전기응고술을 통해 확립된 폐쇄성 만성 췌장염 모델

요약

본 프로토콜은 췌관 폐쇄를 유발하기 위해 췌관의 시각화 및 췌관의 전기응고를 포함하는 만성 폐쇄성 췌장염을 모델링하는 새로운 접근 방식을 설명합니다.

초록

만성 췌장염(CP)은 췌장을 파괴하고 당뇨병을 유발하며 췌장암 위험을 증가시켜 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있는 심각한 염증 상태입니다. CP 문제를 해결하는 것은 위장병학의 중요한 연구 초점입니다. 우리는 8주 된 C57BL/6 수컷 마우스를 사용하여 기존 모델의 한계를 극복하기 위해 새로운 동물 모델을 개발했습니다.

마취된 마우스를 대상으로 복부 수술을 통해 췌장을 노출시킨 후, 간 근처의 총담관을 고정하여 메틸렌 블루가 들어가는 것을 방지했습니다. 담관에 모세혈관을 삽입하여 염료를 주입하고, 췌관을 염색한 후 염색하였다. 췌관을 시각화한 후, 총담관과 상췌십이지장 동맥 사이의 위치의 중간 및 하부 2/3에서 전기응고를 위해 췌장을 선택하였다. 청색 염색액을 인식할 수 없을 때 전기응고를 종료했습니다. 그런 다음 복부를 닫았고 쥐는 정상적으로 키웠습니다. 수술 후 7일, 14일, 21일, 28일에 HE 염색, Masson 염색 및 면역조직화학을 사용하여 췌장을 검사하고 혈청에서 생화학적 매개변수를 분석했습니다. 14일 후의 병리는 혈청 생화학적 매개변수와 마찬가지로 만성 췌장염의 특성과 밀접하게 일치했습니다.

서론

만성 췌장염(CP)은 췌장이 파괴되고 복통과 소화 장애로 나타나는 심각한 진행성 염증성 질환입니다. 시간이 지남에 따라 당뇨병을 유발하고 췌장암의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 따라서 CP의 동물 모델을 확립하고 효과적인 치료 전략을 개발하는 것이 중요합니다.

췌장 외분비 선포 세포는 많은 수의 소화 효소를 생산하고 분비합니다. 소기관과 단백질 항상성 조절이 중단되면 세포내 트립시노겐의 부적절한 활성화로 이어져 궁극적으로 선포 세포 손상 및 췌장염 발병으로 이어질 수 있습니다¹.

이전 연구에서는 쥐 모델, 특히 반복적인 세룰레인 주사² 및 췌관의 외과적 결찰 ^3,4에 의해 유도된 모델이 CP 연구에 중요한 역할을 한 것으로 나타났습니다. 세룰레인은 만성 상태로 전환될 수 있는 급성 췌장염을 유발할 수 있지만 특정 췌관 폐쇄가 없기 때문에 폐쇄성 췌장염을 시뮬레이션하는 데 있어 임상적 중요성이 제한됩니다. 외과적 결찰은 인간 CP의 폐쇄성 특성을 더 잘 모방하지만 매우 침습적이고 수행하기 어려우며 종종 심각한 전신 효과를 초래하여 국소적인 관 병리에 대한 연구를 방해합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 전기응고를 통한 새로운 폐쇄성 CP 모델이 제안되었습니다. 췌관 결찰술의 원리와 유사하게 췌관을 막지만 수행하기 쉽고 성공률이 더 높습니다. 연구자들은 돼지의 주췌관에서 고주파 절제술이 췌장 위축을 유도하는 안전하고 효과적인 방법이라고 제안했습니다^.5, 이는 또한 고주파 전기응고로 주췌관을 절단하는 것도 유사한 효과를 낼 수 있음을 시사합니다. 이 기술은 역행성 췌관 천자와 관 염색을 위한 메틸렌 블루 용액 주입에 이어 국소적인 관 폐쇄를 유도하기 위한 전기 응고를 포함합니다 (그림 1). 이 접근법은 광범위한 염증 반응과 전신 합병증을 피하면서 인간의 폐쇄성 CP를 모방한 염증과 섬유증을 촉진합니다. 기존 모델과 비교하여 전기응고 모델은 특히 췌관을 표적으로 삼고 변동성을 줄이며 전신 합병증을 완화하는 등 몇 가지 장점을 제공합니다. 이는 CP에서 관 폐쇄를 뒷받침하는 메커니즘과 질병 진행에서의 역할을 이해하기 위해 보다 질병에 특이적이고 재현 가능하며 다양한 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

설명된 모든 동물 실험은 해군 의과대학의 동물 사용 및 관리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 수술 재료가 멸균되었는지 확인하십시오.

1. 개복술

1. 마취 유도를 위해 복강 주사를 통해 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물을 투여합니다. 페달 반사 및 각막 반사의 상실을 평가하여 마취 깊이를 모니터링합니다. 시술 중 적절한 마취를 유지하기 위해 필요에 따라 추가 용량(초기 용량의 20%)을 제공합니다. 발가락을 꼬집어 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 체온을 유지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 올려 놓으십시오.
2. 트리머를 사용하여 가슴과 하복부 사이의 머리카락(~^2cm2)을 면도합니다. 클로르헥시딘/요오드와 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 3회 소독합니다.
3. 수술용 테이프를 사용하여 마우스를 수술용 플레이트에 고정하고 멸균 드레이프를 붙입니다.
4. 가위를 사용하여 중앙복부에 2cm 길이의 절개를 한 다음 상복부와 검상돌기 사이에 1cm 길이의 절개를 합니다.

2. 췌장 위치 파악 및 노출

1. 복부 확장기의 도움으로 전기 응고가 수행될 췌장 부위를 찾습니다.
2. 멸균 면봉을 사용하여 왼쪽 상복부 뒤쪽에서 십이지장을 식별하고 십이지장을 돌려 간을 연결하는 투명한 담관을 시각화합니다.

3. 수술 부위 추적

1. 미세혈관 클립을 사용하여 근위 총담관을 일시적으로 막고 거행성 주입이 간으로 누출되는 것을 방지합니다.
2. 내경 0.25mm, 외경 0.35mm의 폴리에틸렌 튜브를 외경 0.25mm의 바늘에 연결합니다. 이 장치를 사용하여 앰플라 주위에 삽입하십시오. 십이지장의 주요 유두를 겨냥하고 튜브를 삽입합니다. 카테터를 담관에 반쯤 삽입하고 삽입을 중지합니다.
3. 주입 펌프를 시작하고 0.2% 메틸렌 블루 용액(0.9% 식염수로 희석)을 50μL/min의 속도로 2분 동안 50μL/10g의 용량으로 마이크로펌핑합니다. 췌관은 점차 파란색으로 변합니다.
4. 세션이 끝나면 폴리에틸렌 튜브를 당겨 빼내고 미세혈관 클립을 제거합니다.

4. 전기응고 절차의 유도

1. 멸균 면봉을 사용하여 췌장을 고정하고 전기응고칼을 파란색 부분에 대고 전기응고를 합니다. 전기응고 부위는 총담관과 상췌십이지장 동맥 사이의 중간 및 하부 2/3에 있습니다.
   1. 이 연구를 따르려면 다음 전기 응고의 작동 매개변수를 사용하십시오: 전압 : 220V; 전극 재질: 순수 구리; 치료 시간: 전기 응고 후 메틸렌 블루 표시 위치의 파란색이 노란색 또는 갈색으로 대체될 때까지 2-3초 동안 혈관을 피하는 췌장 위치에서 치료; 수술 영역 크기: 마우스에 따라 전기 응고 영역은 췌장 뒷면에 위치합니다. 총담관과 전상췌장십이지장 동맥 사이의 위치를 선택합니다. 온도: 300°C.
2. 파란색 염색 용액이 보이지 않으면 전기응고를 종료합니다.
3. 4-0 흡수성 봉합사로 복부를 봉합하고 4-0 비흡수성 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사로 피부를 봉합합니다. 개복술과 봉합 사이에 20분 이상 걸리지 마십시오.
4. 대조군을 실험 마우스와 동일한 방식으로 처리하되 주입 성분이 메틸렌 블루로만 구성되어 있는지 확인하십시오. 대조군(가짜)에서는 메틸렌 블루 주사를 투여하되 전기응고 수술은 하지 않는다.

5. 동물을 살리기

1. 복부 수술 후 마우스의 수술 후 상처 관리는 절개 부위의 출혈이나 발적을 매일 검사합니다: 출혈이 발생하면 멸균 거즈로 부드럽게 압력을 가하여 출혈을 멈춘 후 드레싱을 교체하고, 발적이 있는 경우 에리스로마이신 연고를 하루에 한 번 바르면서 마우스가 상처를 갉아먹지 않도록 조치를 취합니다. 진통에 관해서는 수술 직후 복강내 주사로 카프로펜(5mg/kg)을 투여한 후 연속 3일 동안 24시간에 한 번씩 투여한다.

6. 분석 방법

1. 전기응고 7일, 14일, 21^일, 28일에 혈청 생화학적 지표를 측정하고 췌장 조직의 병리학적 변화를 관찰합니다.
2. 복강내 주사를 통해 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물로 동물을 마취하고 안와 신경총을 통해 약 500μL의 혈액을 채취합니다.
3. 안구가 약간 돌출되도록 뒷면 피부를 부드럽게 잡습니다.
4. 모세혈관의 끝을 눈가에 놓고 약 30°-45°의 각도로 안구 아래에 부드럽게 삽입합니다. 혈액이 흐르기 시작할 때까지 모세혈관을 회전시킵니다.
5. 컬렉션이 끝나면 거즈로 부드럽게 압력을 가하여 눈꺼풀을 감은 상태로 유지합니다.
6. 혈청을 원심분리하고(1,200 × g, 15분) 아밀라아제, 빌리루빈 및 히알루론산을 측정하기 위해 상청액을 제거합니다(단계 6.10).
7. 케타민-자일라진으로 마우스를 마취하고 깊은 마취 상태(페달 반사 또는 각막 반사 없음)에 있는지 확인한 다음 안락사를 위해 자궁경부 탈구를 시행합니다.
8. 안락사된 쥐를 4°C의 수술대에 놓고 가위와 집게를 사용하여 복벽에 "V"자 절개를 하여 복강을 노출시킵니다. 생쥐의 췌장을 제거하고 장기를 세 부분으로 나누어 염색합니다.
9. 췌장을 4% 폴리포름알데히드 용액에 고정하여 처리하고 파라핀에 포획합니다. 췌장의 파라핀 블록을 0.5mm 두께의 절편으로 자르고 헤마톡실린과 에오신(HE)과 Masson's 염색으로 염색하여 광학 현미경으로 시각화합니다. 면역조직화학적 분석을 위해 파라핀 포매 췌장 조직을 사용하십시오.
10. 제조업체의 권장 사항에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 아밀라아제(U/dL), 빌리루빈(mmol/L) 및 히알루론산(μg/L)을 측정합니다.

결과

동물을 대조군(전기응고를 위한 메틸렌블루만 주사)과 전기응고군으로 나누어 각 그룹당 총 20마리의 마우스를 가졌다. 사망률은 대조군에서 0%, 전기응고군에서 15%였다. 모델 구축 성공률(살아있는 모델 마우스 수)은 71%였습니다. 각 그룹에서 병리학적 평가를 위해 12마리의 동물이 선택되었습니다. 각 그룹의 3마리의 마우스를 7일, 14일, 21^일, 28일에 무작위로 선택하여 HE, Masson 및 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 모델링 프로세스는 그림 1에 나와 있습니다. 메틸렌 블루로 추적한 후 생쥐의 췌장에서 총담관과 전상췌장십이지장 동맥 사이의 위치를 전기응고시켰다. 전기 응고 부위를 3분의 1 미만의 면적으로 위치의 중하부에 선택하면 효과가 기대에 미치지 못할 가능성이 높습니다. 그러나 2/3를 초과하면 전기응고 후 72시간 이내에 마우스가 사망할 가능성이 높으며, 이는 췌관이 완전히 막힌 후 발생하는 중증 급성 췌장염 때문일 가능성이 높습니다.

이로부터 전기응고 후 14일째에 마우스의 췌장에서 만성 췌장염의 조직학적 영상이 관찰될 수 있으며( 도 1 참조), 이는 완전히 막히지는 않지만 췌관이 부분적으로 막힌 후 형성된다고 결론지었다. 7일째 조직은 경미한 조직 부종을 보였고, 조직은 만성 췌장염의 증거를 보이지 않았다. 14일째, 췌장 조직의 HE 염색은 췌장 선포 세포가 흩어져 있는 것으로 나타났습니다. 21일째에는 췌장 조직의 선포 세포의 염증 정도가 점차 회복되었습니다. 28일째에 조직의 병리학적 변화가 역전되는 징후가 있었습니다 (그림 2). 이는 전기응고 과정에서 췌관 전기응고가 불충분하고, 부분적인 췌관 폐쇄 후 남은 췌관의 보상 효과 때문일 수 있습니다.

Masson 염색은 수술군의 섬유증 정도가 가짜 수술군보다 유의하게 더 심한 것으로 나타났습니다. col-1 및 (알파-평활근 액틴) SMA의 염색에 대한 면역조직화학적 점수가 더 높았습니다(그림 3). 췌장 조직에서 만성 췌장염의 유무는 14일째 병리학적 분석으로 관찰하였고, 그 후 병리학적 분석에서만 HE 염색으로 전후의 변화를 비교하였다. 혈청 생화학적 지표 분석을 통해 혈청 아밀라아제, 빌리루빈, 히알루론산 농도는 대조군보다 전기응고군에서 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 만성 췌장염의 시작을 나타낸다(그림 4).

그림 1: 마우스의 전기응고를 통해 유발된 폐쇄성 만성 췌장염의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 시간 경과에 따른 췌장 조직의 헤마목실린-에오신 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 췌장의 헤마목실린-에오신 및 마손 염색 및 면역조직화학. 약어: Col-1 = 알파-1 1형 콜라겐; SMA = 알파-평활근 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 다양한 기간의 생쥐의 혈청 생화학적 지표의 대표적인 결과. (A) 혈청 히알루론산 농도(μg/L). (B) 혈청 빌리루빈 농도(mmol/L). (C) 혈청 아밀라아제 농도(U/dL). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

췌장염의 위험과 중증도는 유전적 요인과 환경적 요인 모두에 의해 결정됩니다⁶. 임상적 췌장염의 완전한 치료는 위장병학의 목표이며, 동물 모델을 만드는 것이 첫 번째 단계입니다. 이러한 모델을 설정하기 위한 다양한 방법이 존재하며 각각 장점과 단점이 있습니다 7,8,9,10,11.

외과 의사들은 췌장 외분비 분비를 줄이기 위해 고주파 전기응고술을 사용하여 주 췌관에서 관내 열 절제술(ETHA)을 수행함으로써 췌장 십이지장 절제술(PD) 후 수술 후 췌장 누공(POPF)의 발생률을 줄였습니다¹². 이는 췌장 위축을 유발하는 열 절제 방법이 임상 실습에서 구현되었음을 시사합니다. 우리는 메틸렌 블루를 사용하여 췌관을 시각화하고 정밀하게 전기응고함으로써 폐쇄성 췌장염의 새로운 모델을 개발했습니다.

이 실험을 위해 C57BL/6 8주령 수컷 마우스를 선택했습니다. 암컷 쥐는 생식 주기를 가지고 있으며 체내 호르몬 수치가 실험 데이터에 영향을 미칠 수 있습니다. 생후 8주에 생쥐는 성숙한 신체 장기와 양호한 생활 건강 지수를 가진 전성기였으며 같은 나이의 수컷 생쥐는 크기가 더 강했습니다. 수술 후 1개월의 관찰 기간 동안 7일, 14일, 21일, 28일에 마우스 췌장을 샘플링했습니다. 14일째에 얻은 결과는 췌장염의 병리학적 특징과 가장 일치합니다.

이 접근 방식에는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 먼저, 총담관은 췌관에 염료를 주입할 수 있도록 간문에 최대한 가깝게 고정해야 합니다. 둘째, 메틸렌 블루 염료를 췌관에 주입하는 속도와 시간에 주의를 기울여야 합니다. 염료 용액이 너무 적으면 췌관이 보이지 않으며, 염료 용액이 너무 많으면 수술 부위에서 주 췌관의 위치를 식별하는 데 방해가 됩니다. 셋째, 청색 염색 용액이 보이지 않을 때 전기응고를 종료하였다. 이 실험에서는 전기응고된 마우스 췌장의 면적이 다르기 때문에 메틸렌 블루 염색이 표시된 부위에 수술이 시행되기 때문에 메틸렌 블루 염색을 사용하여 췌관을 추적합니다. 넷째, 수술 중 췌장의 출혈은 즉시 중단해야 합니다. 동시에 전기응고칼을 사용하여 췌장을 절단해야 합니다. 어떤 이유로든 전기응고칼이 췌장에 달라붙은 경우 전기응고시간을 연장해야 합니다. 이는 췌장 누출로 인한 심각한 수술 후 합병증의 발생을 예방하는 가장 일반적인 방법입니다.

그러나 이 방법에는 단점이 있습니다. 시술자의 숙련도는 실험 결과에 직접적인 영향을 미치며, 다양한 마우스에 걸친 수술의 균일성은 모델의 성공률에 영향을 미칩니다. 이 모델은 담석이나 췌관 폐쇄의 영향을 시뮬레이션하여 급성 췌장염을 반복적으로 유발하여 결국 만성 췌장염을 유발합니다. 이것은 빌리루빈 수치 상승을 설명할 수 있습니다. 따라서 이 모델은 전기응고 정도에 따라 급성 췌장염 모델로도 개발될 수 있습니다. 전기응고 3일 후 마우스의 췌장에 대한 초기 실험에서는 급성 췌장염의 특징이 나타났지만 수술 후 합병증으로 인해 급성 췌장염에 대한 모델의 성공률이 낮아졌습니다. 그러나 전기응고 과정에서 전기소작술에서 발생하는 열이 주담관으로 퍼졌을 가능성도 배제할 수 없습니다. 전기응고를 통해 급성 췌장염을 안정적으로 유도하는 방법에 대한 질문은 탐구할 가치가 있습니다.

몇 주에 걸쳐 반복적으로 주사해야 하는 기존의 세룰레인 주사 방법에 비해 전기응고법은 시간을 절약하고 더 편리합니다. 세룰레인 주사는 우수한 안정성과 작동 용이성을 보여주지만 전기응고는 ~20분이 소요되며 후속 실험 시간을 절약합니다.

새로운 모델의 개발은 질병의 자연사를 연구하고 표적 치료법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 우리의 새로운 동물 모델은 내시경 역행 담췌관조영술 췌장염(ERCP)¹³을 포함하여 마우스의 췌관 폐쇄로 인한 만성 췌장염을 시뮬레이션하는 데 도움이 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16mm 미세혈관 클립	중국 닝보의 스트롱거
흡수성 봉합사	양저우 진환 의료기기 공장	4-0	-
카프로펜	상하이 맥클린 생화학 유한회사.	C830557-5g	-
모세관	타이곤, 미국	그리고 nbsp; AAQ(AAD)04091	0.25 x 0.3 mm
전기응고 칼	순예 의료기기 주식회사, 닝보, 중국	순예 BDD-YE-DF-1
눈 가위
케타민 염산염 주입 (Ketaset CIII)	조이티스 주식회사	S5564	-
메틸렌 블루 염색 용액	솔라비오, 상하이, 중국	그리고 nbsp; G1303
비흡수성 4-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사	중국 상하이 진환
작동 현미경	무르지더, 광둥, 중국	MSD203
안과 겸자
둥근 머리 면봉	올가 셰러, 화시의료, 중국
주사기 바늘	중국 저장성 민남크		0.25mm
조직 겸자
조직 가위	상하이 푸신 기기 기술 공사
자일라진 염산 주입	바이엘 동물 건강	XYL-50-20	-