컨포칼 스캐닝 레이저 검안경을 통한 맞춤형 아데노 관련 바이러스 혈청형을 이용한 망막 세포의 종단 생체 내 이미징

요약

이 프로토콜은 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(CSLO)을 사용하여 세포 특이적 표지 및 생체 내 이미징을 위한 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 사용을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 다양한 망막 세포 유형과 망막 기능 및 질병에 대한 기여도를 조사할 수 있습니다.

초록

망막 세포 과정의 역동적인 특성으로 인해 안구 질환에 대한 이해와 치료를 강화하기 위해 유전자 전달 및 실시간 모니터링 기술의 발전이 필요합니다. 본 연구는 최적화된 아데노연관바이러스(AAV) 접근법을 소개하며, 특정 혈청형과 프로모터를 활용하여 망막신경절세포(RGC) 및 뮐러신경교세포를 포함한 표적 망막 세포에서 최적의 transfection 효율을 달성합니다. 컨포칼 주사 레이저 검안경(CSLO)의 정밀도를 활용하여 이 연구는 AAV 매개 녹색 형광 단백질(GFP)의 종적 발현을 캡처하는 생체 내 이미징을 위한 비침습적 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 최종 절차의 필요성을 제거하여 관찰의 연속성과 피험자의 안녕을 보존합니다. 또한, GFP 신호는 상구(superior colliculus, SC) 및 외측 외상핵(lateral geniculate nucleus, LGN)으로 가는 시각 경로를 따라 AAV에 감염된 망막 신경절(RGC)에서 추적될 수 있으며, 이를 통해 직접적인 시각 경로 매핑을 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 발견은 상세한 프로토콜을 제공하고 망막 세포 행동, 질병 발병 기전 및 유전자 치료 중재의 효능에 대한 실시간 연구에 이 강력한 도구의 적용을 입증하여 살아있는 망막과 그 연결에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서론

망막은 중추신경계에서 유일하게 광학적으로 접근할 수 있는 부분으로, 신경과학 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 합니다¹. 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 시각 정보를 뇌에 전달하는 망막의 출력 뉴런으로, 시각 기능에 중요한 역할을 합니다. 이들의 상실 또는 기능 장애는 시각 장애와 돌이킬 수 없는 실명으로 이어지는데, 이는 녹내장과 다른 시신경병증에서 볼 수 있다². 망막의 주요 신경교세포(glial cell)인 뮐러아교세포(Müller glia)는 망막의 항상성을 유지하고, 뉴런에 구조적, 신진대사적 지원을 제공하며, 신경전달물질 수치를 조절하고, 망막 복구 및 재생에 기여하는 데 필수적이다³. 이들의 기능 장애는 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy)⁴, 노화 관련 황반변성(age-related macular degeneration)⁵, 안구 허혈 증후군(ocular ischemic syndrome)⁶ 등 다양한 망막 질환....

프로토콜

모든 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 베이징 캐피탈 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 4주 된 성인 수컷 C57BL/6J 마우스(체중 15-20g)를 모든 실험에 사용했으며 12/12시간 라이트/다크 주기로 온도 조절이 가능한 방에 보관했습니다. 표준 설치류 차우와 물은 자유자재로 사용할 수 있었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. AAV 매개 망막 세포 형질주입

참고: 망막 신경절 세포의 표적 형질도입을 위해 이 프로토콜은 hSyn 프로모터를 통합하여 향상된 GFP의 강력한 발현을 유도하는 AAV2-hSyn-eGFP를 사용합니다. Müller glia는 AAV9-GfaABC1D-eGFP를 사용하여 표적화됩니다. 최적의 transduction efficiency와 강력한 transgene 발현을 달성하기 위해 마우스¹³의 유리체강내 주사에 대해 1 x 10¹²

결과

제시된 프로토콜에 따라, AAV 매개 유전자 전달과 CSLO의 조합을 사용하여 다양한 망막 세포를 성공적으로 시각화하고 생체 내에서 추적했습니다. AAV2-hSyn-eGFP는 망막 신경절 세포를 효과적으로 형질전환하여 망막 전체에 걸쳐 강력한 eGFP 발현을 일으켰으며, 이는 CSLO에 의해 확인되었으며 신경절 세포층에서 특이적으로 발견되는 RGC 특이적 마커인 RNA 결합 단백질(RBPMS)과 공동 국소화되었습니다(그림 2 및 그림 3). 이 프로토콜은 또한 AAV9-GfaABC1D-eGFP를 사용하여 Müller glia를 표적으로 하는 능력을 확인했습니다. CSLO 시각화는 특히 내부 망막층 내에서 광범위한 eGFP 발현을 보여주었으며, 이는 Müller glia의 알려진 주요 분포 세그먼트와 일치합니다. GFP 양성 신호는 또한 Müller glia marker glutamine synthetase .......

토론

제시된 프로토콜은 AAV 매개 유전자 전달과 CSLO 이미징의 힘을 활용하여 특정 망막 세포 집단의 생체 내 감시를 위한 강력하고 접근 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공하여 생리학적 또는 병리학적 조건에서 망막 세포 역학 및 손상 또는 질병에 대한 반응에 대한 종단 연구를 용이하게 합니다.

이 방법의 성공 여부는 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 최적의 AAV transduction efficiency를 달성하는 것은 타겟 세포 집단에서 형광 리포터의 강력하고 특이적인 발현을 위해 매우 중요합니다. 이는 AAV 혈청형 선택, 바이러스 역가 및 주입 기술과 같은 요인의 영향을 받을 수 있습니다 13,15,16.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
33 게이지 바늘	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	유리체강 내 주사
0.5% 프로파라카인	공급자:Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		국소 마취제
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., 중국		바이러스 역가: 2.7 x 1012 바이러스 게놈 (VG)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., 중국		바이러스 역가: 4.5 x 1012 바이러스 게놈 (vg)/mL
Betadine	Healthy 의료 회사	001651	국소 방부제
각막 셀라 겸자 (이)	Mingren Eye Instruments, 중국	MR-F301A	유리체 내 주사 중 눈꺼풀 안전
Dumont 05 # 집게	FST	51-AGT5385	시신경 분쇄 Graphpad
프리즘 GraphPad	프리즘, 미국		그래프 도면 및 통계 분석
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		CSLO 이미징을 위한 "IR" 및 "FA" 모드
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		이미지 처리
Maxitrol 항생제 연고	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	국소 항생제
마이크로리터 주사기	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	유리체강 주사
Mydrin-P 안과 용액	Santen Pharmaceutical Co., Ltd, 일본		동공 확장
안과 수술 현미경	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	외과 수술용
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		이미지 정렬 및 자르기
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, 독일		국소 윤활제