Method Article

담배 연기 추출물로 자극된 쥐 기도 상피 세포에서 다중-오믹스의 분화 및 변화를 연구하기 위한 시험관 내 모델

DOI:

10.3791/67057

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July 12th, 2024

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1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 만성 담배 연기 추출물(CSE)에 대한 적응에 초점을 맞춘 쥐 기도 상피 세포를 분리하고 분화하기 위한 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 모델은 CSE의 다중 오믹스 영향을 종합적으로 특성화하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 연기 노출 시 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 주로 담배 연기 노출에 기인합니다. 기도 상피 세포가 담배 연기에 기능적으로 적응하는 방법을 조사하는 것은 COPD의 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요합니다. 본 연구는 담배 연기의 실제 영향을 모방하기 위해 일차 쥐 기도 상피 세포를 사용하여 시험관 내 모델을 설정하는 것이었습니다. 확립된 세포주와 달리 일차 세포는 성장 패턴, 노화 및 분화를 포함한 in vivo와 유사한 특성을 더 많이 유지합니다. 이 세포는 민감한 염증 반응과 효율적인 분화를 나타내므로 생리적 상태를 밀접하게 나타냅니다. 이 모델에서는 최적 농도의 담배 연기 추출물(CSE)을 사용하여 공기-액체 계면에서 28일 동안 배양한 결과, 미분화 세포의 단층이 CSE 순응을 나타내는 가성층화된 원주 상피로 변형되었습니다. 그런 다음 CSE가 기저 기도 세포의 분화에 영향을 미치는 메커니즘을 밝히기 위해 포괄적인 다중 오믹스 분석을 적용했습니다. 이러한 통찰력은 담배 연기 노출에 대한 반응으로 COPD 진행을 뒷받침하는 세포 과정에 대한 심층적인 이해를 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 복잡한 특성을 가진 이질적인 폐 질환이며, COPD 환자는 점차 젊어지는 경향이 있습니다1. COPD2의 주요 위험 요인인 흡연은 담배 연기에 대한 초기 장벽 역할을 하는 기도 상피 세포에 지대한 영향을 미칩니다. 이러한 알려진 연관성에도 불구하고, 담배 연기가 기도 상피 세포의 변화를 유도하는 자세한 메커니즘은 여전히 충분히 연구되지 않았습니다. 이러한 분자 변화에 대한 철저한 이해는 COPD의 조기 진단 마커와 치료 표적을 식별하는 데 필수적입니다.

이 간극을 해결하기 위해 우리는 쥐 기도 상피 세포를 사용하는 새로운 in vitro 모델을 개발했습니다. 이 세포는 담배 연기 추출물(CSE)로 장기간 자극을 받았기 때문에 역동적인 세포 변화를 모니터링하고 장기 담배 자극 하에서 기도 상피 세포의 변화와 기전을 조사할 수 있었습니다. 이 모델에서는 기도 상피 세포의 공기-액체 인터페이스를 제공하기 위해 transwell을 사용하였으며, 담배 연기 추출물은 상피 세포 분화의 초기 단계에서 28일에 분화가 끝날 때까지 자극되었습니다. 이전 연구에서는 기도 상피 세포(세포주 우성)의 분화와 단기 자극만 조사했습니다. 그들은 단일 규제 경로 3,4,5,6으로 제한되었습니다. 그러나 여기에 제시된 프로토콜은 일차 마우스 기도 상피 세포를 사용하고 이전 기도 상피 세포 배양 방법보다 더 나은 세포 활성을 위해 세포 추출 과정을 최적화합니다. 이 모델은 포괄적인 전사체(transcriptomic), 단백질체(proteomic), 메타볼로미(metabolomic) 및 후성유전체학(epigenomic) 분석과 함께 세포 분화의 변화에 초점을 맞춥니다. 면역형광 및 첨단 멀티오믹스 기술을 사용하여 만성 담배 연기 노출에 대한 기도 상피 세포의 세포 반응을 규명하여 COPD 발병 기전에 대한 더 깊은 이해에 기여하는 것을 목표로 했습니다. 이 모델은 다양한 오염 물질의 장기 자극에 의해 유발되는 기도 상피 세포 분화 패턴의 변화와 그 메커니즘을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전체 프로토콜은 쥐 기관에서 분리된 기도 상피 세포의 준비에 1일, 세포 증식에 15일, 공기-액체 계면에서 CSE 자극에 28일을 포함하여 44일이 필요합니다. 모든 실험동물은 캐피탈의과대학 동물실험센터 SPF 배리어동물실에 수용되며, 캐피탈의과대학 동물실험 및 실험동물윤리위원회(AEEI-2020-100)의 검토 및 승인을 받아 ARRIVE 가이드라인7의 요구사항을 충족합니다.

1. 쥐 기관에서 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분리

  1. 준비
    1. 50x 보충제 1mL와 하이드로코르티손 스톡 0.05mL를 48.95mL 팽창 기저 배지와 결합하여 완전한 팽창 배지를 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 4주 이내에 사용하십시오.
    2. 7.5mg의 proteinase와 5mg의 deoxyribonuclease I을 Ham's F-12 5mL에 용해시켜 proteinase 용액을 준비합니다. 여과하여 멸균하여 4 °C에서 보관하고 4 주 이내에 사용하십시오.
    3. 0.05mL의 100x 페니실린/스트렙토마이신과 0.01mL의 500x 겐타마이신/암포테리신을 5mL의 완전 팽창 배지, PBS 및 단백질 분해효소 용액(100U/mL 페니실린, 100U/mL 스트렙토마이신, 10μg/mL 겐타마이신 및 0.25μg/mL 암포테리신 B)에 추가하여 항생제 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 4주 이내에 사용하십시오.
    4. 수술 기구를 멸균하고 세포 분리를 위한 생물학적 안전 작업대를 준비합니다. 동시에 표준 세포 배양 장비를 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.
    5. 쥐 꼬리 콜라겐(0.02N 아세트산에서 100μg/mL)을 100mm 배양 접시와 24mm 트랜스웰(0.05mL/cm2)에 첨가하여 쥐 꼬리 콜라겐 코팅 접시를 준비합니다. 살균을 위해 UV 광선 아래에서 밤새 열어 두십시오.
  2. 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분리
    1. 기관 상피 세포 분리를 위해 C57BL/6 마우스(6-8주령, 수컷, SPF 상승)를 사용합니다. 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액 과다 투여(약 200mg/kg)로 안락사시킨다. 충분한 세포 수율을 위해 5마리의 마우스를 사용합니다.
    2. 알코올이 기관으로 유입되는 것을 방지하기 위해 코와 입을 알코올에 담그지 말고 75% 에탄올 용액에 담가 쥐를 살균합니다.
    3. 마우스를 해부합니다.
      1. 수술용 칼날과 집게를 사용하여 아래턱에서 쥐의 복강까지 표피를 자르고 열기 위한 한 세트의 장치를 사용합니다.
      2. 다른 수술 기구를 사용하여 양쪽의 갑상선을 찢고 기관, 주변 근육 조직 및 식도 사이의 연결을 제거합니다.
      3. 그런 다음 조심스럽게 가슴을 절개하고 집게를 사용하여 흉강 깊숙이 파고들어 폐 전체를 꺼내 기관의 끝을 찾습니다.
    4. 기관을 처리합니다.
      1. 갑상선 연골에서 기관지-기관지 가지까지의 기관을 잘라내고 4가지 항생제가 들어 있는 저온 전 팽창 배지에 넣습니다.
      2. 튜브를 흔들어 기관 표면에서 가능한 한 많은 피를 헹구고 얼음 위에 유지한 다음 다음 쥐를 위한 수술을 시작합니다.
    5. 수집된 모든 기관을 4가지 항생제(200U/mL 페니실린, 200U/mL 스트렙토마이신, 20μg/mL 겐타마이신, 0.5μg/mL 암포테리신 B)가 포함된 사전 냉각 PBS 버퍼로 옮겨 분해 전 전처리합니다.
    6. 수술 기구 세트를 사용하여 기관 표면에서 혈전 및 기타 조직을 제거한 다음 1cm2 크기로 자릅니다.
    7. 기관 조직을 proteinase 용액에서 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
    8. 40분 후 튜브를 여러 번 흔들고 40μm 세포 여과기를 사용하여 나머지 조직을 제거합니다. 5mL의 팽창 매체로 여과기에 잘게 잘린 기관을 헹구고 세포 현탁액을 400 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리 한 다음 상층액을 버립니다.
    9. 얻어진 세포를 8mL의 팽창 배지에 재현탁시킵니다.
    10. trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
    11. 쥐 꼬리 콜라겐으로 사전 코팅된 100mm 접시(1 x 104 live cells/cm2)에 플레이트 P0 세포 현탁액을 놓고 37°C, 5%CO2의 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

2. 원발성 쥐 기도 상피세포의 확장 배양 및 통로

  1. 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 P0 세포 배양용 배지를 3일마다(일반적으로 6일 이내) 교체합니다. 이 시점에서, 쥐 기관 상피 세포는 조약돌 모양의 온전한 단층을 형성할 수 있습니다(그림 1A-D).
  2. 충분한 양의 PBS, 완전 팽창 배지 및 ACF(Animal Component-Free) 세포 해리 키트를 37°C로 사전 예열합니다.
  3. PBS 3mL로 세포를 부드럽게 헹굽니다.
  4. 효소 해리를 수행합니다.
    1. ACF 효소 해리 용액 3mL를 접시에 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 피펫팅 후 세포를 부드럽게 제거하고 세포 현탁액을 3mL의 ACF 효소 억제 용액으로 옮깁니다.
    2. ACF 효소 해리 용액 3mL의 추가를 반복하고 세포 분리를 극대화하기 위해 5분 동안 다시 배양합니다.
  5. 셀 현탁액을 400 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버립니다.
  6. 1mL의 확장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
  7. trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
  8. 쥐 꼬리 콜라겐으로 사전 코팅된 여러 100mm 접시(5 x 104 live cells/cm2)에 P1 세포 현탁액을 플레이트하고 37°C, 5% CO2의 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

3. 공기-액체 계면에서 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분화 및 CSE 자극

  1. 셀 유형을 확인합니다.
    1. 사이토케라틴에 대한 항체가 있는 면역형광 분석(IFA)을 사용하여 분리된 세포의 상피 기원을 확인합니다. 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅된 유리 슬라이드에 세포를 종자하고 파라포름알데히드를 사용하여 세포가 80% 밀도에 도달한 후 최소 12시간 동안 고정합니다.
    2. PBS 용액으로 슬라이드를 3분 동안 5회 세척하고 실온(RT)에서 3시간 동안 PBS 용액에 0.1% BSA 및 0.1% triton X-100으로 배양합니다.
    3. 4 °C에서 1:500으로 희석하여 상업용 anti-pan cytokeratin 항체와 함께 슬라이드를 밤새 배양합니다.
    4. 다음 날, PBS 용액으로 슬라이드를 5분 동안 3회 세척하고 어두운 곳에서 2시간 동안 RT에서 1:1000으로 희석하여 2차 항체 완충액으로 배양합니다.
    5. 배양 후 PBS로 슬라이드를 3회 세척하고(세탁당 5분) DAPI를 1:1000으로 희석하여 추가합니다. RT에서 15분 동안 배양한 후 PBS로 5분 동안 슬라이드를 한 번 세척합니다.
    6. 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 발현 패턴을 양성 대조군(A549 세포주) 및 음성 대조군(Raw264.7 세포주)과 비교합니다(그림 2).
  2. 분화를 위해 세포에 씨를 뿌립니다.
    1. 앞서 설명한 대로 P2 세포를 분리 및 원심분리하고, 1 x 104 live cells/cm2의 도금을 용이하게 하기 위해 세포 펠릿을 적절한 부피의 팽창 매체에 재현탁시킵니다.
    2. 1mL의 세포 현탁액을 transwell 폴리카보네이트 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 피펫팅합니다. 트랜스웰의 기저 구획에 1.5mL의 증식 배지를 추가합니다.
  3. 37 °C에서 세포를 배양하고 합류점에 도달할 때까지 팽창 배지를 사용하여 3일마다 기저 및 정점 챔버의 모든 배지를 완전히 교체합니다. 일반적으로 3-6일이 소요됩니다.
  4. ALI 10x Supplement 5mL, ALI Maintenance Supplement 500mL, 헤파린 용액 100μL, 하이드로코르티손 원액 250mL를 ALI 기초 배지 44.15mL에 추가하여 50mL의 완전 분화 배지를 준비합니다.
  5. CSE를 준비합니다.
    1. 담배 1개비를 12.5mL의 분화 배지에 거품을 낸 다음 0.22μm 기공 필터를 통해 여과하여 CSE를 준비합니다. 실험과 CSE 배치 간의 표준화를 보장하려면 분광 광도계에서 320nm에서 흡광도를 측정하고 광학 밀도(OD) 1을 100%8로 정의합니다.
  6. 적절한 농도의 CSE를 함유한 분화 배지를 사용하여 원발성 쥐 기도 상피 세포를 자극하여 세포의 분화에 미치는 영향을 검출합니다.
  7. 세포가 28일 동안 분화하도록 하며, 이 기간 동안 기저실 배지를 교체하고 정점 챔버 배지를 제거하고 기저실 배지를 적절한 농도의 CSE가 포함된 분화 배지로 교체하여 정점 쪽을 일주일에 두 번 세척합니다.
  8. 노출 후 세포를 분석합니다.
    1. CSE를 함유한 분화 배지에 노출시킨 후 형태학적 변화(즉, 면역형광 분석(IFA) 또는 헤마톡실린-에오신 염색(HE) 또는 생물정보학 분석 절차(즉, 전사체학, 단백질체학, 대사체학 등)를 검출하기 위해 언제든지 시점(즉, 0-28일)에 세포와 배양 상층액을 수확합니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분화
Murine 기도 상피 세포는 분화 배지를 사용하여 공기-액체 계면에서 배양한 후 성공적으로 분화되었습니다. 섬모 세포와 잔 세포의 존재는 섬모 마커 아세틸화 α-Tubulin(녹색; 그림 3A) 및 잔 세포 마커 Mucin5AC, 각각6 (빨간색; 그림 3B).

세포 분화를 위한 CSE 농도 측정
24시간 동안 서로 다른 농도의 CSE로 분리된 상피 세포를 자극합니다. 그 결과, CSE 농도가 6% 이상일 때 상피세포의 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났습니다(p <0.05, 그림 4A). 장기간의 자극 하에서 세포 활성을 유지하기 위해 2%, 4% 및 6% CSE를 함유한 배양 배지를 사용하여 28일 동안 상피 세포의 분화를 자극했습니다. 또한, 그 결과 CSE 농도가 증가함에 따라 상피 세포에서 유의미한 세포 사멸이 없었지만(그림 4B), 세포간 막관통 저항성(TEER)(그림 4C) 및 박리된 세포(그림 4D)의 수에는 점진적인 변화가 있음을 보여주었습니다. 또한, 쥐 기도 상피 세포 배양이 CSE에 만성적으로 노출되었을 때 분화된 세포와 섬모 세포의 전반적인 감소가 관찰되었습니다(그림 4E-H). 따라서 6% CSE를 함유한 분화 배지를 선택하여 28일 동안 상피 세포를 분화시키면서 세포 생존력의 감소 없이 상피 장벽 기능을 조절하지 않고 섬모 세포 수를 감소시켰습니다.

멀티오믹스 분석
28일 동안 0% 또는 6% CSE를 함유하는 차등 배지로 자극된 두 그룹의 세포를 수거했습니다. 전사체학 분석을 위해 총 mRNA를 추출했습니다. 라이브러리 준비, 염기서열분석, 품질관리, 참조 게놈에 대한 읽기 매핑, 유전자 발현의 정량화 후 두 그룹 간의 유전자 발현 차이를 분석했습니다. clusterProfiler R 패키지는 유전자 길이 불일치를 설명하기 위해 조정과 함께 차등 발현을 보이는 유전자에 대한 유전자 온톨로지(GO)의 농축 분석을 수행하는 데 사용되었습니다(그림 5A). KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)는 게놈 염기서열 분석 및 고처리량 실험 방법론에 의해 생성된 것과 같은 광범위한 데이터 세트에서 파생된 분자 수준 데이터를 통합하여 세포, 유기체 및 생태학을 포함한 다양한 수준에서 복잡한 생물학적 시스템의 기능과 역할을 쉽게 이해할 수 있는 포괄적인 데이터베이스 역할을 합니다(그림 5B)). 단백질체학의 경우, 0% 또는 6% CSE를 함유하는 차등 배지로 배양 후 28일에 두 그룹의 세포에서 총 단백질을 추출했습니다. 단백질 품질 검사, 염분 제거, 단백질 효소 가수분해, 펩타이드의 TMT(Tandem Mass Tags) 라벨링, 분획 분리, LC-MS 분석, 단백질 식별 및 단백질 정량 분석 후 두 그룹 간에 차등적으로 발현된 단백질을 정의할 수 있습니다. GO 분석은 비중복 단백질 데이터베이스(그림 6A)에 대해 interproscan 프로그램을 사용하여 수행되었으며 KEG는 경로를 분석하는 데 사용되었습니다(그림 6B). 대사체학의 경우, 배양 상층액은 0% 또는 6% CSE를 함유하는 분화 배지로 배양 후 28일에 기도 상피 세포의 두 그룹에서 수집했습니다. 대사 산물의 HPLC-MS/MS 분석, 식별 및 정량화 후 두 그룹 간의 차등 대사 산물을 정의할 수 있습니다. KEGG 데이터베이스(그림 7A), 인간 대사체 데이터베이스(그림 7B) 및 지질지도 데이터베이스(그림 7C)를 사용하여 모든 대사 산물에 주석을 달았습니다. KEGG 데이터베이스는 이러한 차등 대사 산물 및 대사 경로의 기능을 분석하는 데 사용되었습니다(그림 7D). 후성유전체학의 경우, ATAC-seq는 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다9. 배양 후 28일에 0% 또는 6% CSE를 함유하는 차등 배지로 두 그룹의 세포에서 핵을 추출하고, 핵 펠릿을 Tn5 transposase 반응 혼합물에 재현탁시켰다. 전치 반응을 37°C에서 30분 동안 배양하였다. 어댑터, 라이브러리 준비, 품질 평가, 클러스터링 및 염기서열분석을 추가한 후 두 그룹 간의 차등 후성유전체학을 정의할 수 있습니다. 차등 피크 관련 유전자의 GO 농축 분석은 생물학적 과정, 세포 구성 요소 및 분자 기능이 풍부한 GO 항목에서 차등 피크 관련 유전자의 수 분포를 직접 반영합니다(그림 8A). KEGG 데이터베이스는 이러한 차등 유전자 및 경로의 기능을 분석하는 데 사용되었습니다(그림 8B).

tight junction 단백질을 암호화하는 유전자
전사체 데이터에 따르면 CSE의 장기 자극 후 Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 및 Ocrn을 포함한 밀착 연접 단백질을 암호화하는 수많은 유전자의 발현이 감소했으며(그림 9A), Cldn3 및 Ocln의 감소된 발현은 Western-Blot 및 면역조직화학(IHC)에 의해 추가로 확인되었습니다(그림 9B-E)). 이러한 데이터는 CSE에 노출되면 기도 상피 세포의 단단한 접합 단백질의 발현이 현저히 감소한다는 것을 시사합니다.

사이토카인(Cytokine)과 케모카인(chemokine) 발현
긴밀한 연결의 파괴 외에도 전사체학은 CSE의 장기 자극 후 Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 및 Il33을 포함한 일부 사이토카인 및 케모카인의 발현은 증가하지만 Ccl5의 발현은 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 10A). Luminex 테스트는 쥐 기도 상피 세포의 상층액에서 CXCL-5, CSF-3 및 IL-1α(그림 10B-D)의 농도가 증가했지만 CCL-5(그림 10E)가 감소했음을 추가로 확인했습니다. 이러한 결과는 CSE에 대한 노출이 사이토카인과 케모카인의 발현에 선택적으로 작용한다는 것을 시사합니다.

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그림 1: 원발성 쥐 기도 상피 세포의 성장. (A) 새로 분리된 세포는 둥글고 투명하게 나타납니다. (B) 분리 후 2일째까지 팽창된 세포가 작은 세포 섬으로 형성되었습니다. (C) 4일째 되는 날, 더 큰 세포 섬이 형성됩니다. (D) 6일째까지 조약돌 형태와 90% 이상 융합. (4배 확대, 눈금 막대: 250μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 상피 세포 마커의 면역형광 분석. 원발성 쥐 기도 상피 세포에서 사이토케라틴 발현, A549(양성 대조군) 및 Raw264.7(음성 대조군). DAPI로 염색된 핵(63배 확대, 눈금 막대: 40μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 섬모 세포와 잔 세포의 마커에 대한 면역형광 분석. 사용된 마커는 섬모 세포와 잔 세포를 확인하기 위해 각각 아세틸화된 (A) α-Tubulin 및 (B) Mucin 5AC였습니다(100 배율, 스케일 바: 패널 A에서 10 μm 및 패널 B에서 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: CSE 농도가 상피 세포에 미치는 영향. (A) 다양한 CSE 농도에서 24시간 동안의 세포 생존율. (B) 28일째의 세포 생존율. (C) TEER 측정. (D) 박리된 세포의 수. (E-H) 0%, 2%, 4% 및 6% CSE 농도에서 섬모(녹색) 및 잔 세포(자주색)에 대한 면역형광(20배 확대, 눈금 막대: 50μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 유전자 발현을 위한 GO 및 KEGG 농축 분석. (A) 농축 생물학적 과정, 세포 구성 요소 및 분자 기능에서 GO 용어 중요성. (B) KEGG 경로에서 차등적으로 발현된 유전자의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 단백질 발현 분석. (A) 차등 단백질 발현을 보여주는 GO 농축 막대 차트. (B) 차등적으로 발현된 단백질을 기반으로 한 KEGG 경로 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 대사 산물 KEGG 경로 분석. (A) KEGG 데이터베이스를 사용하여 모든 대사 산물에 주석을 달았습니다. (B) Human Metabolome Database를 사용하여 모든 대사 산물에 주석을 달습니다. (C) Lipidmaps 데이터베이스를 사용하여 모든 대사 산물에 주석을 달습니다. (D) 다양한 KEGG 경로에서 차등적으로 발현된 대사 산물의 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: 차등 피크 관련 유전자 발현 분석. (A) 차등 단백질 발현을 보여주는 GO 농축 막대 차트. (B) 차등적으로 발현된 단백질을 기반으로 한 KEGG 경로 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9: CSE 자극을 사용하거나 사용하지 않은 쥐 기도 상피 세포에서 tight junction protein의 발현. (A) transcriptome에서 tight junction protein 발현의 히트맵. (B-E) 쥐 기도 상피 세포에서 (B,C) Cldn3 및 (D,E) Ocrn의 발현 수준은 Cldn3 및 Ocln에 대한 Western Blot 및 면역조직화학에 의해 검출되었습니다(80 배율; 눈금 막대: 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 10: 사이토카인 발현 분석. (A) 사이토카인 발현의 전사체 히트맵. (B-E) CSE 자극이 있거나 없는 세포의 CXCL-5, CSF-3, IL-1α 및 CCL-5 수준에 대한 Luminex 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

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COPD는 흔한 만성 기도 염증성 질환입니다. 담배 연기에 노출되면 만성 기도 염증, 기도 재형성 및 폐 구조 파괴가 발생하는데, 이는 다양한 구조 세포와 면역 세포의 상호 작용의 결과입니다10. 폐의 선천성 면역 체계의 최전선인 기도 상피 세포는 질병 발병 과정에서 매우 중요한 역할을 합니다11. 이러한 관점에서 상피 세포가 유해 물질의 자극에 의해 하류 세포가 어떻게 변화하고 조절하는지 밝히는 것은 시급히 해결해야 할 과학적 문제입니다.

최근에는 일부 한계를 극복한 COPD의 여러 동물모델에서 보고되고 있다12. 이 모델에서는 중등도의 호중구성 기도 염증, Th1/Th17 염증 신호, 현저한 점액 과잉 생성, 기도 리모델링 증가, 폐 기능 저하 및 확대된 기도를 관찰할 수 있습니다. 이러한 모델은 COPD와 같은 변화를 확립하는 데 1개월밖에 걸리지 않지만, 1개월 이내에 담배 연기에 노출된 쥐에서 무슨 일이 일어났는지는 아직 불분명합니다. 장기간의 CSE 자극을 사용하면 더 쉽게 보정할 수 있다는 장점이 있는데, 이는 기도 상피 세포가 흡연자의 기도 상피 세포와 마찬가지로 죽음 없이 가능한 한 심한 담배 자극에 노출될 수 있음을 의미합니다. 이 경우 기도 염증 및 폐기종 형성으로 이어지는 동적 병리학적 변화를 모니터링하는 것은 흡연과 관련된 COPD의 발병 기전을 더 깊이 이해하는 데 중요합니다. 따라서 우리는 연기 상태를 모방하기 위한 체외 모델을 구축하고 CSE가 기도 상피 세포에 노출되는 동안 동적 변화를 모니터링하려고 했습니다. 또한, 상대적으로 정제된 기도 상피세포는 전체 조직보다 다중오믹스 연구를 더 쉽게 만들어 CSE에 노출된 기도 상피세포의 분자 및 세포 반응을 찾고 높은 처리량으로 COPD의 주요 경로와 치료 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기서, 쥐 기관 상피 세포의 분리를 설명하는 프로토콜은 Hilaire et al.13 및 You et al.14 의 프로토콜에서 약간의 수정을 가하여 적응된 것이다. 이 연구에 사용된 프로토콜에서 쥐 기도 상피 세포는 공기-액체 계면과 CSE를 포함하는 배지를 사용하여 섬모 세포와 잔 세포를 포함하는 유사 층화 구조로 증식 및 분화되어 만성 CSE 적응 모델을 확립했습니다. 다음 이벤트는 현재 모델의 핵심 포인트입니다.

자궁경부 탈구는 목에 기계적으로 무리를 주어 상피세포를 물리적으로 손상시킬 수 있고, 클로랄 하이드레이트 마취도 기도에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려하여 펜토바르비탈 나트륨을 안락사에 사용하였다15. 생쥐에 대한 수술 중 알코올이 비강으로 들어가는 것을 방지하기 위해 목과 아래쪽 부위만 담그면 기도 상피 세포의 생존력을 높일 수 있습니다16. 본 연구의 예비 데이터에 따르면 기관 삽관 또는 알코올 침수를 받은 기도 상피 세포는 생존력이 낮고 확장에 실패했습니다. 또한 적혈구가 없는 기도 상피세포를 얻기 위해서는 주요 기도를 분리할 때 혈액 오염을 피하기 위해 수술 절차에 주의해야 합니다.

특정 병원체가 없는 쥐에서도, 기도는 중요한 미생물을 서식시켰습니다. P0 원발성 쥐 기도 상피 세포의 확장 매체에 적절한 항생제를 첨가하는 것은 박테리아 또는 진균 병원체로부터의 오염을 피하는 데 필수적입니다. 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B 및 겐타마이신17 의 칵테일 용액은 멸균 시험관 환경에서 P0 쥐 기도 상피 세포의 확장을 효과적으로 보장합니다. 예비 실험에 따르면 박테리아 오염을 효과적으로 억제하지 않으면 P0 쥐 기도 상피 세포가 첫 번째 통과 전에 죽습니다.

분해 방법에서는 4 °C와 37 °C를 모두 테스트했습니다. 예비 실험 결과에 따르면 37°C에서 분해한 경우 시간 효율성, 세포 생존율 및 세포 수율 측면에서 4°C를 능가했습니다.

상피 세포의 파종 전에, 쥐 꼬리 콜라겐을 아세트산에 용해시키고 상피 세포 접착력을 향상시키기 위해 배양 접시 코팅에 사용하였다18. 그러나 콜라겐 코팅의 밀도는 너무 높거나 낮아서는 안됩니다. 불충분한 밀도는 적절한 접착 조건을 제공하지 못하는 반면, 과도한 밀도는 배양 표면에 결정질 잔류물을 생성합니다.

중요한 단계는 더 많은 상피 세포를 살리고 섬유아세포 오염을 방지하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 1) 동물 성분이 없는 세포 해리 키트를 사용하면 상피 세포를 부드럽게 분리하고 불필요한 세포 손상을 줄일 수 있으며 2) 하이드로코르티손이 함유된 차등 배지를 사용하면 섬유아세포의 성장을 억제하고 상피 세포의 증식을 촉진할 수 있습니다.

기도 상피 세포의 전통적인 수중 단층 배양은 호흡기 연구 및 독성학 연구에서 필수품이었습니다. 그러나 이러한 방법은 생체 내에서 발견되는 기도 상피 조직의 차별화된 특성을 정확하게 복제하기에는 부족합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 대체 기도 상피 모델을 선택했습니다. 이 모델은 공기-액체 계면(19)에서 트랜스웰 시스템(transwell systems)에 의해 제공되는 것과 같은 미세다공성 막 지지체(microporous membrane scaffolds)에서 일차 기도 세포의 배양에 근거를 두고 있다. 이러한 ALI 배양 설정에서 정점 표면을 주변 공기에 노출시키는 것은 세포 분화를 촉진하는 데 도움이 되며, 이에 따라 생체 내 조건(20)을 더욱 밀접하게 모방한다.

차별화가 효과적이지 않은 경우 잠재적인 원인을 평가하는 것이 중요합니다. 여기에는 기도 상피 세포가 과도한 통과 과정을 겪었을 가능성이 포함되며, 이로 인해 분화 능력이 저하될 수 있습니다. 또한, 격주로 진행되는 배지 교환 과정에서 정점 챔버 내의 점액과 체액 축적이 완전히 제거되도록 하는 것이 필수적이며, 이는 잔류 내용물이 분화 과정을 방해할 수 있기 때문입니다.

이 모델은 몇 가지 제한 사항이 있지만 여전히 연구에 유용한 도구입니다. 한 가지 제한 사항은 기도 상피 세포를 자극하기 위해 CSE 함유 배지를 사용하는 것이 흡연자의 기도 상피 세포가 경험하는 생체 내 조건을 완전히 복제하지 못할 수 있다는 것입니다. 또한, in vitro 에서 분화된 섬모 상피 세포의 생존 가능성은 일반적으로 한 달로 제한됩니다. 이러한 제약에도 불구하고 이 모델은 공기-액체 계면에서의 기도 상피 세포 분화 연구, CSE에 대한 장기 적응 및 특정 시간 프레임에 걸친 다중 오믹스 분석의 적용을 용이하게 하는 몇 가지 주요 측면을 효과적으로 통합합니다. 이 포괄적인 접근법은 기도 상피 세포의 생리학적 및 병리학적 메커니즘에 대한 향후 연구를 위한 정교하고 전체적인 프레임워크를 제공합니다. 또한 기도 질환에 대한 잠재적인 바이오마커 및 치료 표적을 식별하는 데 도움이 됩니다. 우리의 경험이 관련 연구에 이 모델을 사용하고자 하는 사람들에게 유용한 정보를 제공하기를 바랍니다.

Disclosures

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저자는 밝힐 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82090013)의 지원을 받았습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x 페니실린/스트렙토마이신 용액Gibco15140122
24mm 트랜스웰(0.4 &마이크로); m 모공 폴리 에스테르 멤브레인 인서트, 멸균BIOFILTCS016012
40 µ m 세포 여과기Falcon352340
500x 겐타마이신/암포테리신 용액GibcoR01510
아세틸화 &알파;-TubulinCST#5335
아세틸-&알파;-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
동물 성분 유리 세포 해리 키트Stemcell05426
항팬 사이토케라틴 항체abcamab7753
담배말보로
Claudin3면역웨이YT0949
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclase ISigma-AldrichDN25
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclase I시그마DN25
햄' s F-12Sigma-AldrichN6658
헤파린 솔루션 Stemcell07980
하이드로코르티손 원액Stemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
기초 중간		줄기세포05002 
PneumaCult-ALI 10x 보충제스템셀05003 
PneumaCult-ALI 유지 관리 보충제스템셀05006
PneumaCult-Ex Plus 50x 보충제스템셀05042
PneumaCult-Ex Plus 기초 매체스템셀05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
랫테일 콜라겐코닝354236
Trypan 블루스템셀07050 

References

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