여기에서는 만성 담배 연기 추출물(CSE)에 대한 적응에 초점을 맞춘 쥐 기도 상피 세포를 분리하고 분화하기 위한 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 모델은 CSE의 다중 오믹스 영향을 종합적으로 특성화하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 연기 노출 시 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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방법 논문
담배 연기 추출물로 자극된 쥐 기도 상피 세포에서 다중-오믹스의 분화 및 변화를 연구하기 위한 시험관 내 모델
이 논문에서
요약
초록
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 주로 담배 연기 노출에 기인합니다. 기도 상피 세포가 담배 연기에 기능적으로 적응하는 방법을 조사하는 것은 COPD의 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요합니다. 본 연구는 담배 연기의 실제 영향을 모방하기 위해 일차 쥐 기도 상피 세포를 사용하여 시험관 내 모델을 설정하는 것이었습니다. 확립된 세포주와 달리 일차 세포는 성장 패턴, 노화 및 분화를 포함한 in vivo와 유사한 특성을 더 많이 유지합니다. 이 세포는 민감한 염증 반응과 효율적인 분화를 나타내므로 생리적 상태를 밀접하게 나타냅니다. 이 모델에서는 최적 농도의 담배 연기 추출물(CSE)을 사용하여 공기-액체 계면에서 28일 동안 배양한 결과, 미분화 세포의 단층이 CSE 순응을 나타내는 가성층화된 원주 상피로 변형되었습니다. 그런 다음 CSE가 기저 기도 세포의 분화에 영향을 미치는 메커니즘을 밝히기 위해 포괄적인 다중 오믹스 분석을 적용했습니다. 이러한 통찰력은 담배 연기 노출에 대한 반응으로 COPD 진행을 뒷받침하는 세포 과정에 대한 심층적인 이해를 제공합니다.
서론
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 복잡한 특성을 가진 이질적인 폐 질환이며, COPD 환자는 점차 젊어지는 경향이 있습니다1. COPD2의 주요 위험 요인인 흡연은 담배 연기에 대한 초기 장벽 역할을 하는 기도 상피 세포에 지대한 영향을 미칩니다. 이러한 알려진 연관성에도 불구하고, 담배 연기가 기도 상피 세포의 변화를 유도하는 자세한 메커니즘은 여전히 충분히 연구되지 않았습니다. 이러한 분자 변화에 대한 철저한 이해는 COPD의 조기 진단 마커와 치료 표적을 식별하는 데 필수적입니다.
이 간극을 해결하기 위해 우리는 쥐 기도 상피 세포를 사용하는 새로운 in vitro 모델을 개발했습니다. 이 세포는 담배 연기 추출물(CSE)로 장기간 자극을 받았기 때문에 역동적인 세포 변화를 모니터링하고 장기 담배 자극 하에서 기도 상피 세포의 변화와 기전을 조사할 수 있었습니다. 이 모델에서는 기도 상피 세포의 공기-액체 인터페이스를 제공하기 위해 transwell을 사용하였으며, 담배 연기 추출물은 상피 세포 분화의 초기 단계에서 28일에 분화가 끝날 때까지 자극되었습니다. 이전 연구에서는 기도 상피 세포(세포주 우성)의 분화와 단기 자극만 조사했습니다. 그들은 단일 규제 경로 3,4,5,6으로 제한되었습니다. 그러나 여기에 제시된 프로토콜은 일차 마우스 기도 상피 세포를 사용하고 이전 기도 상피 세포 배양 방법보다 더 나은 세포 활성을 위해 세포 추출 과정을 최적화합니다. 이 모델은 포괄적인 전사체(transcriptomic), 단백질체(proteomic), 메타볼로미(metabolomic) 및 후성유전체학(epigenomic) 분석과 함께 세포 분화의 변화에 초점을 맞춥니다. 면역형광 및 첨단 멀티오믹스 기술을 사용하여 만성 담배 연기 노출에 대한 기도 상피 세포의 세포 반응을 규명하여 COPD 발병 기전에 대한 더 깊은 이해에 기여하는 것을 목표로 했습니다. 이 모델은 다양한 오염 물질의 장기 자극에 의해 유발되는 기도 상피 세포 분화 패턴의 변화와 그 메커니즘을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.
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프로토콜
전체 프로토콜은 쥐 기관에서 분리된 기도 상피 세포의 준비에 1일, 세포 증식에 15일, 공기-액체 계면에서 CSE 자극에 28일을 포함하여 44일이 필요합니다. 모든 실험동물은 캐피탈의과대학 동물실험센터 SPF 배리어동물실에 수용되며, 캐피탈의과대학 동물실험 및 실험동물윤리위원회(AEEI-2020-100)의 검토 및 승인을 받아 ARRIVE 가이드라인7의 요구사항을 충족합니다.
1. 쥐 기관에서 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분리
- 준비
- 50x 보충제 1mL와 하이드로코르티손 스톡 0.05mL를 48.95mL 팽창 기저 배지와 결합하여 완전한 팽창 배지를 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 4주 이내에 사용하십시오.
- 7.5mg의 proteinase와 5mg의 deoxyribonuclease I을 Ham's F-12 5mL에 용해시켜 proteinase 용액을 준비합니다. 여과하여 멸균하여 4 °C에서 보관하고 4 주 이내에 사용하십시오.
- 0.05mL의 100x 페니실린/스트렙토마이신과 0.01mL의 500x 겐타마이신/암포테리신을 5mL의 완전 팽창 배지, PBS 및 단백질 분해효소 용액(100U/mL 페니실린, 100U/mL 스트렙토마이신, 10μg/mL 겐타마이신 및 0.25μg/mL 암포테리신 B)에 추가하여 항생제 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 4주 이내에 사용하십시오.
- 수술 기구를 멸균하고 세포 분리를 위한 생물학적 안전 작업대를 준비합니다. 동시에 표준 세포 배양 장비를 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.
- 쥐 꼬리 콜라겐(0.02N 아세트산에서 100μg/mL)을 100mm 배양 접시와 24mm 트랜스웰(0.05mL/cm2)에 첨가하여 쥐 꼬리 콜라겐 코팅 접시를 준비합니다. 살균을 위해 UV 광선 아래에서 밤새 열어 두십시오.
- 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분리
- 기관 상피 세포 분리를 위해 C57BL/6 마우스(6-8주령, 수컷, SPF 상승)를 사용합니다. 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액 과다 투여(약 200mg/kg)로 안락사시킨다. 충분한 세포 수율을 위해 5마리의 마우스를 사용합니다.
- 알코올이 기관으로 유입되는 것을 방지하기 위해 코와 입을 알코올에 담그지 말고 75% 에탄올 용액에 담가 쥐를 살균합니다.
- 마우스를 해부합니다.
- 수술용 칼날과 집게를 사용하여 아래턱에서 쥐의 복강까지 표피를 자르고 열기 위한 한 세트의 장치를 사용합니다.
- 다른 수술 기구를 사용하여 양쪽의 갑상선을 찢고 기관, 주변 근육 조직 및 식도 사이의 연결을 제거합니다.
- 그런 다음 조심스럽게 가슴을 절개하고 집게를 사용하여 흉강 깊숙이 파고들어 폐 전체를 꺼내 기관의 끝을 찾습니다.
- 기관을 처리합니다.
- 갑상선 연골에서 기관지-기관지 가지까지의 기관을 잘라내고 4가지 항생제가 들어 있는 저온 전 팽창 배지에 넣습니다.
- 튜브를 흔들어 기관 표면에서 가능한 한 많은 피를 헹구고 얼음 위에 유지한 다음 다음 쥐를 위한 수술을 시작합니다.
- 수집된 모든 기관을 4가지 항생제(200U/mL 페니실린, 200U/mL 스트렙토마이신, 20μg/mL 겐타마이신, 0.5μg/mL 암포테리신 B)가 포함된 사전 냉각 PBS 버퍼로 옮겨 분해 전 전처리합니다.
- 수술 기구 세트를 사용하여 기관 표면에서 혈전 및 기타 조직을 제거한 다음 1cm2 크기로 자릅니다.
- 기관 조직을 proteinase 용액에서 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
- 40분 후 튜브를 여러 번 흔들고 40μm 세포 여과기를 사용하여 나머지 조직을 제거합니다. 5mL의 팽창 매체로 여과기에 잘게 잘린 기관을 헹구고 세포 현탁액을 400 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리 한 다음 상층액을 버립니다.
- 얻어진 세포를 8mL의 팽창 배지에 재현탁시킵니다.
- trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
- 쥐 꼬리 콜라겐으로 사전 코팅된 100mm 접시(1 x 104 live cells/cm2)에 플레이트 P0 세포 현탁액을 놓고 37°C, 5%CO2의 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
2. 원발성 쥐 기도 상피세포의 확장 배양 및 통로
- 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 P0 세포 배양용 배지를 3일마다(일반적으로 6일 이내) 교체합니다. 이 시점에서, 쥐 기관 상피 세포는 조약돌 모양의 온전한 단층을 형성할 수 있습니다(그림 1A-D).
- 충분한 양의 PBS, 완전 팽창 배지 및 ACF(Animal Component-Free) 세포 해리 키트를 37°C로 사전 예열합니다.
- PBS 3mL로 세포를 부드럽게 헹굽니다.
- 효소 해리를 수행합니다.
- ACF 효소 해리 용액 3mL를 접시에 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 피펫팅 후 세포를 부드럽게 제거하고 세포 현탁액을 3mL의 ACF 효소 억제 용액으로 옮깁니다.
- ACF 효소 해리 용액 3mL의 추가를 반복하고 세포 분리를 극대화하기 위해 5분 동안 다시 배양합니다.
- 셀 현탁액을 400 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버립니다.
- 1mL의 확장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
- trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
- 쥐 꼬리 콜라겐으로 사전 코팅된 여러 100mm 접시(5 x 104 live cells/cm2)에 P1 세포 현탁액을 플레이트하고 37°C, 5% CO2의 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
3. 공기-액체 계면에서 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분화 및 CSE 자극
- 셀 유형을 확인합니다.
- 사이토케라틴에 대한 항체가 있는 면역형광 분석(IFA)을 사용하여 분리된 세포의 상피 기원을 확인합니다. 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅된 유리 슬라이드에 세포를 종자하고 파라포름알데히드를 사용하여 세포가 80% 밀도에 도달한 후 최소 12시간 동안 고정합니다.
- PBS 용액으로 슬라이드를 3분 동안 5회 세척하고 실온(RT)에서 3시간 동안 PBS 용액에 0.1% BSA 및 0.1% triton X-100으로 배양합니다.
- 4 °C에서 1:500으로 희석하여 상업용 anti-pan cytokeratin 항체와 함께 슬라이드를 밤새 배양합니다.
- 다음 날, PBS 용액으로 슬라이드를 5분 동안 3회 세척하고 어두운 곳에서 2시간 동안 RT에서 1:1000으로 희석하여 2차 항체 완충액으로 배양합니다.
- 배양 후 PBS로 슬라이드를 3회 세척하고(세탁당 5분) DAPI를 1:1000으로 희석하여 추가합니다. RT에서 15분 동안 배양한 후 PBS로 5분 동안 슬라이드를 한 번 세척합니다.
- 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 발현 패턴을 양성 대조군(A549 세포주) 및 음성 대조군(Raw264.7 세포주)과 비교합니다(그림 2).
- 분화를 위해 세포에 씨를 뿌립니다.
- 앞서 설명한 대로 P2 세포를 분리 및 원심분리하고, 1 x 104 live cells/cm2의 도금을 용이하게 하기 위해 세포 펠릿을 적절한 부피의 팽창 매체에 재현탁시킵니다.
- 1mL의 세포 현탁액을 transwell 폴리카보네이트 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 피펫팅합니다. 트랜스웰의 기저 구획에 1.5mL의 증식 배지를 추가합니다.
- 37 °C에서 세포를 배양하고 합류점에 도달할 때까지 팽창 배지를 사용하여 3일마다 기저 및 정점 챔버의 모든 배지를 완전히 교체합니다. 일반적으로 3-6일이 소요됩니다.
- ALI 10x Supplement 5mL, ALI Maintenance Supplement 500mL, 헤파린 용액 100μL, 하이드로코르티손 원액 250mL를 ALI 기초 배지 44.15mL에 추가하여 50mL의 완전 분화 배지를 준비합니다.
- CSE를 준비합니다.
- 담배 1개비를 12.5mL의 분화 배지에 거품을 낸 다음 0.22μm 기공 필터를 통해 여과하여 CSE를 준비합니다. 실험과 CSE 배치 간의 표준화를 보장하려면 분광 광도계에서 320nm에서 흡광도를 측정하고 광학 밀도(OD) 1을 100%8로 정의합니다.
- 적절한 농도의 CSE를 함유한 분화 배지를 사용하여 원발성 쥐 기도 상피 세포를 자극하여 세포의 분화에 미치는 영향을 검출합니다.
- 세포가 28일 동안 분화하도록 하며, 이 기간 동안 기저실 배지를 교체하고 정점 챔버 배지를 제거하고 기저실 배지를 적절한 농도의 CSE가 포함된 분화 배지로 교체하여 정점 쪽을 일주일에 두 번 세척합니다.
- 노출 후 세포를 분석합니다.
- CSE를 함유한 분화 배지에 노출시킨 후 형태학적 변화(즉, 면역형광 분석(IFA) 또는 헤마톡실린-에오신 염색(HE) 또는 생물정보학 분석 절차(즉, 전사체학, 단백질체학, 대사체학 등)를 검출하기 위해 언제든지 시점(즉, 0-28일)에 세포와 배양 상층액을 수확합니다.
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결과
분화
Murine 기도 상피 세포는 분화 배지를 사용하여 공기-액체 계면에서 배양한 후 성공적으로 분화되었습니다. 섬모 세포와 잔 세포의 존재는 섬모 마커 아세틸화 α-Tubulin(녹색; 그림 3A) 및 잔 세포 마커 Mucin5AC, 각각6 (빨간색; 그림 3B).
세포 분화를 위한 CSE 농도 측정
24시간 동안 서로 다른 농도의 CSE로 분리된 상피 세포를 자극합니다. 그 결과, CSE 농도가 6% 이상일 때 상피세포의 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났습니다(p <0.05, 그림 4A). 장기간의 자극 하에서 세포 활성을 유지하기 위해 2%, 4% 및 6% CSE를 함유한 배양 배지를 사용하여 28일 동안 상피 세포의 분화를 자극했습니...
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토론
COPD는 흔한 만성 기도 염증성 질환입니다. 담배 연기에 노출되면 만성 기도 염증, 기도 재형성 및 폐 구조 파괴가 발생하는데, 이는 다양한 구조 세포와 면역 세포의 상호 작용의 결과입니다10. 폐의 선천성 면역 체계의 최전선인 기도 상피 세포는 질병 발병 과정에서 매우 중요한 역할을 합니다11. 이러한 관점에서 상피 세포가 유해 물질의 자극에 의해 하류 세포가 어떻게 변화하고 조절하는지 밝히는 것은 시급히 해결해야 할 과학적 문제입니다.
최근에는 일부 한계를 극복한 COPD의 여러 동물모델에서 보고되고 있다12. 이 모델에서는 중등도의 호중구성 기도 염증, Th1/Th17 염증 신호, 현저한 점액 과잉 생성, 기도 리모델링 증가, 폐 기능 저하 및 확대된 기도를 관찰할 수 있습니다. 이러한 모델은 COPD와 같은 변화를 확립하는 데 1개월밖에 걸리지...
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82090013)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100x 페니실린/스트렙토마이신 용액 | Gibco | 15140122 | |
| 24mm 트랜스웰(0.4 &마이크로); m 모공 폴리 에스테르 멤브레인 인서트, 멸균 | BIOFIL | TCS016012 | |
| 40 µ m 세포 여과기 | Falcon | 352340 | |
| 500x 겐타마이신/암포테리신 용액 | Gibco | R01510 | |
| 아세틸화 &알파;-Tubulin | CST | #5335 | |
| 아세틸-&알파;-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb | cellsignal | #5335 | |
| 동물 성분 유리 세포 해리 키트 | Stemcell | 05426 | |
| 항팬 사이토케라틴 항체 | abcam | ab7753 | |
| 담배 | 말보로 | ||
| Claudin3 | 면역웨이 | YT0949 | |
| 소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| 소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclase I | 시그마 | DN25 | |
| 햄' s F-12 | Sigma-Aldrich | N6658 | |
| 헤파린 솔루션 | Stemcell | 07980 | |
| 하이드로코르티손 원액 | Stemcell | 07925 | |
| Mucin 5AC | abcam | ab212636 | |
| Occludin | proteintech | 27260-1-AP | |
| PBS | Cytosci | CBS004S-BR500 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140122 | |
| PneumaCult-ALI 기초 중간 | 줄기세포 | 05002 | |
| PneumaCult-ALI 10x 보충제 | 스템셀 | 05003 | |
| PneumaCult-ALI 유지 관리 보충제 | 스템셀 | 05006 | |
| PneumaCult-Ex Plus 50x 보충제 | 스템셀 | 05042 | |
| PneumaCult-Ex Plus 기초 매체 | 스템셀 | 05041 | |
| Pronase E | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 랫테일 콜라겐 | 코닝 | 354236 | |
| Trypan 블루 | 스템셀 | 07050 |
참고문헌
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