미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 분리는 대사 장애 및 질병을 연구하기 위해 분자 생물학 및 생화학 분야의 선구자들이 확립한 절차에 따라 수십 년 동안 실행되어 왔습니다. 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학을 적절하게 조사하려면 일관된 미토콘드리아 품질이 필요합니다. 그러나 연구자는 다양한 공개 격리 방법을 사용할 수 있습니다. 다른 실험 전략에는 다른 격리 방법이 필요하지만 기본 원리와 절차는 유사합니다. 이 프로토콜은 작은 동물과 세포를 포함한 다양한 조직 소스에서 잘 결합된 미토콘드리아를 추출할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 단계에는 장기 절제, 미토콘드리아 정제, 단백질 정량 분석 및 다양한 품질 관리 검사가 포함됩니다. 고품질 미토콘드리아를 식별하는 데 사용되는 주요 품질 관리 지표는 호흡 제어 비율(RCR)입니다. RCR은 ADP가 없는 경우의 속도에 대한 산화적 인산화 중 호흡수의 비율입니다. 대체 메트릭에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 조직 소스에 비해 높은 RCR 값을 얻을 수 있지만 연구자의 개별 요구에 맞게 여러 단계를 최적화할 수 있습니다. 이 절차는 강력하며 동물 모델 및 조직 공급원에서 평균 이상의 RCR 값을 가진 분리된 미토콘드리아를 일관되게 생성했습니다.
서론
미토콘드리아는 특정 세포 기능에 최적화된 세포질 에너지 조건을 설정하는 세포 내 세포 기관입니다. 세포, 조직 및 유기체 수준 연구는 미토콘드리아 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 세포 기관을 분리하는 것은 다른 방법으로는 불가능한 수준의 실험 제어를 제공합니다. 미토콘드리아 분리는 1940년대부터 수행되어 다양한 세포와 조직에 걸친 신진대사 및 호흡에 대한 기계론적 연구를 가능하게 했습니다 1,2. 미토콘드리아의 역사적 관련성도 잘 문서화되어 있습니다3. ATP의 주요 생산자인 미토콘드리아는 최적의 세포 및 장기 기능에 필수적인 많은 핵심 역할을 합니다4. 미토콘드리아 매트릭스 내에서 기질은 TCA 회로에 의해 산화되어 NADH 및 UQH2 5,6과 같은 환원 등가물 및 이동 전자 운반체를 생성합니다. 사이토크롬 C는 미토콘드리아 생화학 반응 네트워크7에서 세 번째 주요 이동 전자 운반체입니다. 그런 다음 이러한 분자는 내부 미토콘드리아 막(8)에 내장된 전자 전달 시스템(ETS)의 막관통 복합체에 의해 산화됩니다. ETS의 산화 환원 반응은 매트릭스에서 막간 공간으로의 양성자 전위와 결합됩니다. 이러한 과정은 ATP 9,10을 생성하기 위해 F1F0 ATP 합성 효소에 의해 ADP를 Pi로 인산화하는 데 사용되는 전기 화학적 양성자 구배를 설정합니다. 각 복합체에서 발생하는 개별 과정은 Clark형 전극 또는 마이크로플레이트 산소 소비량 분석을 사용하여 고분해능 호흡 측정법으로 탐색할 수 있습니다11,12. 또한 분리된 미토콘드리아를 사용하는 질병 모델 및 치료법은 특정 병리의 진행에서 미토콘드리아 기능의 영향 또는 중요성을 결정할 수 있습니다. 이는 미토콘드리아 기능 장애가 심부전에 어떻게 영향을 미치는지 밝히기 위해 연료 및 기질 전달의 변화를 사용한 심장학 분야에서 결실을 맺는 것으로 입증되었습니다 13,14,15,16. 미토콘드리아는 또한 당뇨병, 암, 비만, 신경 장애 및 근육병증과 같은 다른 질병 상태의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다17,18. 따라서 분리되거나 정제된 미토콘드리아를 사용하면 소스 조직에서 산화 대사 및 ATP 생성에 대한 기계론적 조사가 가능합니다.
미토콘드리아 분리 프로토콜은 생체 에너지 연구에서 그 중요성 때문에 부족함이 없습니다. 또한, 조직과 세포 내 미토콘드리아의 하위 집단에 맞춘 매우 특이적인 방법을 찾을 수 있습니다19,20. 기본 절차 단계는 분리 방법 간에 유사하지만 미토콘드리아의 양과 품질을 개선하기 위해 완충 조성, 균질화 단계 및 원심분리 스핀에 변형을 가할 수 있습니다. 이러한 측면의 변화는 조직의 대사 요구량, 전반적인 장기 기능, 미토콘드리아 밀도 및 기타 요인을 기반으로 합니다. 간 및 골격근과 같은 조직에서는 휴대용 균질화기를 사용하여 미토콘드리아 무결성을 보존하고 미토콘드리아 막의 손상을 제한합니다21. 그러나 신장에서 분리할 때 일부 프로토콜에서는 더 나은 결과를 얻기 위해 수동 구동 균질화 또는 상용 키트를 사용할 것을 제안합니다22. 두 방법 모두 기능적 미토콘드리아를 생성하지만, 이러한 프로토콜을 사용하여 분리를 완료하는 데 걸리는 추가 시간으로 인해 소기관의 품질이 저하될 수 있습니다. 원심분리는 또한 미토콘드리아 단백질의 추출에 필수적인데, 이는 핵 및 기타 세포 소기관과 같은 세포 구성 요소를 미토콘드리아23에서 분리하기 때문입니다. 분리 과정 동안, 더 순수한 분리물을 얻기 위해 차등 또는 밀도 기반 원심분리를 구현해야 하는지 여부에 대해 논의됩니다24. 밀도 원심분리는 미토콘드리아를 과산화소체와 같은 유사한 비중의 소기관에서 분리할 수 있지만, 이러한 방법의 미토콘드리아가 차등 원심분리를 사용하여 분리된 미토콘드리아에 비해 현장 소기관 기능을 더 잘 나타내는지는 잘 확립되지 않았습니다. 미토콘드리아 생리학 분야에서는 밀도 기반 원심분리가 선호되며 분리 순도를 높이기 위해 쉽게 변경할 수 있습니다. g-force, 원심분리 기간 및 원심분리 스핀 수에 대한 변화가 통합되는지 여부는 미토콘드리아 정제에 미치는 영향 때문에 실험 전에 고려해야 합니다. 또한, 분리 중 가장 중요한 단계라고 할 수 있는 미토콘드리아 재현탁은 스크래핑(scraping), 와류 기반 혼합(vortex-based mixing) 또는 균질화(homogenization)를 사용하는 연구마다 크게 다르다 23,25,26. 이러한 유형의 기계적 재현탁은 너무 마모성이 있어 미토콘드리아의 막 무결성을 손상시킬 수 있습니다. 이러한 이유로 이를 해결하기 위해 부드러운 세탁을 수행해야 합니다. 과다한 변조와 제안된 방법론에도 불구하고 설치류 모델에 대한 높은 재현성과 적응성을 가진 포괄적인 프로토콜은 적습니다.
본 명세서에 기술된 방법은 소동물 심장 조직으로부터 정제되고 잘 결합된 미토콘드리아를 수득하는 상세하고 견고하며 재현성이 높은 프로토콜을 개략적으로 설명합니다. 입증된 바와 같이, 이 방법은 신장, 간 및 배양 세포에서 미토콘드리아를 분리하기 위한 각 실험 및/또는 실험실 환경의 특정 요구 사항을 수용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 여기에 나열되지 않은 조직 및 기타 동물로부터 미토콘드리아를 분리하기 위해 추가 수정을 할 수 있습니다. 모든 격리에 사용되는 버퍼 레시피가 제공되며 필요한 경우 수정할 수 있습니다. 발표된 다른 프로토콜과 유사하게, motorized homogenization 및 differential centrifugation이 구현됩니다. 그러나 분리 소스에 따라 고품질 미토콘드리아 분리물을 일관되게 제공하기 위해 전단 시간과 샘플이 원심분리되는 힘을 모두 조정합니다. 특히, 이 프로토콜은 피펫팅 을 통한 부드러운 세척을 사용하여 펠릿 미토콘드리아를 부유시키며, 이는 미토콘드리아 멤브레인의 무결성을 보존하고 세포 소기관의 전반적인 기능을 유지하는 데 도움이 된다는 점에서 다른 프로토콜과 다릅니다. 미토콘드리아 단백질은 총 단백질 측정 또는 구연산염 합성효소 활성을 측정하여 정량화할 수 있습니다. 이 분리 방법의 유용성과 광범위한 적용 가능성은 다양한 유기체 및 조직 공급원에서 달성된 호흡 제어 비율(RCR) 값에 의해 더욱 뒷받침됩니다.
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프로토콜
모든 척추 동물의 사용 및 치료는 미시간 주립 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인한 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 Hartley 알비노 기니피그와 Sprague Dawley(SD) 쥐를 사용하여 설계되었습니다. 기니피그에서 심장 미토콘드리아를 분리하기 위해 동물은 4-6주(300-450g)의 나이에 희생되었습니다. 남녀 모두의 SD 쥐로부터 심장 미토콘드리아는 10-13주(250-400g) 사이에 얻어졌다. 버퍼에 대한 조리법은 표 1 에 설명되어 있으며 미리 준비해야 합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 실험 준비
- 분리를 시작하기 전에 두 개의 50mL 원심분리 튜브에 "스핀 1 및 2" 및 "스핀 3"으로 레이블을 지정합니다.
- 튜브, 갓 해동된 분리 완충액(IB), 날카로운 다진 가위, 조립된 균질화 프로브, 5mL 비커 또는 이에 상응하는 크기의 용기를 얼음 위에 놓습니다.
- 갓 해동된 호흡 완충액(RB)을 인큐베이터에 넣어 후속 호흡 분석을 위해 따뜻하게 합니다.
- 냉장 원심분리기를 4°C로 미리 식힙니다.
- 모든 장비가 정렬되어 있고 Bacillus licheniformis 의 7-15 U/mg 프로테아제 20 μL가 "스핀 1 및 2"라고 표시된 튜브에 추가되었는지 확인합니다.
- 심정지 완충액(CB, 표 1), 유리 캐뉼라 및 스톱콕 밸브가 부착된 플라스틱 튜브를 사용하여 캐뉼레이션을 통한 관류를 위한 중력 종속 압력 시스템을 설정합니다.
- 수술 도구를 준비하고 심장 박리 및 캐뉼레이션을 위한 적절한 가위와 겸자를 포함하십시오.
참고: 모든 물은 순수한 품질(18.2MΩ·cm)이어야 합니다.
2. 조직 해부
- 멸균 헤파린 설페이트를 500U/kg의 용량으로 복강내 주사합니다.
- 헤파린 투여 후 동물을 유도 챔버에 15분 동안 두십시오. 이 시간 동안 2L/min의 순수한O2 가스를 공급하여 동물에게 완전히 산소를 공급하고 진정시키며 관심 조직에 부정적인 결과를 초래할 수 있는 스트레스를 최소화합니다.
- 0.5%에서 이소플루란의 연속적인 흐름으로 마취 유도를 시작합니다. 1분 후 1%로 증가시킵니다. 5%에 도달할 때까지 1분마다 5%씩 계속 증가합니다. 5%가 되면 1분 동안 기다렸다가 동물의 호흡 패턴을 모니터링합니다.
- 호흡이 느려지고 힘들어지면(대략 6.5분 지점에서) 이소플루란과 산소 흐름을 끕니다.
- 유도 챔버에서 동물을 빠르게 제거하고 발을 쥐어짜고 각막 반사를 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 동물이 두 자극 중 하나에 반응하면 유도실에 다시 넣고 마취를 읽고 마취 깊이 검사를 반복합니다.
- 적절한 마취 깊이에 도달하면 단두대로 재빨리 목을 베어 경추를 심하게 하고 엎드린 몸을 얼음 위에 놓습니다.
- 쇄골에서 외측 흉곽을 따라 흉부 길이를 따라 두 개의 평행한 수직 절개를 만듭니다. 절개 부위가 외측 흉부의 갈비뼈를 자를 수 있을 만큼 충분히 깊은지 확인하되 심장이나 대혈관과 같은 흉곽 내 구조를 손상시키지 마십시오.
참고: 수직 절개 크기는 사용하는 동물에 따라 다릅니다. 기니피그와 쥐를 사용하는 경우 다이어프램까지 자릅니다(쥐의 경우 약 6.35cm, 기니피그의 경우 약 11cm). 마우스를 사용하는 경우 표준 개흉술을 시행한다27. - 지혈제를 사용하여 심장을 노출시켜 흉부 전방을 변위시키고 노출된 흉강을 얼음으로 채웁니다. 이 단계는 온열 허혈 시간을 최소화하고 분리된 세포 소기관의 생존력을 향상시킵니다.
- 핀셋을 사용하여 흉선과 심낭을 뭉툭하게 절개하고 심장을 완전히 노출시킵니다.
- 겸자를 사용하여 심장에 부드러운 하부 견인력을 가하여 대동맥을 노출시키고 식별합니다. 대동맥은 심장 기저부에서 뻗어 나온 가장 두꺼운 대동맥입니다. 폐정맥과 같은 다른 큰 혈관은 대동맥보다 눈에 띄게 더 반투명합니다.
- 대동맥을 대동맥 뿌리 위로 약 4-6mm 자르지만 경동맥 분지 지점 아래를 자릅니다.
- 관상 동맥에서 혈액이 제거되고 장기가 희게 보일 때까지 중력 의존 압력 헤드를 사용하여 얼음처럼 차가운 심정지(CB) 용액으로 대동맥을 관개하고 심장28,29를 관류합니다.
알림: 큰 설치류의 경우 1.8-2.2mm의 캐뉼라 직경이 잘 작동하고 작은 설치류의 경우 1.4-1.8mm의 직경 범위가 권장됩니다. 역관류는 관상 동맥 혈관에서 혈액이 제거되는 데 15-30초 이상 걸리지 않아야 합니다. - 심방, 연골 판막 조직 및 지방 조직을 절개하여 심실 심근을 격리합니다.
- 0.1-0.2mL의 얼음처럼 차가운 IB가 들어 있는 미리 냉각된 10mL 비커에 심실을 넣습니다.
- 날카로운 수술용 가위로 조각이 약 1mm가 될 때까지 조직을 다집니다3.
3. 미토콘드리아 정제 및 단백질 정량
- 다진 조직을 프로테아제 용액이 들어 있는 "Spins 1 and 2"라고 표시된 미리 냉각된 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 얼음처럼 차가운 IB를 최종 부피 25mL에 추가합니다.
- 전동식 휴대용 회전자-고정자 균질화기를 사용하여 조직을 18,000rpm으로 얼음 위에 20-25초 동안 분산시킵니다.
- "Spins 1 and 2"라고 표시된 튜브에서 균질화된 조직을 4°C에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다.
- 상층액(프로테아제 포함)을 폐기물 카보이에 부어 버리고 펠릿을 IB 5mL로 부드럽게 헹구어 잔류 프로테아제를 제거합니다.
- 헹굼제를 버린 후 부드러운 소용돌이에 의해 신선한 얼음처럼 차가운 IB로 펠릿을 최종 부피 25mL까지 재현탁시킵니다.
- 800 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액(미토콘드리아 포함)을 "Spin 50"이라고 표시된 미리 냉각된 3mL 튜브에 부드럽게 부어 제거합니다. 붓는 동안 펠릿의 느슨한 상단 부분이 빠지지 않도록 주의하십시오. 대안으로, 전사 피펫 또는 스트리펫을 사용하여 상층액을 수집할 수 있습니다.
- 상층액을 8000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 생성된 상층액을 버리고 미토콘드리아 함유 펠릿을 유지합니다.
- 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 튜브 내벽에서 과도한 상층액을 흡수하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 펠릿을 가능한 한 얼음 위에서 4°C로 유지하십시오.
- 미토콘드리아를 재현탁시키려면 튜브 바닥에 80μL의 얼음처럼 차가운 IB를 추가합니다. 펠릿 위에 IB를 반복적으로 세척하여 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.
- 기포가 생성되지 않도록 마이크로피펫을 40-60 μL 부피를 흡입하여 전달하도록 설정하십시오.
- 미토콘드리아 펠릿이 분산됨에 따라 펠릿화된 미토콘드리아를 효율적으로 재현탁시키기 위해 마이크로피펫 부피를 늘립니다. 피펫 팁으로 펠릿을 만지지 말고 거품을 만들지 마십시오.
- 다시 현탁되면 미토콘드리아를 사전 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 스톡 미토콘드리아로 표시합니다. 총 일시 중단 볼륨을 기록해 둡니다.
- 샘플의 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하려면 제조업체의 지침에 정의된 대로 잘 알려진 BCA 또는 Bradford 단백질 분석을 사용하여 총 단백질 분석을 수행하십시오.
참고: 수율을 평가하기 위한 대안 또는 보완 전략은 구연산염 합성효소 활성을 측정하는 것입니다. 참고로, 미토콘드리아 함량은 Vinnakota et al.30에 기술된 프로토콜에 따라 정량화할 수 있습니다.
4. 품질 관리 검사
- 미리 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에서 IB를 사용하여 미토콘드리아 스톡을 원하는 작업 농도로 희석합니다.
참고: 미토콘드리아 스톡은 심장 조직에서 분리물을 사용할 때 호흡 측정 분석을 위해 0.1mg/mL의 최종 농도에서 작동하도록 40mg/mL로 희석됩니다. - 산소 그래프 챔버, 스토퍼 및 마이크로리터 주사기를 증류수로 10번 헹구어 호흡 측정 분석에 사용하기 전에 세척합니다.
- 미토콘드리아 분리체의 생존력과 품질을 테스트하려면 2.3mL의 호흡 완충액(RB)을 산소 그래프 챔버에 로드하고 산소 소비 신호가 37°C에서 약 10분 동안 또는 속도가 0에 가까울 때 평형을 이루도록 합니다.
- 신호가 평형을 이루면 스토퍼를 아래로 누르고 스토퍼의 모세관에서 나오는 과도한 완충액을 흡입합니다.
- 마이크로리터 주사기를 사용하여 1mM EGTA를 추가하여 완충액 또는 미토콘드리아 샘플에 잔류 칼슘을 킬레이트화합니다.
- 호흡에 연료를 공급하기 위해 5mM 피루브산 나트륨과 1mM L-말레이트를 첨가하십시오.
- 기질을 추가한 후 희석된 미토콘드리아 덩어리를 추가하여 작업 농도를 달성하고 5분 동안 호흡이 발생하도록 합니다. 이 기간을 LEAK 또는 State 2 호흡이라고 합니다.
- 5분 표시에서 500μM ADP 덩어리를 추가하여 OXHPOS라고도 하는 State 3 호흡을 시작하고 미토콘드리아가 산소결핍증이 될 때까지 호흡할 수 있도록 합니다.
- 상태 3 동안의 최대 산소 소비량을 상태 2에서 ADP를 추가하기 직전의 산소 소비량으로 나누어 호흡 제어 비율(RCR)을 계산합니다( 그림 1 참조).
참고: 1 - 1/RCR의 대체 RCR 표현식을 0과 1 사이로 제한되는 품질 메트릭으로 사용할 수도 있습니다. 그러나 RCR이 10을 >할 때 이 메트릭을 사용하여 품질을 구별하기가 어렵습니다( 그림 2 참조). - 챔버와 스토퍼를 순수한 물로 10번 헹구어 후속 분석을 위해 산소 그래프를 청소합니다. 호흡 측정이 완료되면 챔버에 70% 에탄올을 채우고 다음 사용 시까지 챔버에 마개를 놓습니다.
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결과
미토콘드리아 분리가 완료되면 고분해능 호흡 측정법을 사용하여 산소 소비량(JO2)을 정량화하여 분리체의 품질과 기능을 테스트해야 합니다. 이를 위해 미토콘드리아 스톡을 40mg/mL로 희석하여 분리된 심장 미토콘드리아를 사용하는 모든 호흡 측정 분석에 대해 RB 2mL에 0.1mg/mL의 작업 농도를 허용했습니다. 호흡은 칼슘 킬레이트제인 1mM EGTA의 존재 하에 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트에 의해 연료를 공급하고, 상태 2 호흡을 확립하기 위해 5분 동안 평형을 이루도록 허용했습니다. 이 상태에서 산소 소비량은 평균 45-55pmol/mL/s 또는 27-33nmol/mg/min이어야 합니다. 전극에 따른 산소 소비율을 인식하고 필요한 경우 적절한 배경 보정을 수행하십시오. 산화적 인산화(상태 3)는 500μM ADP의 볼루스에 의해 5분 표시에서 시작됩니다. 기판 추가 및 대표 추적은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다...
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토론
이 프로토콜에 간결하게 설명된 방법을 준수하면 다른 조직 유형 및 소스 외에도 작은 설치류의 심장 조직에서 잘 결합된 미토콘드리아를 격리할 수 있습니다. 전반적으로 이 과정은 총 3-3.5시간이 소요되어야 하며, 이 기간 동안 모든 동물 조직, 샘플 및 분리물은 분해를 제한하기 위해 가능한 한 4°C의 얼음 위에 있어야 합니다. 이 절차는 강력하며 실험 목표와 사용된 모델에 더 잘 맞도록 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다. 조직 절개 과정에서 만들 수 있는 한 가지 조절은 헤파린을 배제하는 것입니다. 헤파린은 혈전의 형성을 예방하기 위해 투여되지만(31 ), 심장이 충분히 빠르게 통조림되고 관류되는 경우(참수 후 1.5분 이내) 필요하지 않다. 또한, CB를 사용한 심장 관류는 더 큰 설치류에 권장되므로 마우스 심장 또는 기타 장기로 작업할 때 다진 및 초기 균질화 전에 IB 세척을 포함하는 것이 좋습니다. 이 단계를 통...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없다고 선언한다.
감사의 글
이 프로토콜에 대한 근본적인 기여를 한 Daniel A. Beard와 Kalyan C. Vinnakota에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF CAREER 보조금 MCB-2237117의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | |||
| 10 mL 유리 비커 | 장기 절개 및 민싱용 | ||
| 50 mL 원심분리기 튜브 | 원심분리 | ||
| 아데노신 5'-디포스페이트 모노포타슘 염 이수화물 | Sigma | A5285 | 호흡량 측정 분석 |
| BSA 단백질 분석 키트 | 열 향 | PI23225 | 미토콘드리아 단백질 정량화 |
| 덱스트로스 | 시그마 | DX0145 | 버퍼 (CB) |
| 에틸렌 글리콜 - 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 | 시그마 | E4378 | 완충액 (CB 및 IB) 및 호흡량 측정 분석 |
| : 유리 캐뉼라 | Radnoti, | 기니, 돼지 및 쥐 심장 관류 | |
| 헤파린, 나트륨, 돼지 점막, | Sigma | SRE0027-250KU | 동물 IP 주입 |
| 고해상도 호흡계 | 클라크형 전극; 2 mL 챔버가 있는 옥시그래프 | ||
| 유도 챔버 | |||
| 이소플루란 | 시그마 | 792632 | 마취제 |
| L-말산 | 시그마 | 02288-50G | 호흡량 분석 |
| 염화마그네슘 육수화물 | 시그마 | M9272 | 버퍼(RB) |
| 만니톨 | 시그마 | MX0214 | 버퍼 (IB) |
| 마이크로 리터 주사기 | 경우 크기는 5– 50 &마이크로; L | ||
| Microplate reader | 는 37°C에서 배양할 수 있어야 합니다. 씨 | ||
| 걸레 | 시그마 | 475898 | 모든 버퍼 |
| O2 탱크 | |||
| OMNI THQ 균질화기 | OMNI International | 12-500 | 유사한 로터 스테이터 균질화기는 피펫을 작동시킬 것입니다 |
| . | 2– 20 & 마이크로; L; 20– 200 &마이크로; L; 200– 1000 &마이크로; L | ||
| 염화칼 | 시그마 | P3911 | 완충액 (RB 및 CB) |
| 인산 칼륨 이염기성 | 시그마 | 795496 | 완충액(IB 및 RB) |
| 의 경우 Bacillus licheniformis Sigma의 프로테아제 | P5459 | ||
| 염화나트륨 | 시그마 | S9888 | 완충액 (CB) |
| 피루브산나트륨 | 피셔 생물시약 | BP356-100 | 호흡량 측정 분석 |
| 자당 시 | 그마 | 8510-OP | 완충액 (IB) |
| 용 외과적 해부 키트 | 동물 및 조직 출처에 따라 다름 | ||
| 탁상용 원심분리기 | 4°C로 냉각해야 합니다. 씨 |
참고문헌
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