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방법 논문

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

1.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

2024년 7월 26일

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 온전한 Drosophila 유충에서 개별 뉴런의 레이저 세포 절제를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 발달 중인 신경계에서 뉴런 간의 경쟁을 줄이는 효과를 연구할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜은 온전한 Drosophila melanogaster 유충의 중추신경계(CNS)에서 2광자 레이저 시스템을 사용한 단일 뉴런 절제를 설명합니다. 이 비침습적 방법을 사용하여 발달 중인 신경계를 세포 특이적 방식으로 조작할 수 있습니다. 네트워크에서 개별 뉴런의 발달을 방해하는 것은 신경계가 시냅스 입력의 손실을 어떻게 보상할 수 있는지 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 개별 뉴런은 초파리의 거대 섬유 시스템에서 특별히 절제되었으며, 두 개의 뉴런, 즉 시냅스전 거대 섬유(GF)와 시냅스 후 거대 운동 뉴런(TTMn)에 중점을 두었습니다. GF는 탈출 반응에 중요한 동측 TTMn과 시냅스를 형성합니다. GF가 축삭 성장을 시작한 직후 3번째 instar 뇌의 GF 중 하나를 절제하면 CNS가 발달하는 동안 세포가 영구적으로 제거됩니다. 나머지 GF는 부재 이웃에 반응하여 반대측 TTMn에 대한 이소성 시냅스 말단을 형성합니다. 이 비정형, 양측 대칭 말단은 염료 결합에 의해 입증된 바와 같이 두 TTMns를 모두 자극하고 전기 생리학적 분석에 의해 입증된 바와 같이 두 운동 뉴런을 모두 구동합니다. 요약하면, 단일 인터뉴런의 절제는 하나의 뉴런의 손실을 보상하고 탈출 회로에 대한 정상적인 반응을 복원할 수 있는 양측 뉴런 쌍 간의 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

서론

레이저 절제술은 다양한 유기체의 신경 회로를 해부하는 데 선호되는 도구입니다. 벌레와 파리와 같은 모델 유전 시스템에서 개발된 이 기술은 신경계의 구조, 기능 및 발달을 연구하기 위해 동물계 전반에 걸쳐 적용되었습니다 1,2,3. 여기에서는 Drosophila의 회로 조립 중에 뉴런이 어떻게 상호 작용하는지 조사하기 위해 단일 뉴런 절제가 사용되었습니다. 파리의 탈출 시스템은 성체 파리에서 가장 큰 뉴런과 가장 큰 시냅스를 포함하고 있기 때문에 분석에 가장 적합한 회로이며, 이 회로는 지난 수십 년 동안 잘 특성화되어 왔다4. 뉴런-뉴런 상호 작용이 Giant Fiber 회로의 조립에서 수행하는 역할이 이 연구의 초점입니다.

1960년대에 Hubel과 Wiesel의 연구 이후 신경과학의 초점이 되어 온 상호작용의 한 유형은 "시냅스 경쟁(synaptic competition)"이다.5,6. 이 프로토콜에서는 현상의 분자적 토대를 발견할 수 있는 Drosophila의 거대 섬유 시스템(GFS)에서 단일 세포 절제를 통한 경쟁의 역할을 재검토하는 데 레이저 절제가 사용되었습니다.

발달 중인 파리에서 뉴런의 절제는 표적 뉴런의 시각화, 절제 방법의 정밀도, 표본의 생존 등 다양한 이유로 어려웠습니다. GFS에서 이러한 문제를 극복하기 위해 UAS/Gal4 시스템(7 )을 사용하여 관심 뉴런을 라벨링하고, 이광자 현미경을 사용하여 시냅스전 거대 섬유 또는 시냅스후 점프 운동 뉴런(TTMn)을 제거했습니다.

이 연구에서는 GFS에서 시냅스 연결성과 시냅스 강도를 조정하는 데 있어 인접한 양측 뉴런이 수행하는 역할을 결정하기 위해 양측 뉴런 쌍(시냅스전 GF 또는 시냅스 후 운동 뉴런) 중 하나를 번데기 발달 직전에 삭제했습니다. 이 발달 단계에서 GF 축삭 형성이 완료되지 않았습니다8. 그런 다음 성인의 시냅스 회로의 GF 구조와 기능을 검사했으며 특히 나머지 GF의 출력에 주의를 기울였습니다.

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프로토콜

프로토콜에 사용 된 모든 동물은 Drosophila melanogaster 종이었습니다. 이 종의 사용을 둘러싼 윤리적 문제는 없습니다. 이 작업을 수행하기 위해 윤리적 허가가 필요한 것은 아니었다. 연구에 사용된 Drosophila 종, 시약 및 장비에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 초파리 번식 및 올바른 유충 단계 선택

  1. 절제할 세포에서 발현을 유도하는 Gal4 드라이버 라인을 선택하고 이를 UAS-GFP 리포터 라인과 재결합하거나 교차합니다. 25 °C의 표준 플라이 먹이로 파리를 키웁니다.
    참고: 거대 섬유(GF) 절제를 위해 R91H05-Gal4 또는 A307-Gal4를 UAS-GFP와 재결합했습니다. UAS-GFP와 재조합된 ShakB(치명적)-GAL4는 TTMn 절제에 사용되었다( 재료 표 참조).
  2. 먹이에서 나오기 시작한 유충을 선택하고 먹이 바이알 측면으로 기어 올라갑니다. 그 유충은 GF 세포 절제를 수행하기 위해 선호되는 단계인 방황 단계에 있습니다.
    알림: 절제는 모든 유충 단계에서 수행할 수 있습니다. 마지막 유충 단계는 GF 세포체가 뇌에서 쉽게 식별될 수 있기 때문에 GFS 발달의 조작에 중요했지만 GF 축삭은 이 단계에서 표적에 연결하지 않았습니다.

2. 3번째 인스타 유충 준비

참고: 유충은 Burra et al.9와 유사한 방법을 사용하여 마취시켰다. 시술 시간을 단축하려면 한 번에 하나의 유충만 준비하십시오. 마취제에 대한 짧은 노출은 실험 동물의 생존을 향상시킬 것입니다10.

  1. 꽉 끼는 뚜껑이 있는 유리 접시를 준비합니다. 접시에 면봉을 놓고 흄 후드 아래에 약 3-5ml의 에틸 에테르 (위험, 인화성 액체, 실험실 가운, 장갑, 고글)를 넣으십시오. 접시를 뚜껑으로 덮으십시오.
  2. 플라이 바이알에서 개별 3번째 instar 유충을 수집합니다. 3번째 유충 단계에서 유충은 식품 배지를 떠나 식품 바이알(11)의 측면을 따라 기어 올라갑니다.
    1. 유충이 여전히 움직이고 있고 번데기 형성을 시작하지 않았는지 확인하십시오. 정지해 있고 몸이 짧아지는 유충은 번데기가 시작되고 있으며 절제에 적합하지 않습니다. 작은 붓으로 유충을 집어 올립니다.
      참고: 3번째 유충 단계는 두 번째 털갈이 후 발달 72시간(알을 낳은 후)에 시작되어 25°C에서 자란 파리의 경우 120시간에 번데기가 형성될 때까지 지속됩니다.
  3. 유충 한 마리를 작고 열린 용기에 옮깁니다. 에틸 에테르가 있는 유리 접시에 용기를 넣고 접시를 단단히 닫습니다. 유리 접시를 열 때는 연기가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 스노클 아래나 흄 후드에 넣으십시오.
    1. 30초 간격으로 접시에서 유충이 있는 뚜껑을 제거하고 해부 현미경으로 유충의 이동성을 확인합니다. 유충은 일반적으로 1분 이내에 움직일 수 없습니다. 입 고리가 경련을 멈추면 유충이 장착할 준비가 된 것입니다. 3분 후에 완전히 움직이지 않는 유충은 버리십시오.
      알림: 마이크로 원심분리기 튜브의 거꾸로 된 뚜껑 상단(튜브에서 뚜껑 제거)을 용기로 사용할 수 있습니다.

3. 절제를 위해 슬라이드에 유충 장착

  1. 마취된 유충을 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다. 곤충 식염수 한 방울에 유충을 담그십시오. 이렇게 하면 유충에 달라붙을 수 있는 음식물 찌꺼기를 씻어낼 수 있습니다.
  2. 해부 현미경으로 종이 티슈로 대부분의 식염수를 제거합니다. GF 절제를 위해 유충 등쪽을 위로 배치하거나 TTMn 절제를 위해 복부 쪽을 위로 배치합니다. 유리 커버슬립을 유충 위로 천천히 내립니다. 커버슬립 측면에 식염수를 추가하여 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공간을 채웁니다.
  3. GF 절제의 경우 박리 현미경으로 고배율로 뇌의 위치를 확인하십시오. 뇌가 수평을 이루고 큐티클을 통해 볼 수 있는지 확인하십시오. 종종 뇌는 지방 조직으로 덮여 시각화 및 세포 절제가 불가능합니다.
    1. 뇌를 덮고 있는 지방 조직을 제거하려면 집게로 커버슬립에 약간의 압력을 가하고 커버슬립을 좌우로 움직입니다. 이런 식으로 지방 조직을 뇌에서 멀리 이동할 수 없다면 대신 다른 유충을 사용하십시오.

4. 대상 세포 찾기

참고: 이 연구에 사용된 다광자 시스템은 정립 현미경에 장착되었습니다. 시스템별 소프트웨어를 사용하여 획득 및 레이저 자극 설정을 제어했습니다. 이 시스템에는 샘플을 찾기 위해 epifluorescence 광원이 장착되어 있었습니다. 대물 렌즈는 25x 배율, 2mm의 긴 작동 거리, 1.10의 개구수를 가진 수침 렌즈였습니다.

  1. 샘플을 다광자 현미경의 스테이지에 놓고 GFP 필터를 사용하여 형광 모드에서 샘플을 찾습니다. GF 절제의 경우 그림 1A,C,D에서 볼 수 있듯이 뇌에서 세포체를 식별할 수 있습니다. TTMn 절제의 경우, 그림 1A,B와 같이 복부 신경삭(VNC)의 복부 쪽에서 4개의 세포 클러스터를 식별할 수 있습니다. 초점을 맞추면 세포를 시야의 중앙에 놓고 2광자 모드로 전환합니다.

5. 절제 매개변수 설정

  1. 레이저 설정 및 검출기 게인을 조정하여 view Galvano 스캐너로 GFP 발현 세포. 870nm의 파장은 GFP 신호를 시각화하는 데 가장 적합합니다. 시야에서 셀을 중앙에 배치합니다.
  2. 원형 관심 영역(ROI)을 사용하여 절제 영역을 정의합니다. ROI가 셀 표면의 대부분을 덮는지 확인합니다(그림 1E,G).
  3. 소프트웨어에서 절제 프로토콜을 설정합니다. 한 가지 획득 프레임을 설정한 다음 자극을 설정하고 다른 획득 프레임을 설정합니다.
  4. 더 낮은 값(10%-20 %)에서 자극 레이저 출력 설정을 시작하고 자극 프로토콜을 실행합니다. 성공적인 절제는 ROI 위치에서 세포 소마 중앙에 있는 명확한 원과 ROI를 둘러싼 형광의 증가로 인식할 수 있습니다(그림 1F).
    1. 절제가 성공하지 못하고 단순히 셀을 표백한 경우(그림 1H) 레이저 출력을 5%씩 증가시키거나 루프 수를 한 번에 하나씩 늘리고 프로토콜을 다시 실행합니다. 적용된 레이저 출력은 프로토콜에 사용된 시스템에 대해 10%에서 40% 사이였습니다.
      참고: 절제를 위한 레이저 출력 설정은 세포가 조직에 얼마나 깊숙이 위치해 있는지와 큐티클 접힘과 같은 기타 요인에 따라 크게 달라집니다. 셀이 밝고 명확하게 보이면 레이저 출력은 범위의 하단에 있습니다. 레이저 출력은 레이저 모델과 레이저의 수명에 따라 시스템마다 다릅니다.

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그림 1: 온전한 Drosophila L3 유충에서 레이저 절제를 위한 뉴런 식별. (A) 뇌의 거대 섬유(GF) 소마의 위치와 복부 신경삭(VNC)의 tergotrochanteral motorneuron(TTMn)을 포함하는 운동 뉴런 클러스터의 개략도. (B) 유충 VNC에서 GFP의 shakB(치명적)-Gal4 구동 발현의 최대 강도 투영. 중간선은 점선으로 표시됩니다. 원은 레이저 절제를 대상으로 하는 TTMn을 포함하는 뉴런 클러스터를 나타냅니다. 척도 막대: 50 μm. (C) A307-Gal4의 제어 하에 GFP를 발현하는 유충 뇌의 부분 투영도. 원은 레이저 절제 대상인 GF soma를 나타냅니다. 스케일 바: 50 μm. (D) UAS-GFP를 구동하는 R91H05-Gal4를 사용한 뇌의 최대 강도 투영. 두 GF(원)는 위치, 모양 및 크기로 식별할 수 있습니다. 스케일 바: 50 μm. (E) 레이저 절제 전 GF soma 확대 보기. 자홍색 원은 레이저 절제의 대상 영역을 나타냅니다. 스케일 바: 10 μm. (F) 국부적인 레이저 출력 전달 및 성공적인 절제 후 GF soma 확대 보기. 스케일 바: 10 μm. (G) 레이저 절제 전 GF soma 확대도. 자홍색 원은 레이저 절제의 대상 영역을 나타냅니다. 스케일 바: 10 μm. (H) 국부적인 레이저 출력 전달 및 실패한 절제(표백) 후 GF soma 확대도. 눈금 막대: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 유충 회수

  1. 세포를 성공적으로 절제한 후 커버슬립을 제거하고 붓으로 슬라이드에서 유충을 부드럽게 들어 올립니다. 유충을 식품 바이알에 넣습니다. 유충은 30분 이내에 다시 기어 다니기 시작합니다.
    참고: 시술 시간을 짧게 유지하면 동물의 생존율이 향상됩니다. 경험을 쌓으면 10분 이내에 실험을 수행할 수 있습니다.
  2. 번데기 케이싱에서 닫힐 때까지 표준 조건에서 유충을 계속 키웁니다.

7. 성체 파리에서 GFS의 기능 테스트

참고: 다음 단계는 Allan and Godenschwege12 및 Augustin et al.13에 자세히 설명되어 있습니다.

  1. 성충은 에클로젼 후 2-5일 후에 실험하십시오. CO2 로 파리를 마취하고 다리를 왁스에 밀어 넣어 치과 왁스에 장착합니다. 날개를 90° 각도로 펼치고 왁스로 제자리에 고정합니다. 코를 왁스에 밀어 넣어 머리를 고정합니다.
  2. 양쪽 눈에 자극 와이어를 삽입하고, 복부에 접지선을 삽입하고, 양쪽의 점프 근육(TTM)에 유리 기록 전극을 삽입합니다.
  3. 단일 자극으로 GF 회로를 자극하여 두 근육의 반응 잠복기를 측정합니다. 각각 100Hz와 200Hz의 자극으로 회로를 자극하여 두 근육에 대해 다음 주파수를 측정합니다.

8. 컨포칼 이미징을 위한 거대 섬유 시스템의 해부 및 라벨링

참고: Fly CNS 해부 및 염료 주입은 Boerner 및 Godenschwege14에 자세히 설명되어 있습니다.

  1. 집게로 치과용 왁스에서 파리를 부드럽게 제거하고 해부 내시경 아래에서 실리콘 엘라스토머를 깐 페트리 접시에 옮깁니다.
  2. 가위로 다리, 날개, 주둥이를 제거하고 곤충 핀을 사용하여 플라이 등쪽이 위로 향하게 엘라스토머 코팅에 고정합니다.
  3. 중복부에서 흉부 전체를 거쳐 목까지 정중선을 따라 측면 절개를 하여 흉부와 머리를 연결합니다. 곤충 핀으로 파리를 엽니다. 신경계를 손상시키지 않고 파리에서 장기와 땀샘을 제거하십시오.
    참고: 이 시점에서, GF 축삭돌기에 염료를 주입하여 GF와 전기적으로 결합된 뉴런을 표지할 수 있다 13.
  4. 머리에서 머리 캡슐을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.

9. 신경계의 면역조직화학(immunohistochemistry of the nervous system)

  1. CNS 절제 후 실온(RT)에서 45분 동안 PBS의 4% PFA로 파리를 고정합니다. RT의 PBS에서 20분 동안 세척합니다(3회).
  2. 0.5% 세제 용액으로 PBS의 3% BSA에서 RT에서 1시간 동안 샘플을 차단합니다.
  3. 0.3% 세제 용액과 토끼 항-GFP(1:500)를 사용한 PBS의 3% BSA에서 4°C에서 2-3박 동안 배양합니다. RT에서 PBS에서 20분 동안 세척합니다(6회).
  4. 토끼 방지 Alexa 488을 사용하여 PBS 4 °C에서 밤새 배양합니다. RT에서 PBS에서 20분 동안 세척합니다(6회).
  5. 각 단계에서 10분 동안 오름차순 에탄올 시리즈(50%, 70%, 90%, 100% 에탄올)로 샘플을 탈수합니다. 핀을 제거하고 복부와 비행 근육을 잘라냅니다. 신경계를 포함하는 흉부의 나머지 부분을 슬라이드로 옮기고 살리실산메틸과 같은 장착 매체로 덮습니다. 샘플에 커버슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉합니다.
  6. 컨포칼 현미경으로 신경계를 이미지화하여 GF 말단의 해부학적 구조를 분석합니다.

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결과

이 방법은 초파리의 신경계에서 특정 신경 네트워크의 발달을 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 주요 연구 질문은 시냅스 연결의 형성이었습니다. 시냅스전(presynaptic) GF 또는 시냅스후(postsynaptic) TTMn을 제거함으로써 이 중심 시냅스에서의 반응성 시냅스 형성과 시냅스 기능 및 발달에 중요한 분자 메커니즘을 조사할 수 있었습니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이, GFs 중 하나 또는 TTMns 중 하나의 레이저 세포 절제를 수행하고, 성충 파리에서 번데기 발달 후 시냅스에 미치는 영향을 분석하였다.

이 시술이 동물의 생존에 부정적인 영향을 미치지 않도록 모의 절제를 병행하여 수행했습니다. 모의 절제술을 위해 동물은 실험 동물과 동일한 방식으로 취급되었지만 레이저 펄스는 0%의 레이저 출력으로 전달되었습니다. 82.4%의 사례에서 모의 절제술을 받은 동물이 성체 파리로 발달했습니다. 모의 절제 파리의 GF는 1ms 미만의 대기 시간으로 반...

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토론

2광자 현미경을 사용한 세포 절제는 초파리에서 신경 회로 발달을 조작하는 매우 성공적인 방법임이 입증되었습니다. 이 방법은 비침습적이기 때문에 동물에게 최소한의 피해를 입힙니다. 이 데이터는 알려진 회로에 대한 이러한 세포 특이적 조작의 유용성을 뒷받침합니다.

절제의 성공을 위해 가장 적합한 Gal4 드라이버를 선택하는 것이 중요했습니다. GFS가 잘 연구되었기 때문에, 많은 특정 Gal4 드라이버 라인이 설명되었다7. 대부분의 Gal4 드라이버는 매우 제한적이지만 여전히 다른 많은 뉴런에서 발현됩니다. 한 가지 과제는 온전한 동물에서 표적 세포를 신뢰성 있게 식별하는 것이었습니다. GFP 라벨이 명확하게 보이는 동물의 경우, 낮은 레이저 출력에서 절제를 수행할 수 있으며 종종 한 번의 시도만 필요했습니다. 뚱뚱한 조직이 두뇌를 덮고 있던 동물에서 GFP 표정은 약했다, 표적 세포의 삭제는 레이저 노출의 더 높은 레이저 ...

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공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

2광자 현미경에 대한 실험은 FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core에서 수행되었습니다. 재정적 지원을 해주신 Jupiter Life Science Initiative에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-green 형광 단백질, 토끼Fisher ScientificA111221:500 농도
Apo LWD 25x/1.10W 객관적인NikonMRD77220침수 긴 작동 거리
소 혈청 알부민(BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
CottonBall Genesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable(플루오로-루비)Fisher ScientificD1817
Gu and O'Dowd의초파리 식염
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1위험, 인화성 액체
플라이 푸드 B (블루밍턴 레시피)LabExpress7001-NV
메틸 살리실레이트Fisher ScientificO3695-500
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mLEppendorf22363204
현미경 커버 슬립 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
뉴로비오틴 트레이서벡터 실험실SP-1120
Nikon A1R, 다광자 현미경직립 FN1 마이크로솝 스탠드의Nikon
, NIS 요소, 고급 연구, Nikon수집 및 데이터 분석 소프트웨어
파라포름알데히드(PFA),Fisher ScientificT353-500
PBS(인산염 완충 살린),Fisher BioReagentsBP2944-100정제
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(치명적)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost 현미경 유리 슬라이드Fisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000세제 용액
UAS-10xGFPBloomington 초파리 재고 센터32185
수 레시피, 2006: , , , , , , ,

참고문헌

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  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
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  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

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