우리는 관련 혈관 흐름 조건에서 혈관 내피 세포(EC)를 배양하기 위해 조정 가능한 젤라틴 기반 기질을 합성하고 특성화했습니다. 이 생체 모방 표면은 생리학적 및 병리학적 조건을 모두 복제하여 EC 행동에 대한 기계적 힘을 연구하고 혈관 건강 및 질병 메커니즘에 대한 이해를 증진합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 혈관 건강과 죽상 동맥 경화증과 같은 질병의 발병을 이해하는 데 중요한 내피 세포(EC) 기능에 대한 조직 강성과 전단 응력의 결합된 효과를 조사하는 것을 목표로 하는 혁신적인 시험관 내 모델을 제시합니다. 전통적으로 연구는 전단 응력과 기판 강성이 EC에 미치는 영향을 독립적으로 탐구해 왔습니다. 그러나 이 통합 시스템은 이러한 요소를 결합하여 혈관 구조의 기계적 환경에 대한 보다 정확한 시뮬레이션을 제공합니다. 목표는 인간 EC를 사용하여 다양한 조직 강성 수준 및 흐름 조건에 걸쳐 EC 기계형질도입을 검사하는 것입니다. 우리는 조정 가능한 강성을 가진 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 하이드로겔을 합성하고 밀도를 달성하기 위해 EC로 파종하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 또한, 전산 유체 역학 시뮬레이션으로 보완된 비용 효율적인 유동 챔버의 설계 및 조립에 대해 설명하여 층류 및 적절한 전단 응력 수준을 특징으로 하는 생리학적 유동 조건을 생성합니다. 이 프로토콜은 또한 컨포칼 현미경 검사를 위한 형광 라벨링을 통합하여 조직 규정 준수 및 흐름 조건 모두에 대한 EC 반응을 평가할 수 있습니다. 이 모델은 배양된 EC를 여러 통합된 기계적 자극에 노출시킴으로써 고혈압 및 노화와 같은 요인이 EC 기능 및 EC 매개 혈관 질환에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 포괄적인 조사를 가능하게 합니다. 이러한 연구에서 얻은 통찰력은 혈관 질환의 기저를 밝히고 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 중요한 역할을 할 것입니다.
서론
혈관 내부 표면을 감싸고 있는 내피는 혈관 건강을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 내피 세포(EC)는 혈관 긴장도 조절, 선택적 투과성, 지혈 및 기계적 전달을 포함한 다양한 심혈관 기능을 조절하는 데 핵심적인 역할을 합니다 1,2. 연구는 EC 기능 장애를 죽상 동맥 경화증 발병의 주요 역할과 확고하게 연결했습니다. 특히, EC는 혈류 및 기저 혈관 조직과 상호 작용하는 계면에서 다양한 기계적 힘을 만납니다 3,4. 여러 연구에서 EC 기능 장애를 혈류 및 조직 강성으로 인한 유체 전단 응력과 같은 혈관 환경 내 기계적 요인의 비정상적인 변화와 연관시켰다 5,6,7.
그러나 선행 연구는 조직 강성과 전단 응력이 EC 기능에 미치는 복합적인 영향을 이해하는 데 제한적인 관심을 받았습니다. 연구 결과를 죽상동맥경화증 및 기타 심혈관 질환에 대한 효과적인 치료법으로 전....
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프로토콜
1. GelMA의 합성
- 무수 탄산나트륨 0.2M 용액과 중탄산나트륨 0.2M 용액을 준비합니다.
- 중탄산나트륨 용액 46mL와 탄산나트륨 용액 15mL를 섞고 탈이온수 139mL를 추가합니다. 필요한 경우 0.1M NaOH 및 HCl을 사용하여 pH를 9.5로 조정합니다.
- 돼지 껍질에서 추출한 A형 300-블룸 젤라틴 10g을 100mL의 탄산염-중탄산염 완충액에 10% w/v 농도로 추가합니다.
- 자기 교반기를 사용하여 700rpm에서 용액을 저어주면서 55°C 수조를 사용하여 젤라틴을 용해시킵니다. 완전히 용해되면 0.1M NaOH를 사용하여 젤라틴 용액의 pH를 9.5로 조정합니다.
- 메타크릴화를 시작하려면 938μL의 무수메타크릴산(MAH)을 용액에 적가합니다. 젤라틴 용액에서 MAH의 초기 분포를 개선하여 중심에서 다양한 깊이와 반경 방향 거리를 포함한 다양한 위치에 주입합니다.
- 빛에 노출되지 않도록 반응 용기를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 온도를 55°C로 유지하고 용액을 500rpm에서 1시간 동안 교반하여 반응을 완료합니다(그림 1A)12.
참고: ....
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결과
그림 1 은 메타크릴화 반응을 통한 GelMA 합성 과정을 개략적으로 보여주는 실험 설정을 보여줍니다. 그런 다음 생성된 생성물을 사용하여 하이드로겔 기판을 제조하고 그 위에 EC를 파종했습니다. 그 후, 세포를 12 dyne/cm2에서 6시간 흐름 실험을 위해 흐름 챔버에 도입했습니다.
1 개H NMR 분광법을 사용하여 메타크릴레이화 반응의 성공을 평가했습니다(그림 2A). GelMA에서 1.9ppm의 메틸기와 5.4-5.6ppm 사이의 비닐 피크의 존재는 성공적인 메타크릴화를 확인했습니다. 또한, GelMA에서 3ppm에서 라이신 피크의 감소는 라이신 잔기의 소비를 나타내며, 이는 메타크릴레이트 잔기 12,13,16으로 대체됩니다.
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토론
혈관계는 다양한 힘이 세포 행동에 큰 영향을 미치는 역동적인 환경입니다. 이러한 힘을 고려하지 않고 심혈관 질환의 생물학적 현상을 연구하는 것은 부정확합니다. 따라서 혈관의 기계적 환경을 모방할 수 있는 세포 모델이 중요합니다. 연구자들은 이미 이러한 힘이 세포 행동에 미치는 영향을 강조하는 데 상당한 진전을 이루었습니다11. 그러나 인체의 병리학적 및 생리학적 조건 모두에서 세포의 행동을 이해하려면 혈관의 환경과 더 유사한 보다 정확한 모델을 개발하는 것이 필수적입니다. 따라서 우리는 접근 용이성과 사용자 친화성을 유지하면서 혈관 환경을 보다 정확하게 복제하는 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.
이 모델은 다양한 강성 수준을 가진 기판의 인간 세포에 제어된 유동 유래 전단 응력을 적용하여 기존 모델에 비해 생리학적 현실에 더 가까운 조건을 생성할 수 있습니다. GelMA는 1) 조정 가능한 기계적 특성, 2) 비팽창 거동, 3) .......
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공개 사항
저자는 임시 특허 출원(No. 63/634,853)이 Flow Chamber with a Mechanically Tunable Substrate라는 제목으로 제출되었으며 다른 경쟁 이익이 존재하지 않는다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 유동 챔버 제작에 도움을 준 Robert Egan에게 감사를 표합니다. 저자는 실험 중 도움을 준 Lucas McCauley에게 감사를 표합니다. 또한 컨포칼 현미경에 대한 접근을 허용한 Northeastern University의 CILS(Institute for Chemical Imaging of Living Systems) 핵심 시설에 감사드립니다. 저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NIH 1R01EB027705은 SB에 수여)과 국립과학재단(National Science Foundation, NSF CAREER Awards: DMR은 1847843 SB에, CMMI 1846962는 EE에 수여)이 제공하는 자금 지원을 인정한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) | 인비트로겐 | 15524-010 | 하이드로겔 제작 |
| 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 | 시그마-알드리치 | 440159 | 유리 염류화 |
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 함유 마운팅 미디어 | Vector Laboratories | H-1200 | 면역염색 |
| 아세톤 | 테르모 피셔 사이언티픽스 | A18-4 | GelMA 합성 |
| 알렉사 플루어 555 팔로이딘 | Cell Signaling Technology | 8953S | Immunostaining |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | 하이드로겔 Fabrication |
| Clear Scratch- and UV-resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'') | McMaster-CARR | 8560K165 | Flow Chamber Fabrication |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 800 | Immunostaining |
| Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL 주사기 주사기 without Needles | ; | 22-031-375 | 플로우 실험 |
| EC 성장 키트 | American Type Culture Collection (ATCC) | PCS-100-041 | 세포 배양 |
| 에탄올 200 프루프 | Decon Labs | 2701 | 살린화 |
| 젤라틴 A형(300 블룸) | Sigma-Aldrich | G1890 | GelMA 합성 |
| 빙하 아세트산 | Thermo Fisher Scientifics | 9526-33 | 유리 염분화 |
| 고순도 고온 실리콘 고무 시트 | McMaster-Carr | 87315K74 | 플로우 챔버 제작 |
| 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) | 미국식 배양 컬렉션(ATCC) | PSC-100-010 | 세포 배양 |
| M3x30mm 기계 나사 육각 소켓 둥근 머리 나사 304 스테인레스 스틸 패스너 볼트 20pcs | uxcell | B07Q5RM2TP | 플로우 챔버 제작 |
| Masterflex L/S 디지털 드라이브와 Easy-Load® 정밀 튜브용 3 펌프 헤드; 115/230 VAC | VWR | #MFLX77921-65 | 흐름 실험 |
| Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, Puri-Flex, L/S 25; 25피트 | VWR | #MFLX96419-25 | 흐름 실험 |
| 메타크릴 무수물(MAH) | 시그마-알드리치 | 276685 | GelMA 합성 |
| 파라포름알데히드 | Thermo Fisher Scientifics | 043368.9M | 세포 배양 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Gibco | 14080-055 | 일반 |
| 중탄산나트륨 | 피셔 케미컬 | S233-3 | GelMA 합성 |
| 탄산나트륨 | 피셔 케미컬 | S263-500 | GelMA 합성 |
| SOLIDWORKS 교육용 버전 | |||
| SOLIDWORKS 학생용 버전 데스크탑, 2023 | SolidWorks | N/A | 플로우 챔버 설계 |
| 혈관 기초 매체 | 미국식 배양 컬렉션(ATCC) | PCS-100-030 | 세포 배양 |
참고문헌
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacother....
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