방법 논문

컨포칼 스캐닝 레이저 검안경을 통한 맞춤형 아데노 관련 바이러스 혈청형을 이용한 망막 세포의 종단 생체 내 이미징

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DOI:

10.3791/67106

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2024년 10월 11일

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(CSLO)을 사용하여 세포 특이적 표지 및 생체 내 이미징을 위한 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 사용을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 다양한 망막 세포 유형과 망막 기능 및 질병에 대한 기여도를 조사할 수 있습니다.

초록

망막 세포 과정의 역동적인 특성으로 인해 안구 질환에 대한 이해와 치료를 강화하기 위해 유전자 전달 및 실시간 모니터링 기술의 발전이 필요합니다. 본 연구는 최적화된 아데노연관바이러스(AAV) 접근법을 소개하며, 특정 혈청형과 프로모터를 활용하여 망막신경절세포(RGC) 및 뮐러신경교세포를 포함한 표적 망막 세포에서 최적의 transfection 효율을 달성합니다. 컨포칼 주사 레이저 검안경(CSLO)의 정밀도를 활용하여 이 연구는 AAV 매개 녹색 형광 단백질(GFP)의 종적 발현을 캡처하는 생체 내 이미징을 위한 비침습적 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 최종 절차의 필요성을 제거하여 관찰의 연속성과 피험자의 안녕을 보존합니다. 또한, GFP 신호는 상구(superior colliculus, SC) 및 외측 외상핵(lateral geniculate nucleus, LGN)으로 가는 시각 경로를 따라 AAV에 감염된 망막 신경절(RGC)에서 추적될 수 있으며, 이를 통해 직접적인 시각 경로 매핑을 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 발견은 상세한 프로토콜을 제공하고 망막 세포 행동, 질병 발병 기전 및 유전자 치료 중재의 효능에 대한 실시간 연구에 이 강력한 도구의 적용을 입증하여 살아있는 망막과 그 연결에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서론

망막은 중추신경계에서 유일하게 광학적으로 접근할 수 있는 부분으로, 신경과학 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 합니다1. 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 시각 정보를 뇌에 전달하는 망막의 출력 뉴런으로, 시각 기능에 중요한 역할을 합니다. 이들의 상실 또는 기능 장애는 시각 장애와 돌이킬 수 없는 실명으로 이어지는데, 이는 녹내장과 다른 시신경병증에서 볼 수 있다2. 망막의 주요 신경교세포(glial cell)인 뮐러아교세포(Müller glia)는 망막의 항상성을 유지하고, 뉴런에 구조적, 신진대사적 지원을 제공하며, 신경전달물질 수치를 조절하고, 망막 복구 및 재생에 기여하는 데 필수적이다3. 이들의 기능 장애는 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy)4, 노화 관련 황반변성(age-related macular degeneration)5, 안구 허혈 증후군(ocular ischemic syndrome)6 등 다양한 망막 질환과 관련이 있다. 망막 신경절세포와 뮐러 신경교세포는 밀접한 상호작용과 상호의존성을 보인다. 뮐러신경교세포(Müller glia)는 망막신경세포(Rrecc)에 필수적인 지원을 제공하는 반면, 망막신경세포(RGC) 활동은 뮐러(Müller) 신경교세포(Müller glia) 기능에 영향을 미칠 수 있다 3,7. 망막 신경절 세포와 뮐러 신경교세포를 모두 연구하는 것은 망막 기능을 이해하고 여러 망막 질환에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.

현재 망막 연구의 평가는 주로 광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography, OCT)과 같은 기술을 사용하여 망막 신경 섬유층의 두께나 축삭 다발의 궤적을 측정합니다 8,9. 이러한 방법은 망막 신경절 세포(RGC loss)를 검출하는 데 매우 중요하지만, 제한된 해상도로 인해 망막 신경절 세포(RGC morphology) 및 신경교세포(glial cell)에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, AO-SLO(Adaptive Optics scanning laser ophthalmoscopy)와 같은 고급 기술을 통해 살아있는 인간 망막10에서 망막 세포, 광수용체 및 신경교세포의 세포 수준 이미징이 가능하지만, 기술적 복잡성과 제한된 접근성으로 인해 주로 전문 연구 환경에서만 사용할 수 있습니다. 이러한 제약을 감안할 때, in vivo에서 특정 망막 세포 집단에 대한 심층적인 연구를 위해 보다 접근하기 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 개발해야 할 필요성이 지속적으로 있습니다.

따라서 이 프로토콜은 망막 세포의 연구 응용 분야에 적합한 대체 이미징 접근 방식을 도입하는 것을 목표로 합니다. AAV 매개 세포 유형 특이적 라벨링의 힘과 CSLO 이미징의 비침습적 특성을 결합합니다. 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 면역원성이 낮고 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포를 포함한 광범위한 세포 유형을 형질도입할 수 있는 능력으로 알려진 다재다능한 유전자 전달 벡터입니다11. 따라서 복잡한 망막 환경 내에서 특정 세포 집단을 표적으로 삼는 데 이상적인 도구입니다. 엄선된 혈청형 및 promoter와 함께 AAV 벡터를 활용함으로써, 망막 신경절 세포(recc s) 및 Müller glia와 같은 여러 관심 세포 유형에서 형광 단백질의 선택적 발현을 달성할 수 있습니다. 예를 들어, AAV2는 망막 신경절12,13에서 더 높은 형질도입 효율로 알려져 있는 반면, AAV8은 광수용체14를 표적으로 하는 데 현저하게 효과적이며, AAV9는 Müller 신경교세포15에서 강력한 형질주입 능력을 보여주어 다양한 망막 세포층에 걸쳐 광범위한 효율성을 보여줍니다. AAV의 효과는 혈청형의 선택뿐만 아니라 transgene 발현의 강도와 세포 특이성을 결정하는 promoter에 의존한다는 점에 유의하는 것이 중요하며, 이는 최적의 transduction을 달성하기 위한 신중한 선택의 중요성을 강조합니다.

망막 신경절 세포 라벨링을 위해 이 프로토콜은 인간 시냅신(hSyn) 프로모터와 함께 AAV2를 사용합니다. AAV2는 유리체강내 주사 후 망막 신경세포의 효율적인 형질도입을 나타내며(13), 유비쿼터스 뉴런 프로모터인 hSyn 프로모터는 이러한 세포 내에서 강력하고 특이적인 전이유전자 발현을 유도합니다16. Müller glia의 경우, 프로토콜은 GfaABC1D promoter17에 의해 구동되는 AAV9 벡터를 활용하며, 이는 이러한 세포15에서 강력한 transgene 발현을 보여줍니다. 이 표적 라벨링 접근 방식을 통해 연구원들은 이러한 세포를 주변 망막 조직과 구별하고 시간이 지남에 따라 추적할 수 있으며, 이는 망막 세포와 생물 환경 변화에 대한 반응에 대한 생체 내 감시를 위한 기초를 제공합니다.

컨포칼 주사 레이저 검안경(CSLO)은 살아있는 망막의 고해상도 이미지를 제공하는 비침습적 이미징 기술로, 형광 표지된 망막 세포 집단의 실시간 시각화를 가능하게 합니다 18,19,20. 집중된 레이저 빔이 망막을 스캔하여 핀홀을 통과하는 방출광을 포착하여 초점이 맞지 않는 신호를 제거함으로써 대비가 향상된 더 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 형질전환 표지된 망막 신경절 세포(transgenic labeled RGC21,22) 및 미세아교세포(microglia) 23을 시각화하는 연구를 포함하여 살아있는 동물의 망막 세포 이미징에 널리 사용되는 Heidelberg Spectralis CSLO 시스템을 활용합니다. 488nm 레이저와 적절한 필터를 갖춘 HRA CSLO 장치를 사용함으로써 연구자들은 형광 리포터 유전자를 운반하는 AAV 벡터의 유리체강내 주입 후 살아있는 동물에서 형광 표지된 망막 신경절 세포 또는 뮐러 신경교세포를 이미지화할 수 있습니다. 중추 망막과 말초 망막을 모두 다루는 주간 세션이 있는 종단 이미징 프로토콜은 시간 경과에 따른 변화를 추적합니다. 동물 복지를 우선시하기 위해 이 프로토콜은 HRA CSLO 장치의 자동 시선 추적 시스템(ART)을 활용하여 전신 마취나 콘택트렌즈 없이도 정밀한 이미지 획득을 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 AAV와 CSLO의 결합된 힘을 활용하여 생체 내에서 특정 망막 세포 유형의 종단 모니터링을 가능하게 합니다. AAV 매개 표지의 세포 유형 특이성과 CSLO의 비침습적 고해상도 이미징 기능을 결합함으로써 이 방법을 통해 연구자들은 다양한 자극 또는 중재에 대한 반응으로 망막 신경절 세포와 뮐러 신경교세포의 동적 변화를 연구할 수 있습니다. 이러한 통찰력은 망막 질환에 대한 새로운 진단 및 치료 전략의 개발에 정보를 제공하는 데 중요한 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 베이징 캐피탈 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 4주 된 성인 수컷 C57BL/6J 마우스(체중 15-20g)를 모든 실험에 사용했으며 12/12시간 라이트/다크 주기로 온도 조절이 가능한 방에 보관했습니다. 표준 설치류 차우와 물은 자유자재로 사용할 수 있었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. AAV 매개 망막 세포 형질주입

참고: 망막 신경절 세포의 표적 형질도입을 위해 이 프로토콜은 hSyn 프로모터를 통합하여 향상된 GFP의 강력한 발현을 유도하는 AAV2-hSyn-eGFP를 사용합니다. Müller glia는 AAV9-GfaABC1D-eGFP를 사용하여 표적화됩니다. 최적의 transduction efficiency와 강력한 transgene 발현을 달성하기 위해 마우스13의 유리체강내 주사에 대해 1 x 1012 바이러스 게놈(vg)/mL의 최소 AAV 역가가 권장됩니다.

  1. AAV 매개 망막 세포 형질 주입 절차를 수행할 때 우발적인 노출을 방지하고 안전한 작업 환경을 보장하기 위해 엄격한 안전 프로토콜을 준수합니다.
  2. 인증된 생물안전성 작업대(BSC) 내에서 바이러스 벡터와 관련된 모든 절차를 수행합니다. 시술 기간 동안 실험실 가운, 장갑, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 직원에게 제공하십시오.
  3. 규정 준수를 유지하고 모든 실험실 직원을 보호하기 위해 기관 안전 프로토콜에 따라 모든 날카로운 물건과 생물학적 위험 물질을 적절하게 폐기하십시오.

2. 바이러스 벡터 및 동물의 준비

  1. -80°C에서 저장된 AAV2-hSyn-eGFP 또는 AAV9-GfaABC1D-eGFP 벡터를 얻습니다. 바이러스 무결성을 보존하기 위해 사용하기 직전에 얼음 위에서 벡터를 해동합니다.
  2. 50 mg/kg의 복강내 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 추가 조치를 취하기 전에 뒷발 반사를 테스트하여 마취 깊이를 확인하십시오.
  3. 시술 중 수술 부위에 방해가 되지 않도록 수염을 다듬습니다. 20% 포비돈 요오드 용액으로 안와를 2초 동안 소독한 다음 멸균 생리식염수로 철저히 헹굽니다.
  4. 0.5% 프로파라카인 한 방울을 국소적으로 바르면 불편함을 최소화하고 불수의성 안구 운동을 방지할 수 있습니다.

3. 바이러스 벡터의 취급 및 유리체강내 주입

  1. 선택된 AAV 용액(AAV2-hSyn-eGFP 또는 AAV9-GfaABC1D-eGFP) 1μL를 깨끗하고 사전 냉각된 파라핀 필름 조각으로 옮겨 바이러스 활성에 영향을 줄 수 있는 온도 변동을 방지합니다.
  2. 안과 수술용 현미경 아래에서 33G 베벨 바늘이 있는 Hamilton 유리 주사기를 사용하여 AAV 용액을 흡입합니다.
  3. 현미경 아래에 마우스를 복부 누운 상태로 놓습니다. 머리를 약간 기울여 주사를 위한 안구 쪽을 들어 올립니다. 현미경의 배율을 조정하고 최적화하여 마우스 궤도의 상위 영역을 명확하게 식별합니다.
  4. 눈의 상공막 가장자리에 있는 윤부 뒤쪽 1-2mm 후방의 바늘을 유리체강에 삽입합니다. 역류 또는 압력으로 인한 손상을 방지하기 위해 AAV 용액을 천천히 주입합니다.
    참고: 주사 부위 위치: 윤부에서 약 1mm 뒤쪽에 있는 눈의 상측두사분면에 주사를 수행합니다. 주요 혈관을 피하고 렌즈 손상 위험을 최소화하려면 이 위치를 선택하십시오. 홍채 침투 또는 렌즈 마모를 방지하기 위해 가장자리에 너무 가까운 주사 부위를 피하십시오. 혈관 구조 피하기: 주사 전에 작동 현미경을 사용하여 계획된 주사 부위에 보이는 혈관이 있는지 주의 깊게 검사합니다. 선박이 있는 경우 진입점을 약간 조정하여 선박을 피하십시오. 바늘을 홍채와 평행한 얕은 각도로 삽입하면 혈관 손상의 위험을 더욱 줄일 수 있습니다. 망막하 출혈의 위험을 줄이기 위해 같은 부위에 반복적으로 주사하지 마십시오.
  5. 바늘을 30초 동안 제자리에 유지하여 벡터가 유리체 챔버 내에서 분산되어 망막 표면에 정착할 수 있도록 함으로써 성공적인 transduction의 가능성을 극대화합니다.
  6. 유리체 역류의 위험을 최소화하기 위해 바늘을 천천히 빼십시오.
  7. 주사 직후 주사 부위에 국소 항생제 연고를 바르십시오. 연고가 안구 표면을 완전히 덮을 수 있도록 균일하게 도포되어 안구 감염 및 염증을 예방하십시오.
    참고: 항생제 연고에는 덱사메타손 1mg/g, 네오마이신 황산염 3500IU/g 및 폴리믹신 B 황산염 6000IU/g이 포함되어 있습니다.
  8. 마취에서 회복하는 동안 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열 패드에 올려 놓고 고통이나 이상의 징후가 있는지 면밀히 모니터링합니다. 완전히 회복되고 합병증이 나타나지 않으면 정상적인 음식과 물을 섭취할 수 있는 케이지로 되돌려 보냅니다.

4. CSLO를 사용한 생체 내 이미징

  1. 동물 준비
    1. 유리체강내 주사 4주 후 AAV2-hSyn-eGFP 또는 AAV9-GfaABC1D-eGFP에 감염된 마우스를 선택합니다. 0.5% 트로피카마이드와 0.5% 페닐에프린이 함유된 눈 용액 한 방울을 눈 표면에 바르면 동공이 약 2mm 직경으로 확장됩니다22.
      참고: 유리체강내 주사 후 최적의 망막 세포 형광 표지를 위해 최소 4주의 AAV 형질 주입 시간 간격이 권장됩니다13. 또한, 우리의 시신경 파쇄(ONC) 실험에서 망막은 감염 후 4주와 파쇄 손상 후 7일과 14일에 영상화되었습니다. 이 시점은 초기 AAV 발현과 ONC 후 망막 변화의 진행을 모두 포착하기 위해 선택되었습니다.
    2. 작업 과정에서 동물 배설물이 오염될 수 있는 것을 방지하기 위해 이미징 플랫폼을 깨끗한 패드 조각으로 덮으십시오.
      참고: 맞춤형 이미징 플랫폼은 동물이 엎드려 눕을 수 있는 충분한 공간을 제공하여 안정성을 보장하고 수동 구속 시 움직임을 최소화하여 최적의 이미지 획득을 가능하게 합니다.
    3. 마우스를 이미징 플랫폼으로 조심스럽게 옮기고 이미징 전에 2-5분의 순응 기간을 허용하여 스트레스를 최소화하고 이미징 환경에 쉽게 적응할 수 있도록 합니다.
    4. 두 번째 기술자의 도움을 받아 시술 내내 의식 상태를 유지하면서 동물을 부드럽게 제지하십시오. 15초 촬영 후 10초의 휴식 간격을 제공하여 눈을 깜박이고 각막의 수분을 유지합니다.
      알림: 두피 피부를 부드럽게 문질러 눈꺼풀이 자연스럽게 들리도록 유도하고, 강제로 눈꺼풀을 고정하거나 클립과 같은 추가 장치의 사용을 피하여 눈 부상의 위험을 줄입니다. 전신 마취는 일시적인 렌즈 불투명도를 악화시킬 가능성이 있으므로 장시간 이미징 세션 동안 광학적 선명도를 유지하기 위해 사용되지 않습니다. 시술 전반에 걸쳐 고품질 이미지 획득과 동물의 편안함 및 안전의 균형을 유지합니다. 동물의 복지를 보장하고 영상 품질을 유지하기 위해 5분 이내에 전체 절차를 완료하십시오.
    5. 초점 노브(그림 1B)와 마이크로 매니퓰레이터(그림 1C)를 미세 조정하여 후속 생체 내 이미징을 위한 관심 영역(ROI)을 조준하여 머리 자세를 조정하고 카메라 렌즈를 정렬합니다.
  2. 시스템 구성
    1. 카메라에 비접촉식 55° 광각 렌즈를 부착하여 안저 영역의 시야를 확장합니다.
    2. 필터 휠을 A (혈관 조영술) 위치로 설정하여 적외선(IR) 및 형광 혈관 조영술(FA) 이미징 모드를 획득할 수 있습니다(그림 1A). 레이저와 전원 공급 장치를 켜서 CSLO 이미징 시스템을 활성화합니다.
    3. Heidelberg Eye Explorer 소프트웨어를 열고 메뉴 표시줄 상단의 새 환자 아이콘을 클릭하여 새 검사를 만듭니다. 관련 동물 정보를 입력하고 팝업 창에서 기본 각막 곡률인 7.7mm를 수락합니다.
    4. 제어판 화면에서 노란색 시작 버튼(그림 1E)을 선택하여 라이브 이미징 모드를 시작합니다.
  3. 생체 내 CSLO 이미징
    1. 제어판에서 820nm 여기 파장에서 자동 형광이 있는 IR 모드(그림 1G)를 선택합니다. 고해상도 이미징을 달성하기 위해 High Res. (HR) 모드는 창 인터페이스 또는 수동 제어판을 통해 활성화됩니다(그림 1F).
      참고: 적외선 반사(IR) 이미징은 일반적으로 CLSO 안과 이미징의 첫 번째 단계로, 플루오레세인 혈관 조영술(FA) 전에 획득하여 기준선 보기를 제공합니다. 조명, 최소한의 아티팩트, 주요 망막 혈관에 대한 선명한 초점조차도 z-plane focusing의 신뢰성과 고품질 IR 이미지를 달성하는 데 매우 중요합니다.
    2. 미세 조정을 위해 XYZ-micromanipulator가 있는 조이스틱을 사용하여 렌즈를 마우스 눈 쪽으로 이동합니다. 광학적 투명도를 검사하고 감도 노브(그림 1D)를 시계 반대 방향으로 돌려 안저 이미지의 밝기를 40%-60%로 줄여 안저의 과다 노출을 방지하고 망막 세부 사항의 시각화를 향상시킵니다.
    3. 시신경 디스크와 망막 혈관이 안저에서 명확하게 식별될 때까지 초점 손잡이와 미세 조작기를 조정합니다.
      참고: 최적 초점면의 기준: (1) 어두운 모서리가 없는 균일하게 조명된 안저 시야. (2) 초점 어두운 점이나 왜곡이 없는 광학 디스크 주변의 균일한 조명. (3) 혈류의 눈에 띄는 움직임과 함께 큰 망막 혈관의 명확한 내강 모양.
    4. 여기 파장이 488nm인 고체 청색 레이저와 500nm의 배리어 필터를 사용하여 FA 모드(그림 1H)로 전환합니다. 감도 노브(그림 1D)를 시계 방향으로 돌려 안저 이미지의 밝기를 50%-107%로 높여 대상 망막 영역을 비춥니다.
    5. ART 평균값(소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 하단에 있는 파란색 막대)을 15 이상으로 설정하여 신호 대 잡음 비율을 높입니다. 이 기능은 동일한 위치에서 획득한 일련의 B 스캔의 평균을 계산하여 이미지 품질을 향상시킵니다.
      참고: ART 평균 값이 높을수록 일반적으로 평균화를 통해 이미지 품질이 향상되지만 스캔 시간도 연장됩니다. 이렇게 오랜 시간이 길어지면 각막 탈수 및 동물 피로의 위험이 잠재적으로 증가할 수 있으며, 특히 깨어 있는 동물 이미징에서 신중하게 고려해야 하는 요인입니다.
    6. 망막의 내면에 재정렬하고, 특히 망막 신경절 세포(RGC) 또는 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)를 발현하는 GFP를 표적으로 합니다. 망막 신경절 세포체(RGC soma) 및 축삭돌기(axons) 또는 뮐러(Müller) 세포체와 같은 원하는 세포 집단의 선명한 조명을 보장하기 위해 미세 조정이 이루어집니다. 이미징 감도는 최적의 시각화를 달성하고 GFP 양성 세포의 과포화를 방지하기 위해 균형을 이룹니다.
      참고: GFP 신호의 비슷한 선명도와 밝기를 가진 이미지를 얻으려면 실험의 모든 마우스에 대해 감도 획득이 일정해야 합니다.
    7. 감도 노브(그림 1D)를 눌러 온라인에서 실시간 평균 이미지를 생성하는 ART 모드를 시작합니다. 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 하단에 있는 파란색 막대(ART 평균값을 나타냄)가 설정된 ART 값(≥ 20프레임)에 도달할 때까지 기다렸다가 제어 인터페이스에서 Acquire 버튼을 눌러 안저 이미지를 캡처합니다.
      참고: ART 모드의 경우 시선 추적이 통합되어 생체 내 이미징 중 사소한 안구 움직임을 자동으로 보정하여 선택한 망막 초점면에서 일관된 초점을 맞출 수 있습니다.
    8. 원하는 이미지를 획득하면 터치 패널의 감도 노브를 눌러 ART 모드를 종료합니다.
      참고: 각막의 건조를 방지하고 자발적인 눈 깜박임을 허용하기 위해 이미징 과정에서 15초마다 10초의 휴식을 취했습니다.
    9. 코 및 측두 망막 영역을 탐색하려면 카메라 헤드를 수평으로 움직이면서 화면의 라이브 이미지를 관찰합니다. 대상 영역에 도달하면 초점을 미세 조정하고 2.3.1-2.3.8 단계에 설명된 대로 이미징 프로세스를 시작합니다.
      참고: 느리고 통제된 카메라 움직임을 유지하면서 안저의 일관되고 밝은 조명을 보장합니다. 어두운 영역이 나타나면 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 카메라 위치를 수직으로 조정하고 망막의 중심을 다시 잡습니다.
    10. 상망막을 이미지화하려면 마우스 머리의 자세를 앞면이 위로 향하도록 부드럽게 조정합니다. 카메라 헤드를 위쪽으로 적당히 기울여 상망막 영역에 맞춥니다. 필요에 따라 초점을 다시 조정하고 이미징을 진행합니다.
    11. 이미징이 완료되면 원하는 모든 망막 영역이 획득 창을 종료하고 이미지가 자동으로 저장됩니다. 각막의 수분을 유지하기 위해 영상화된 눈에 국소 윤활제를 바르십시오.
    12. 반대쪽 눈의 검사를 시작하려면 동물을 플랫폼 반대편으로 재배치하고 2.3.1-2.3.11 단계를 반복합니다.

5. 이미지 처리 및 분석

  1. 이미지 내보내기 및 준비
    1. Heidelberg Eye Explorer 소프트웨어를 열고 원하는 CSLO 이미징 세션을 좋은 품질로 선택합니다. 시간이 지남에 따라 일관된 감도 설정으로 동일한 망막 위치의 단일 또는 연속 이미지를 선택합니다.
    2. 초점이 좋지 않거나 각막의 선명도가 떨어지는 흐릿한 이미지를 제외하여 망막 구조가 선명하게 시각화된 이미지만 분석에 사용되도록 합니다. 추가 처리를 위해 이러한 이미지를 TIFF 형식으로 내보냅니다.
  2. 이미지 정렬 및 자르기
    1. 동일한 망막 영역을 기준으로 마우스 눈당 이미지를 그룹화합니다.
      참고: CSLO 시스템에서 획득한 원본 이미지는 크기가 1536 x 1536 픽셀, 해상도가 5.69um/픽셀, ART 값이 ≥15인 TIFF 형식으로 저장됩니다.
    2. 후속 검사를 위해 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어로 가져옵니다. 기준선 이미지의 방향과 일치하도록 필요에 따라 이미지를 회전하고 정렬합니다. 처리된 이미지를 저장하거나 내보낼 때 가능한 최고의 이미지 품질을 유지하는 설정을 사용하여 잠재적인 압축 아티팩트를 최소화합니다.
    3. 혈관 구조와 광학 디스크를 랜드마크로 사용하여 해당 기준선 이미지와 일치하도록 회전하여 동일한 눈의 시계열의 CSLO 이미지를 정렬합니다.
      참고: 정렬된 각 이미지를 주의 깊게 검사하고 자르기를 진행하기 전에 다음 기준을 충족하는지 확인하십시오: (1) 전체 망막 영역 캡처: 이미지는 시신경 디스크 및 주요 혈관과 같은 주요 랜드마크를 포함하여 의도된 관심 망막 영역을 완전히 포함해야 합니다. (2) 모션 아티팩트 부재: 이미지는 이미징 중 안구 움직임으로 인한 구조의 흐림, 줄무늬 또는 중복이 없어야 합니다. (3) 왜곡 최소화: 이미지는 이미징 각도나 렌즈 효과로 인해 발생할 수 있는 뒤틀림, 늘어남 또는 압박 아티팩트 없이 망막 구조를 정확하게 표현해야 합니다. (4) 이미지 품질 메트릭의 균형: 배경 소음 수준 평가(구조가 없는 영역에서 픽셀 강도의 표준 편차 < 5(0-255 스케일)); 신호 대 잡음비(SNR>20), 조명 일관성(6개 이미지 사분면 간의 변동 계수<10%) 및 이미지 균일성(균질 영역의 변동 계수<15%)).
    4. 회전된 이미지를 선택하고 TIFF 형식으로 내보냅니다. 각 시점에 대해 자르기 도구를 사용하여 품질이 승인된 이미지에서 GFP 양성 세포가 포함된 5-10개 영역(각각 300 x 300픽셀)을 무작위로 선택하고 자릅니다. 추가 분석을 위해 자른 각 이미지를 TIFF 형식으로 개별적으로 내보냅니다.
  3. 형광 강도 측정
    1. 자른 CSLO 이미지(8비트 그레이스케일, 300 x 300 픽셀)를 ImageJ/Fiji에서 엽니다.
    2. 형광 신호의 전반적인 변화를 검사하려면 Analyze > Measure (또는 Ctrl + M)를 사용하여 자른 이미지당 총 형광 강도를 측정합니다. 자른 전체 이미지의 평균 GFP 형광 강도를 나타내는 "Mean" 값을 기록합니다.
  4. 망막 신경절 분석기(RGC) 정량화
    1. ImageJ/Fiji에서 Image > Adjust > Brightness/Contrast 를 사용하여 자른 CSLO 이미지의 강도 임계값을 조정하여 검은색 배경에 대해 개별 흰색 소마 바디를 최적으로 시각화합니다.
      참고: 잘린 이미지의 배치를 검토한 후 개별화된 임계값을 결정하거나 일관된 임계값 알고리즘을 적용합니다(예: ImageJ/Fiji의 Huang's method5 ). Huang의 방법 : (1) 이미지를 8 비트 그레이 스케일로 변환합니다 (이미지 > 유형 > 8 비트). (2) 임계값 설정 도구(이미지 > Adjust > Threshold)에 액세스합니다. (3) 임계값 방법으로 Huang 을 선택합니다. (4) 세분화를 미리 보고 적용을 클릭합니다. 임계값은 자동으로 계산되어 이미지 히스토그램에 표시됩니다.
    2. Cell Counter 플러그인을 활성화하고 각 GFP 양성 RGC soma를 클릭하여 계산합니다. 분석된 영역에 표시된 총 셀 수를 기록합니다. 각 후속 시점에서 자른 모든 이미지에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
  5. 데이터 분석
    1. 세포 수 및 형광 강도 데이터를 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어(예: GraphPad Prism)로 내보냅니다.
    2. 해당 실험 설계 및 가설을 기반으로 적절한 통계 테스트를 수행합니다. 결과를 해석하고 결론을 내립니다.

결과

제시된 프로토콜에 따라, AAV 매개 유전자 전달과 CSLO의 조합을 사용하여 다양한 망막 세포를 성공적으로 시각화하고 생체 내에서 추적했습니다. AAV2-hSyn-eGFP는 망막 신경절 세포를 효과적으로 형질전환하여 망막 전체에 걸쳐 강력한 eGFP 발현을 일으켰으며, 이는 CSLO에 의해 확인되었으며 신경절 세포층에서 특이적으로 발견되는 RGC 특이적 마커인 RNA 결합 단백질(RBPMS)과 공동 국소화되었습니다(그림 2 및 그림 3). 이 프로토콜은 또한 AAV9-GfaABC1D-eGFP를 사용하여 Müller glia를 표적으로 하는 능력을 확인했습니다. CSLO 시각화는 특히 내부 망막층 내에서 광범위한 eGFP 발현을 보여주었으며, 이는 Müller glia의 알려진 주요 분포 세그먼트와 일치합니다. GFP 양성 신호는 또한 Müller glia marker glutamine synthetase (GS)와 고도로 공동 국소화되어 이 접근법의 특이성을 더욱 확인했습니다(그림 2E, F 및 그림 3B). 이러한 발견은 다양한 망막 세포 유형을 연구하기 위한 AAV 보조 유전자 전달의 다양성을 재확인했습니다. Müller glia를 표적으로 하는 능력을 확인하기 위해 AAV9-GfaABC1D-eGFP를 사용했습니다. CSLO 영상은 특히 내부 망막층 내에서 광범위한 eGFP 발현을 보여주었으며, 이는 알려진 Müller glia의 분포와 일치합니다(그림 2E, F). 이 선택적인 발현 패턴은 GFP 신호와 Müller 신경교세포 마커 글루타민 합성효소(GS) 사이에서 관찰된 높은 수준의 공동 국소화에 의해 추가로 검증되었습니다(그림 3B).

망막 신경절 세포와 뮐러 신경교세포(Müller glia) 모두에 대한 바이러스 표적화 접근법의 특이성과 효율성을 정량화하기 위해 공동 국소화 분석을 수행하여 GFP 형광을 표준 세포 유형 마커와 비교했습니다(그림 3B, D). 총 6개의 마우스 눈을 분석했습니다. AAV2-hSyn-GFP를 표적으로 하는 망막 신경절 세포의 경우, 형질도입 효율은 64% ± 3%였고, 형질도입 특이도는 68% ± 3%였습니다. AAV9-GfaABC1D-GFP로 표적으로 하는 Müller 신경교세포의 경우, 형질도입 효율은 58% ± 2%였고, 형질도입 특이도는 71% ± 2%였습니다. 이러한 결과는 이 AAV 매개 유전자 전달 접근법이 고유한 망막 세포 유형의 선택적 표지를 가능하게 하여 망막의 세포 및 분자 과정을 연구하기 위한 다양성을 강조한다는 것을 보여줍니다.

망막 세포 섭동의 종단 모니터링에 대한 CSLO의 적합성을 평가하기 위해 AAV2-hSyn-eGFP에 감염된 마우스에서 일시적인 ONC 모델을 수행했습니다. eGFP 신호 및 망막 신경절 세포의 수가 2주 동안 점진적으로 감소하는 것이 관찰되었습니다(그림 4). 망막 신경절 세포의 생존율은 CSLO 형광 강도, CSLO 이미지에 대한 생체 내 세포 수, RBPMS 양성 세포의 생체 외 망막 신경절 세포(ex vivo RGC) 수의 세 가지 지표로 정량화되었습니다. 4단계에서 설명한 대로 이미지 처리 후 각 망막(총 6개의 눈)에서 최소 10개의 관심 영역(ROI)을 잘라내어 각 ROI가 동일한 망막 위치를 포함하고 각 시점에서 명확한 세포 신호를 나타내도록 했습니다. 그런 다음 CSLO 형광 강도는 각 시점에서 각 자른 ROI 내의 평균 강도를 측정하여 정량화했습니다. in vivo에서는 각 시점에서 동일한 자른 ROI 내에서 개별 GFP 양성 망막 신경절 세포를 수동으로 계수하여 세포 수를 얻었습니다. 마지막으로, RBPMS 면역염색을 위해 망막을 적출하고, 각 망막에 대해 망막 섹터별로 이미지화된 24개의 정의된 영역 내에서 RBPMS 양성 세포를 계수했습니다. 세 가지 망막 신경절 세포 생존 지표(CSLO 형광 강도, 생체 내 세포 수, 생체 외 RBPMS 양성 세포 수) 모두와 ONC 후 시간(모두 p < 0.001, 그림 4C) 간에 유의미한 음의 상관관계가 발견되었으며, 이는 진행성 망막 신경절 소실 및 퇴행을 보여주었습니다. 중요한 것은 초기 망막 신경절 세포 밀도 또는 감소율 측면에서 서로 다른 실험 그룹에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다는 점이며, 이는 ONC 모델 및 이미징 접근 방식의 전반적인 일관성을 나타냅니다. 이러한 결과는 ONC 후 망막 신경절 손상에 대한 이전 연구와 일치하며, 망막 신경절 질환 건강을 모니터링하기 위한 비침습적이고 신뢰할 수 있는 도구로서 이 CSLO 기반 프로토콜의 효과를 입증합니다.

시각 경로 내에서 망막 신경절 세포(RGC) 축삭돌기를 추가로 조사하기 위해, AAV 매개 eGFP 라벨링과 전행성 추적자 콜레라 독소 소단위 B(CTB)의 조합과 함께 이중 라벨링 접근법을 사용했습니다24. 생쥐는 CTB의 유리체강내 주사를 맞았고 2일 후 조직학적 분석을 위해 희생되었습니다. 시신경에서 eGFP 및 CTB 신호의 공동 국소화는 망막 절막 절 축삭의 긍정적인 추적을 확인했습니다(그림 5A). 축삭 손상 후 신호의 변화를 추가로 연구하기 위해 마우스는 급성 망막 신경절 손상 모델인 편측성 시신경 파쇄(ONC)를 받았습니다25. 간단히 말해서, 생쥐를 마취하고 한쪽 시신경을 노출시키고 5초 동안 미세한 집게를 사용하여 지구 뒤에서 약 1mm 떨어진 곳에서 분쇄하여 상당한 망막 절막 절개 절개술과 그에 따른 퇴행을 유도했습니다. ONC 손상 후 eGFP와 CTB 강도의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이는 상당한 신경 섬유 손실과 축삭 수송 중단을 나타냅니다. 뇌 단면에 대한 추가 분석을 통해 감각 운동 통합 및 안구 운동에 관여하는 중뇌 구조인 상구(SC)와 시각 피질에 대한 시각 정보의 주요 중계 센터인 외측 외상핵(LGN)에 대한 망막 신경절 투영이 밝혀졌습니다. ONC 후, 부상의 반대쪽 측면에서 GFP 강도 감소가 나타났습니다(그림 5B-E). 이러한 결과는 망막 신경절 축삭 변성을 연구하고 생체 내에서 투영 패턴을 매핑하는 데 이 방법의 유용성을 보여주며, 기존의 침습적 추적 방법에 대한 잠재적인 대안을 제공합니다.

figure-results-1
그림 1: 실시간 망막 이미징을 위한 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(CSLO) 이미징 시스템 및 제어판 인터페이스.(A-D) 이미징 시스템 구성 요소: 이 이미지는 HRA CSLO 장치의 주요 구성 요소를 나타냅니다. (A) 필터 레버는 적외선 반사(IR) 및 플루오레세인 혈관 조영술(FA) 이미징을 결합한 경우 "A" 위치로 설정됩니다. (B) 초점 손잡이는 대물 렌즈의 미세 초점을 조정합니다. (C) 마이크로 매니퓰레이터는 여러 자유도(예: X, Y, Z축) 및 회전을 통해 망막에 대한 광선의 정확한 위치, 정렬 및 조명을 가능하게 합니다. (D) 감도 노브는 감지된 광 신호의 증폭을 조정하여 IR 및 FA 이미지의 밝기를 제어합니다. 노브를 누르면 이미지 평균화가 시작되어 여러 프레임을 결합하여 노이즈를 줄이고 신호 대 노이즈 비율을 향상시킵니다. (E-H) 제어판 인터페이스: 스크린샷에는 라이브 이미지 획득 및 시각화에 사용되는 설정이 포함된 CSLO 제어판이 표시됩니다. (E) 획득 제어 패널이 시작됩니다. (F) 최적의 이미지 품질을 위해 고해상도 모드를 사용하는 것이 좋습니다. (G) IR 이미징 설정이 강조 표시되어 망막 구조와 혈관을 시각화할 수 있습니다. (H) FA 이미징 설정은 단일 포인트 및 멀티 포인트 형광 이미징에 대한 옵션을 표시하여 망막 세포 내에서 형광 신호를 감지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: C57 마우스에서 AAV transfection 후 형광 표지된 망막 세포의 In vivo CSLO 이미징. (A) 마우스 눈에서 AAV 형질 주입 후 CSLO 보조 종단 이미징의 실험 타임라인. (B) AAV2-hSyn-eGFP 발현 4주 후 C57 마우스 망막의 상부 및 중심 영역의 대표적인 CSLO 이미지. 눈금 막대: 500 μm. (C) (B)의 수동으로 스티칭된 망막 몽타주는 eGFP 발현 망막 세포의 분포를 보여줍니다. 눈금자: 500 μm. (D) (C)의 박스 영역의 확대된 CSLO 이미지와 망막 플랫마운트의 해당 컨포칼 현미경 이미지. 망막 신경절 세포(RGC marker RBPMS, 빨간색)와 eGFP(녹색)의 공동 국소화(colocalization)는 망막 신경절 세포(예: 동그라미)에서 AAV 매개 발현을 확인합니다. 스케일바: 50 μm. (E) AAV9-GfaABC1D-eGFP로 주입한 후 4주 후에 C57 마우스 망막의 수동 스티칭 몽타주로, Müller 신경교세포 특이적 eGFP 발현을 보여줍니다. 스케일 바: 500 μm. (F) (E)의 박스 영역의 확대된 CSLO 이미지와 망막 플랫마운트의 해당 컨포칼 현미경 이미지. eGFP(녹색)와 Müller 신경교세포 마커 글루타민 합성효소(GS, 빨간색)의 공동 국소화는 Müller 신경교세포(예시는 동그라미로 표시)에서 AAV 매개 발현을 확인합니다. 눈금 막대 : 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 마우스 망막에서 AAV 매개 유전자 전달의 세포 유형 특이성. (A) AAV2-hSyn-eGFP 감염 4주 후 C57 마우스의 망막 단면 및 플랫마운트의 면역조직화학. GFP(녹색)와 RBPMS(빨간색)의 공동 국소화는 망막 절막 세포 특이적 발현을 확인합니다. 스케일 바: 50 μm. (B) 망막 신경절 세포에서 AAV2-hSyn-GFP 형질 전환 효율 및 특이성의 정량화. 효율은 망막 편평한 산에서 GFP를 발현하는 RBPMS 양성 망막 신경절 세포의 백분율로 표시됩니다. 특이도는 망막 부분(n = 4마리의 마우스에서 6개의 눈)에서 RBPMS에 대해서도 양성인 GFP 양성 세포의 비율로 표시됩니다. (C) AAV9-GfaABC1D-eGFP 감염 4주 후 C57 마우스의 망막 단면 및 플랫마운트의 면역형광 염색. GFP(녹색)와 GS(빨간색)의 공동 국소화는 Müller 신경교세포 특이적 발현을 확인합니다. 스케일 바: 50 μm. (D) Müller glia에서 AAV9-GfaABC1D-GFP 형질 주입 효율 및 특이성의 정량화. 효율성은 망막 플랫마운트에서 GFP를 발현하는 GS 양성 뮐러 신경교세포(Gs positive Müller glia)의 백분율로 표시됩니다. 특이도는 망막 부분에서 GS에 대해서도 양성인 GFP 양성 세포의 비율로 표시됩니다(n = 3마리의 마우스에서 6개의 눈). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: AAV2-hSyn-eGFP 마우스에서 급성 시신경 파쇄(ONC) 후 망막 신경절 세포(RGC) 생존에 대한 종단 CSLO 모니터링. (A) AAV 감염 후 급성 시신경 손상의 실험 타임라인에 대한 개략도. (B) 기준선, 7일 및 ONC 후 14일에서 AAV2-hSyn-eGFP 마우스의 동일한 망막에 대한 종단 CSLO 이미징, GFP 신호를 발현하는 망막 신경절 세포를 시각화합니다. 상자 영역의 확대된 이미지가 오른쪽에 표시되며, 망막 신경절 세포의 형태 및 분포를 보여주는 망막 플랫마운트의 대표적인 컨포칼 현미경 이미지도 함께 표시됩니다. 스케일 바: 100 μm. (C) 기준선(평균 ± SEM)에 대한 세포 수와 CSLO 형광 강도의 백분율 변화를 측정하여 ONC 후 2주 동안의 망막 신경절 생존율의 정량화를 평가했습니다. 각 시점에서 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다(일원 분산 분석). 선형 회귀 분석은 GFP 형광(r² = 0.945, p < 0.001), RBPMS 염색(r² = 0.888, p < 0.001), CSLO 세포 수(r² = 0.511, p < 0.001) 및 CSLO 형광 강도(r² = 0.7486, p < 0.001)를 기반으로 손상 후 시간과 망막 신경절 절막 세포 생존 지표 간에 유의한 음의 상관관계를 보여주었습니다. n = 6 마우스/그룹/시점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 시각 경로를 따라 망막 신경절 축삭 돌기의 AAV 지원 매핑. (A) AAV2-hSyn-eGFP 마우스의 시신경 한 쌍의 대표적인 형광 현미경 이미지, GFP 표지 망막 신경절 축삭돌기(녹색) 및 전성 축삭 추적자 콜레라 독소 B(CTB, 자홍색)와의 공동 국소화를 보여줍니다. 상단 패널은 전체 시신경에 대한 개요를 제공하고(스케일 바: 1000μm), 하단 패널은 박스형 영역(스케일 바: 100μm)을 확대하여 보여줍니다. ONC 손상 후 2주가 지나면 GFP와 CTB 신호 모두 시신경(왼쪽) 전체에서 현저한 감소를 보이며, 이는 망막 신경절 축삭 손실 및 시각 경로를 따른 장애를 나타냅니다. (B) 상구(superior colliculus, SC)에 대한 망막 신경절 축삭돌기(RGC axonal projections). ONC 2주 후 AAV2-hSyn-eGFP 마우스의 관상 뇌 절편은 SC 내에서 GFP 표지 망막 신경절 축삭돌기(녹색) 및 CTB 염색(자홍색)을 강조합니다. 왼쪽(왼쪽): 반대쪽 SC; 오른쪽(오른쪽): 동측 SC(ONC 부상 쪽). 눈금 막대 : 1000 μm. (C) (B)의 상자 영역의 확대 된 모습은 GFP 및 CTB 신호 (병합 이미지)의 공동 국소화를 보여 주며 SC 내 RGC 축삭 다발과 그 투영 패턴을 강조합니다. 눈금 막대 : 100 μm. (D) ONC 후 측면 외상 핵 (LGN)에 대한 망막 절막 절개 축삭 돌기, LGN 내에서 GFP 표지 RGC 축삭 (녹색) 및 CTB 염색 (자홍색)을 나타냅니다. 왼쪽(L): 반대쪽 LGN; 오른쪽(오른쪽): 동측 LGN(ONC 부상 쪽). 스케일 바: 1000 μm. (E) (D)의 박스형 영역을 확대한 모습은 망막 신경절 세포 다발과 LGN 내의 투영 패턴을 강조합니다. 눈금 막대 : 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

제시된 프로토콜은 AAV 매개 유전자 전달과 CSLO 이미징의 힘을 활용하여 특정 망막 세포 집단의 생체 내 감시를 위한 강력하고 접근 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공하여 생리학적 또는 병리학적 조건에서 망막 세포 역학 및 손상 또는 질병에 대한 반응에 대한 종단 연구를 용이하게 합니다.

이 방법의 성공 여부는 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 최적의 AAV transduction efficiency를 달성하는 것은 타겟 세포 집단에서 형광 리포터의 강력하고 특이적인 발현을 위해 매우 중요합니다. 이는 AAV 혈청형 선택, 바이러스 역가 및 주입 기술과 같은 요인의 영향을 받을 수 있습니다 13,15,16. 둘째, CSLO 이미징 중 적절한 동물 취급 및 제지는 모션 아티팩트를 최소화하고 이미지 품질을 유지하는 데 필수적입니다. 맞춤형 이미징 플랫폼을 사용하고 전신 마취를 피하면 망막 구조를 명확하고 일관되게 시각화하는 데 도움이 됩니다. 셋째, 최소한의 노이즈와 최적의 신호 대 노이즈 비율26으로 고해상도 이미지를 얻기 위해서는 초점, 감도 및 평균 설정을 포함한 CSLO 이미징 매개변수의 신중한 최적화가 필요합니다. 마지막으로, 잠재적인 한계를 해결하고 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 연구 설계에서 엄격한 이미지 품질 관리 조치를 구현하고 동물 수를 늘렸습니다.

Spectralis HRA CSLO 시스템은 임상 종방향 이미징을 향상시키는 자동 시선 추적 기능을 갖추고 있습니다. ART(Automatic Real-Time) 추적 기능은 이미징 중에 특정 망막 영역을 고정하여 모션 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 인간 임상 이미징을 위해, 이 시스템은 또한 동일한 해부학적 망막 위치(27)를 장기간 추적하기 위한 알고리즘을 포함한다. 그러나 이러한 기술은 인간과 설치류의 눈 사이에 상당한 해부학적 차이로 인해 설치류 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 설치류의 눈은 훨씬 작고(인간의 경우 24mm에 비해 직경이 3-4mm) 황반과 같은 특정 랜드마크가 없기 때문에 자동 추적에 고유한 문제가 있습니다28. 결과적으로, 설치류 모델을 연구하는 연구자들은 주로 혈관 패턴 및 시신경두와 같은 해부학적 랜드마크를 사용하여 특정 망막 영역을 찾고 세션13,22에 걸쳐 일관된 이미징 평면을 유지하는 수동 방법에 의존합니다. 이 접근 방식은 설치류 눈의 랜드마크가 제한적일 뿐만 아니라 실험적 조작으로 인한 잠재적인 상당한 망막 변화로 인해 이러한 특정 문제를 위해 설계되지 않은 자동화 시스템을 혼란스럽게 할 수 있기 때문에 필요합니다. 따라서 설치류 망막 이미징을 위한 특수 시선 추적 및 정렬 알고리즘을 개발하는 것은 중요한 미래 방향을 나타냅니다. 특히, 소형 동물 사용에 대한 장기 추적 알고리즘을 조정하면 종단 연구의 정밀도와 재현성을 크게 향상시킬 수 있습니다.

기존의 조직학적 기법은 동물 희생이 필요하고 종단 연구를 배제하지만, 이 AAV 지원 CSLO 이미징 방법은 생체 내에서 망막 세포 역학을 모니터링하기 위한 비침습적 접근 방식을 제공합니다. 이 접근 방식은 특히 형질전환 형광 단백질 라벨링 19,21,22,29를 사용하는 동물 모델에서 손상 후 특정 망막 세포의 종적 변화를 추적하기 위한 cSLO 이미징의 유용성을 입증하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 연구는 세포 사멸, 생존, 잠재적으로 이동 또는 프로세스 아웃을 포함하여 생체 내에서 다양한 망막 세포 이벤트를 시각화하는 CSLO의 능력을 강조했습니다. 이 프로토콜은 특정 망막 세포 집단의 AAV 매개 형질도입을 연구하기 위해 이 기술의 적용을 확장하여 망막 내 AAV 전달 및 전이유전자 발현의 장기적인 효과를 모니터링하고 망막 질환의 진행과 치료 개입의 효능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. OCT를 사용한 현재의 임상 평가는 주로 망막 신경 섬유층 두께를 측정하여 망막 신경절 세포의 축삭 소실에 초점을 맞추고 있지만, 9 이러한 평가는 개별 망막 신경절 세포의 형태나 신경교세포의 관여를 평가하기 위한 해상도가 부족하다. AO-SLO는 살아있는 인간 망막10에서 세포 수준의 이미징을 가능하게 하지만, 그 복잡성과 제한된 가용성은 주로 연구 환경에서 사용하는 데 제약이 있습니다. 또한, AO-SLO 내에서 신경교세포 유형을 구별하기 위해서는 종종 추가적인 표지 방법이 필요합니다30. 이 방법은 시간이 지남에 따라 개별 망막 신경절 세포와 기타 형광 표지된 망막 세포 집단을 시각화하고 추적하기 위한 보다 포괄적이고 접근 가능한 접근 방식을 제공함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이는 다양한 조건에서 세포 반응을 조사할 수 있는 길을 열어 표적 치료법의 개발을 지원합니다. 또한, AAV 보조 CSLO 이미징과 광유전학31 또는 칼슘 이미징32을 결합하면 망막 세포 기능과 시각 처리, 회로 발달 및 재생에서의 역할에 대한 이해를 더욱 심화할 수 있습니다.

이 방법의 장점에도 불구하고 몇 가지 제한 사항 및 잠재적인 문제 해결 고려 사항을 인정해야 합니다. AAV transduction efficiency의 가변성이 발생할 수 있으며, 이로 인해 특정 세포 유형 또는 실험 조건에 대한 주입 파라미터 또는 바이러스 역가의 최적화가 필요합니다. CSLO 이미징은 각막 혼탁, 눈물막 불안정성, 안구 움직임과 같은 요인의 영향을 받을 수 있으므로 이미지 획득 중에 신중한 모니터링과 조정이 필요합니다. 또한, CSLO의 제한된 침투 깊이는 내부 망막층으로의 시각화를 제한하여 광수용체와 같은 더 깊은 구조를 잠재적으로 배제할 수 있습니다33. Spectralis cSLO 시스템을 사용하면 망막34 내의 고유한 세포 특징과 패턴을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 이 이미징 방식은 특정 조건에서 단일 세포 관찰을 용이하게 할 수 있지만, 드문드문 라벨링된 Thy1-YFP 마우스22에서 개별 망막 신경절 세포를 시각화하는 이전 연구에서 입증된 바와 같이, 밀집된 라벨링 시나리오에서 개별 세포를 정량화하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 예를 들어, 이 연구에서 AAV 매개 망막 감염 후 eGFP로 망막 신경절 세포를 대량 표지하는 것은 특히 발현 수준과 세포 중복의 변화가 있는 영역에서 개별 세포의 명확한 시각화를 방해할 수 있습니다. 이 문제는 전체 망막 두께35에 걸쳐 있는 길쭉한 형태학으로 인해 cSLO를 사용하여 단일 초점면 내에서 단일 세포를 캡처하기 어렵기 때문에 Müller glia를 이미징할 때 더욱 복잡해집니다. 따라서 AAV9 매개 Müller 신경교세포 감염 효율의 평가는 주로 CSLO 이미징을 사용하여 전반적인 전달 패턴 및 분포를 평가하는 데 의존합니다.

또한 HRA 시스템의 ART 평균화는 이미지 품질을 향상시키지만, 증가된 스캔 시간은 특히 깨어 있는 동물 이미징에서 실질적인 한계를 나타냅니다. 선택된 ART 평균값 15는 이미지 품질과 스캔 시간의 균형을 유지하여 합리적인 스캔 시간을 유지하면서 충분한 노이즈 감소를 제공하는 것입니다. 동물의 불편함과 스트레스를 최소화하기 위해서는 이미징 절차를 최적화하여 효율성을 높이고, 깨어 있는 동물을 다루고 이미징하는 데 숙련된 훈련된 인력을 고용하고, 이미징 세션 전반에 걸쳐 동물의 불편함이나 각막 건조증 징후가 있는지 부지런히 모니터링해야 합니다. 이러한 조치는 데이터 품질과 동물 복지를 모두 보장하는 데 중요했으며, 깨어 있는 동물 모델에서 생체 내 망막 이미징에 대한 평균 ART 를 사용할 때 두 요소를 모두 고려하는 것이 중요하다는 점을 강조했습니다.

이러한 한계와 잠재적인 변동성 원인을 인식함으로써 연구자는 이미징 프로토콜을 최적화하고, 아티팩트를 최소화하고, 데이터의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위한 적절한 조치를 취할 수 있습니다.

전반적으로, 이 접근 가능하고 쉽게 구현할 수 있는 방법은 특히 부상이나 질병에 대한 반응으로 망막 신경절 세포와 뮐러 신경교세포(Müller glia) 사이의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있는 강력한 수단을 제공합니다. 연구자들이 이러한 동적 상호 작용을 시각화하고 정량화할 수 있도록 함으로써 이 접근 방식은 망막 병리학의 기저에 있는 새로운 세포 및 분자 메커니즘의 발견을 용이하게 합니다. 이는 차례로 표적 치료 전략의 개발과 개선된 질병 대책에 대한 실마리를 제공합니다.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82130029)의 보조금으로 지원되었습니다. 그림 2A 와 그림 4A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다 .

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
33 게이지 바늘Hamilton Corp., Reno, NV, USA7803-05유리체강 내 주사
0.5% 프로파라카인 공급자:Santen Pharmaceutical Co., Ltd.국소 마취제
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., 중국바이러스 역가: 2.7 x 1012 바이러스 게놈 (VG)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., 중국바이러스 역가: 4.5 x 1012 바이러스 게놈 (vg)/mL 
BetadineHealthy 의료 회사001651국소 방부제
각막 셀라 겸자 (이)Mingren Eye Instruments, 중국MR-F301A유리체 내 주사 중 눈꺼풀 안전
Dumont 05 # 집게FST51-AGT5385시신경 분쇄 Graphpad
프리즘 GraphPad프리즘, 미국그래프 도면 및 통계 분석
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, GermanyCSLO 이미징을 위한 "IR" 및 "FA" 모드
Image J/FijiNational Institutes of Health, USA이미지 처리
Maxitrol 항생제 연고Alcon Laboratories, INC. USA0065-0631국소 항생제
마이크로리터 주사기Hamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01유리체강 주사
Mydrin-P 안과 용액Santen Pharmaceutical Co., Ltd, 일본동공 확장
안과 수술 현미경 Leica AG, Heerbrugg, SwitzerlandM220외과 수술용
Pentorbarbitol SodiumSigma Aldrich, USA57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, USA이미지 정렬 및 자르기
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, 독일국소 윤활제 

참고문헌

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