비 흡수성 (볼) 5-0 3.5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2후 봉
합 의료 봉합 바늘 각도 바늘 4 * 10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4수술 후 봉합용
중성 발삼Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)G8590슬라이스 실러로
PBS (1X)Shenzhen Mohong Technology Co., LtdB0015슬라이드 세척 및 부분 용액 희석 용 버퍼
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)Epizyme BiotechPS108P단백질의 비특이적 결합 방지
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase 항체BIOSS 항체bs-6292R조직의 알칼리 인산 가수 분해 효소에 결합
식염수제휴 병원 Youjiang Medical University For NationalitiesLHN500동물용 gavage
면도/전기 가위HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002면도용
스테인리스 스틸 의료 바늘 홀더 14cm 거친 바늘프리미어 의료 기기 Co.SP784마우스 수술 용
스테인레스 스틸 안과 겸자 10.5cm 곡선 (후크 없음)ZhuoyouyueYKNWW-10.5마우스 수술 용
스테인레스 스틸 안과 용 가위 / 수술 용 가위 10CM 스트레이트 팁프리미어 의료 장비 (ZYJD-10-ZJ마우스 수술 용
스테인레스 스틸 팁 위 바늘 12 게이지 55mm 팔꿈치GWJ-12-55Wgavage에 의해 마우스에 사용
Tris-EDTA 항원 복구 유체 (50x)proteintechPR30002파라핀 섹션의 항원 복구
용 목재 해부 보드 25 * 16cmJP16 * 24마우스 수술
용 Xiaoyao 알약Jiuzhitang Co., Ltd.YPG-041동물 약물 전달
Others
R 4.3.1데이터 처리
Cytoscape3.9.1네트워크 생물학전통 한의학에 대한 규제 네트워크 구축
ImageJ 1.54fNational Institutes of Health를 위한 이미지 처리 면역조직화학 결과
Adobe Photoshop 24.0.0Adobe이미지 조합용
GraphpadPrism 9.5GraphPad 소프트웨어데이터 셀의 통계 분석
차원OLYMPUS슬라이싱 및 촬영용
OLYMPUS BX53OLYMPUSHE 염색 및 면역조직화학 단면 사진용
에 있는 무감각을 위해 , 강화 헤 수술 주)을 위한 국가 자원

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