식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

Summary

화학 유전학은 표적 유전자좌에서 다른 곁사슬을 포함하는 아미노산으로 게이트키퍼 잔기를 치환하는 것을 포함합니다. 여기에서 우리는 cdpk1 의 hypomorphic 대립 유전자를 포함하는 돌연변이 기생충을 생성하고 돌연변이 배경에서 기생충이 채택한 보상 경로를 확인했습니다.

Abstract

말라리아 기생충에 의한 약물의 효과를 파괴하는 메커니즘 중 하나는 전사체의 재배선을 통해서입니다. 이 효과는 다유전자군에 속하는 표적 유전자에서 더 두드러집니다. CDPK 계열에 속하는 Plasmodium falciparum 단백질 키나아제는 혈액 병기 발달에 필수적입니다. 따라서 CDPK는 항말라리아 화합물 개발을 위한 좋은 대상으로 간주됩니다. 화학 유전학 접근법은 역사적으로 고등 진핵생물에서 단백질 키나아제의 기능을 규명하는 데 사용되어 왔습니다. 유전자 조작을 통해 다른 곁사슬을 가진 다른 아미노산을 게이트키퍼 잔기로 대체해야 합니다. 게이트키퍼 위치에서의 아미노산 치환은 단백질 키나아제의 활성을 조절하고 표적 유전자의 기능적 식별을 돕는 범프 키나아제 억제제(BKI)로 알려진 특정 종류의 화합물에 대한 감수성을 변화시킵니다. 여기에서 우리는 cdpk1의 hypomorphic 대립 유전자를 보유하는 돌연변이 기생충에 의해 진화 된 보상 메커니즘을 이해하기 위해 화학 유전학 접근 방식을 활용했습니다. 전반적으로, 우리의 접근법은 개별 키나아제에 대한 약물 내성의 발달을 방지하기 위해 동시에 표적화될 수 있는 보상 경로를 식별하는 데 도움이 됩니다.

Introduction

말라리아는 매년 수백만 명의 사망을 초래하는 주요 전염병 중 하나이며, 특히 5세 미만의 어린이는¹세를 기록하고 있습니다. 임상적으로 이용 가능한 말라리아 백신은 없습니다. 더욱이 가장 치명적인 인간 말라리아 기생충인 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)은 아르테미시닌 ^2,3,4,5라는 최전선 약물에 대한 내성을 획득한 것으로 알려져 있습니다. 아르테미시닌 내성의 전 세계적 확산을 방지하기 위해 신속하게 배포할 수 있는 새로운 약물 표적과 새로운 전략을 식별하는 것이 시급합니다. 약물 작용 메커니즘과 보상 경로의 분자적 기초에 대한 더 나은 이해는 약물 내성 발생을 피하기 위한 더 나은 전략을 고안하는 데 도움이 될 수 있습니다.

칼슘 의존성 단백질 키나아제(Calcium Dependent Protein Kinase, CDPK) 계열에 속하는 단백질 키나아제(protein kinase)는 적혈구, 성기, 적혈구 전 단계(pre-erythrocytic stage) 동안 기생충 발달의 여러 단계에서 매우 중요하다⁶. P의 무성 복제 중. falciparum, CDPK5는 성숙한 schizonts에서 merozoites의 출구에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다⁷. CDPK5의 조건부 결실은 정신분열증이 혈류로 merozoites를 방출하는 것을 허용하지 않으며, 이는 기생충의 죽음으로 이어집니다. CDPK5 매개 기생충 탈출의 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않았으며 단백질 키나아제 G(PKG)를 업스트림 조절인자로 포함하는 것으로 생각됩니다 ^7,8. CDPK7은 고리 단계 기생충이 영양류⁹로 성숙하는 데 필수적입니다. CDPK4는 CDPK과의 또 다른 구성원으로 모기의 성기 발달에 중요한 역할을 합니다. 그것은 편모 과정 동안 여러 단계에 관여하므로 자유롭고 운동성이 있는 남성 배우자 10,11,12,13의 형성에 중요합니다. CDPK1 인산화 성분 내막 복합체 및 rhoptry^14,15. 또한, CDPK1의 조건부 결실은 RBC¹⁶의 침입에 관여하는 단백질의 저인산화(hypo-phosphorylation)를 초래합니다. CDPK1은 침입 과정 동안 정점 소기관의 배출을 조절하는 것으로 나타났다¹⁷. CDPK1은 또한 SERA5 프로테아제¹⁸을 인산화하여 감염된 적혈구에서 메로조이트의 탈출을 돕습니다. 인산화된 CDPK1은 우선적으로 메로조이트의 정점 말단에 국한되며, 여기서 침입 과정에 필요한 다른 기생충 단백질과 상호 작용할 수 있다^19,20. CDPK1은 또한 수컷과 암컷 생식세포의 형성에 관여하는데, 이는 말라리아 전염과 모기 내 기생충의 성적 발달에 중요한 단계이다²¹.

화학 유전학 접근법은 역사적으로 포유류 키나아제^22,23의 기능적 역할을 식별하는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 게이트키퍼 위치의 잔류물을 다른 곁사슬의 아미노산으로 치환하는 방법을 활용합니다. 게이트키퍼 잔기의 변화는 인접한 ATP 포켓의 크기를 조절하며, 이는 다시 야생형에 비해 돌연변이 효소에 대한 범프 키나아제 억제제(BKI)라고 하는 화합물의 접근성을 변화시킵니다. 게이트키퍼 위치에서 부피가 큰 잔류물을 더 작은 잔류물로 치환하면 BKI에 접근할 수 있고, 역치환은 키나아제를 BKI에 내성을 갖도록 합니다. 몇몇 경우에, 게이트키퍼 잔기의 치환은 표적 효소의 키나아제 활성의 감소와 연관되어, 기능적 연구에 대한 변형을 용납할 수 없게 만든다^24,25. 효소 활성에 대한 게이트키퍼 치환의 부정적 영향은 불내성 키나아제⁽²⁵)의 두 번째 부위에서 억제 인자 돌연변이를 생성함으로써 역전될 수 있다. Apicomplexan 단백질 키나아제의 기능을 연구하기 위해 화학 유전학 접근법이 활용되었습니다. 더 작은 게이트키퍼 잔기를 함유하는 야생형 CDPK4는 bumped kinase 억제제 BKI-1 및 1294에 의해 선택적으로 억제되었으며, 이로 인해 남성 생식세포 형성 및 난포 발달이 차단되었습니다^11,12. CDPK4의 작은 게이트키퍼 잔기를 부피가 큰 메티오닌 잔기로 치환하면 편모¹¹에서 BKI 매개 억제가 감소했다. 말라리아 기생충과 밀접한 관련이 있는 Apicomplexan 기생충인 Toxoplasma gondii의 CDPK1은 tachyzoites^26,27에 의한 숙주 세포의 운동성 및 침입에 관여하는 것으로 나타났습니다. 야생형 TgCDPK1의 더 작은 게이트키퍼 포켓을 이용하여 동물 모델에서 질병 발병을 감소시키는 특정 억제제를 설계했습니다^28,29. P.의 참여 팔시파룸 후기 분열형 발달 및 배우자 형성에서 단백질 키나아제 G(PKG)는 특정 약리학적 억제제(^30,31)를 사용하여 효소의 활성을 억제함으로써 입증되었습니다. 게이트키퍼 위치에서 트레오닌을 글루타민(T618Q)으로 치환하면 억제제에 대한 돌연변이 효소의 민감도가 크게 감소하여 정상적인 생식세포 형성 및 분열체-고리 진행이 발생했습니다^30,31.

대부분의 이전 연구는 표적 키나아제 11,12,22,23,26,30,31의 기능적 특성 분석을 위해 화학 유전학 접근법을 사용했지만, 우리는 단백질 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 기생충의 보상 메커니즘 발달을 이해하기 위해 이 접근법을 채택했습니다. 우리는 이전에 메티오닌 (T145M)으로 CDPK1의 야생형 게이트키퍼 잔기를 치환하면 돌연변이 효소³²의 트랜스인산화 전위가 ~ 47% 감소한다는 것을 보여주었습니다. cdpk1의 hypomorphic 대립유전자(cdpk1t145m)를 포함하는 돌연변이 기생충은 다른 CDPK 패밀리 구성원의 전사 재배선에 의해 CDPK1의 감소된 활성에 대해 사전 적응됩니다. 우리는 이 전략이 필수 단백질 키나아제의 저형성 대립유전자를 포함하는 돌연변이 기생충의 보상 메커니즘을 설명하기 위해 일반적으로 사용될 수 있다고 믿습니다. 표적 키나아제의 기능을 부분적으로 보상하는 다른 키나아제는 개별 키나아제에 대한 약물 내성의 발달을 방지하기 위해 타겟 키나아제와 함께 동시에 억제될 수 있습니다. 이것은 말라리아 통제를 위한 더 나은 전략이 될 수 있습니다.

Protocol

그만큼 P. falciparum 기생충 균주 (NF54)는 Alvaro Molina Cruz 21,32,33에서 수득하였다. 기생충 배양에 사용된 O⁺ 인간 적혈구는 인도 뉴델리의 로타리 혈액 센터에서 채취했습니다. 플라스미드 pL6eGFP 및 pUF1은 Jose-Juan Lopez-Rubio로부터 수득하였다. DSM267은 Margaret A. Phillips와 Pradipsinh K. Rathod로부터 입수하였다. WR99210 Jacobus Pharmaceutical Company에서 제공했습니다.

1. 대장균에서 재조합 CDPK1 발현을 위한 플라스미드 구축

1. cdpk1 유전자의 전체 CDS를 증폭하기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 설계합니다(PlasmoDB accession no. PF3D7_0217500) 프라이머 분석 소프트웨어 사용.
   1. 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍인 DNA 중합효소(Pk1fpgex 및 Pk1rpgex)를 사용하여 Plasmodium falciparum에서 제조한 cDNA를 20μL의 반응 부피에서 템플릿으로 사용하여 전체 CDS를 증폭합니다. PCR 증폭 조건을 다음과 같이 설정합니다. 98°C에서 2분 동안 초기 변성, (98°C에서 30초 동안 변성, 52°C에서 20초 동안 어닐링, 62°C에서 20초 동안 연장) x 36, 62°C에서 10분 동안 최종 연장 추가 사용이 있을 때까지 PCR 산물을 4°C에서 보관하십시오.
2. 증폭된 PCR 산물 1μg과 pGEX4T1 발현 플라스미드 1μg을 BamHI(20,000U/mL) 및 NotI(20,000U/mL) 제한 엔도뉴클레아제와 함께 37°C에서 3-4시간 동안 총 반응량 30μL로 분해합니다.
3. 이중 분해된 PCR 산물과 플라스미드를 정제하려면 컬럼 기반 PCR 세척 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따릅니다.
4. 총 반응 부피 10 μL에서 1 μL의 T4 DNA ligase를 사용하여 1 μL의 벡터 대 삽입 몰 비율로 insert가 있는 이중 분해 정제 pGEX4T1 플라스미드 100 ng를 결찰합니다.
5. 트랜스폼 E. 대장균 제조업체의 프로토콜에 따라 결찰된 혼합물을 함유한 DH5α 유능한 세포 및 암피실린(100μg/mL)을 함유한 LB 한천 플레이트에 플레이트.
6. 제조업체의 지침에 따라 mini plasmid purification kit를 사용하여 plasmid를 정제하여 재조합 plasmid의 존재 여부에 대해 형질전환에서 얻은 4개의 박테리아 클론을 스크리닝합니다. 위의 1.3단계에서 설명한 대로 BamHI 및 NotI를 사용하여 이중 제한 분해로 재조합 플라스미드를 확인합니다.
7. Sanger DNA 염기서열분석을 통해 올바른 염기서열에 대한 제한 분해 양성 클론을 추가로 검증합니다. 트랜스폼 E. 대장균 CDPK1 단백질 발현을 위한 염기서열 검증 플라스미드 구조를 가진 BLR(DE3) pLysS 유능한 세포.

2. E. coli에서 재조합 CDPK1 단백질의 발현 및 정제

1. 재조합 CDPK1의 발현
   1. E의 단일 클론을 접종하십시오. 대장균 염기서열 검증된 플라스미드 구조체를 포함하는 BLR(DE3) pLysS 균주를 암피실린(100μg/mL)을 함유하는 LB 배지 10mL에 넣습니다. 200-250 rpm에서 진탕하면서 37°C에서 밤새 배양액을 배양합니다.
   2. 2차 배양액에 1차 배양액의 1%를 접종하고 박테리아 세포가 37°C에서 중간 로그 단계까지 성장하도록 합니다. 2차 배양물의 광학 밀도(OD)가 600nm에서 0.7-0.9에 도달하면 1mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 전장 재조합 CDPK1 의 발현을 유도하고 24°C에서 10-12시간 동안 배양합니다.
   3. 부양 후 E를 수확합니다. 5,000 x g에서 10분 동안 원심분리에 의한 대장 균 세포. 상층액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 유지합니다.
   4. 1mM 디티오트레이톨(DTT), 0.1mg/mL 라이소자임, 1mM EDTA, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 및 인산염 완충 식염수(PBS)의 1x 프로테아제 억제제 칵테일 조성으로 용해 완충액을 준비합니다.
   5. 세포 펠릿을 용해 완충액의 펠릿 중량 부피의 10배로 재현탁시킵니다. 단백질 변성으로 이어질 수 있는 국부적 가열을 방지하기 위해 15초 켜기, 9초 끄기 간격으로 15분 동안 세포 현탁액을 초음파 처리합니다.
   6. 용해물을 17,000 x g 에서 1시간 동안 원심분리하고 4°C에서 밤새 글루타치온 비드로 투명한 상층액을 배양합니다. 정제된 재조합 CDPK1 단백질을 얻기 위해 아래에 언급된 프로토콜을 따르십시오.
2. GST 태그 CDPK1 정제를 위해 글루타치온 비드를 사용한 친화성 크로마토그래피
   1. 250mL의 박테리아 배양을 위해 500μL의 완전히 재현탁된 글루타치온 비드를 사용하고 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다.
   2. 5mL의 결합 완충액(140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM_Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3)으로 비드를 세척하고 반전시켜 혼합합니다.
   3. 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 3x-4x에 대해 세척 및 원심분리를 반복합니다.
   4. 비드를 박테리아 세포 용해물에 추가하고 4°C에서 약간 흔들어(20-30rpm)하여 12시간 동안 배양합니다.
   5. 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 상층액을 저장하여 결합되지 않은 상태로 남아 있는 재조합 CDPK1의 양을 추정할 수 있습니다.
   6. CDPK1 결합 비드를 1mM DTT가 포함된 PBS로 최소 5-6회 세척한 후 50mM Tris, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.5로 세척합니다.
   7. 먼저 250μL의 용출 완충액 1(EB1)로 결합된 단백질을 2번 용리한 다음 250μL의 용출 완충액 2(EB2)로 2배를 용리합니다. EB1 및 EB2의 조성은 각각 50mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.5 및 20mM 환원 글루타치온으로 50mM Tris, 100mM NaCl 및 pH 7.5에서 각각 환원된 글루타치온입니다.
   8. CDPK1 결합 비드를 용출 완충액 1 및 2에서 부드러운 교반 또는 종단 간 회전을 사용하여 실온(RT)에서 5-10분 동안 배양합니다.
   9. 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 용리된 CDPK1 재조합 단백질이 포함된 상층액을 별도의 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
   10. 2.2.8 및 2.2.9 단계를 반복하여 EB1 및 EB2로 각각 2 개의 용리를 얻습니다.

3. 재조합 CDPK1 게이트키퍼 돌연변이 단백질 생성을 위한 부위 지정 돌연변이 유발

1. 염기서열이 검증된 cdpk1 유전자를 함유한 pGEX4T1 플라스미드를 사용합니다. 우리는 E. coli BLR(DE3) pLysS 균주의 형질전환에 사용된 것과 동일한 플라스미드를 사용하는 것을 선호합니다.
2. 야생형 cdpk1 유전자 염기서열에 게이트키퍼 돌연변이를 도입하도록 프라이머를 설계합니다. 야생형 게이트키퍼 잔기(T145)는 cdpk1 유전자의 ACC 코돈에 의해 암호화됩니다. 트레오닌 게이트키퍼를 각각 AGC 및 ATG 코돈으로 인코딩된 작은(세린, T145S) 및 부피가 큰(메티오닌, T145M) 게이트키퍼 잔기로 교체합니다.
3. 아래에 언급된 지침에 따라 site-directed mutagenesis를 위한 forward 및 reverse primer를 설계하십시오.
   1. 두 프라이머가 서로 보완적인지 확인하십시오. 돌연변이의 양쪽에 변형되지 않은 염기서열의 15-20개의 뉴클레오티드를 유지합니다. 돌연변이 부위를 제외한 염기서열에 대해 Tm이 50°C에서 55°C까지인지 확인합니다.
4. site-directed mutagenesis kit를 사용하여 cdpk1의 gatekeeper mutant construct를 생성합니다. 제조업체의 지침에 따라 원하는 돌연변이를 도입하십시오. 부위 지정 돌연변이 유발에 사용되는 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
5. 반응 혼합물을 0.5 μL DpnI (20,000 U/mL) 효소로 처리하여 부모의 메틸화된 플라스미드를 분해합니다. 반응 혼합물을 37°C에서 3시간 동안 배양합니다. E. coli DH5α 유능한 세포를 DpnI 처리된 반응 혼합물로 형질전환시킵니다.
6. DNA 염기서열분석을 통해 cdpk1 유전자 염기서열에서 원하는 돌연변이의 도입을 확인하기 위해 T145M 및 T145S 플라스미드 구조의 클론 각각을 스크리닝합니다.
7. 1.5단계에서 설명한 대로 재조합 CDPK1 T145M/S 단백질의 발현을 위해 E. coli BLR(DE3) pLysS 균주에서 염기서열이 검증된 플라스미드를 형질전환시킵니다.
8. 야생형 CDPK1 단백질에 대한 섹션 2에 설명된 단계에 따라 CDPK1 게이트키퍼 돌연변이 단백질을 발현하고 정제합니다.

4. CDPK1의 In vitro kinase 활성 분석

참고: 재조합 야생형 CDPK1 및 게이트키퍼 돌연변이 단백질의 키나아제 활성은 Allen et ^al.34에 설명된 반합성 에피토프 태깅 접근법에 의해 평가됩니다.

1. 50 μL의 총 반응 혼합물에서 CDPK1의 외인성 기질로서 50 mM Tris, 50 mM MgCl₂, 1x 인산염 억제제 칵테일과 2 μg 미엘린 염기성 단백질(MBP)을 포함하는 완충액에 50 ng의 재조합 단백질을 배양합니다.
2. 칼슘의 존재 또는 부재를 요구하는 조건에 따라 CaCl₂ 또는 EGTA를 각각 첨가하여 kinase 분석 완충액에서 각각 2.5mM의 최종 농도를 만듭니다. 완충액에 최종 농도 100μM까지 ATPγS를 첨가하여 전달 가능한 말단 인산기의 공급원으로 사용합니다.
3. 반응 혼합물을 30°C의 수조에서 1시간 동안 배양한 후 5mM EGTA를 첨가하여 반응을 종료합니다. 반응 혼합물에 5μl의 50mM p-니트로벤질 메실레이트(PNBM)를 첨가하고 형질인산화 MBP 및 자가인산화 CDPK1에서 인산화된 세린 및 트레오닌 잔기의 알킬화를 위해 20°C의 수조에서 2시간 동안 배양합니다.
4. 총 55 μL의 반응 혼합물에 19 μL의 4x SDS 시료 완충액을 추가하고 95 °C에서 5 분 동안 가열합니다.

5. in vitro kinase assay의 thio-phosphorylated products를 검출하기 위한 Western blot 분석

1. 12% SDS-PAGE 겔을 준비하고 각 샘플의 15μL를 로드합니다. 반응 혼합물을 분리하여 자가인산화된 CDPK1 및 transphosphorylated MBP를 시각화합니다.
2. 습식 전달 방법(³²)을 사용하여 SDS-PAGE 겔로부터 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이송한다.
3. RT에서 0.05% Tween 20을 포함하는 Tris 완충 식염수(20mM Tris-HCL, pH 7.5, 150mM NaCl)에 5% 탈지유로 배양하여 PVDF 멤브레인의 비특이적 부위를 차단합니다.
4. PVDF 멤브레인을 알킬화된 티오포스포릴화 부가물에 대한 토끼 1차 항체와 함께 차단 완충액에서 4°C에서 하룻밤 동안 1:2,500으로 희석하여 배양합니다.
5. 하룻밤 배양 후 0.05% 트윈 20을 넣은 트리스 완충 식염수로 블롯을 각각 3분 동안 10분 동안 세척합니다.
6. 블로킹 버퍼에 염소 항-토끼 2차 항체로 블롯을 RT에서 1시간 동안 1:5,000으로 희석한 후 0.05% Tween 20을 함유한 Tris-buffered saline으로 세척합니다.
7. 제조업체의 지침에 따라 용액 A와 용액 B를 동일한 비율로 혼합하여 블롯을 화학발광 기판으로 오버레이하고 암실의 X선 필름에 노출시켜 CDPK1 자가인산화 및 MBP 형질인산화 신호를 얻습니다.

6.게이트키퍼 치환을 도입하기 위해cdpk1 locus를 타겟팅하기 위한 가이드 시퀀스 클로닝  

참고: 20개의 뉴클레오티드의 가이드 서열은 수동 큐레이션으로 선택하고 다음 단계를 사용하여 BtgZI 부위의 pL6eGFP 플라스미드에서 클로닝했습니다.

1. BtgZI 효소를 사용한 pL6eGFP 분해
   1. 반응 조건에 대한 효소 제조업체의 프로토콜에 따라 20 μL의 반응 혼합물에서 60 °C에서 4시간 동안 pL6eGFP 플라스미드³⁵ 1 μg의 BtgZI 효소 (5,000 단위/mL)와 함께 분해합니다.
   2. 4시간의 배양 기간이 끝나면 분해된 플라스미드를 1% 아가로스 겔에 올려놓고 분해된 플라스미드가 들어있는 겔 조각(~ 9.8kb)을 절제합니다. 제조업체의 지침에 따라 column-based gel extraction kit를 사용하여 분해된 plasmid를 정제합니다.
2. 올리고의 어닐링
   1. DNase/RNase가 없는 물에서 올리고뉴클레오티드(Ck1GUIDEFWD 및 Ck1GUIDEREV)를 재구성하여 100μM 원액을 제조합니다.
   2. 10mM Tris(pH 8.0), 50mM NaCl 및 1mM EDTA를 포함하는 용액에 각 올리고뉴클레오티드 20μM를 결합합니다. 혼합물을 95°C의 건욕에서 5분 동안 배양하고 반응을 실온으로 냉각시킵니다. 반응 혼합물의 온도가 RT에 도달하는 데 일반적으로 1시간이 걸립니다.
   3. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 Tris pH 8.0에서 0.5μM로 희석하여 총 반응 혼합물 부피가 100μL가 됩니다.
3. 융합 반응
   1. 1.5 μL의 희석된 올리고뉴클레오티드와 100 ng의 BtgZI 분해 선형화 플라스미드를 총 반응 부피 10 μL의 In-Fusion 효소 프리믹스에 결합하여 pL6CK1G 플라스미드를 포함하는 CDPK1 가이드를 생성합니다.
   2. 50°C에서 15분 동안 반응을 배양합니다. E의 변형이 진행될 때까지 4°C에서 반응을 보관하십시오. 대장균.
      참고: 장기 보관의 경우 반응 혼합물을 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
4. E의 변형. 대장균 Stellar competent cells (항성, 유능한 세포)
   1. 반응 혼합물 2.5μL를 E에 첨가합니다. 대장균 Stellar competent Cells를 선택하고 제조업체의 프로토콜에 따라 형질전환 과정을 진행합니다.
   2. 형질전환된 유능한 세포를 LB 암피실린(100μg/mL) 플레이트에 패팅하고 형질전환된 박테리아가 밤새 37°C에서 자랄 수 있도록 합니다.
   3. 형질전환된 콜로니를 선택하고 시판되는 plasmid miniprep kit를 사용하여 plasmid를 추출합니다. 플라스미드 정제에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다. Sanger DNA 염기서열분석을 통해 플라스미드에 가이드가 삽입되었는지 검증합니다.

7. Cas9 엔도뉴클레아제 제한 cdpk1 유전자좌의 수리를 위한 상동성 암의 클로닝

참고: 타겟 유전자좌에 도입될 SNP를 포함하는 상동성 암(homology arm)은 상업적으로 합성됩니다. 우리는 일반적으로 길이가 400-1000bp인 상동성 암을 사용합니다. 상동성 암(homology arm)은 원하는 SNP의 통합 후 변형된 유전자좌의 재절단을 방지하기 위해 가이드 RNA 영역 및 PAM에 조용한 돌연변이를 포함합니다. Met 또는 Ser 게이트키퍼 돌연변이와 침묵 돌연변이를 포함하는 상동성 암(CDPK1의 뉴클레오티드 133 - 553에 해당)은 AflII 및 SpeI 제한 부위 옆에 있습니다.

1. 20 μL의 반응 혼합물에서 AflII(20,000 U/ml) 및 SpeI(20,000 U/ml) 제한 효소 각각을 0.5 μL를 사용하여 pL6CK1G와 상동성 암을 포함하는 플라스미드를 37°C에서 4시간 동안 이중 분해합니다.
2. 1.5% 아가로스 겔에서 이중 분해 플라스미드의 전체 반응을 실행하고 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 pL6CK1의 상동성 암 및 플라스미드 골격에 해당하는 밴드를 정제합니다.
3. T4 DNA ligase를 사용하여 10 μL의 총 반응 부피에서 1:5의 벡터 대 삽입 비율로 100 ng의 pL6CK1 플라스미드를 분해한 상동성 암을 결찰합니다. 16°C에서 하룻밤 동안 결찰 반응을 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 E . coli DH5α 유능한 세포를 완전한 결찰 혼합물로 형질전환시킵니다.
4. 형질전환된 세포를 암피실린(100μg/mL)을 함유하는 LB 한천 플레이트에 패팅하여 양방향 형질전환체를 선택합니다. LB ampicillin 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 plasmid extraction kit를 사용하여 plasmid를 정제합니다.
5. 단계 7.3에서 설명한 것과 동일한 분해 조건을 사용하여 정제된 플라스미드를 AflII 및 SpeI 효소로 절단하여 상동성 암의 존재에 대해 클론을 확인합니다. 상동성 암의 전체 염기서열을 검증하기 위해 Sanger DNA 염기서열분석을 통해 이중 분해 양성 클론을 추가로 확인합니다.

8. 말라리아 기생충 transfection을 위한 pL6CK1Met, pL6CK1Ser 및 pUF1 플라스미드 정제

1. pL6CK1Met, pL6CK1Ser 및 pUF1의 염기서열 검증 클론의 1차 배양액 5mL를 암피실린(100μg/mL)이 함유된 LB 배지에 넣고 10시간 동안 배양합니다. 1차 배양액을 2차 배양액으로 1:1000 비율로 옮기고 추가로 12시간 동안 배양합니다.
2. 원심분리기 병에서 5000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아 배양을 펠렛화합니다.
3. 제조업체의 프로토콜에 따라 plasmid purification kit를 사용하여 plasmid를 분리합니다. 기생충의 직접 transfection을 위해 플라스미드 DNA를 DNase/RNase가 없는 물에 용해시킵니다.

9. transfection을 위한 Plasmodium falciparum의 시험관 내 배양 및 소르비톨 동기화

참고: 인간 적혈구(RBC)에서 P. falciparum in vitro 배양은 Trager 및 Jensen(³⁶)이 설명한 방법에 따라 수행됩니다.

1. P의 NF54 균주를 전파합니다. L-글루타민, 25mM HEPES, 25mM 중탄산나트륨 및 50μg/mL 하이포잔틴이 보충된 RPMI 1640을 포함하는 완전 RPMI(cRPMI) 배지에서 2%의 헤마토크릿으로 O⁺ 인간 적혈구에서 배양하여 팔시파룸. 배지에 0.5 % AlbuMAX II 및 10 μg / mL 겐타마이신을 보충하고 5 % O₂ , 5 % CO₂ 및 90 % N₂ 의 분위기에서 37 ° C에서 배양을 유지합니다.
2. 고리 단계 기생충을 얻기 위한 소르비톨 동기화를 위해 RT에서 3분 동안 2,300 x g 에서 원심분리하여 50mL 원추형 튜브에 있는 비동기 기생충을 펠렛화합니다. 상층액을 버립니다.
3. 기생된 RBC를 5% 소르비톨 9 부피로 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 2,300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 적혈구를 펠릿 아래로 내리고 소르비톨을 버립니다.
4. 소르비톨 처리된 기생충을 불완전한 RPMI, iRPMI(알부맥스 및 중탄산나트륨이 없는 RPMI 배지)로 세척한 후 cRPMI에서 배양합니다. plasmid transfection을 위해 다음 cycle에서 ring stage parasites를 사용합니다.

10. pL6CK1Met, pL6CK1Ser 및 pUF1 플라스미드를 이용한 고리 단계 기생충의 형질주입

참고: 다음 단계는 플라스미드 DNA를 가진 고리 단계 기생충의 직접 transfection에 사용됩니다.

1. 30mL의 물, 240mM KCl, 0.3mM_CaCl2, 4mM EGTA, 10mM_MgCl2, 20mM_K2HPO4/KH2PO4 및 50mM HEPES에 용해시켜 2x 사이토믹스 완충액³⁷을 제조합니다. pH를 7.6으로 조정합니다. 최종 부피를 50mL로 조정합니다. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 완충액을 여과 멸균합니다. 그런 다음 2x cytomix buffer를 멸균수로 희석하여 1x cytomix buffer를 얻습니다.
2. 멸균된 15mL 원뿔형 튜브에 100μL의 충전된 고리 스테이지 기생 적혈구를 넣고 5mL의 1x 사이토믹스 완충액으로 2번 세척합니다. RT에서 994 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세척을 수행합니다.
3. 세척 후 완충액을 제거하고 각 플라스미드(T145M 돌연변이 생성을 위한 pL6CK1Met/pUF1 및 T145S 돌연변이 생성을 위한 pL6CK1Ser/pUF1) 50 μg을 충전된 기생 적혈구에 첨가합니다. 그런 다음 plasmid의 부피에 따라 2x buffer를 추가하고 1x buffer 농도로 400 μL로 용량을 조절합니다.
4. 각 transfection에 대해 위 용액 400μL를 0.2cm 큐벳에 전달합니다. 0.31 kV, 950 μF, 저항이 무한으로 설정된 조건을 사용하여 전기합니다.
5. 전기천공법 후, 큐벳에서 형질주입된 기생충을 제거하고 cRPMI와 혼합한 다음 총 부피가 15mL인 T25 플라스크에 옮깁니다. 9.1단계에서 언급한 조건에서 2시간 동안 기생충을 배양합니다.
6. 배양 후 형질주입된 기생충을 50mL 원추형 튜브에 옮기고 994 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 10mL의 불완전한 RPMI로 기생충을 씻습니다. 신선한 cRPMI로 2일 동안 배양하고 24시간 후에 배양액을 보충합니다.
7. 48시간 후, 각 플라스크에서 cRPMI를 제거하고 2 nM의 WR99210 및 150 nM의 DSM267³⁸을 포함하는 cRPMI에 배양액을 재현탁시킨다. 그런 다음 400μL의 신선한 적혈구를 추가하여 배양액을 T75 플라스크에 옮깁니다. 7일 동안 WR99210와 DSM267이 포함된 cRPMI로 배지를 매일 보충합니다. 그 후, transfection 후 14일까지 두 약물을 모두 포함하는 cRPMI를 격일로 추가합니다.
8. 14일째에 슬라이드 준비를 위해 1.5mL의 미세 원심분리 튜브(MCT)에 200μL의 형질주입된 배양액을 분주합니다. RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 흡인하고 세포를 슬라이드로 옮깁니다. 다른 슬라이드를 45° 각도로 배치하여 문지르십시오.
9. 슬라이드를 메탄올에 고정하고 초순수에 1:10으로 희석하여 Giemsa 염색을 준비합니다. 그런 다음 슬라이드를 Giemsa 염색에 20분 동안 완전히 담가 염색합니다. 슬라이드를 흐르는 물에 씻고 완전히 말리십시오. 그런 다음 이멀젼 오일을 바르고 100x 배율로 광학 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다.
10. 기생충이 시각화되면 매일 배지를 보충하고 2-3일 동안 자랄 수 있도록 합니다. 그런 다음 기생충을 제거하여 표적 유전자 자리에서 표적 유전자 염기서열의 원하는 변형을 확인합니다.
    알림: 14일째에 기생충이 보이지 않으면 4일 후에 미디어(두 약물 모두 포함)를 보충하십시오. 기생충을 30% 줄이고 신선한 혈액을 추가하여 기생충이 다시 나타날 때까지 7일마다 2%의 헤마토크릿을 유지합니다.

11. cdpk1 locus의 원하는 변형을 가진 형질전환 기생충의 PCR 검증

1. 기생충이 2-3일 성장한 후 500μL의 배양액을 제거하고 1.5mL MCT로 옮깁니다.
2. 2,400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 사포닌 처리로 적혈구를 용해합니다.
   1. 사포닌 처리를 위해 10% 사포닌 용액 10μL를 재현탁 펠릿 1mL에 넣고 4°C에서 5분 동안 보관합니다. 2,400 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 붉은색이 완전히 사라지고 검은 색의 기생충 알갱이가 얻어질 때까지이 단계를 반복하십시오.
3. 기생충 펠릿을 1x PBS 1mL로 2,400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 50μL의 DNase/RNase가 없는 물에 재현탁시킵니다. 재현탁 기생충 펠릿을 95°C에서 5분 동안 가열한 다음 16,200 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 기생충 DNA가 포함된 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
4. 프라이머 세트 ck1f1 및 ck1r3wt ( 표 1 참조)를 사용하는 전장 유전자를 PCR로 증폭하기 위해 위의 유전 물질을 활용하고, 상기 단계 1.2에서 설명한 바와 같이 상동성 암 외부 영역을 특이적으로 표적으로 합니다. ck1f1 프라이머를 사용하여 T145M 돌연변이를 포함하는 상동성 영역의 염기서열을 분석합니다.

12. 클론 유전자 변형 기생충을 얻기 위한 희석 제한

1. 염기서열 확인 후 형질주입된 기생충 배양액을 희석하여 200μL당 1개의 기생충 농도를 달성합니다. 그런 다음 희석된 배양액 100μL를 96웰 조직 배양 플레이트의 웰에 추가합니다. 다음 단계(12.2-12.4)를 수행하여 1 기생충/200 μL를 달성합니다.
2. 2% 헤마토크릿으로 기생하는 적혈구 10mL를 준비합니다. 위에서 설명한 Giemsa 염색 방법을 사용하여 배양액의 기생충혈증 비율을 추정합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 1:100 희석된 배양에서 총 적혈구 수를 계산합니다.
   총 적혈구 수/mL = 계수된 평균 적혈구 수 x 희석 계수 x 10⁴
   기생하는 적혈구의 수/mL = (기생충혈증 퍼센트 x 총 적혈구의 수/mL)/100
3. 초기 배양액을 2배(각각 1:100 희석)하여 기생하는 RBC의 1:10,000 희석액을 준비합니다.
4. 희석된 배양액에서 적절한 부피(마이크로리터)를 추가하여 10mL의 배지에서 총 50개의 기생충을 얻어 2%의 헤마토크릿을 보장합니다. 그런 다음 50개의 기생충이 포함된 배지 100μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 혼합 가스(단계 9.1에서 상기한 바와 같은 조성물)로 세척된 밀폐된 세카도르에 플레이트를 놓고 37°C에서 배양합니다. 2일마다 미디어를 교체하십시오.
5. 기생충이 나타날 때까지^7일마다 2% 헤마토크릿이 함유된 cRPMI로 배지를 교체합니다.
   1. 96웰 플레이트를 45° 각도로 기울이고 적혈구가 가라앉을 때까지 기다립니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하고 기생충이 없는 웰에서 배지의 분홍색과 대조되는 기생충이 포함된 웰에서 노란색으로 변하는 색상을 관찰합니다. 이 색상 변화는 기생충이 매체를 산성화하기 때문에 발생합니다.
6. 색상 변화를 관찰한 후 색상 변화를 나타내는 우물에서 소량의 배양액을 꺼내고 슬라이드에 번짐을 준비하고 우물 위치에 해당하는 숫자로 라벨을 붙입니다. 슬라이드를 Giemsa 염색제로 염색하고 위에서 설명한 대로 현미경으로 관찰합니다.
7. 우물의 내용물을 T25 플라스크에 옮기고 현미경으로 기생충을 관찰했습니다. 기생충이 T25 플라스크에서 4-5일 동안 자라도록 하고 이틀에 한 번씩 배지를 보충합니다.
8. 기생충혈증이 2-3%에 도달하면 500μL의 기생충 배양액을 추출합니다. 그런 다음 적혈구를 사포닌 용해하고 섹션 11에 설명된 방법을 사용하여 기생충 유전 물질을 추출합니다.
9. 클론 형질전환 기생충의 생성을 확인하려면 위의 1.1.1단계에서 설명한 대로 PCR 반응을 설정하고 DNA 시퀀싱을 위한 PCR 산물을 보내 표적 유전자좌에서 원하는 SNP의 도입을 확인합니다.

13. Real-Time PCR을 이용한 전사체 분석

1. Percoll/Sorbitol 정제 및 기생충의 동기화
   1. 39,40mL 코니컬 튜브에 각각 70%씩 3mL를 순차적으로 적층한 다음 15mL 코니컬 튜브에 퍼콜/소르비톨 40% 용액을 준비합니다.
   2. WT 및 CDPK1 T145M의 주혈기 기생충을 주로 포함하는 1-2mL의 기생충 배양액을 그래디언트 위에 부드럽게 층상합니다.
   3. 스윙 버킷 로터에서 원심분리기에서 4로 설정된 감속을 사용하여 RT에서 15분 동안 2,300 x g 에서 그래디언트를 원심분리합니다.
   4. 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 그래디언트의 계면에서 기생충의 trophozoite 및 schizont 단계를 포함하는 중간 고리를 수집합니다.
   5. 9:1(cRPMI:10xPBS)의 동일한 부피를 추가하여 기생충을 세척한 다음 994 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 기생충을 펠릿화합니다.
   6. 펠릿을 19:1(cRPMI:10xPBS)의 용액으로 다시 세척한 다음 994 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
   7. 각 기생충 펠릿을 2% 헤마토크릿이 있는 cRPMI가 포함된 별도의 플라스크에 추가합니다(37°C에서 사전 배양). 위의 단계 9.1에서 설명한 것과 같은 조건에서 플라스크를 4시간 동안 배양하여 농축된 주혈진기에서 새로운 적혈구로 merozoites의 침입을 허용합니다.
   8. 4 시간 후, 9.2-9.4 단계에서 설명한대로 기생충을 소르비톨로 처리하여 고도로 동기화 된 0 - 4 h 고리 단계 기생충을 얻습니다.
   9. 소르비톨 처리 후 44 시간 동안 동기화 된 기생충을 배양하여 기생충의 44 - 48 시간 schizont 단계를 얻습니다.
2. WT 및 CDPK1 T145M 기생충의 주혈체로부터 RNA 분리
   1. 침입 후 44-48 시간에 WT 및 CDPK1 T145M 기생충을 수확하십시오. 기생충 펠릿을 994 x g 에서 1x PBS로 4 ° C에서 5 분 동안 세척합니다.
   2. 1x PBS 1mL에 기생충 펠릿을 재현탁시키고 사포닌으로 처리하여 11.2.1단계에서 설명한 대로 주변 적혈구를 용해합니다.
   3. 기생충 펠릿을 RNA 추출 시약 1mL에 재현탁시키고 추가 처리할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
   4. 핵단백질 복합체의 완전한 해리를 위해 냉동된 펠릿을 15-30°C에서 해동합니다.
   5. RNA 추출 시약 mL당 200μL의 클로로포름을 추가하고 튜브를 15초 동안 손으로 세게 흔듭니다. 실온에서 2-3분 동안 배양합니다.
   6. 혼합물을 16,200 x g 에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리합니다. RNA는 무색의 상부 수성층에만 독점적으로 남아 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.
3. WT 및 CDPK1 T145M 기생충의 RNA에서 cDNA 합성
   1. 오염된 DNA를 제거하기 위한 제조업체의 지침에 따라 DNA 제거 키트로 RNA 함유 샘플을 처리합니다.
   2. 제조업체의 프로토콜에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 분리된 RNA 샘플에서 cDNA를 합성합니다. 역전사 과정을 위해 oligo-dT 프라이머 대신 무작위 헥사머 프라이머를 사용합니다.
   3. cDNA 전처리 중 정제된 RNA에서 게놈 DNA 오염의 캐리오버를 배제하기 위해 cDNA 전처리에 사용되는 각 RNA 샘플에 대한 NO-RT(역전사 효소를 추가하지 않고 설정된 반응) 제어를 확인합니다.
   4. 게놈 DNA 오염을 배제하기 위해 전장 cdpk1 유전자와 같은 중간 intronic 염기서열을 포함하는 유전자 세그먼트를 증폭하여 cDNA를 테스트합니다. 1.1.1단계에 설명된 대로 PCR 조건을 사용합니다.
4. WT 및 CDPK1 T145M 기생충의 전사체 발현 분석
   1. WT 및 CDPK1 T145M 기생충에서 제조한 cDNA를 사용하여 Real-time PCR을 통해 11개의 서로 다른 유전자에 대한 전사체 발현 분석을 수행합니다. 11개의 타겟 유전자에는 적혈구 침습에 관여하는 CDPK 계열 7개 멤버와 4개의 kinase가 포함됩니다(Real-time PCR에 사용되는 유전자 및 해당 프라이머는 표 2 참조).
   2. 프라이머 합성 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 설계합니다. 유사한 용융 온도를 가진 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 선택된 각 유전자의 약 120bp를 증폭합니다.
   3. pre-mix를 사용하여 표적 유전자를 증폭하고 다음 사이클링 매개변수를 사용하여 Real-Time PCR 시스템에서 플레이트를 실행합니다: 95°C에서 3분 동안 초기 변성, 95°C에서 10초 동안 40주기 변성, 52°C에서 20초 동안 어닐링, 62°C에서 30초 동안 연장.
   4. 두 개의 하우스키핑 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 및 Threonine tRNA ligase(ThrRS)³²를 사용하여 각 유전자의 발현 수준을 정상화합니다. WT 대조군과 비교하여 CDPK1 T145M 기생충의 각 표적 키나아제의 상대 발현을 계산합니다.
   5. R 통계 분석 패키지를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 또는 다른 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
      참고: RNA-Seq 또는 마이크로어레이와 같은 글로벌 전사체학 방법은 WT에 비해 돌연변이 기생충의 전사체 재배선에 대한 더 넓은 관점을 얻기 위한 우수한 접근 방식입니다.

Results

재조합 WT CDPK1은 N-말단 글루타티온 S-전이효소(GST) 태그가 있는 융합 단백질로 발현되고 GST 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제됩니다. 정제된 CDPK1 단백질은 anti-CDPK1 및 anti-GST 항체를 사용하여 Western blot을 통해 검출되었습니다(그림 1). WT CDPK1의 트레오닌 게이트키퍼 잔기(T145)는 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 각각 CDPK1T145M 및 CDPK1T145S 돌연변이 재조합 단백질을 생성하는 Met 및 Ser로 대체되었습니다(그림 2). 모든 재조합 CDPK1 단백질의 키나아제 활성을 평가하기 위해 시험관 내 키나아제 분석을 수행했습니다. 키나아제 활성은 웨스턴 블롯 형식의 특정 항체를 사용하여 티오-포스페이트 에스테르 그룹을 검출함으로써 반합성 에피토프 태그 접근법³⁴ 를 사용하여 테스트되었습니다(그림 3). CDPK1의 자가인산화 활성과 CDPK1의 외인성 기질로 사용되는 MBP의 형질인산화에 대한 게이트키퍼 치환의 영향은 각각의 자가인산화 및 형질인산화 밴드의 강도를 정량화하여 평가되었습니다. 메티오닌 게이트키퍼가 있는 돌연변이 CDPK1은 ~53%의 트랜스인산화 활성을 유지한 반면, 게이트키퍼 위치에 세린이 존재하면 기질 트랜스인산화가 완전히 폐지되었습니다(그림 3). Thr에서 Met(T145M)로의 게이트키퍼 치환으로 이어지는 SNP는 2개의 플라스미드 시스템을 사용하여 CRISPR-Cas9를 통한 내인성 cdpk1 유전자좌에서 엔지니어링되었습니다(그림 4 및 그림 5). T145S 치환을 가진 돌연변이 기생충은 생성되지 않았는데, 이는 CDPK1 활성에 대한 Ser 게이트키퍼의 치명적인 영향 때문일 수 있습니다. CDPK1T145M 돌연변이 기생충은 제한 희석법을 사용하여 서브클로닝하고, CDPK1T145M 돌연변이 기생충의 생성을 검증하기 위해 Sanger 시퀀싱을 통해 게이트키퍼 치환을 확인했습니다. CDPK 계열의 7개 구성원과 기생충의 후기 분열성 발달에 관련된 4개의 다른 키나아제를 포함한 11개의 다른 키나아제의 전사체 수준을 Real-time PCR을 사용하여 테스트했습니다(그림 6). 11개의 서로 다른 키나아제의 발현 수준을 하우스키핑 유전자로 정규화된 CDPK1T145M 돌연변이 기생충과 야생형(WT) 기생충 간에 비교했습니다. CDPK 가족 구성원의 전사체 발현은 WT 기생충에 비해 CDPK1T145M 돌연변이에서 변경되었습니다(그림 6). CDPK1T145M 돌연변이에서 더 높은 발현을 보이는 전사체는 CDPK1T145M 돌연변이 기생충에서 CDPK1의 기능을 보상할 수 있습니다.

그림 1: 전장 재조합 야생형(WT) PfCDPK1의 특성화. N-말단 글루타티온 S 전이효소(GST) 태그와 융합된 전장 WT CDPK1 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제하고 10% SDS-PAGE에서 분리했습니다. CDPK1은 Coomassie Brilliant Blue R-250 염색 폴리아크릴아미드 겔에서 나타난 바와 같이 예측된 분자량 ~ 87 kDa로 이동했다. SDS-PAGE에서 분리한 재조합 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 항-CDPK1 및 항-GST 항체로 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리하였다. SDS-PAGE에서 전장 재조합 CDPK1에 해당하는 band를 두 항체 모두에서 검출하여 단백질의 정체를 확인하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 정제된 재조합 CDPK1 게이트키퍼 돌연변이 단백질의 특성 분석. (A) TgCDPK1 및 PfCDPK1의 일차 아미노산 서열의 정렬(Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). PfCDPK1의 위치 145에 있는 트레오닌은 TgCDPK1의 게이트키퍼 위치인 글리신 128에 해당합니다(빨간색으로 강조 표시). (B) WT CDPK1에서 삼중항 코돈 ACC(검은색 원)로 인코딩된 Thr 게이트키퍼 잔류물(빨간색으로 강조 표시)의 만화가 표현. site-directed mutagenesis에 의한 gatekeeper 잔기를 대체하여 CDPKT145M에서 Met(노란색으로 강조 표시) 및 CDPKT145S에서 Ser(파란색으로 강조 표시)로 재조합 돌연변이 CDPK1 단백질을 생성합니다. (C) CDPK1의 재조합 WT 및 돌연변이 단백질의 SDS-PAGE 프로필. 재조합 WT 및 게이트키퍼 돌연변이 단백질을 GST 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE에서 분리하였다. 모든 재조합 단백질은 ~87kDa의 예상 분자량을 따릅니다. M- 분자량 사다리. (D) 웨스턴 블로팅을 통한 재조합 CDPK1 WT 및 돌연변이 단백질의 특성 분석. CDPK1의 재조합 WT 및 게이트키퍼 돌연변이 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하고 웨스턴 블로팅을 위해 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. SDS-PAGE에서 full-length recombinant WT 및 mutant CDPK1 단백질에 해당하는 band를 anti-CDPK1 및 anti-GST 항체로 검출하여 모든 재조합 단백질의 동일성을 확인하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: CDPK1의 게이트키퍼 치환은 돌연변이 효소의 키나아제 활성을 감소시킵니다. (A) CDPK1 단백질의 키나아제 활성을 검출하기 위한 반합성 에피토프 태깅 접근법의 만화가 표현. 여기에는 transphosphorylation 활성만 설명되어 있습니다. CDPK1 단백질은 전달 가능한 말단 티오포스페이트기의 공급원인 ATPγS(노란색 실선 삼각형)가 있는 상태에서 외인성 기질(S, 단색 녹색 사각형)을 생성합니다. 티오포스포릴화된 잔기는 p-니트로벤질 메실레이트(PNBM)로 처리하여 알킬화되어 티오포스페이트 에스테르를 형성한 다음 알킬화된 티오포스페이트 부가물을 특이적으로 인식하는 항체로 검출됩니다. (B) 반합성 에피토프 태깅 접근법을 사용한 시험관 내 키나아제 활성 분석을 사용하여 재조합 CDPK1 돌연변이 단백질의 자가인산화 및 트랜스인산화 전위에 대한 게이트키퍼 치환의 효과를 테스트했습니다. 모든 재조합 단백질은 칼슘 의존성 키나아제 활성을 나타냅니다. CDPK1의 자가인산화(auto-phosphorylation) 및 외인성 기질인 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 트랜스인산화(trans-phosphorylation)는 염화칼슘(Ca²⁺)이 있는 경우에만 분명했으며, Ca²⁺ 이온의 특정 킬레이터인 EGTA의 존재 하에서는 인산화가 검출되지 않았습니다. 게이트키퍼 돌연변이는 감소된 자가인산화 활성을 보인 반면, MBP의 트랜스인산화는 CDPK1T145S년에 완전히 폐지되었습니다. CDPK1T145M는 이전에 보고된 바와 같이 트랜스인산화 전위(~ 53%)를 유지한다³². 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: CRISPR-Cas9를 사용하여 cdpk1 유전자좌의 게이트키퍼 위치에 SNP를 도입하기 위한 플라스미드 구성. 432 내지 451 bp에 해당하는 20개의 뉴클레오티드의 가이드 서열을 pL6eGFP 플라스미드의 BtgZI 제한 부위에서 클로닝하여 pL6CK1G를 생성하였다. 쉴드 돌연변이(빨간색으로 표시)와 함께 원하는 SNP(T145M 또는 T145S, 녹색으로 표시된 해당 코돈)를 통합한 상동성군(421 bp)을 AflII 및 SpeI 제한 효소 부위 내의 pL6CK1G에서 클로닝하여 각각 pL6CK1G^T145M 및 pL6CK1G^T145M을 생성했습니다. 쉴드 돌연변이는 원하는 편집 후 변형된 유전자좌의 재절단을 방지합니다. 두 번째 플라스미드에 인코딩된 Cas9 엔도뉴클레아제인 pUF1은 pL6CK1G^T145M/S 플라스미드에서 발현된 guide RNA의 도움으로 cdpk1 유전자좌 내의 표적 부위로 전달됩니다. Cas9는 PAM 시퀀스의 5' 쪽을 향해 대상 부위에 이중 가닥 절단을 도입합니다. DSB는 pL6CK1G^T145M/S 플라스미드의 homology arm을 사용하여 복구됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: P의 개략도 표현. cdpk1 유전자좌에서 게이트키퍼 돌연변이(T145M)의 도입을 위해 CRISPR 플라스미드를 사용한 falciparum transfection. i) 비동기 P. Falciparum 배양은 동기화된 고리 단계 기생충을 얻기 위해 소르비톨 처리됩니다. ii) 동기화된 고리 단계 기생충은 완충 용액에 재현탁된 pL6CK1G,^T145M/S 및 pUF1 플라스미드와 함께 전기천공법 큐벳에서 채취합니다. iii) 기생충은 310볼트, 950μF 및 무한 저항에서 전기천공됩니다. iv) 형질주입 후, 기생충을 새로운 완전 RPMI 배지(cRPMI)가 포함된 T25 플라스크로 옮기고 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 형질주입된 기생충은 WR99210 및 DSM267 약물이 보충된 cRPMI로 전환되고 T75 플라스크에서 증식됩니다. v) 14일째에는 슬라이드를 준비하고 Giemsa 염색을 사용하여 염색합니다. vi) 그 후, 기생 적혈구의 존재를 평가하기 위해 광학 현미경으로 혈액 도말을 시각화합니다. vii) 시각화 시 기생충은 약물이 있는 상태에서 자랄 수 있습니다. 그 후, 기생충을 처리하여 표적 cdpk1 유전자좌의 원하는 변형을 검증하기 위한 PCR 및 DNA 시퀀싱을 위한 템플릿을 얻습니다. viii) 검증 후, 클론 형질전환 기생충은 96-웰 플레이트에서 제한 희석을 설정하여 수득합니다. ix) 양성 웰(positive well)로부터의 클론 형질전환 기생충을 T25 플라스크로 옮겨 성장시키십시오. x) 클론 형질전환 기생충은 PCR을 통해 추가로 검증되고 DNA 염기서열 분석 및 크로마토그램 분석을 통해 게이트키퍼 위치에서 원하는 SNP의 존재를 검증합니다. 그림은³²에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 실시간 PCR(RT-PCR)을 통한 표적 유전자의 전사체 분석에 사용되는 단계의 개략도. 나 는) P. 주로 성숙한 Schizont기 기생충이 있는 Falciparum 배양은 동일한 주기에서 소르비톨 처리를 통해 얻어집니다. ii) 기생충은 성숙한 분열기 기생충의 농축을 위해 15mL 원뿔형 튜브에 70/40 Percoll/sorbitol의 그래디언트에 부드럽게 층을 이룹니다. iii) 40 % 및 70 % personal/sorbitol의 간기에 있는 검은색 고리를 새로운 50mL 튜브로 옮기고 처리하여 cRPMI에 재현탁시킵니다. schizont-stage 농축 기생충은 침입을 위해 37 °C에서 사전 배양 된 신선한 RBC로 배양됩니다. iv) 기생충을 4시간 동안 배양한 다음 5% 소르비톨로 처리하여 고도로 동기화된 0-4시간 고리 단계 기생충을 얻습니다. v) 기생충을 추가로 배양하여 고도로 동기화된 44-48시간 분열기 기생충을 얻기 위해 소르비톨 후 추가로 처리한다. vi) 동기화된 기생충은 사포닌으로 처리하여 적혈구에서 방출하고 RNA 추출 시약에 저장합니다. 총 RNA는 RNA 추출 재현 기생충에서 분리됩니다. vii) cDNA는 분리된 RNA로부터 제조됩니다. viii) 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 타겟 유전자를 증폭하기 위해 cDNA 템플릿으로 Real-time PCR 실험을 설정합니다. 플레이트는 Real-Time PCR 시스템에서 실행됩니다. ix) 전사체 발현 데이터는 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 이 그래프는 CDPK1 T145M 기생충에서 야생형(WT)과 비교한 11개 키나아제의 차등 전사체 발현 수준을 나타냅니다. 이 수치는³²에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 이름	프라이머 시퀀스
PK1FPGex	ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG
PK1RPGEX	ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC
CK1T145S	GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATTTTTTTTAGTAGTAGAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisense	TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAaaaattttcttatcttcaaaaacatcaaac
CK1T145M	GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATTTTTTTTAGTAGTAG앗아가아아ttttatgaaggtggggaa
Ck1T145M_antisense	TTCCCCACCTTCATAA아
Ck1GUIDEFWD	TAAGTATATAATATTAaccgaattttatgaaggtgttttagagctagaa
Ck1GUIDEREV	TTCTAGCTCTA아
CK1F1	아팃쯔챠�
ck1r3wt	TGCATCTCTTAATCTCTCTCTCTG입니다.

표 1: 연구에 사용된 프라이머 목록.

유전자 이름	포워드 프라이머		리버스 프라이머
CDPK1 (PF3D7_0217500)	GGAAGAATTAGCAAATTTTTTGTTTGACATC		ATGTTAACGAATTCATCAAAGT캇캣gt
CDPK2 (PF3D7_0610600)	GGAACAGGAGAATTTACAACGAC		TGTATACATAATAACACACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)	CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG		CAGCGTCCATTGTAAG 아캇캇쿵쿵�
CDPK4 (PF3D7_0717500)	ATACTTCTCTCAGGGTGCCC		CTTATCACTAATTTTTTT 가얏트그타아
CDPK5 (PF3D7_1337800)	GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG		TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)	CCTCCCGTAGATA아아타쿳쿳		ATCTGCTTCAATAAATCCcaatacatttgc
CDPK7 (PF3D7_1123100)	아그트크타아아아가타타 TAAAGAACTAGGTAG태그		챠타아아아아
PKA (PF3D7_0934800)	AATCATCCATTTTGTGT아		CTTTTGTTTCTTCTTAAA 아
PKG (PF3D7_1436600)	아		CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)	CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG		GAGAGCGCAATTAGccatattg
PI3K (PF3D7_0515300)	CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG		ATCACATTTGTTATACTT 아싯캣카캣챗gtt
갭드 (PF3D7_1462800)	갸아아		GGGTTACCTCACATGG
ThrRS (PF3D7_1126000)	CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT		TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

표 2: Real-time PCR 분석에 사용된 프라이머의 염기서열과 함께 표적 유전자 목록(PlasmoDB 식별 번호).

Discussion

cdpk1의 hypomorphic 대립 유전자를 포함하는 돌연변이 형질 전환 기생충의 생성은 재조합 효소를 사용한 시험관 내 키나아제 활성 데이터를 기반으로 합니다. 다른 gatekeeper 잔기를 가진 돌연변이 재조합 단백질을 가능한 한 많이 생성하는 것이 좋습니다. P. falciparum 게놈은 AT가 매우 풍부하기 때문에 E에서 재조합 단백질의 발현. 대장균은 코돈 최적화가 필요할 수 있습니다. 이는 돌연변이 효소의 키나아제 활성에 대한 게이트키퍼 치환을 종합적으로 평가하는 데 도움이 될 것입니다. transphosphorylation 전위의 감소를 초래하는 Gatekeeper 치환은 대립 유전자 교환 transgenic 기생충을 생성하기 위해 선택됩니다. 이와 병행하여, kinase의 transphosphorylation 활성을 완전히 폐지하는 gatekeeper 치환은 negative control로 간주되어야 합니다. 대립형질 교환 기생충을 생성하는 동안 또 다른 중요한 고려 사항은 테스트 돌연변이 및 음성 대조군과 함께 동의어 돌연변이를 도입하는 것입니다. cdpk1 유전자좌에 동의어 돌연변이를 포함하는 기생충의 생성은 테스트 돌연변이를 도입하는 동안 기술적 오류를 배제하기 위한 중요한 내부 통제 역할을 합니다. 더욱이, 동의어 돌연변이를 운반하는 형질전환 기생충은 WT 기생충 대신 모든 비교 연구의 대조군으로 사용될 수 있습니다.

우리는 게이트키퍼 돌연변이 기생충^32,35를 생성하기 위해 2-플라스미드 시스템을 사용했습니다. 그러나, 표적 자리에서 SNP를 도입하는 효율은 2-플라스미드 시스템(⁴¹) 대신에 단일 플라스미드 시스템을 사용함으로써 증가될 수 있다. 단일 플라스미드 시스템에서는 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집에 필요한 모든 중요 요소가 두 개가 아닌 단일 플라스미드에 통합됩니다. 단일 플라스미드는 Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하고, tracrRNA와 가이드 RNA로 구성된 sgRNA를 전사하며, 타겟 부위에서 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중 가닥 절단을 복구하기 위한 상동성 암을 포함합니다. 2-플라스미드 시스템에서 기생충은 두 플라스미드와 함께 co-transfection됩니다. 2-플라스미드 시스템에서 두 플라스미드를 동시에 수용하는 기생충의 수는 단일 플라스미드 시스템에 비해 적기 때문에 CRISPR 매개 유전자 편집의 효율성은 단일 플라스미드 시스템에 비해 2-플라스미드 시스템에서 더 낮습니다. 대안적으로, 자살-구조 전략⁽⁴²)이 또한 채택될 수 있는데, 여기서 상동성 팔은 선형 단편으로서 제공되거나 약물 선택 마커 없이 플라스미드(구조 플라스미드)로 제공된다. Cas9 엔도뉴클레아제 및 sgRNA 인코딩 가이드 RNA는 약물 선택 카세트(suicide plasmid)를 포함하는 플라스미드에 제공됩니다. 약물 선택 카세트가 없는 선형 단편 또는 플라스미드는 기생충 복제 중에 손실될 가능성이 더 높기 때문에 표적 자리에서 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중 가닥 절단은 제한된 기간 동안 사용할 수 있는 상동성 암을 사용하여 즉시 복구해야 합니다. 이 전략은 더 효율적이기 때문에 two-plasmid 시스템에 비해 몇 가지 장점이 있으며, 다른 plasmid에서 homology arm을 sub-clone할 필요가 없습니다. CRISPR-Cas9 유전자 편집의 다른 변이도 표적 유전자좌(⁴³)에 SNP를 도입하기 위해 고려될 수 있습니다.

cdpk1 유전자좌에 T145M 치환을 도입하기 위한 가이드 영역을 수동으로 선택했습니다. 타겟 궤적에 이중 가닥 절단을 도입하기 위한 적절한 가이드 시퀀스는 Chopchop⁴⁴, CRISPOR⁴⁵, CCTop⁴⁶, Cas-OFFinder⁴⁷과 같은 무료로 사용 가능한 다양한 온라인 소프트웨어를 사용하여 선택할 수 있습니다. 이러한 소프트웨어는 각 가이드 염기서열의 효율성을 제공할 뿐만 아니라 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집 실험의 성공률을 높이는 off-target 및 specificity scores도 제공합니다.

말라리아 기생충의 transfection에 사용할 수 있는 다양한 방법이 있습니다. 우리는 transfection 실험을 위해 ring-stage 기생충을 사용하지만(^48,49), 플라스미드를 가진 RBC의 pre-loading은 기생충 transfection 연구(⁵⁰)에도 성공적으로 사용되었다. 이 방법에서 적혈구는 전기천공법을 통해 특정 파라미터 세트에 따라 플라스미드로 transfection된 후 정제된 말기 기생충 감염에 사용됩니다. 이 기생충은 플라스미드가 미리 로드된 적혈구에 침입합니다. 플라스미드가 미리 로드된 적혈구 내에서 성장하는 동안, 기생충은 알려지지 않은 메커니즘(⁵⁰)을 통해 플라스미드 DNA를 흡수한다. 기생충 transfection에 사용할 수 있는 또 다른 방법이 있는데, 이는 플라스미드와의 직접 transfection을 위해 매우 성숙한 정제된 schizont-stage 기생충을 필요로 합니다. 정제된 schizonts의 transfection에 사용되는 기기는 4D-nucleofector⁵¹입니다. transfection 방법의 선택은 사용 가능한 자원과 성공률에 따라 연구 그룹마다 다릅니다. 세 가지 방법 중 어떤 것이 그룹에 효과가 있는지 확인하고 후속 transfection 실험에 사용하는 것이 좋습니다. transfection 효율을 더욱 증가시키기 위해 두 가지 방법을 연속적으로 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 첫 번째 transfection 단계에서는 고리 단계 기생충을 사용한 후 플라스미드가 사전 로드된 새로운 RBC를 추가할 수 있습니다.

우리는 CDPK1T145M 기생충에서 전사체 분석을 위해 이전 문헌 또는 CDPK 계열의 구성원의 존재를 기반으로 한 대조군과 비교하여 몇 개의 유전자만 선택했습니다. 그러나 CDPK1 의 저형성 대립유전자를 포함하는 형질전환 기생충에서 글로벌 전사 재배선에 대한 포괄적인 관점을 얻으려면 RNA-Seq 또는 마이크로어레이와 같은 접근법을 사용할 수 있습니다.

이 연구에서 사용된 방법은 약물 압력 하에서 보상 메커니즘의 발달을 이해하기 위해 말라리아 기생충의 다른 키나아제에 적용할 수 있습니다. 이 기술을 통해 얻어진 정보는 약물 내성의 개발 및 확산을 피하기 위해 조합 약물의 전략적 배치에 유용 할 수 있습니다. 기능적 보완을 보이는 두 개 또는 여러 개의 kinase를 표적으로 하는 것이 말라리아 통제 및 제거를 위해 개별 kinase를 표적으로 하는 것보다 더 나은 전략입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x 인산염 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST 항체	ThermoFisher Scientific	G7781
안티 마우스 HRP	Sigma-Aldrich	A4416
안티 토끼 HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
원심분리기	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
원심분리기 (세균 세포 펠릿화용)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
원심분리기 (기생충 펠릿화/가공용)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 로터)
DpnI		NEB RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS 수용 세포	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a 수용 세포	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP 화학발광 시약	G-Bioscience	7860-003
겐타마이신	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa 염색 Himedia		S011-100ML
글루타티온 세파로스 4B	GE 헬스케어	17075601
HEPES, 유리산	머크	391338
하이포잔틴	머크	4010CBC
인퓨전 HD 클로닝 키트	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, 탈인산화	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin 젤 및 PCR 클린업 미니 키트	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
프로테아제 억제제 칵테일	Roche
Qiaprep 스핀 미니프렙 키트	Qiagen	27106
QuikChange II XL 현장 지정 돌연변이 유발 키트	Agilent	200521
RNeasy 미니 키트	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
사포닌	시그마-알드리치	47036
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA 리가제	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate 에스테르 항체	Abcam	Ab92570