우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.
세포 정지는 정상 및 암 줄기 세포(CSC)에 설명된 성장 정지 또는 느린 증식 상태입니다. Quiescence는 항증식성 화학 요법 약물로부터 CSC를 보호할 수 있습니다. T세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델에서 정지 세포는 치료 저항성 및 줄기 농도와 관련이 있습니다. 세포 증식 염료는 세포 분열을 추적하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 형광 염료는 세포막의 아민기와 세포 내부의 거대분자에 공유 결합되어 있습니다. 이를 통해 최대 10개의 분열에 대해 라벨링된 세포를 추적할 수 있으며, 이는 유세포 분석으로 해결할 수 있습니다.
궁극적으로 증식 속도가 가장 높은 세포는 세포 분열할 때마다 희석되기 때문에 염료 유지율이 낮고, 휴면 상태이며 분열 속도가 느린 세포는 가장 높은 유지력을 갖습니다. 휴면 세포를 분리하기 위한 세포 증식 염료의 사용은 T-ALL 마우스 모델에서 최적화되고 설명되었습니다. 기존 마우스 모델을 보완하는 rag2:Myc 유래 제브라피시 T-ALL 모델은 백혈병 줄기세포(LSC)의 빈도가 높고 대규모 이식 실험을 위한 제브라피시의 편리성으로 인해 T-ALL에서 자가 재생을 조사할 수 있는 훌륭한 장소를 제공합니다.
여기에서는 세포 증식 염료를 사용한 제브라피시 T-ALL 세포 염색, 제브라피시 세포의 염료 농도 최적화, 성공적으로 염색된 생체 내 세포 패시에이지, 이식된 동물에서 살아있는 세포 분류를 통해 다양한 염료 머무름 수준을 가진 세포 수집을 위한 워크플로우에 대해 설명합니다. T-ALL에 LSC에 대한 잘 정립된 세포 표면 메이커가 없다는 점을 감안할 때, 이 접근 방식은 생체 내에서 정지 세포를 조사할 수 있는 기능적 수단을 제공합니다. 대표적인 결과를 위해, 우리는 생착 효율과 고농도 및 저염료 보유 세포의 LSC 빈도를 설명합니다. 이 방법은 약물 반응, 전사 프로필 및 형태를 포함한 정지 세포의 추가 특성을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
성체 줄기세포는 주어진 장기에서 분화된 세포 유형의 재생을 담당하며, 주로 휴면 상태, 분열하지 않는 상태로 존재한다 1,2. 예를 들어, 혈액을 유지하는 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 대부분 정지 상태를 유지하며, 극히 일부만이 세포주기에 들어가 자가 재생하거나 분화하여 성숙한 혈액 성분을 생성한다3. 이와 유사하게, 암의 경우, 암 줄기세포(cancer stem cell, CSCs)라고 불리는 희귀한 세포의 하위 집단(subpopulation)이 자가 재생 능력을 가지고 있으며, 악성 종양의 장기 유지를 담당한다4. 암 줄기세포는 생체 내에서 정지 상태 또는 느린 성장 상태로 존재하며, 이로 인해 항증식성 암 치료5를회피하고, 면역 체계의 제거를 회피하고6, 산화 스트레스를 줄이고, DNA 복구 경로를 향상시킬 수있다7. 치료 후 남겨진 CSC의 수가 적어도 종양이 다시 증식할 수 있으며, 이로 인해 환자의 재발이 발생할 수 있다8. 따라서 셀룰러 정지를 이해하는 것은 CSC의 잠재적 취약성을 식별하고 이를 표적으로 하는 새로운 방법을 개발하는 데 큰 가능성을 제공합니다.
카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) 염색 및 그 유도체와 같은 세포 증식 염료는 세포 분열 빈도를 추적하는 데 일반적으로 사용된다9. 염료는 세포막을 가로질러 투과되며 세포 내부로 들어가면 세포 내 에스테라아제에 의해 활성화되어 형광 생성물이 됩니다. 생성된 형광 화합물은 세포내 단백질(10)의 숙시니미딜 부분과 아민 작용기 사이에 형성된 공유 아미드 결합을 통해 세포 내부에 유지됩니다. 각 세포 분열과 함께 형광 화합물은 생성된 두 세포 사이에서 균등하게 분할되어 2배 신호 희석을 일으킵니다. 이 염료는 유세포 분석11을 통해 최대 10개의 세포 분열을 검출할 수 있습니다.
이 접근법은 이전에 염료11,12의 높은 머무름을 가진 세포의 느린 순환 집단을 식별함으로써 시험관 내에서 CSC 집단을 농축하는 데 사용되었습니다. T-ALL에서 CFSE는 마우스의 환자 유래 이종이식에서 생체 내 종양 성장을 추적하는 데 사용되었습니다. 세포 라벨링과 3주간의 이식 후 유세포 분석 결과 CFSE 형광을 여전히 유지하는 드문 세포 집단이 나타났습니다. 이 집단은 환자에서 줄기세포, 치료 저항성, 재발 유발 세포와의 높은 유사성과 관련이 있었다13. 따라서 이 염료는 T-ALL에서 백혈병 줄기세포(LSC) 표현형을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
이 연구의 목적은 제브라피시 T-ALL 모델을 사용하여 생체 내 정지를 연구하기 위해 세포 증식 염료의 적용을 확장하는 것입니다. 특히, rag2:Myc-driven zebrafish T-ALL model14 는 마우스 모델 및 인간 질병15에 비해 LSC의 빈도가 높기 때문에 자가 재생 연구를 위한 훌륭한 장소를 제공한다. 또한, 제브라피시를 사용하면 대규모 이식 연구가 가능하며, 이는 생쥐에 비해 훨씬 저렴한 관리 및 유지 관리 비용으로 수행할 수 있습니다16. 제브라피쉬는 간단한 형광 현미경을 사용하여 종양 발생 속도를 추정하기 위해 형광 표지된 종양 세포를 쉽게 볼 수 있기 때문에 실시간 이미징 응용 분야에도 탁월합니다16.
이 프로토콜에서는 세포 증식 염료로 제브라피시 T-ALL 세포를 염색한 후 합성 CG1 제브라피시에서 염색된 세포의 생체 내 증식을 수행하는 워크플로우를 설명합니다. 백혈병 발병 시, 염료를 유지한 세포의 분류와 LSC 자가 재생률을 정량화하기 위한 후속 제한 희석 이식 실험에 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 정지 LSC를 표적으로 하기 위한 잠재적 화합물의 생체 내 약물 스크리닝을 포함한 추가 응용 분야로 확장될 수 있습니다. 또한 수집된 세포는 전사체 프로파일링, 단백질체학 및 대사체학과 같은 다양한 다운스트림 분석에 사용할 수 있으며, T-ALL에서 정지 LSC의 거동에 대한 고유한 통찰력을 제공합니다.
LSC는 기존의 항증식 화학요법 치료에 내성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 세포에 대한 표적 치료법을 찾는 것은 재발 발생을 줄이고 환자 예후를 개선하는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다20. 이전 연구에서는 T-ALL PDX 모델13에서 약물 내성 및 줄기성과 관련된 소량의 정지 세포 집단을 식별하기 위해 형광 세포 증식 염색을 사용?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구를 위한 자금은 미국 국립암연구소(National Cancer Institute, R37CA227656에서 JSB로)에서 제공했다. 이 연구는 또한 켄터키 대학교 마키 암 센터(P30CA177558)의 유세포 분석 및 면역 모니터링 공유 리소스의 지원을 받았습니다.
26 G/2” micro-syringe | Hamilton | 87930 | NA |
35 µm filter cap FACS tubes | Falcon | 352235 | NA |
40 µm cell strainer | CELLTREAT | 229482 | NA |
96-well skirted PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
Cell sorter | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
Conical tubes | VWR | 10026-078 | NA |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
Epifluorescence stereo microscope | Nikon | SMZ25 | NA |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
Fish system water | N/A | N/A | 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate, an anesthetic |
Petri dishes | Corning | 07-202-011 | NA |
Razor blades | American Line | 66-0089 | NA |
Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |