Method Article

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

DOI:

10.3791/67094

⸱

February 21st, 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In This Article

Summary

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공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

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공기-액체 계면(ALI)에서 원발성 폐 기도 상피 세포를 분화하는 것은 폐기도의 정점 쪽을 모방한 다세포 가성층 기도 상피를 개발하기 위해 널리 사용되는 기술입니다. 원발성 폐 기도 세포의 분화가 예상되지만, 섬모 기능 및 막 불투과성과 같은 생물물리학적 특성의 평가는 기도 상피의 품질 평가를 제공하고 실험의 신뢰성을 보장합니다. 여기에서는 ALI 배양에서 다세포 가성층 기도 상피의 발달을 위한 간단한 프로토콜을 설명하고 두 가지 중요한 생물물리학적 특성인 섬모 기능과 막 불투과성을 평가합니다. 섬모 기능을 확인하기 위해 도립 현미경에 부착된 고속 카메라를 사용하여 4주 동안 분화된 기도 상피의 섬모 움직임을 캡처한 다음 Simon Amon Video Analysis(SAVA) 시스템을 사용하여 섬모 박동 주파수(CBF)를 정량화했습니다. 또한 기도 상피의 상피 장벽 무결성을 결정하기 위해 볼트-옴 미터를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정했습니다.

Introduction

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천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증과 같은 만성 호흡기 질환은 전 세계적으로 주요 건강 문제 중 하나입니다1. 인간 인플루엔자 A 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)와 같은 바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 유병률도 경제적 및 공중 보건 부담을 초래합니다2. 따라서 돌이킬 수 없는 호흡기 조직 손상으로 이어지는 호흡기 질환에 대한 치료 요법을 개발해야 할 필요성이 매우 큽니다. 호흡기 상피 조직 자체는 산소 흡수에 관여할 뿐만 아니라 병원균 및 유해 화학 물질의 침입으로부터 신체를 보호하는 장벽을 제공합니다3. 호흡기 상피는 섬모 세포(ciliated cell), 배상 세포(goblet cell), 기저 세포(basal cell)의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성된 복잡한 세포 조직을 가지고 있습니다. 최근에는 기도 상피4에 새롭지만 드문 전리세포 세포가 존재한다는 보고가 있었습니다. 이 복잡한 조직은 항균 펩타이드의 분비, 적응 면역 반응을 활성화하기 위한 사이토....

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Protocol

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프로토콜은 생물 안전성 레벨 2 층류 후드(생물 안전 캐비닛)에서 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 모든 매체와 용액은 사용하기 전에 37°C에서 해동해야 합니다. 원심분리는 4°C에서 수행해야 합니다. 실험에 사용된 모든 재료는 멸균되어야 합니다. 일차 세포(비식별화된 기증자)는 네브래스카주 오마하에 있는 네브래스카 대학 의료 센터(UNMC)의 Kristina Bailey 박사와 협력하여 얻었습니다. 일차 세포는 비식별화된 기증자로부터 유래하며, 세포는 NIH Human Subject에 속하지 않습니다. 세포는 노스다코타주 그랜드포크스에 있는 노스다코타대학교(University of North Dakota)와 네브래스카주 오마하의 UNMC 간에 승인된 MTA(Material Transfer Agreement)에 따라 획득되었습니다. 여기에서는 계대가 형성된 4개의 NHBE 세포를 사용했습니다. 더 높은 계대 NHBE 세포(최대 계대 8)도 기도 상피로 분화하는 것으로 나타났지만, 계대 1에서 4까지의 계대 간에 전체 게놈 전사 프로파일에 명백한 차이가 없기 때문에 일반적으로 4개의 계대 NHBE 세포를 사용합니다 6,14.

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Results

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우리는 2명의 독립적인 비식별화 기증자(2명의 비흡연, 건강한 성인 또는 COPD가 있는 성인, 50세 이상의 여성)로부터 1차 NHBE 세포를 분화하여 얻은 기도 상피의 섬모 기능과 막 불투과성을 모두 평가했습니다. 섬모 기능을 결정하기 위해 28일 분화된 기도 상피의 CBF를 측정했습니다. 우리는 CBF가 양쪽 기도 상피에 대해 최소 3Hz에 도달하는 것을 관찰했으며, 이는 이전에 발표된 결과와 유사했습니다(그림 1)6,7,14. 또한 TEER을 측정하여 동일한 기도 상피에 대한 막 불투과성을 평가했습니다. 양쪽 기도 상피에 대해 약 800ohm/cm2의 TEER을 발견했으며, 이는 이전에 발표된 데이터(그림 2)와 유사합니다(그림 2.......

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Discussion

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인간의 일차 기도 상피(ALI 배양)는 기능과 기전을 조사하고 동물 사용을 줄이기 위한 생물학적 평가를 위한 체외 폐 모델로 점점 더 많이 사용되고 있다14. ALI는 단층 수중 배양에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 폐기도의 정점 쪽을 모방한 조직과 같은 가성층화 기도 상피를 제공합니다 6,7,14. 그러나 실험의 신뢰성과 재현성을 향상시키기 위해 차별화된 가성층화 기도 상피의 품질과 무결성을 평가해야 합니다. 고도로 분화된 정점 기도 상피의 품질에 대한 정보를 제공하는 두 가지 중요한 생물물리학적 지표는 섬모 기능과 막 불투과성입니다. 이러한 특성은 ALI에서 1차 상피 세포 분화의 초기 단계에서 평가할 수 있지만, 감염성 질환 연구에서 가성층화.......

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 NIH P20GM113123와 UND SMHS 파일럿 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific, 미국14190-144
기도 상피 세포 성장 매체PromoCell, 독일C-21060
Amphotericin BThermo Fisher Scientific, 미국15290-026
EVOM2 volt OhmmeterWorld Precision Instruments, 미국해당
없음 헤파린 솔루션STEMCELL 기술, 미국07980
하이드로코르티손 주식STEMCELL technologies, 미국07926
현미경: 현미경과 관련된 120f/sec 고속 카메라(Basler)가 있는 Leica DMI8(Leica 현미경). 마이크로소프는 스테이지 챔버 인큐베이터 i8로도 고정됩니다.Leica, USA적용되지
Penicillin-StreptomycinCorning, USA30-002-CI
PneumaCult-ALI 기초 매체 STEMCELL technologies, 미국05002
PureColAdvanced BioMatrix, 미국5005
Sisson-Ammons 비디오 분석(SAVA) 시스템. 소프트웨어 V.2.1.15 Amson Engineering, 미국해당 없음
않음

References

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  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M.

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Ciliary FunctionMembrane ImpermeabilityAirway EpitheliumAir Liquid InterfaceCiliary Beat FrequencyTransepithelial Electrical ResistancePseudostratified EpitheliumBronchial Epithelial CellsHigh Speed MicroscopySAVA System

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