방법 논문

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

DOI:

10.3791/67078

⸱

2024년 7월 26일

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미세아교세포는 중추신경계(CNS)의 조직에 상주하는 대식세포로, 신경 건강과 중추신경계 항상성을 지원하는 다양한 기능을 수행합니다. 이들은 중추신경계 질환 활동과 관련된 면역 세포의 주요 집단으로, 다발성 경화증(MS)과 같은 만성 신경퇴행성 질환 중 신경 손상에 잠재적으로 기여하는 반응성 표현형을 채택합니다. 미세아교세포가 건강 및 질병 중 신경 기능과 생존을 조절하는 뚜렷한 메커니즘은 미세아교세포, 뉴런 및 기타 CNS 환경 요인 간의 복잡한 생체 내 상호 작용을 해결하는 데 어려움이 있기 때문에 제한되어 있습니다. 따라서 미세아교세포와 뉴런을 함께 배양하는 체외 접근법은 미세아교세포-뉴런 상호작용을 연구하기 위한 유용한 도구로 남아 있습니다. 여기에서는 생쥐에서 일차 미세아교세포와 뉴런을 생성하고 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 구체적으로, 미세아교세포는 출생 후 일 0-2일 사이에 신생아 마우스에서 유래한 뇌 균질액으로부터 확립된 혼합 신경교세포(glia) 배양으로부터 시험관내에서 9-10일 후에 분리하였다. 신경 세포는 배아 16-18일 사이에 마우스 배아의 뇌 피질에서 분리되었습니다. 시험관 내에서 4-5일 후, 신경 세포를 96웰 플레이트에 파종한 후 미세아교세포를 추가하여 공동 배양을 형성했습니다. 이 프로토콜은 두 세포 유형 모두 공동 배양을 확립하기 위해 실험적 성숙도에 도달해야 하기 때문에 신중한 타이밍이 중요합니다. 전반적으로 이 공동 배양은 미세아교세포-뉴런 상호 작용을 연구하는 데 유용할 수 있으며 면역형광 현미경 검사, 실시간 이미징, RNA 및 단백질 분석을 포함한 여러 판독값을 제공할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미세아교세포(Microglia)는 중추신경계(CNS)의 면역감시 및 항상성을 촉진하는 조직 상주 대식세포입니다1,2,3. 난황낭 적혈구세포 전구세포(yolk sac erythromyeloid progenitor cell)에서 유래하며, 배아 발달 과정에서 뇌에 서식하며4,5,6 증식과 세포자멸사(apoptosis)를 수반하는 자가재생(self-renewal)을 통해 유기체의 수명 동안 유지된다7. 정상 상태에서, 휴지 상태의 미세아교세포는 형태학을 파급시키고 조직 감시에 참여한다 8,9,10.

미세아교세포는 수많은 세포 표면 수용체를 발현하여 중추신경계의 변화에 신속하게 반응할 수 있습니다11,12 감염 또는 조직 손상 시 염증 반응을 촉진할 수 있습니다.12,13,14 뿐만 아니라 다발성 경화증(MS)16,17과 같은 신경퇴행성 질환 9,15 동안에도 염증 반응을 촉진합니다. 미세아교세포는 또한 다양한 신경전달물질과 뉴로펩티드(18,19,20)에 대한 수용체를 발현하는데, 이는 이들이 또한 신경세포 활동에 반응하고 조절할 수 있음을 시사한다 21,22. 실제로, 미세아교세포와 뉴런은 막 단백질에 의해 매개되는 직접 상호작용 또는 용해성 인자 또는 중간 세포를 통한 간접 상호작용과 같은 다양한 형태의 양방향 통신(8,23)에서 상호작용한다(23,24).

예를 들어, 뉴런에 의해 분비되는 다양한 신경 전달 물질은 미세아교세포의 신경 보호 또는 염증 활동을 조절할 수 있습니다 25,26,27. 또한, 뉴런과 미세아교세포 사이의 직접적인 상호작용은 미세아교세포를 항상성 상태로 유지하는 데 도움이 된다28. 반대로, 미세아교세포와 뉴런의 직접적인 상호작용은 뉴런 회로(29)를 형성하고 뉴런 신호전달(30,31,32)에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 상호작용의 중단이 뉴런(30) 및 미세아교세포(microglia) 반응성(33,34)의 과흥분성을 유발하기 때문에, 조절되지 않는 미세아교세포-뉴런 상호작용은 신경계 질환(33,35)에 기여하는 요인으로 연루된다. 실제로, 정신병적질환 23,26 및 신경퇴행성 질환은 기능 장애(dysfunctional microglia-neuronal interactions)를 나타내는 것으로 설명되었다33. 이러한 관찰은 중추신경계에서 미세아교세포-신경세포 통신의 중요성을 강조하지만, 이러한 상호 작용이 건강과 질병에서 미세아교세포와 신경세포 기능을 조절하는 방법에 대한 구체적인 메커니즘은 상대적으로 알려져 있지 않습니다.

중추신경계(CNS)와 같은 복잡한 환경 내에서는 여러 환경 요인이 미세아교세포-신경세포 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 생체 내에서 일시적인 세포 상호작용을 연구하는 능력을 제한합니다. 여기에서는 미세아교세포와 뉴런 사이의 직접적인 세포 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 체외 미세아교세포-뉴런 공동 배양 시스템을 제시합니다. 이 프로토콜은 출생 후 0-2일과 배아 생쥐 16-18일 사이에 각각 신생아 마우스의 피질에서 일차 미세아교세포와 뉴런의 생성을 설명합니다. 그런 다음 뉴런과 미세아교세포를 다운스트림 고처리량 실험을 위해 96웰 플레이트에서 공동 배양합니다. 우리는 이전에 미세아교세포 식세포작용이 산화된 포스파티딜콜린 매개세포 사멸로부터 뉴런을 보호한다는 것을 입증하기 위해 이 접근법을 사용했으며, 이는 이 방법이 신경 퇴행 및 다발성 경화증의 맥락에서 미세아교세포의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 미세아교세포-뉴런 공동배양은 바이러스 감염(viral infections)38 또는 신경세포 손상 및 복구(neuronal injury and repair)39와 같은 다른 상황에서 미세아교세포-뉴런 누화(microglia-neuronal crosstalk)의 영향을 조사하는 데에도 유용할 수 있다. 전반적으로, in vitro microglia-neuronal co-culture system을 통해 연구자들은 조작 가능하고 통제된 환경에서 microglia-neuronal 상호 작용을 연구할 수 있으며, 이는 in vivo 모델을 보완합니다.

프로토콜

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이 연구에 사용된 모든 동물은 서스캐처원 대학의 대학 동물 관리 위원회(UACC)와 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)의 승인을 받아 수용 및 처리되었습니다. 이 연구에는 출생 후 0-2일 CD1 수컷 및 암컷 마우스와 임신한 CD1 마우스의 배아 16-18일(E16-18) 배아가 사용되었습니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 원발성 미세아교세포 배양

참고: 미세아교세포가 성숙하고 뉴런이 96웰 플레이트에 파종된 후 2일 이내에 수확할 준비가 되도록 혼합 신경교세포와 뉴런 배양 시간을 정하는 것이 중요합니다.

  1. 준비
    1. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청이 보충된 고포도당이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), L-글루타민 2.92mg/mL, 1mM 피루브산 나트륨, 1mM 비필수 아미노산 및 20mM의 HEPES가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)이 포함된 37°C 수조에서 사전 데우기.
    2. 각 T-75 플라스크에 5mL의 10μg/mL 폴리-L-오르니틴(PO) 하이드로브로마이드를 추가합니다. PO가 플라스크 바닥을 완전히 덮도록 플라스크를 부드럽게 휘젓습니다. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 코팅 단계는 T-75 플라스크에 대한 셀 접착을 용이하게 하기 위해 필요합니다.
  2. P0-P2 신생아 마우스에서 뇌 분리
    알림: 모든 해부 도구를 멸균하고 시약의 멸균 상태를 유지하십시오. 전체적으로 무균 기술을 준수하도록 합니다.
    1. 해부를 시작하기 전에 해부가 이루어질 곳에 70% 에탄올 또는 소독 스프레이를 조리대에 뿌립니다. 해부 현미경을 설정하고 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다. Leibovitz의 L-15 배지 20mL를 페트리 접시에 붓습니다. 오염을 줄이기 위해 현미경을 사용하지 않는 동안 Petri 접시의 뚜껑을 켜 두십시오.
    2. 종이 타월을 여러 겹 놓고 종이 타월에 70% 에탄올을 철저히 뿌립니다. 해부 도구(해부 가위, 한 쌍의 마이크로 집게, 조직 집게)에 70% 에탄올을 철저히 뿌리고 도구를 종이 타월 위에 놓아 준비합니다.
    3. 출생 후 0-2일 마우스를 종이 타월에 옮기고 마우스에 70% 에탄올을 철저히 뿌립니다. 해부 가위를 사용하여 쥐의 목을 베십시오(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
    4. 머리를 부드럽게 잡으면서 목에서 코까지 두개골의 정중선을 절개합니다. 조직 집게로 두개골을 벗겨 뇌를 드러냅니다.
    5. 조직 겸자를 사용하여 뇌 아래에 겸자를 삽입하여 뇌를 부드럽게 퍼내고 뇌를 머리에서 들어 올립니다. 즉시 Leibovitz의 L-15 배지 20mL가 들어있는 페트리 접시에 뇌를 넣습니다.
    6. 해부 현미경으로 한 쌍의 마이크로 집게를 사용하여 뇌간과 수막을 조심스럽게 제거합니다. 5mL의 Leibovitz의 L-15 배지가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 뇌를 수집합니다.
  3. 뇌 해리, 혼합 신경교세포 배양 파종 및 유지
    알림: 생물 안전 작업대에서 모든 후속 단계를 수행하십시오.
    1. 멸균 일회용 메스 칼날로 뇌를 약 1mm2 조각으로 잘게 썰어냅니다. 다진 뇌를 새로운 멸균 50mL 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
    2. 다진 뇌에 최종 농도 0.25% 트립신을 첨가하고 조직을 37°C 수조에서 20분 동안 배양합니다. 2-3분마다 조직 해리를 돕기 위해 튜브를 부드럽게 뒤집어 용액을 혼합합니다.
    3. 5%CO2 인큐베이터에서 5mL의 PO가 포함된 T-75 플라스크를 생물안전 작업대로 옮깁니다. PO를 버리고 멸균 3x 인산염 완충 용액(PBS)으로 플라스크를 1번 헹굽니다. 과도한 PO는 세포에 유독하므로 플라스크를 철저히 헹굽니다.
    4. 37°C 수조에서 분해된 조직을 생물안전 작업대로 옮깁니다. 트립신을 중화하기 위해 5mL의 완전한 신경교세포 배양 배지를 추가합니다. 10mL 피펫을 사용하여 조직 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
    5. 멸균 70μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 멸균 50mL 코니컬 튜브에 놓고 약 5mL의 L-15를 붓어 메쉬를 적십니다. 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 멸균된 1mL 주사기에서 플런저를 제거하고 플런저를 사용하여 조직을 메쉬로 분쇄하여 조직 덩어리를 제거하고 균질화된 세포 현탁액을 생성합니다.
    6. 주기적으로 약 5mL의 Leibovitz의 L-15 배지를 70μm 나일론 메쉬에 붓고 1mL 주사기 플런저로 메쉬의 조직을 계속 연마합니다. 메쉬에 눈에 보이는 조직이 거의 또는 전혀 남아 있지 않으면 메쉬를 버리고 셀 현탁액을 따로 보관합니다.
    7. 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 각 플라스크에 신경교세포 배양 배지가 있는 1-2개의 뇌를 포함하는 동일한 부피의 세포 현탁액을 최종 부피 15mL에 추가합니다.
    8. 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날, 멸균 1x PBS로 플라스크를 두 번 세척하여 부착되지 않은 세포와 부스러기를 제거합니다.
    9. 15mL의 신선한 완전 신경교세포 배양 배지를 배양액에 추가하고 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 3일 후 배지의 절반을 40ng/mL의 대식세포 집락 자극 인자(MCSF)가 보충된 10mL의 신선한 신경교세포 배양 배지로 교체합니다.
      참고: 그 후, 배지의 절반은 3일마다 40ng/mL의 MCSF가 보충된 10mL의 신선한 신경교세포 배양 배지로 교체됩니다. 배양액은 미세아교세포를 수확하기 전에 8-10일 동안 유지됩니다.

2. 1차 뉴런 배양

  1. 준비
    1. B-27 플러스 보충제를 B-27 플러스 신경 세포 배양 시스템에서 해동합니다. B-27 플러스 신경 세포 배양 시스템, 1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 및 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)의 신경기저 플러스 배지를 수조에서 37°C에서 사전 데우십시오.
    2. T-25 플라스크에 5mL의 10μg/mL PO를 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 플라스크를 배양합니다. 해부를 위한 기구와 용품을 준비합니다.
      참고: 이 코팅 단계는 T-25 플라스크에 대한 세포 접착을 용이하게 합니다.
  2. E16-E18 마우스 배아에서 뇌 분리
    알림: 모든 해부 도구를 멸균하고 시약의 멸균 상태를 유지하십시오. 전체적으로 무균 기술을 준수하도록 합니다.
    1. 해부를 시작하기 전에 해부가 이루어질 곳에 70% 에탄올 또는 소독 스프레이를 조리대에 뿌립니다. 해부 현미경을 설정하고 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다. 20mL의 1x HBSS를 페트리 접시에 붓습니다. 오염을 줄이기 위해 현미경을 사용하지 않는 동안 Petri 접시의 뚜껑을 켜 두십시오.
    2. 종이 타월을 여러 겹 놓고 종이 타월에 70% 에탄올을 철저히 뿌립니다. 해부 도구(스프링 가위, 마이크로 집게 한 쌍, 조직 집게)에 70% 에탄올을 철저히 뿌리고 도구를 종이 타월 위에 놓아 준비합니다.
    3. 이소플루란을 사용하여 임신 16-18일 사이에 임신한 쥐를 마취하고 자궁경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
    4. 70% 에탄올에 적신 종이 타월 위에 마우스를 등을 대고 눕힙니다. 70% 에탄올로 복부를 소독합니다. 조직 집게로 하복부의 피부를 들어 올리고 이 지점에서 하부 흉곽까지 박리 가위로 V자 절개를 합니다.
    5. 조직 겸자로 배아가 들어 있는 자궁 뿔을 잡고 복강에서 배아를 부드럽게 제거합니다. 배아가 들어있는 자궁 뿔을 70 % 에탄올로 간단히 소독합니다.
    6. 개별 주머니에서 한 번에 하나의 배아를 절개합니다. 스프링 가위를 사용하여 목 뒤에서 코까지 두개골 상단에 정중선 절개를 만듭니다. 그런 다음 절개 부위에서 두개골을 들어 올려 뇌를 드러냅니다. 조직 겸자로 뇌를 부드럽게 퍼내고 15mL의 1x HBSS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 뇌를 옮깁니다.
    7. 박리 현미경으로 한 쌍의 마이크로 집게로 뇌간과 뇌 피질 양쪽의 수막을 조심스럽게 제거합니다. 뇌 피질을 10mL의 1x HBSS가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
  3. 세포 배양에서 대뇌 피질 뉴런의 뇌 해리 및 파종(Brain dissociation and seeding of cortical neurons in cell culture)
    알림: 생물 안전 작업대에서 모든 후속 단계를 수행하십시오.
    1. 멸균 일회용 메스 칼날을 사용하여 50mL 원뿔형 튜브에 뇌를 약 1mm2 조각으로 자릅니다. 다진 뇌를 새로운 멸균 50mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
    2. 최종 농도 0.25%의 트립신을 튜브에 추가합니다. 튜브를 35-38°C의 뜨거운 수조에 15분 동안 담그고 튜브를 부드럽게 혼합하여 2-3분마다 조직을 균질화합니다.
    3. 온수 욕조에서 튜브를 꺼냅니다. 조직 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 더 해리시킨 다음 균질화된 현탁액에 0.5mL의 열 비활성화 FBS를 추가하여 트립신 활성을 중화합니다. 신경 세포에 대한 독성을 최소화하기 위해 기포를 피하십시오.
    4. 멸균 70μm 나일론 메쉬 세포 스트레이너를 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 놓고 약 5mL의 신경기저 배지를 추가하여 메쉬를 적십니다. 70μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과합니다. 1mL 주사기 플런저를 사용하여 조직을 세포 여과기에 부드럽게 갈아넣습니다. 세포 여과기를 세척하기 위해 계속 분쇄하면서 약 5mL의 1x HBSS를 주기적으로 붓습니다.
    5. 원추형 튜브를 300 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 이 기간 동안 B-27 플러스 보충제를 신경기저 플러스 배지에 희석하여 최종 농도 1배로 희석하여 완전한 신경기저 배지로 사용하십시오.
    6. T-25 플라스크의 PO를 버리고 5mL의 1x PBS로 플라스크를 세 번 헹굽니다.
    7. 조심스럽게 디캔팅하여 상층액을 제거하고 2-3mL의 완전한 신경기저 배지를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 혈구계와 trypan blue로 세포 농도와 총 세포 수를 측정합니다. 배아 당 최대 1.0 x 107 세포를 기대할 수 있습니다.
    8. PO 코팅된 T-25 플라스크의 세포를 플라스크당 약 2.0 x 107 개의 세포로 5ml의 완전한 신경기저 배지에 플레이트합니다. 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 세포 배양을 배양합니다.
    9. 배양 플라스크에서 2.5mL의 배지를 새로 만든 완전한 신경기저 배지로 교체하여 2-3일마다 절반의 배지 교체를 수행합니다.

3. 일차 뉴런과 미세아교세포의 공동 배양

참고: 모든 후속 단계는 멸균 생물 안전 작업대에서 수행해야 합니다.

  1. 96-well plate에 뉴런 파종(seeding neurons)
    1. 웰당 100μL의 10μg/mL PO를 추가하고 37°C에서 최소 1시간 동안 플라스크를 배양하여 웰을 PO로 코팅합니다. 세포를 파종하기 전에 1x PBS로 플레이트를 3번 세척하고 마지막 세척 후 남아 있는 액체를 흡인합니다.
    2. T-25 플라스크에서 자란 뉴런은 배양 2-5일 후 공동 배양을 위해 수확됩니다. 배지를 0.25% 트립신 및 1mg/mL DNase I이 포함된 5mL의 1x Versene 용액으로 교체하여 플라스크에서 뉴런을 분리합니다. 소화를 위해 플라스크를 인큐베이터 내부에 5-6분 동안 넣고 세포 분리를 돕기 위해 2-3분마다 플라스크를 부드럽게 휘젓습니다.
    3. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포가 분리되어 있는지 확인합니다. 0.5mL의 열 비활성화 FBS를 추가하여 트립신과 DNase I을 중화합니다. 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 전달합니다. 수집된 뉴런을 최대화하기 위해 5mL의 완전한 신경기저 배지로 플라스크를 한 번 세척합니다. 동일한 15mL 코니컬 튜브에 있는 모든 세포를 수집합니다.
    4. 셀 현탁액을 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 2-3mL의 완전한 신경기저 배지에 부드럽게 재현탁시킵니다.
    5. 혈구계로 세포를 계수하고 완전한 신경기저 배지를 추가하여 최종 농도 7.5 x 105 뉴런/mL를 얻습니다. 세포 현탁액 100μL를 PO 코팅된 96웰 플레이트의 각 웰에 시드하여 7.5 x 104 뉴런/웰을 얻습니다. 플라스크당 5-600만 개의 뉴런이 생성될 것으로 예상됩니다.
    6. 하룻밤 동안 96웰 플레이트에서 뉴런을 배양합니다. 다음 날 100μL의 완전한 신경기저 배지를 각 웰에 추가합니다.
      참고: 뉴런이 적절한 신경돌기 성장을 보이면(96-웰 플레이트에 파종한 후 약 3-4일) 미세아교세포와 공동 배양할 준비가 된 것입니다.
  2. 분리 및 미세아교세포-신경세포 공동 배양
    1. 8-10일의 혼합 신경교세포 배양 사이에 10mL 피펫으로 각 플라스크의 T-75 플라스크를 신경교세포 배양 배지로 부드럽게 세척하여 미세아교세포를 수집하고 세포와 배지를 멸균된 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 10mL의 신선한 신경교세포 배양액으로 플라스크를 다시 세척하여 플라스크에서 추가 미세아교세포를 분리하고 배지를 수집합니다. 플라스크당 7.5 x 105 microglia의 수율이 예상됩니다.
    2. 각 플라스크에 20ng/mL MCSF가 보충된 20mL의 신선한 신경교세포 배양 배지를 추가합니다. 미세아교세포는 혼합된 신경교세포 배양이 유지되는 경우 한 번 또는 두 번 더 수확할 수 있습니다.
    3. 세포 수집을 300 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 2mL의 완전한 신경기저 배지에 부드럽게 재현탁시킵니다.
    4. 혈구계와 trypan blue로 세포를 세십시오. 최종 농도인 2.5 x 105 cells/mL에 완전한 신경기저 배지를 추가합니다.
    5. 96웰 신경 세포 배양 플레이트에서 100μL의 신경기저 배지를 제거하고 100μL의 2.5 x 105 cells/mL 세포 현탁액을 7.5 x 104 뉴런의 웰당 2.5 x 104 microglia를 파종합니다. 37%CO2 인큐베이터에서 5°C에서 밤새 배양하여 미세아교세포가 가라앉을 수 있도록 합니다. 이제 공동 배양을 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미세아교세포에 대한 혼합신경교세포(mixed glia) 배양의 주요 단계를 보여주는 흐름도가 그림 1A에 나와 있습니다. 전반적으로, 1일차에는 희박한 세포와 과도한 세포 파편이 예상됩니다(그림 1B). 4일째가 되면 특히 부착성 성상세포(adherent astrocyte)의 생성과 함께 세포 수가 증가하는 것이 관찰되어야 하며, 이는 길쭉한 형태에서 알 수 있습니다(그림 1C). 몇 개의 미세아교세포는 성상교세포(astrocyte) 위에서 관찰되거나 배지에 떠다니는 작은 원형 세포로 관찰될 수 있습니다. 8일째가 되면 성상교세포의 합류층이 세포의 부착층을 형성하는 반면, 미세아교세포는 성상교세포에 반쯤 부착되어 있거나 배지에 떠 있는 둥글고 밝은 세포로 나타납니다(그림 1D). 8일째까지 미세아교세포의 밀도가 낮으면 수확 전에 며칠 더 배양할 수 있습니다.

신경 세포 배양의 주요 단계를 보여주는 흐름도가 그림 2A에 나와 있습니다. 건강한 배양에서는 뉴런이 체외에서 1-3일 후에 부착되어 신경돌기를 형성합니다(그림 2B). 마찬가지로, 뉴런을 96웰 플레이트에 파종하면 처음에는 둥글게 보이지만 3일째가 되면 뉴런이 부착되어 이웃 뉴런과 연결되는 신경돌기를 형성해야 합니다(그림 2C). 반대로, 건강하지 않은 뉴런 배양에는 세포 해리가 부족하거나 뉴런을 잘못 취급하여 발생할 수 있는 세포 덩어리와 세포 파편이 포함될 수 있습니다(그림 2D).

microglia-neuronal co-culture 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 흐름도가 그림 3A에 나와 있습니다. 2.5 x 104 미세아교세포를 7.5 x 104 뉴런에 추가한 후 둥글고 큰 미세아교세포가 뉴런과 신경돌기 상단 또는 사이에 나타나야 합니다(그림 3B). 미세아교세포-신경세포 공동 배양을 추가로 시각화하기 위해 미세아교세포와 뉴런을 단독으로 또는 공동 배양하여 면역형광 현미경 검사를 위해 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(IBA-1, 빨간색) 및 튜불린 βIII(TUJ1, 녹색) 항체37로 표지했습니다(그림 3C-F).

세포 배양 과정: 마우스 피질의 단일 세포 현탁액; 다이어그램에 표시된 단계; 현미경 이미지.
그림 1: 1차 미세아교세포 배양 개요. (A) 혼합 신경교세포 배양을 생성하는 주요 단계의 흐름도. (비-디) 1일차(B), 4일차(C) 및 8일차(D)의 혼합 신경교세포 배양을 측정한 대표적인 10x 명시야 현미경 이미지. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

신경 배양 과정 다이어그램; T25, 96웰 플레이트에서 마우스 배아 세포 준비 및 이미징.
그림 2: 1차 뉴런 배양 개요. (A) 뉴런 생성의 주요 단계에 대한 흐름도. (B) T-25 플라스크에서 배양된 뉴런을 보여주는 대표적인 10x 명시야 현미경 이미지. (C) 96웰 플레이트에서 배양된 뉴런의 대표적인 10x 명시야 현미경. (D) 96웰 플레이트에 있는 건강하지 않은 신경 클러스터의 대표적인 10x 명시야 현미경. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미세아교세포 분리 워크플로 및 현미경 분석; 면역형광 이미지는 세포 마커를 표시합니다.
그림 3: 미세아교세포-뉴런 공동 배양 개요. (A) 미세아교세포-신경세포 공동 배양을 위한 주요 단계의 흐름도. (B) 96웰 플레이트에서 미세아교세포-신경세포 공동 배양의 대표적인 10x 명시야 현미경 이미지. 스케일 바: 100 μm. (C,D) 96웰 플레이트에서 뉴런 단독(C), 미세아교세포 단독(D), 2일차 뉴런 및 미세아교세포 공동 배양(E) 또는 12일 뉴런 및 미세아교세포 공동 배양(F)의 대표적인 면역형광 현미경 이미지. 미세아교세포와 뉴런은 각각 IBA-1(빨간색)과 튜불린 βIII(녹색)로 표지됩니다. 핵은 DAPI(파란색)로 염색됩니다. 면역형광 이미지는 광시야 형광 현미경과 함께 25x, 0.8NA, 수침 대물렌즈를 사용하여 획득했습니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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이 논문에서는 생쥐의 1차 뉴런과 1차 미세아교세포를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜에 대해 설명하며, 이후 미세아교세포와 미세아교세포의 상호 작용이 세포 건강과 기능을 조절하는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있는 미세아교세포-신경세포 공동 배양을 확립하는 데 사용됩니다. 이 비교적 간단하고 접근하기 쉬운 접근법은 중추신경계에서 미세아교세포 뉴런 상호작용의 메커니즘과 기능적 결과에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

최적의 공동 배양을 달성하려면 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면에 각별한 주의가 필요합니다. 뇌 격리 (단계 1.2.6 및 2.2.7 단계) 중에는 배아 뇌와 출생 후 뇌 모두에 부착 된 수막을 조직을 채취하기 전에 완전히 제거해야합니다. 다른 신경아교세포(neuroglia protocol)와 마찬가지로, 수막의 불완전한 제거는 세포 배양이 내피 세포 또는 혈액 유래 세포로 오염되는 결과를 초래할 수있다 40,41,42. 또한 일차 뉴런을 배양할 때(2.3.7 및 3.1.4단계) 뉴런을 플라스크 또는 96웰 플레이트에 파종하기 전에 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포 덩어리를 피하는 것이 중요합니다. 신경 세포 응집체는 배양에 제대로 부착되지 않으며 과도한 신경 세포 스트레스와 세포 사멸을 유발합니다. 또한, T-25 플라스크에서 뉴런을 해리하려고 할 때 트립신으로 뉴런을 장기간 처리하면 원치 않는 세포 사멸이 발생할 수 있습니다(단계 3.1.2). 이를 완화하기 위해, 뉴런은 배아 뇌에서 해리된 후 원하는 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 직접 파종될 수 있습니다(단계 2.3.7). 또한, 이 프로토콜에서는 3:1 뉴런: 미세아교세포 비율을 선택하여 신경염증 중 중추신경계 미세환경에 존재할 수 있는 미세아교세포의 증가량을 부분적으로 나타내도록 했습니다. 대안적으로, 공동 배양에서의 세포의 비율은 실험적 필요성에 따라 조정될 수 있다. 또한, 공동 배양 뉴런을 위해 선택된 시점은 더 성숙한 뉴런 상태를 평가하려는 경우 연장될 수 있습니다.

특히, T-25 플라스크에서 96-웰 플레이트로 뉴런을 해리할 때 트립신만 사용하면 96-웰 플레이트에서 단층 배양 대신 불완전한 해리가 발생하고 세포 덩어리가 형성될 수 있습니다(그림 2D). 이 문제를 해결하기 위해 1mg/mL DNase I을 포함하는 1x Versene 용액을 사용하여 T-25 플라스크에서 뉴런을 분리할 수 있습니다. 신경 응집 및 생존력 감소에 기여하는 다른 요인으로는 세포 현탁액의 불완전한 삼결, 열 불활성화 FBS를 통한 트립신의 부적절한 중화, 과도한 원심분리 또는 장기간의 세포 펠릿 형성이 포함됩니다. 따라서 적절한 조직 해리와 단세포 현탁액의 생성을 보장하는 것은 건강한 미세아교세포와 뉴런 공동 배양을 확립하는 데 중요합니다.

이 프로토콜은 중추신경계에서 미세아교세포-뉴런 상호작용을 요약하여 중추신경계에서 상호작용의 기능적 중요성을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다. 두 개의 세포 집단을 독립적으로 처리할 수 있도록 서로 다른 표면에서 개별 세포 집단을 배양하는 것과 같은 다른 유형의 공동 배양 시스템이 개발되었지만(43,44), 이러한 혼합 배양 시스템은 미세아교세포와 뉴런의 직접적이고 긴밀한 접촉을 가능하게 합니다. 또한, 3일마다 절반의 배지 교체를 통해 적절하게 유지될 경우, 이 혼합 배양 시스템은 12일(그림 3F)에서 잠재적으로 3주까지 건강하게 유지될 수 있으며, 이는 신경세포-미세아교세포 상호작용에 대한 장기 연구를 가능하게 한다45.

공동 배양 시스템의 상대적 단순성은 접근성에 유리하지만, 이 접근 방식의 주요 제한 사항은 2차원 세포 배양이 CNS 조직 환경을 완전히 대표하지 않는다는 것입니다. 실제로, 미세아교세포, 뉴런 및 성상교세포의 삼중 배양은 미세아교세포 또는 성상교세포-신경세포 공동 배양보다 생체 내 신경염증 반응을 더 신뢰성 있게 모방하는 것으로 나타났습니다46,47. 또한, 미세아교세포(microglia) 및 성상교세포(astrocyte) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 포함한 기타 신경교세포(glial cell)를 이용한 뇌 오가노이드 시스템의 최근 개발은 3차원(3D) 조직 구조 및 CNS48의 상호작용을 연구하는 데 더 적합합니다. 마찬가지로, 뉴런, 미세아교세포 및 성상교세포로 구성된 인간 3D 삼중 배양 시스템은 알츠하이머병 상태를 모델링하는 데 효과적인 것으로 나타났다49. 다른 인간 미세아교세포-뉴런 공동 배양은 신경퇴행성 질환 연구에 생리학적으로 더 관련성이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 인간 유도 만능 줄기세포(50)로부터 유래된 미세아교세포와 운동 뉴런의 동반 배양은 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)51과 같은 질병을 연구하는데 유용할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 마우스에서 일차 뉴런 및 미세아교세포를 생성하는 데 드는 상대적 풍부함과 저렴한 비용을 감안할 때, 96웰 플레이트에서 미세아교세포-신경세포 공동 배양을 평가하는 것은 미세아교세포-신경세포 상호작용의 메커니즘 및 기능적 의미를 연구하기 위한 고처리량 접근법이 될 수 있습니다. 다운스트림 분석에는 실시간으로 세포 기능 변화를 결정하기 위한 라이브 셀 이미징, 세포 전사 변화를 결정하기 위한 RNA 시퀀싱, 세포 표현형 변화를 결정하기 위한 면역형광 현미경, 세포 및 단백질체 변화를 결정하기 위한 질량 분석법, 또는 공동 배양 상층액으로 분비되는 단백질을 측정하기 위한 효소 결합 면역 흡착 분석 및 웨스턴 블롯 분석이 포함될 수 있습니다.

미세아교세포는 중추신경계 건강 및 질병의 중요한 매개체이기 때문에 이 공동 배양은 질병 관련 분자 및 화합물이 미세아교세포-신경 세포 양방향 통신에 미치는 영향을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 다발성경화증의 맥락에서, 활성화된 미세아교세포는 파괴적인 역할을 할 수 있으며, 병리학의 악화에 기여할 수있다 52,53. 예를 들어, 이들은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)과 활성산소종(reactive oxygen species)을 분비할 수 있을 뿐만 아니라, 성상세포(astrocyte) 활성화를 촉진할 수 있다(45). 이 프로토콜은 다발성경화증에서 상승된 염증성 사이토카인과 공동 배양에서 미세아교세포를 치료하고 뉴런 건강의 결과를 평가함으로써 미세아교세포의 해로운 역할을 추가로 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 대안적으로, 이 미세아교세포-신경세포 공동 배양은 MS54에서 발견된 산화 산물인 산화된 포스파티딜콜린에 대한 반응으로 뉴런에 대한 미세아교세포의 보호 효과를 보여주는 데 사용되었습니다. 또한, 신경세포 사멸은 미세아교세포의 생존과 식세포작용을 촉진함으로써 발달 과정에서 미세아교세포 유전자 발현을 리모델링한다55. 따라서 이 프로토콜은 미세아교세포 표현형 및 기능에 대한 신경 세포 사멸의 영향을 결정하는 데도 도움이 될 수 있습니다.

요약하면, 이 프로토콜은 시험관 내에서 1차 마우스 유래 뉴런과 미세아교세포의 생성 및 공동 배양을 설명합니다. 96웰 플레이트에 설정된 미세아교세포-신경세포 공동 배양은 다발성경화증을 포함한 중추신경계 건강 및 질병의 맥락에서 미세아교세포와 뉴런의 상호 작용 메커니즘 및 기능을 조사하기 위한 고처리량 접근법이 될 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JP는 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)와 서스캐처원 대학교 의과대학(University of Saskatchewan College of Medicine)의 자금 지원을 인정합니다. YD는 University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 Discovery Grant(RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant(1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant(6368) 및 Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant의 자금 지원을 인정합니다. 그림 1A, 그림 2A 및 그림 3A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 페트리 접시 어부 07-202-011멸균
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus 뉴런 배양 시스템 기코 
해부 현미경VWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco' s 수정된 독수리 매체 (DMEM)Gibco11960-044
태아 소 세럼 ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
헤마사이토미터Hausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 미디엄 (1x)피셔 사이언티픽 
대식세포 콜로니 자극 인자 Peprotech315-02
마이크로-펜치RWDF11020-11오토클레이브/멸균
비필수 아미노산CytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
페니실린 스트렙토마이신 글루타민 (100x)Gibco103780-16
폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드 SigmaP3655-100MG
나트륨 피루베이트 (100 mM)Gibco11360-070
스프링 가위RWDS11008-42오토클레이브/멸균
수술용 칼날Feather08-916-5D멸균
T-25 플라스크Fisher10-126-9
T-75 플라스크 Fisher13-680-65
조직 집게Codman30-4218오토클레이브/멸균
티슈 가위RWDS12052-10오토클레이브/멸균
Trypan Blue 써모피셔 과학 15250-061
트립신(2.5%)ThermoFisher Sci15090046
광시야 면역형광 현미경Zeiss
A365340121083027

참고문헌

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