설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리

요약

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

초록

미토콘드리아 분리는 대사 장애 및 질병을 연구하기 위해 분자 생물학 및 생화학 분야의 선구자들이 확립한 절차에 따라 수십 년 동안 실행되어 왔습니다. 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학을 적절하게 조사하려면 일관된 미토콘드리아 품질이 필요합니다. 그러나 연구자는 다양한 공개 격리 방법을 사용할 수 있습니다. 다른 실험 전략에는 다른 격리 방법이 필요하지만 기본 원리와 절차는 유사합니다. 이 프로토콜은 작은 동물과 세포를 포함한 다양한 조직 소스에서 잘 결합된 미토콘드리아를 추출할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 단계에는 장기 절제, 미토콘드리아 정제, 단백질 정량 분석 및 다양한 품질 관리 검사가 포함됩니다. 고품질 미토콘드리아를 식별하는 데 사용되는 주요 품질 관리 지표는 호흡 제어 비율(RCR)입니다. RCR은 ADP가 없는 경우의 속도에 대한 산화적 인산화 중 호흡수의 비율입니다. 대체 메트릭에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 조직 소스에 비해 높은 RCR 값을 얻을 수 있지만 연구자의 개별 요구에 맞게 여러 단계를 최적화할 수 있습니다. 이 절차는 강력하며 동물 모델 및 조직 공급원에서 평균 이상의 RCR 값을 가진 분리된 미토콘드리아를 일관되게 생성했습니다.

서론

미토콘드리아는 특정 세포 기능에 최적화된 세포질 에너지 조건을 설정하는 세포 내 세포 기관입니다. 세포, 조직 및 유기체 수준 연구는 미토콘드리아 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 세포 기관을 분리하는 것은 다른 방법으로는 불가능한 수준의 실험 제어를 제공합니다. 미토콘드리아 분리는 1940년대부터 수행되어 다양한 세포와 조직에 걸친 신진대사 및 호흡에 대한 기계론적 연구를 가능하게 했습니다 ^1,2. 미토콘드리아의 역사적 관련성도 잘 문서화되어 있습니다³. ATP의 주요 생산자인 미토콘드리아는 최적의 세포 및 장기 기능에 필수적인 많은 핵심 역할을 합니다⁴. 미토콘드리아 매트릭스 내에서 기질은 TCA 회로에 의해 산화되어 NADH 및 UQH₂ ^5,6과 같은 환원 등가물 및 이동 전자 운반체를 생성합니다. 사이토크롬 C는 미토콘드리아 생화학 반응 네트워크⁷에서 세 번째 주요 이동 전자 운반체입니다. 그런 다음 이러한 분자는 내부 미토콘드리아 막(⁸)에 내장된 전자 전달 시스템(ETS)의 막관통 복합체에 의해 산화됩니다. ETS의 산화 환원 반응은 매트릭스에서 막간 공간으로의 양성자 전위와 결합됩니다. 이러한 과정은 ATP ^9,10을 생성하기 위해 F₁F₀ ATP 합성 효소에 의해 ADP를 Pi로 인산화하는 데 사용되는 전기 화학적 양성자 구배를 설정합니다. 각 복합체에서 발생하는 개별 과정은 Clark형 전극 또는 마이크로플레이트 산소 소비량 분석을 사용하여 고분해능 호흡 측정법으로 탐색할 수 있습니다^11,12. 또한 분리된 미토콘드리아를 사용하는 질병 모델 및 치료법은 특정 병리의 진행에서 미토콘드리아 기능의 영향 또는 중요성을 결정할 수 있습니다. 이는 미토콘드리아 기능 장애가 심부전에 어떻게 영향을 미치는지 밝히기 위해 연료 및 기질 전달의 변화를 사용한 심장학 분야에서 결실을 맺는 것으로 입증되었습니다 13,14,15,16. 미토콘드리아는 또한 당뇨병, 암, 비만, 신경 장애 및 근육병증과 같은 다른 질병 상태의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다^17,18. 따라서 분리되거나 정제된 미토콘드리아를 사용하면 소스 조직에서 산화 대사 및 ATP 생성에 대한 기계론적 조사가 가능합니다.

미토콘드리아 분리 프로토콜은 생체 에너지 연구에서 그 중요성 때문에 부족함이 없습니다. 또한, 조직과 세포 내 미토콘드리아의 하위 집단에 맞춘 매우 특이적인 방법을 찾을 수 있습니다^19,20. 기본 절차 단계는 분리 방법 간에 유사하지만 미토콘드리아의 양과 품질을 개선하기 위해 완충 조성, 균질화 단계 및 원심분리 스핀에 변형을 가할 수 있습니다. 이러한 측면의 변화는 조직의 대사 요구량, 전반적인 장기 기능, 미토콘드리아 밀도 및 기타 요인을 기반으로 합니다. 간 및 골격근과 같은 조직에서는 휴대용 균질화기를 사용하여 미토콘드리아 무결성을 보존하고 미토콘드리아 막의 손상을 제한합니다²¹. 그러나 신장에서 분리할 때 일부 프로토콜에서는 더 나은 결과를 얻기 위해 수동 구동 균질화 또는 상용 키트를 사용할 것을 제안합니다²². 두 방법 모두 기능적 미토콘드리아를 생성하지만, 이러한 프로토콜을 사용하여 분리를 완료하는 데 걸리는 추가 시간으로 인해 소기관의 품질이 저하될 수 있습니다. 원심분리는 또한 미토콘드리아 단백질의 추출에 필수적인데, 이는 핵 및 기타 세포 소기관과 같은 세포 구성 요소를 미토콘드리아²³에서 분리하기 때문입니다. 분리 과정 동안, 더 순수한 분리물을 얻기 위해 차등 또는 밀도 기반 원심분리를 구현해야 하는지 여부에 대해 논의됩니다²⁴. 밀도 원심분리는 미토콘드리아를 과산화소체와 같은 유사한 비중의 소기관에서 분리할 수 있지만, 이러한 방법의 미토콘드리아가 차등 원심분리를 사용하여 분리된 미토콘드리아에 비해 현장 소기관 기능을 더 잘 나타내는지는 잘 확립되지 않았습니다. 미토콘드리아 생리학 분야에서는 밀도 기반 원심분리가 선호되며 분리 순도를 높이기 위해 쉽게 변경할 수 있습니다. g-force, 원심분리 기간 및 원심분리 스핀 수에 대한 변화가 통합되는지 여부는 미토콘드리아 정제에 미치는 영향 때문에 실험 전에 고려해야 합니다. 또한, 분리 중 가장 중요한 단계라고 할 수 있는 미토콘드리아 재현탁은 스크래핑(scraping), 와류 기반 혼합(vortex-based mixing) 또는 균질화(homogenization)를 사용하는 연구마다 크게 다르다 23,25,26. 이러한 유형의 기계적 재현탁은 너무 마모성이 있어 미토콘드리아의 막 무결성을 손상시킬 수 있습니다. 이러한 이유로 이를 해결하기 위해 부드러운 세탁을 수행해야 합니다. 과다한 변조와 제안된 방법론에도 불구하고 설치류 모델에 대한 높은 재현성과 적응성을 가진 포괄적인 프로토콜은 적습니다.

본 명세서에 기술된 방법은 소동물 심장 조직으로부터 정제되고 잘 결합된 미토콘드리아를 수득하는 상세하고 견고하며 재현성이 높은 프로토콜을 개략적으로 설명합니다. 입증된 바와 같이, 이 방법은 신장, 간 및 배양 세포에서 미토콘드리아를 분리하기 위한 각 실험 및/또는 실험실 환경의 특정 요구 사항을 수용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 여기에 나열되지 않은 조직 및 기타 동물로부터 미토콘드리아를 분리하기 위해 추가 수정을 할 수 있습니다. 모든 격리에 사용되는 버퍼 레시피가 제공되며 필요한 경우 수정할 수 있습니다. 발표된 다른 프로토콜과 유사하게, motorized homogenization 및 differential centrifugation이 구현됩니다. 그러나 분리 소스에 따라 고품질 미토콘드리아 분리물을 일관되게 제공하기 위해 전단 시간과 샘플이 원심분리되는 힘을 모두 조정합니다. 특히, 이 프로토콜은 피펫팅 을 통한 부드러운 세척을 사용하여 펠릿 미토콘드리아를 부유시키며, 이는 미토콘드리아 멤브레인의 무결성을 보존하고 세포 소기관의 전반적인 기능을 유지하는 데 도움이 된다는 점에서 다른 프로토콜과 다릅니다. 미토콘드리아 단백질은 총 단백질 측정 또는 구연산염 합성효소 활성을 측정하여 정량화할 수 있습니다. 이 분리 방법의 유용성과 광범위한 적용 가능성은 다양한 유기체 및 조직 공급원에서 달성된 호흡 제어 비율(RCR) 값에 의해 더욱 뒷받침됩니다.

프로토콜

모든 척추 동물의 사용 및 치료는 미시간 주립 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인한 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 Hartley 알비노 기니피그와 Sprague Dawley(SD) 쥐를 사용하여 설계되었습니다. 기니피그에서 심장 미토콘드리아를 분리하기 위해 동물은 4-6주(300-450g)의 나이에 희생되었습니다. 남녀 모두의 SD 쥐로부터 심장 미토콘드리아는 10-13주(250-400g) 사이에 얻어졌다. 버퍼에 대한 조리법은 표 1 에 설명되어 있으며 미리 준비해야 합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 준비

1. 분리를 시작하기 전에 두 개의 50mL 원심분리 튜브에 "스핀 1 및 2" 및 "스핀 3"으로 레이블을 지정합니다.
2. 튜브, 갓 해동된 분리 완충액(IB), 날카로운 다진 가위, 조립된 균질화 프로브, 5mL 비커 또는 이에 상응하는 크기의 용기를 얼음 위에 놓습니다.
3. 갓 해동된 호흡 완충액(RB)을 인큐베이터에 넣어 후속 호흡 분석을 위해 따뜻하게 합니다.
4. 냉장 원심분리기를 4°C로 미리 식힙니다.
5. 모든 장비가 정렬되어 있고 Bacillus licheniformis 의 7-15 U/mg 프로테아제 20 μL가 "스핀 1 및 2"라고 표시된 튜브에 추가되었는지 확인합니다.
6. 심정지 완충액(CB, 표 1), 유리 캐뉼라 및 스톱콕 밸브가 부착된 플라스틱 튜브를 사용하여 캐뉼레이션을 통한 관류를 위한 중력 종속 압력 시스템을 설정합니다.
7. 수술 도구를 준비하고 심장 박리 및 캐뉼레이션을 위한 적절한 가위와 겸자를 포함하십시오.
   참고: 모든 물은 순수한 품질(18.2MΩ·cm)이어야 합니다.

2. 조직 해부

1. 멸균 헤파린 설페이트를 500U/kg의 용량으로 복강내 주사합니다.
2. 헤파린 투여 후 동물을 유도 챔버에 15분 동안 두십시오. 이 시간 동안 2L/min의 순수한_O2 가스를 공급하여 동물에게 완전히 산소를 공급하고 진정시키며 관심 조직에 부정적인 결과를 초래할 수 있는 스트레스를 최소화합니다.
3. 0.5%에서 이소플루란의 연속적인 흐름으로 마취 유도를 시작합니다. 1분 후 1%로 증가시킵니다. 5%에 도달할 때까지 1분마다 5%씩 계속 증가합니다. 5%가 되면 1분 동안 기다렸다가 동물의 호흡 패턴을 모니터링합니다.
4. 호흡이 느려지고 힘들어지면(대략 6.5분 지점에서) 이소플루란과 산소 흐름을 끕니다.
5. 유도 챔버에서 동물을 빠르게 제거하고 발을 쥐어짜고 각막 반사를 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 동물이 두 자극 중 하나에 반응하면 유도실에 다시 넣고 마취를 읽고 마취 깊이 검사를 반복합니다.
6. 적절한 마취 깊이에 도달하면 단두대로 재빨리 목을 베어 경추를 심하게 하고 엎드린 몸을 얼음 위에 놓습니다.
7. 쇄골에서 외측 흉곽을 따라 흉부 길이를 따라 두 개의 평행한 수직 절개를 만듭니다. 절개 부위가 외측 흉부의 갈비뼈를 자를 수 있을 만큼 충분히 깊은지 확인하되 심장이나 대혈관과 같은 흉곽 내 구조를 손상시키지 마십시오.
   참고: 수직 절개 크기는 사용하는 동물에 따라 다릅니다. 기니피그와 쥐를 사용하는 경우 다이어프램까지 자릅니다(쥐의 경우 약 6.35cm, 기니피그의 경우 약 11cm). 마우스를 사용하는 경우 표준 개흉술을 시행한다²⁷.
8. 지혈제를 사용하여 심장을 노출시켜 흉부 전방을 변위시키고 노출된 흉강을 얼음으로 채웁니다. 이 단계는 온열 허혈 시간을 최소화하고 분리된 세포 소기관의 생존력을 향상시킵니다.
9. 핀셋을 사용하여 흉선과 심낭을 뭉툭하게 절개하고 심장을 완전히 노출시킵니다.
10. 겸자를 사용하여 심장에 부드러운 하부 견인력을 가하여 대동맥을 노출시키고 식별합니다. 대동맥은 심장 기저부에서 뻗어 나온 가장 두꺼운 대동맥입니다. 폐정맥과 같은 다른 큰 혈관은 대동맥보다 눈에 띄게 더 반투명합니다.
11. 대동맥을 대동맥 뿌리 위로 약 4-6mm 자르지만 경동맥 분지 지점 아래를 자릅니다.
12. 관상 동맥에서 혈액이 제거되고 장기가 희게 보일 때까지 중력 의존 압력 헤드를 사용하여 얼음처럼 차가운 심정지(CB) 용액으로 대동맥을 관개하고 심장^28,29를 관류합니다.
    알림: 큰 설치류의 경우 1.8-2.2mm의 캐뉼라 직경이 잘 작동하고 작은 설치류의 경우 1.4-1.8mm의 직경 범위가 권장됩니다. 역관류는 관상 동맥 혈관에서 혈액이 제거되는 데 15-30초 이상 걸리지 않아야 합니다.
13. 심방, 연골 판막 조직 및 지방 조직을 절개하여 심실 심근을 격리합니다.
14. 0.1-0.2mL의 얼음처럼 차가운 IB가 들어 있는 미리 냉각된 10mL 비커에 심실을 넣습니다.
15. 날카로운 수술용 가위로 조각이 약 1mm가 될 때까지 조직을 다집니다³.

3. 미토콘드리아 정제 및 단백질 정량

1. 다진 조직을 프로테아제 용액이 들어 있는 "Spins 1 and 2"라고 표시된 미리 냉각된 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
2. 얼음처럼 차가운 IB를 최종 부피 25mL에 추가합니다.
3. 전동식 휴대용 회전자-고정자 균질화기를 사용하여 조직을 18,000rpm으로 얼음 위에 20-25초 동안 분산시킵니다.
4. "Spins 1 and 2"라고 표시된 튜브에서 균질화된 조직을 4°C에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다.
5. 상층액(프로테아제 포함)을 폐기물 카보이에 부어 버리고 펠릿을 IB 5mL로 부드럽게 헹구어 잔류 프로테아제를 제거합니다.
6. 헹굼제를 버린 후 부드러운 소용돌이에 의해 신선한 얼음처럼 차가운 IB로 펠릿을 최종 부피 25mL까지 재현탁시킵니다.
7. 800 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.
8. 상층액(미토콘드리아 포함)을 "Spin 50"이라고 표시된 미리 냉각된 3mL 튜브에 부드럽게 부어 제거합니다. 붓는 동안 펠릿의 느슨한 상단 부분이 빠지지 않도록 주의하십시오. 대안으로, 전사 피펫 또는 스트리펫을 사용하여 상층액을 수집할 수 있습니다.
9. 상층액을 8000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
10. 생성된 상층액을 버리고 미토콘드리아 함유 펠릿을 유지합니다.
11. 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 튜브 내벽에서 과도한 상층액을 흡수하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 펠릿을 가능한 한 얼음 위에서 4°C로 유지하십시오.
12. 미토콘드리아를 재현탁시키려면 튜브 바닥에 80μL의 얼음처럼 차가운 IB를 추가합니다. 펠릿 위에 IB를 반복적으로 세척하여 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.
13. 기포가 생성되지 않도록 마이크로피펫을 40-60 μL 부피를 흡입하여 전달하도록 설정하십시오.
14. 미토콘드리아 펠릿이 분산됨에 따라 펠릿화된 미토콘드리아를 효율적으로 재현탁시키기 위해 마이크로피펫 부피를 늘립니다. 피펫 팁으로 펠릿을 만지지 말고 거품을 만들지 마십시오.
15. 다시 현탁되면 미토콘드리아를 사전 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 스톡 미토콘드리아로 표시합니다. 총 일시 중단 볼륨을 기록해 둡니다.
16. 샘플의 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하려면 제조업체의 지침에 정의된 대로 잘 알려진 BCA 또는 Bradford 단백질 분석을 사용하여 총 단백질 분석을 수행하십시오.
    참고: 수율을 평가하기 위한 대안 또는 보완 전략은 구연산염 합성효소 활성을 측정하는 것입니다. 참고로, 미토콘드리아 함량은 Vinnakota et ^al.30에 기술된 프로토콜에 따라 정량화할 수 있습니다.

4. 품질 관리 검사

1. 미리 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에서 IB를 사용하여 미토콘드리아 스톡을 원하는 작업 농도로 희석합니다.
   참고: 미토콘드리아 스톡은 심장 조직에서 분리물을 사용할 때 호흡 측정 분석을 위해 0.1mg/mL의 최종 농도에서 작동하도록 40mg/mL로 희석됩니다.
2. 산소 그래프 챔버, 스토퍼 및 마이크로리터 주사기를 증류수로 10번 헹구어 호흡 측정 분석에 사용하기 전에 세척합니다.
3. 미토콘드리아 분리체의 생존력과 품질을 테스트하려면 2.3mL의 호흡 완충액(RB)을 산소 그래프 챔버에 로드하고 산소 소비 신호가 37°C에서 약 10분 동안 또는 속도가 0에 가까울 때 평형을 이루도록 합니다.
4. 신호가 평형을 이루면 스토퍼를 아래로 누르고 스토퍼의 모세관에서 나오는 과도한 완충액을 흡입합니다.
5. 마이크로리터 주사기를 사용하여 1mM EGTA를 추가하여 완충액 또는 미토콘드리아 샘플에 잔류 칼슘을 킬레이트화합니다.
6. 호흡에 연료를 공급하기 위해 5mM 피루브산 나트륨과 1mM L-말레이트를 첨가하십시오.
7. 기질을 추가한 후 희석된 미토콘드리아 덩어리를 추가하여 작업 농도를 달성하고 5분 동안 호흡이 발생하도록 합니다. 이 기간을 LEAK 또는 State 2 호흡이라고 합니다.
8. 5분 표시에서 500μM ADP 덩어리를 추가하여 OXHPOS라고도 하는 State 3 호흡을 시작하고 미토콘드리아가 산소결핍증이 될 때까지 호흡할 수 있도록 합니다.
9. 상태 3 동안의 최대 산소 소비량을 상태 2에서 ADP를 추가하기 직전의 산소 소비량으로 나누어 호흡 제어 비율(RCR)을 계산합니다( 그림 1 참조).
   참고: 1 - 1/RCR의 대체 RCR 표현식을 0과 1 사이로 제한되는 품질 메트릭으로 사용할 수도 있습니다. 그러나 RCR이 10을 >할 때 이 메트릭을 사용하여 품질을 구별하기가 어렵습니다( 그림 2 참조).
10. 챔버와 스토퍼를 순수한 물로 10번 헹구어 후속 분석을 위해 산소 그래프를 청소합니다. 호흡 측정이 완료되면 챔버에 70% 에탄올을 채우고 다음 사용 시까지 챔버에 마개를 놓습니다.

결과

미토콘드리아 분리가 완료되면 고분해능 호흡 측정법을 사용하여 산소 소비량(J_O2)을 정량화하여 분리체의 품질과 기능을 테스트해야 합니다. 이를 위해 미토콘드리아 스톡을 40mg/mL로 희석하여 분리된 심장 미토콘드리아를 사용하는 모든 호흡 측정 분석에 대해 RB 2mL에 0.1mg/mL의 작업 농도를 허용했습니다. 호흡은 칼슘 킬레이트제인 1mM EGTA의 존재 하에 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트에 의해 연료를 공급하고, 상태 2 호흡을 확립하기 위해 5분 동안 평형을 이루도록 허용했습니다. 이 상태에서 산소 소비량은 평균 45-55pmol/mL/s 또는 27-33nmol/mg/min이어야 합니다. 전극에 따른 산소 소비율을 인식하고 필요한 경우 적절한 배경 보정을 수행하십시오. 산화적 인산화(상태 3)는 500μM ADP의 볼루스에 의해 5분 표시에서 시작됩니다. 기판 추가 및 대표 추적은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. 기능성 미토콘드리아는 그림 2와 같이 조직 소스에 따라 범위가 넓은 ADP를 추가한 후 J_O2가 즉시 증가합니다. EGTA를 사용하지 않는 경우, 잔류 칼슘은 미토콘드리아 농도, 기질 가용성 및 기타 환경 요인에 따라 OXPHOS 중 J_O2의 최대 속도에 다양한 영향을 미칩니다. 완충액 조성은 미토콘드리아 막의 무결성과 기능성을 보존하는 데 중요합니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 언급된 모든 완충액 레시피는 표 1에 더 상세히 설명되어 있으며, 본원에 설명된 모든 미토콘드리아 제제에 활용될 수 있다.

미토콘드리아의 성공적인 분리는 표 2와 같이 각 종 및 조직 소스에 대해 주어진 범위 내에 있는 RCR 값을 얻는 것으로 표시됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 수집된 데이터를 기반으로 기니피그, 랫트 또는 마우스에서 심장 미토콘드리아를 분리하는 경우 RCR은 각각 ≥16, ≥8 및 ≥5여야 합니다. 쥐의 간 또는 신장에서 분리하는 경우 RCR은 ≥6이어야 하며, 세포의 RCR은 3.8 이상이면 허용되는 것으로 간주됩니다. RCR 값이 이 범위 아래로 떨어지거나 호흡 측정 추적에 질적 차이가 있는 경우 오염 문제를 배제하기 위해 새로운 RB 및 기질을 사용한 추가 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 1-1/RCR 변환은 0과 1 사이의 값을 제한하지만 RCR 값이 10보다 클 때 성별 또는 종 간의 미토콘드리아 품질을 비교할 때 이 메트릭은 권장되지 않습니다. 이러한 이유로 모든 실험에서 표준 RCR 값(State 3/State 2 또는 OXPHOS/LEAK)을 정량화했습니다. 마우스의 심장, 간, 신장 및 세포에서 미토콘드리아를 더 잘 분리하기 위해 이 프로토콜에 대해 수행할 수 있는 조절에 관한 정보는 표 3에 자세히 설명되어 있습니다.

그림 1: 고분해능 호흡 측정법을 사용한 품질 관리 검사를 위한 관심 영역. 호흡 챔버에 2mL의 RB를 로드하고 산소 소비율이 0에 가까워질 때까지 37°C에서 평형을 이루도록 했습니다. 평형이 이루어지면 칼슘 킬레이트제인 1mM EGTA를 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트와 함께 첨가했습니다. 이러한 기질을 첨가한 후, 미토콘드리아를 원하는 작업 농도(0.1mg/mL)로 첨가하고 상태 2 호흡(노란색)을 달성하기 위해 5분 동안 호흡하도록 했습니다. 5분 표시에서 500μM ADP를 추가하여 상태 3 호흡(빨간색)을 시작했습니다. RCR은 상태 3과 상태 2를 비교하기 위해 빨간색과 노란색 상자로 표시된 산소 소비량의 평균을 기준으로 결정되었습니다. 상태 4는 녹색 상자로 표시되며 ATP의 미토콘드리아 외 ATPase 가수분해 기간을 나타내며 시토크롬 C 분석에서 외막 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 표시된 데이터는 SD 쥐 심장 미토콘드리아를 사용하여 수집되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 동물 및 조직 공급원에 대한 대표적인 J_O2 추적 및 호흡 제어 비율. 분리된 미토콘드리아의 품질은 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모량을 정량화하여 테스트했습니다. 호흡은 1mM EGTA가 있는 상태에서 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트에 의해 연료를 공급했습니다. 미토콘드리아와 기질은 상태 2 호흡이 안정화되도록 5분 동안 호흡하도록 했습니다. ADP 추가 후 최대 산소 소비량을 ADP 이전 State 2 산소 소비량과 비교하여 각 조직에 대한 호흡 제어 비율(RCR)을 계산했습니다. 미토콘드리아 품질은 P-L 제어 효율 표준에 의해 특성화된 1-1/RCR 값을 계산하여 추가로 평가했습니다. 각 추적의 오른쪽에 있는 막대 그래프는 주어진 조직에 대한 수(파란색) 및 암(녹색) 평균 RCR 및 1-1/RCR 값± SD를 나타냅니다. (A), (B) 및 (C)는 각각 기니피그, Sprague Dawley(SD) 쥐 및 Friend 백혈병 바이러스 B(FVB) 쥐의 심장을 사용하여 수집된 데이터를 나타냅니다. (D)와 (E)는 SD 쥐의 간과 신장에서 채취한 결과이며, (F)는 HEK293 세포를 나타냅니다. 3개의 큰 간엽을 채취하고 양쪽 신장을 분리하는 데 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 버퍼 레시피. 격리 과정 전반에 걸쳐 사용되는 심정지 완충액(CB), 격리 완충액(IB) 및 호흡 완충액(RB)은 나열된 지침에 따라 미리 준비해야 합니다. CB는 4°C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있는 반면, IB와 RB는 -80°C에서 4개월 동안 보관할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 호흡 조절 비율 분석. 기능 분석을 위한 미토콘드리아 분리는 HEK293 세포뿐만 아니라 남성 및 여성 설치류의 광범위한 종 및 조직 소스에 걸쳐 수행되었습니다. 각 성별, 조직 출처 및 종의 표본 크기는 평균 RCR 및 SD± 1-1/RCR 값과 함께 자세히 설명되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 단백질 수율을 높이기 위해 서로 다른 조직에 대한 미토콘드리아 분리 프로토콜에 대한 권장 조절. 프로테아제 및 원심분리 량의 변화는 조직 공급원에 따라 표시됩니다. 총 단백질(mg)의 평균 양은 BSA 단백질 분석의 결과와 최종 미토콘드리아 펠릿의 재현탁 부피로부터 계산되었습니다. 값은 SD의 평균± 보고됩니다. 원심분리 컬럼에 포함된 굵은 글씨체의 지침은 상층액을 폐기, 보유 또는 합산할지 여부를 알려줍니다. 폐기는 생물학적 폐기물 용기에 상층액을 처분하는 것을 의미하며, 보유 및 풀링은 각각 상층액을 다음 원심분리 튜브로 옮기거나 최종 스핀을 위해 수집하는 것을 말합니다. 프로토콜 변경에 대한 자세한 내용은 토론 섹션에서 확인할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜에 간결하게 설명된 방법을 준수하면 다른 조직 유형 및 소스 외에도 작은 설치류의 심장 조직에서 잘 결합된 미토콘드리아를 격리할 수 있습니다. 전반적으로 이 과정은 총 3-3.5시간이 소요되어야 하며, 이 기간 동안 모든 동물 조직, 샘플 및 분리물은 분해를 제한하기 위해 가능한 한 4°C의 얼음 위에 있어야 합니다. 이 절차는 강력하며 실험 목표와 사용된 모델에 더 잘 맞도록 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다. 조직 절개 과정에서 만들 수 있는 한 가지 조절은 헤파린을 배제하는 것입니다. 헤파린은 혈전의 형성을 예방하기 위해 투여되지만(³¹ ), 심장이 충분히 빠르게 통조림되고 관류되는 경우(참수 후 1.5분 이내) 필요하지 않다. 또한, CB를 사용한 심장 관류는 더 큰 설치류에 권장되므로 마우스 심장 또는 기타 장기로 작업할 때 다진 및 초기 균질화 전에 IB 세척을 포함하는 것이 좋습니다. 이 단계를 통해 해부 과정에서 이월된 혈액을 폐기할 수 있습니다. 다른 변경 사항으로는 미토콘드리아 단백질 수율을 높이기 위한 균질화 및 원심분리 속도의 변경이 있습니다. 위에서 설명한 것들은 기니피그와 쥐에서 심장 미토콘드리아를 분리하기 위한 것입니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 설치류의 간, 신장, 쥐의 심장 및 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 데 적용될 수 있다는 것입니다. 특정 조직 유형 및 동물에 기반한 프로테아제의 부피, 균질화 및 원심분리에 대한 권장 변경은 표 3에 자세히 설명되어 있습니다.

최종 원심분리 단계에서 정제된 미토콘드리아 펠릿을 형성한 후, 미토콘드리아는 사전 냉각된 IB에 재현탁되어야 합니다. 첨가된 IB의 부피는 미토콘드리아 펠릿의 크기에 따라 다르지만 기니피그와 쥐의 경우 약 80μL입니다. 마우스 심장에서 분리하는 경우 재부유를 위해 60μL의 IB가 추가됩니다. 미토콘드리아를 처음 분리할 때는 원액을 희석하지 않도록 더 적은 양의 IB를 추가하는 것이 좋습니다. 간과 신장에서 샘플을 정제한 후 형성된 미토콘드리아 펠릿의 일관성으로 인해 재현탁을 위해 훨씬 적은 IB(20μL)를 추가해야 합니다. 다른 방법으로는 미토콘드리아 멤브레인을 마모시키고 전반적인 무결성을 감소시킬 수 있는 스크래핑을 통한 기계적 재현탁의 사용을 제안합니다^32,33. 이 프로토콜을 사용할 때 미토콘드리아의 품질을 향상시키기 위해 IB로 펠릿을 부드럽게 세척하는 것이 좋습니다. 이 과정에서 기포를 생성하거나 피펫 끝으로 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오., 이는 막 파열 및 단백질 오접힘으로 이어질 수 있으므로³⁴. 피펫의 첫 번째 스톱까지만 밀어도 기포 형성 가능성을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 펠릿 전체가 현탁액이 될 때까지 부드러운 피펫 세척을 수행해야 합니다. 총 재현탁 수율은 기니피그와 쥐의 심장 미토콘드리아에 대해 150-200 μL여야 하며 밝은 갈색으로 나타나야 합니다. 더 농축된 샘플은 더 어두운 갈색 음영이 되며 미토콘드리아 단백질의 정량화 후 원하는 작업 농도 범위에 맞게 희석할 수 있습니다.

BSA를 사용한 표준 단백질 분석은 미토콘드리아 단백질 정량화에 최적입니다³⁵. 단백질 분석은 제조업체의 프로토콜에 정의된 권장 기간과 온도 동안 지연시키고 배양해야 합니다. 분리된 미토콘드리아의 경우 37°C에서 30분 동안 배양하면 색상이 잘 펴지고 단백질이 정확하게 정량화됩니다. 단백질의 총량을 정량화하는 동안 단백질 분석 결과가 보정 범위 내에 있는지 확인하기 위해 먼저 재현탁 미토콘드리아와 IB를 1:50, 1:100 및 1:200의 비율로 희석하는 것이 좋습니다. BSA를 표준으로 사용하여 단백질 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 제조업체의 키트에 따라 제공되므로 여기에 나열된 권장 사항이 적용되지 않을 수 있습니다. 각 샘플의 미토콘드리아 함량을 측정하기 위해 CS 분석도 수행해야 합니다. 이 분석은 잘 확립되어 있으며 미토콘드리아 아형³⁶ 간의 생물학적 차이를 연구하는 경우 추가 정규화를 허용합니다.

단백질 측정 후 미토콘드리아 스톡을 희석하여 호흡 측정 분석을 위한 원하는 최종 작업 농도를 얻어야 합니다. 기니피그와 쥐의 심장에서 분리한 미토콘드리아를 40mg/mL로 희석하고, 이 혼합물 5μL를 호흡실에 첨가하여 0.1mg/mL의 작업 농도를 얻습니다. 단일 쥐의 심장 또는 신장 및 간에서 분리하는 경우 미토콘드리아 스톡의 희석이 필요하지 않을 수 있습니다. 원하는 농도를 얻기 위해 더 많은 양의 미토콘드리아를 추가할 수도 있습니다. 상태 2 동안의 산소 소비율이 35-55 pmol/mL/s 사이인 경우, 대부분의 호흡 측정 분석에서 허용된다²⁸. RCR의 수행 및 분석 방법에 대한 자세한 내용은 그림 1 및 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다. 그러나 호흡은 피루브산과 말레이트에 의해 연료가 공급된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 석시네이트 및 로테논과 같은 다른 기질 조건은 P/O 비율 및 기타 생체 에너지 변수가 다르기 때문에 다른 RCR 값을 초래할 것입니다³⁷. 피루브산과 말레이트를 호흡기 연료로 사용하면 거의 최대의 TCA 주기 회전율과 환원 등가물의 생산을 달성할 수 있습니다. 그러나 최대 TCA 주기 활성 및 결합 ETS 기능은 5mM 피루브산, 1mM L-말레이트 및 20mM 숙시네이트로 얻어집니다. 상태 3 동안 산소 소비 속도를 정량화하기 위해 산화적 인산화를 자극할 때, ADP는 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터⁽³⁸)의 ADP_{에 대한} 추정된 KD의 적어도 10배 농도로 첨가된다. 이는 350 μM ADP보다 큰 볼루스에 의해 달성될 수 있으며, 이것이 모든 실험 분석에 500 μM이 사용된 이유입니다. 상태 3의 지속 시간이 너무 짧으면 더 낮은 미토콘드리아 농도를 사용하여 연장할 수 있습니다. 호흡의 추가 분석을 위해, 실험 파라미터(³⁹)에 더 잘 맞도록 시스템에 도입되는 ADP의 농도에 대한 조절이 이루어질 수 있다. 이 프로토콜을 처음 개발할 때, 미토콘드리아 분리체(⁴⁰)의 외막 무결성을 평가하기 위해 시토크롬 C 분석이 사용되었습니다. RCR 값이 예상 범위보다 낮으면 사이토크롬 C 검사를 수행하여 외막 손상이 심각한지 평가합니다. 이렇게 하려면 호흡실에 10μM의 시토크롬 C를 추가하고 호흡 증가가 State 4 비율의 5 또는 10% 미만인지 확인합니다. 예상 범위는 이전에 발표된 연구에서 발견되었으며 종, 조직 및 기질에 특화되어 있습니다. 사이토크롬 c를 첨가하여 State 4 호흡을 10% 이상 자극하면 손상된 미토콘드리아를 제거하기 위해 마지막 8,000 x g 스핀을 반복할 수 있습니다. 즉, 외막 손상은 질병 표현형의 일부일 수 있으며, 따라서 시토크롬 C 검사는 이를 염두에 두고 해석해야 한다⁴¹. 낮은(<10%) 사이토크롬 C 자극 효과로 일관되게 높은 RCR 값을 얻으면 이 테스트는 RCR 값이 허용 범위를 벗어나는 경우에만 필요하고 조언됩니다. 시토크롬 C 검사가 <10%이고 RCR 값이 예상 범위를 벗어나면 표 2에 자세히 설명되어 있는 것처럼 증류수로 10회 세척한 후 새 RB로 호흡 측정 분석을 반복합니다. 감소된 비율이 계속 관찰되면 문제를 진단하기 위해 새로운 시약(피루브산, 말산염, EGTA 및 ADP)을 만들어야 합니다. 또한 시토크롬 C 분석은 ELISA와 TMRE^33,42와 같은 미토콘드리아 염료를 사용하여 수행할 수 있습니다. 조직 유형 및 소스에 따라 이러한 옵션은 외막 무결성을 결정하는 데 더 적합할 수 있습니다.

심장 미토콘드리아를 격리하는 데 사용되는 이 프로토콜에는 큰 제한이 없지만 이러한 방법을 사용할 때 특정 고려 사항을 고려해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 분리 미토콘드리아 화합물의 품질은 온도와 심장에 관류를 주입하고 정제된 펠릿을 부유시키는 데 걸리는 시간에 크게 영향을 받습니다. 따라서 여기에 보고된 것과 유사한 RCR을 얻으려면 이러한 프로세스에 대한 지식이 필요할 수 있습니다. 또한, 분리 과정 동안 사용되는 완충액 및 용액의 조성은 미토콘드리아 무결성 및 기능⁴³에 직접적인 영향을 미치기 때문에 중요합니다. 표 1에 나열된 완충액은 참조로 제공되며 다양한 조직 소스에서 잘 결합된 미토콘드리아를 분리할 수 있지만, 이는 아데닌 뉴클레오티드 전좌 및 ETS 기능²⁸을 방해할 수 있으므로 호흡 분석에서 염화물의 양을 제한하기 위해 변경할 수 있습니다. 완충액 조성은 간 미토콘드리아를 더 잘 분리하기 위해 변경될 수도 있습니다. 간은 지방산 농도가 높기 때문에 RCR이 예상 범위를 벗어나는 경우 BSA 농도가 높은 완충액으로 장기와 다진 조직을 세척하는 것이 좋습니다. 간 절편에서 얻은 미토콘드리아 분리체의 품질은 잘 결합되고 일관되지만, 이러한 변화는 세포소기관 기능을 향상시킬 수 있습니다. 또한 이러한 방법을 사용하는 세포에서 미토콘드리아를 분리하려면 많은 양의 배양된 세포가 필요하며, 이는 잠재적인 한계를 내포하고 있음을 인식해야 합니다. 또한 이 프로토콜은 세포 분리를 위해 특별히 설계되지 않았지만 구현되었을 때 성공적인 것으로 입증되었습니다. 따라서 배양된 세포에 대한 표적 분리 방법이 더 유용할 수 있습니다. 또는 미토콘드리아 품질을 평가하기 위해 연구자들은 RCR을 계산하기 위해 형광 프로브를 선택할 수 있습니다. 분광 형광 분석법은 특히 더 적은 양의 단백질을 추출하는 경우 널리 사용되는 선택입니다^44,45.

전반적으로 이 프로토콜은 기니피그 및 쥐와 같은 작은 동물로부터 잘 결합된 심장 미토콘드리아를 일관되게 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 균질화 속도, 원심분리 시간 및 스핀 수를 변경하여 단백질 수율을 높이기 위해 쉽게 수정할 수 있으며, 이를 통해 쥐의 심장, 간, 신장 및 세포에서 미토콘드리아 분리를 허용할 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 일반적이고 충분히 견고하여 Sea Lamprey⁴⁶과 같은 비포유류 종의 미토콘드리아 기능을 조사하고 고전적 및 극저온 전자 현미경(^40,47)을 사용하여 구조 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 최근의 많은 연구가 온전한 세포 및 조직 시스템의 미토콘드리아 거동 탐구에 초점을 맞추고 있지만, 이러한 방법을 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 추출한 정보의 폭과 깊이는 대사체학, 산화 스트레스 및 ATP 생성에 미치는 영향을 보여줍니다. 잘 결합된 미토콘드리아의 분리를 통해 연구자들은 전체 세포 모델에서는 불가능한 질병 발병 및 진행의 주요 측면을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜의 다양성으로 인해, 심혈관 질환, 당뇨병 및 신경 장애와 같은 병리학에서 관찰되는 미토콘드리아 에너지학의 변화는 본원에 설명된 방법론을 사용하여 탐색할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브
10 mL 유리 비커			장기 절개 및 민싱용
50 mL 원심분리기 튜브			원심분리
아데노신 5'-디포스페이트 모노포타슘 염 이수화물	Sigma	A5285	호흡량 측정 분석
BSA 단백질 분석 키트	열 향	PI23225	미토콘드리아 단백질 정량화
덱스트로스	시그마	DX0145	버퍼 (CB)
에틸렌 글리콜 - 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산	시그마	E4378	완충액 (CB 및 IB) 및 호흡량 측정 분석
: 유리 캐뉼라	Radnoti,		기니, 돼지 및 쥐 심장 관류
헤파린, 나트륨, 돼지 점막,	Sigma	SRE0027-250KU	동물 IP 주입
고해상도 호흡계			클라크형 전극; 2 mL 챔버가 있는 옥시그래프
유도 챔버
이소플루란	시그마	792632	마취제
L-말산	시그마	02288-50G	호흡량 분석
염화마그네슘 육수화물	시그마	M9272	버퍼(RB)
만니톨	시그마	MX0214	버퍼 (IB)
마이크로 리터 주사기			경우 크기는 5– 50 &마이크로; L
Microplate reader			는 37°C에서 배양할 수 있어야 합니다. 씨
걸레	시그마	475898	모든 버퍼
O2 탱크
OMNI THQ 균질화기	OMNI International	12-500	유사한 로터 스테이터 균질화기는 피펫을 작동시킬 것입니다
.			2– 20 & 마이크로; L; 20– 200 &마이크로; L; 200– 1000 &마이크로; L
염화칼	시그마	P3911	완충액 (RB 및 CB)
인산 칼륨 이염기성	시그마	795496	완충액(IB 및 RB)
의 경우 Bacillus licheniformis Sigma의 프로테아제		P5459
염화나트륨	시그마	S9888	완충액 (CB)
피루브산나트륨	피셔 생물시약	BP356-100	호흡량 측정 분석
자당 시	그마	8510-OP	완충액 (IB)
용 외과적 해부 키트			동물 및 조직 출처에 따라 다름
탁상용 원심분리기			4°C로 냉각해야 합니다. 씨