엑소좀의 로딩 및 전달을 위한 Microneedle patches의 제작 및 특성 분석

요약

엑소좀은 상당한 임상적 잠재력을 가지고 있지만, in vivo clearance가 쉽고 안정성이 낮아 실제 적용에는 한계가 있습니다. 마이크로니들은 생리적 장벽을 뚫고 건조 상태 보존을 통해 국소 전달을 가능하게 함으로써 엑소좀 투여의 한계를 해결하고 임상적 유용성을 확대하는 솔루션을 제시합니다.

초록

엑소좀은 새롭게 떠오르는 "차세대" 바이오치료제 및 약물 전달 벡터로서 약물 전달 및 재생 의학에서 질병 진단 및 종양 면역 요법에 이르기까지 다양한 생물 의학 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 기존 bolus 주사에 의한 빠른 제거와 엑소좀의 낮은 안정성으로 인해 임상 적용에 한계가 있습니다. 마이크로니들은 엑소좀이 투여 부위에 머무는 시간을 연장하는 용액으로 작용하여 약물 농도를 유지하고 지속적인 치료 효과를 촉진합니다. 또한 마이크로니들은 생체 활성 물질의 안정성을 유지하는 능력도 가지고 있습니다. 이에 엑소좀을 로딩하고 전달하기 위한 마이크로니들 패치를 소개하고, 엑소좀 분리, 제작, 엑소좀 로딩 마이크로니들 패치의 특성 분석 등의 방법을 공유합니다. 마이크로니들 패치는 트레할로스와 히알루론산을 팁 재료로, 폴리비닐피롤리돈을 팁 재료로 사용하고 폴리비닐피롤리돈을 2단계 주조 방식으로 제작했습니다. 마이크로니들은 팁이 2N을 견딜 수 있는 견고한 기계적 강도를 보여주었으며, 돼지 피부를 사용하여 인간의 피부를 시뮬레이션했으며, 마이크로니들의 팁은 피부 천자 후 60초 이내에 완전히 녹았습니다. 마이크로니들에서 방출된 엑소좀은 형태, 입자 크기, 마커 단백질, 생물학적 기능을 신선 엑소좀과 유사한 것으로 보여 수지상세포의 흡수를 가능하게 하고 성숙을 촉진했습니다.

서론

세포가 세포외 기질로 방출하는 작은 소포인 엑소좀은 여러 질병 및 암의 치료를 위한 잠재적인 바이오 치료제 및 약물 전달 벡터로 제안되어 왔습니다¹. 생물 발생 과정에서 엑소좀은 세포 내에서 기능성 단백질과 핵산을 포함한 다양한 생물학적 활성 분자를 캡슐화합니다². 그 결과, 수송 과정에서 수용 세포에 흡수된 엑소좀은 표적 세포에서 유전자 발현과 세포 기능을 조절할 수 있는 능력을 갖게 됩니다³. 엑소좀은 일종의 자연 정보 전달자로서 조직 재생, 면역 조절 및 전달 운반체로서 충분히 활용되고 있습니다⁴. 엔지니어링 기술을 통해 엑소좀 표면에 특정 리간드를 풍부하게 증강할 수 있으며, 이를 통해 수용 세포에서 신호 전달 이벤트를 유도 또는 억제하거나 특정 세포 유형을 표적으로 할 수 있습니다⁵. 화학요법제는 암 치료를 위해 엑소좀에 주입될 수도 있다⁶. 또한, 엑소좀은 혈액-뇌 장벽을 통과하여 치료용 화물 전달을 할 수 있는 능력이 있어 뇌 질환 치료에 매우 유망하다⁷. 리포좀과 비교했을 때, 엑소좀은 세포 흡수율이 높아지고 생체 적합성이 향상된다⁸. 그들은 더 나은 내성과 더 낮은 독성을 보여주면서 다른 세포에 효율적으로 들어갈 수 있습니다⁹. 그러나 전통적인 엑소좀 볼루스 주입은 혈류에서 간, 신장 및 비장에 의해 격리되고 빠르게 제거되는 경향이 있습니다¹⁰. 더욱이 엑소좀은 in vitro 안정성 이 낮고 보관 조건에 취약하여 임상 적용에 제한이 있습니다¹¹.

마이크로미터 크기의 바늘 끝의 배열인 마이크로니들은 저분자 약물⁽¹²), 단백질(¹³), 핵산(¹⁴) 및 나노의약품(¹⁵)의 전달을 위한 생리학적 장벽을 관통할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 마이크로니들은 피부 표면의 병변을 표적으로 하도록 정밀하게 설계되었으며, 분산된 팁은 표적 부위에서 균일한 약물 분포를 보장하여 치료 효과를 증폭시킵니다¹⁶. 마이크로니들의 설계 및 재료 조성은 단백질 및 핵산과 같은 생체 활성 물질의 건조 저장을 용이하게 하여 안정성을 향상시킵니다¹⁷. 전통적인 주사 방법은 작용 지속 시간이 상대적으로 짧고 통증을 유발할 수 있어 환자에게 두려움을 유발할 수 있다¹⁸. 마이크로미터 크기의 마이크로니들 길이는 조직 외상을 최소화하고 신경 자극을 방지하여 통증을 없애고 환자 순응도를 향상시킵니다¹⁹. 또한, 마이크로니들의 사용자 친화적 특성으로 인해 환자는 전문 인력 없이도 치료를 자가 투여할 수 있다¹⁶. 피부 외에도 미세 바늘은 눈(²⁰), 구강 점막(²¹), 심장(²²) 및 혈관(²³)과 같은 조직에도 사용할 수 있습니다. 엑소좀의 임상 전달을 위한 마이크로니들의 적용은 유망하고 유망한 전략을 제공합니다.

이에 엑소좀 로딩 마이크로니들(exo@MN) 패치를 소개하고 그 제조 방법을 공개한다. 마이크로니들 패치는 원심분리 및 진공 건조와 함께 2단계 주조 방식으로 제작되었으며, 이는 마이크로니들 팁에서 엑소좀의 응집을 촉진하여 전달 효율성을 높였습니다. 바늘 끝과 뒷면은 모두 우수한 생체 적합성과 수용성을 나타내는 재료를 사용하여 구성되었습니다. 트레할로스와 히알루론산(HA)을 팁 소재로 혼입하여 엑소좀을 보호하고, 앱솔루트 에탄올에 용해된 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 백킹 소재로 선택했습니다. 마이크로니들 패치의 형태는 현미경과 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 특성화했습니다. 마이크로니들의 기계적 시험은 피부에 침투할 수 있는 능력을 확인하기 위해 인장계를 사용하여 평가되었으며, 돼지 피부의 방출률은 60초로 조사되었습니다. 또한, exo@MN에 있는 신선한 엑소좀과 엑소좀의 형태, 크기 및 단백질 함량을 투과전자현미경(TEM), 나노입자 추적 분석(NTA) 및 웨스턴 블로팅(WB)을 사용하여 특성화했습니다. 수지상세포(DC)에 의한 엑소좀의 내재화는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 특성화하고, 유세포분석을 통해 DC의 성숙도를 평가했습니다. 두 가지 유형의 엑소좀의 형태학적 특성과 생물학적 기능은 본질적으로 일치합니다.

프로토콜

이 연구는 섹션 3에 설명된 실험에 사용된 돼지 가죽이 실험 동물에서 공급받은 것이 아니라 시장에서 식용 돼지 귀로 구매했기 때문에 윤리적 허가를 필요로 하지 않습니다.

1. 엑소좀의 분리

1. 세포 배양
   1. 직경 15cm의 페트리 접시에서 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(100×)( 재료 표 참조)을 함유한 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 배양 배지에서 마우스 난소 상피암 세포 ID8을 배양합니다.
   2. 세포 밀도가 90%에 도달할 때까지 37°C 및 5% CO₂에서_CO2 인큐베이터(재료 표 참조)에서 ID8 세포를 배양합니다.
2. 엑소좀의 분리
   1. 페트리 접시에서 배양 배지를 제거하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 두 번 세척합니다. 소 태아 혈청( 재료 표 참조)과 페니실린-스트렙토마이신 용액( 재료 표 참조)이 없는 DMEM 20mL를 추가합니다. 37 ° C에서 48 시간 동안 5 % CO₂ 로 배양을 계속합니다.
   2. 직경이 15cm인 페트리 접시 20개에서 세포 배양 상층액을 수집합니다. 4 °C에서 10분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 유리 세포를 제거하기 위해 상층액을 수집합니다.
   3. 2000 x g 에서 10분 4 °C 동안 원심분리하고 세포 파편을 제거하기 위해 상층액을 수집합니다.
   4. 0.22μm 일회용 진공 여과 시스템( 재료 표 참조)을 순환수 진공 펌프( 재료 표 참조)에 연결합니다. 상층액이 0.22μm 폴리에테르 설폰 멤브레인을 통과하여 여과 시스템의 하부 챔버로 들어갈 수 있도록 진공을 생성하여 상층액에서 0.22μm보다 큰 소포 또는 불순물을 효과적으로 제거합니다.
      1. 진공 펌프를 연결하려면 펌프 스위치를 켠 다음 진공 여과 시스템의 공기 흡입구에 연결하십시오. 닫을 때는 먼저 펌프와의 연결을 분리한 다음 진공 펌프를 끄십시오. 이 절차는 진공 펌프의 역류와 배양 유체의 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다.
   5. 100kDa 한외여과관의 내부 튜브에 15mL의 상층액을 추가합니다( 재료 표 참조). 3500 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리하고 외부 튜브에서 액체를 제거합니다.
      참고: 내부 튜브 멤브레인에 100kDa보다 큰 입자를 유지하고 100kDa보다 작은 단백질은 용액과 함께 외부 튜브로 원심분리합니다. 엑소좀은 100kDa보다 컸으며 내부 튜브막에 응집되었습니다.
   6. 액체의 총 부피가 5mL 이내가 될 때까지 위의 단계를 반복합니다. 내부 튜브에서 액체를 수집하고 DPBS 1mL를 추가합니다. 피펫을 사용하여 내부 튜브에 반복적으로 피펫팅하여 부착된 엑소좀이 DPBS에 재부유되도록 한 다음 수집합니다.
   7. 4 °C에서 60분 동안 10000 x g 으로 원심분리하고 상층액을 6mL 퀵 스냅 원심분리기 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 히트 실러로 튜브를 밀봉하십시오.
   8. 초원심분리기를 사용하여 100,000 x g 에서 2시간 4°C 동안 원심분리기( 재료 표 참조). 퀵 스냅 원심분리기 튜브를 절단하고 상층액을 제거한 다음 펠릿을 100μL의 DPBS에 재현탁시킵니다. 이것이 바로 엑소좀 솔루션입니다.
      알림: 펠릿을 재현탁하는 과정에서 피펫을 사용하여 튜브 벽을 최소 200회 피펫팅하고 교반해야 합니다.

2. exo@MN의 제작

1. 마스터 몰드의 준비
   1. CAD 소프트웨어를 사용하여 높이 1200μm, 베이스 직경 400μm, 피치(인접한 마이크로니들 사이의 거리) 900μm의 매개변수를 가진 원뿔형 팁을 특징으로 하는 10 x 10 어레이로 마이크로니들 모델을 구성합니다.
   2. HTL 수지를 재료로 사용하고 3D 프린터를 사용하여 마이크로니들의 마스터 몰드를 인쇄합니다( 재료 표 참조).
   3. 마스터 몰드를 절대 에탄올에 1시간 동안 담가 표면에 붙어있는 수지를 제거합니다.
   4. 곰팡이를 5분 동안 자외선에 노출시켜 경화시킵니다.
   5. 금형을 다시 한 번 절대 에탄올에 1시간 동안 담근 다음 60°C에서 건조 오븐에서 1시간 동안 건조시킵니다. 마스터 금형이 준비되었습니다.
2. 생산 금형의 준비
   1. 폴리디메틸실록산(PDMS, 재료 표 참조)의 A 및 B 성분을 10:1의 비율로 혼합합니다. 잘 저어주고 혼합물을 마스터 몰드에 붓습니다.
   2. PDMS 혼합물에서 기포를 제거하기 위해 PDMS 금형을 1psi 15psi의 압력으로 놓습니다.
   3. PDMS 금형을 60°C에서 2시간 동안 경화한 다음 탈형하여 마이크로니들의 생산 금형을 얻습니다.
   4. 사용하기 전에 초순수로 생산 금형을 청소하십시오.
3. 용액의 준비
   1. 엑소좀 용액의 단백질 함량을 BCA assay kit를 사용하여 정량화합니다( 재료 표 참조). 엑소좀 용액의 농도가 10μg/μL가 되도록 적절한 양의 DPBS를 추가합니다.
   2. DPBS를 용매로 사용하여 200mg/mL 트레할로스( 재료 표 참조) 용액을 준비합니다. 완전히 용해될 때까지 20분 동안 저어줍니다.
   3. DPBS를 용매로 사용하여 200mg/mL 히알루론산(HA, 재료 표 참조) 용액을 준비합니다. 완전히 녹을 때까지 밤새 저어줍니다.
   4. 절대 에탄올을 용매로 사용하여 150mg/mL 폴리비닐피롤리돈(PVP, 재료 표 참조) 용액을 준비합니다. 완전히 녹을 때까지 밤새 저어줍니다.
   5. 엑소좀 용액(10μg/μL)과 트레할로스 용액(200mg/mL)을 1:1 부피 비율로 혼합합니다. 그런 다음 동일한 양의 HA 용액(200mg/mL)을 추가합니다. 팁 용액을 얻기 위해 철저히 혼합하십시오.
4. exo@MN의 제작
   1. PDMS 금형의 표면을 플라즈마 클리너( 재료 표 참조)를 사용하여 낮은 등급에서 30초 동안 처리하여 친수성을 향상시킵니다.
   2. 팁 용액 40μL를 PDMS 금형에 추가합니다. 실온(RT) 및 3000 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 액체가 금형의 바늘 층을 채우도록 합니다.
   3. 금형에서 과도한 액체를 제거하고 진공 건조 오븐( 재료 표 참조)에서 RT에서 1일 동안 건조합니다.
   4. PDMS 금형에 200μL의 PVP 용액을 추가합니다. 원심분리기 3000 x g 을 RT에서 3분 동안 사용하여 액체가 금형의 백킹 층을 채우도록 합니다.
   5. 건조 오븐에서 RT에서 금형을 1일 동안 건조시킨 다음 탈형하여 exo@MN 패치를 얻습니다.
      알림: exo@MN 패치를 사용할 준비가 될 때까지 건조 오븐에 보관하십시오.

그림 1: exo@MN 패치의 제작 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. exo@MN 패치의 특성화

1. 형태 관찰
   1. 패치의 뒷면을 45° 경사면에 붙이고 실체 현미경 아래에 놓습니다( 재료 표 참조).
   2. 일루미네이터를 켜고 4x 대물렌즈를 사용하여 패치의 형태를 캡처합니다.
2. 주사전자현미경(SEM)
   1. 전도성 접착제를 사용하여 패치를 샘플 스테이지에 부착하고 자동 미세 코팅기( 재료 표 참조)로 30초 동안 처리합니다.
   2. 1kV의 가속 전압으로 SEM( 재료 표 참조)을 사용하여 exo@MN 패치의 이미지를 캡처합니다.
3. 기계적 테스트
   1. 패치에서 3 x 3 어레이를 잘라내고 끝이 위쪽을 향하도록 인장계의 단단한 플랫폼에 놓습니다( 재료 표 참조). 프로브의 높이를 조정하여 바늘 끝을 건드리지 않고 바늘 끝에 가깝게 만듭니다.
   2. 압력이 20N에 자동으로 도달하면 매개변수가 중지되도록 설정합니다. 바늘 끝을 0.5mm/min 속도로 수직으로 압축하고 하중 대 변위 프로파일을 기록합니다.
4. 해산
   1. 시장에서 신선한 돼지 귀를 구입하여 조각으로 자릅니다 (5cm x 5cm x 0.3cm). 돼지 가죽을 테이블 위에 펴고 종이를 사용하여 표면의 수분을 말리십시오.
   2. 바늘 끝이 돼지 피부를 향하도록 4개의 건조한 미세바늘 패치를 준비하고 각 패치의 간격을 약간 둡니다. 엄지와 검지를 사용하여 각 마이크로니들 패치를 세로로 누릅니다. 15초마다 하나의 패치를 제거합니다.
   3. 제거한 패치를 즉시 건조 오븐에 넣고 5분 동안 건조시킵니다. 마이크로니들 팁의 열을 잘라내고 현미경 아래에 수평으로 놓고( 재료 표 참조) 4x 대물 렌즈를 사용하여 팁의 용해를 관찰합니다.

4. 패치의 엑소좀 특성 분석 exo@MN

참고: exo@MN의 마이크로니들 팁을 100μL의 DPBS 용액에 용해시켜 방출된 엑소좀에 대해 다음과 같은 특성 분석을 수행합니다.

1. 투과 전자 현미경(TEM)
   1. 구리 메쉬( 재료 표 참조)를 이온 클리너( 재료 표 참조)를 사용하여 친수성 처리로 5분 동안 처리합니다.
   2. 10μL의 샘플을 구리 메쉬의 탄소 쪽에 분주합니다. 1분 동안 그대로 두었다가 가장자리에서 여과지로 닦아 액체를 제거합니다.
   3. 10μL의 3% 우라닐 아세테이트( 재료 표 참조)를 샘플에 추가합니다. 10초 동안 그대로 둔 다음 가장자리에서 여과지로 닦아 액체를 제거합니다.
   4. 샘플에 3% 우라닐 아세테이트 10μL를 추가합니다. 1분 동안 그대로 두었다가 가장자리에서 여과지로 액체를 닦아 제거하고 RT에서 자연 건조합니다.
   5. 80kV의 가속 전압으로 TEM( 재료 표 참조)을 사용하여 엑소좀의 이미지를 캡처합니다.
2. 나노 입자 추적 분석(NTA)
   1. 엑소좀 용액을 DPBS로 희석하여 1 x 10⁷ particles/mL의 입자 농도를 얻습니다. 1mL 주사기를 사용하여 엑소좀 용액 1mL를 NTA의 샘플 챔버에 천천히 주입합니다( 재료 표 참조).
   2. 기기의 SOP(Standard Operating Procedure) 유형을 EV-488로 설정하여 엑소좀의 크기 분포를 감지합니다.
3. 웨스턴 블로팅(WB)
   1. 방사성 면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액: 페닐메탄설포닐 플루오라이드( 재료 표 참조)를 100:1의 비율로 혼합하여 용해 완충액을 준비합니다. 엑소좀을 얼음에 20분 동안 용해시키고 10분마다 소용돌이칩니다.
   2. 용액을 12,000 x g 에서 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 단백질 농도를 측정하기 위해 상층액을 수집합니다.
   3. 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼( 재료 표 참조)를 1:4의 부피 비율로 상층액에 추가하고 잘 섞습니다. 100°C에서 10분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.
   4. 5 μL의 180 kDa 사전 염색 단백질 마커( 재료 표 참조)와 10 μg의 변성된 시료를 4%-20% 프리캐스트 겔( 재료 표 참조)에 추가합니다. 전기영동 시스템( 재료 표 참조)을 60V에서 10분 동안 실행한 다음 140V에서 50분 동안 실행합니다.
   5. 겔의 단백질을 메탄올로 사전 활성화된 PVDF 멤브레인( 재료 표 참조)으로 옮깁니다. 얼음 위에서 290분 동안 90mA에서 전기영동 시스템을 수행합니다.
   6. PVDF 멤브레인을 5% 탈지유 용액에 1시간 동안 배양합니다. 트윈이 있는 트리스 완충 식염수(TBST, 재료 표 참조)로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
   7. 단백질의 위치에 따라 타겟 밴드를 잘라냅니다. 항-마우스 CD63 항체 및 항-마우스 알릭스 항체( 재료 표 참조)로 밴드를 제조사의 지침에 따라 적절한 농도로 희석하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
   8. TBST로 밴드를 세 번 씻습니다. HRP-conjugated anti-rabbit IgG( 재료 표 참조)와 함께 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 TBST로 다시 세 번 씻으십시오.
   9. Super ECL 검출 시약( 재료 표 참조)을 적용하여 밴드 표면을 덮고 겔 이미저( 재료 표 참조)를 사용하여 밴드를 즉시 노출시키고 캡처합니다.
4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)
   1. Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640) 배지 2mL를 사용하여 컨포칼 접시에서 5 x^{10 5} DC를 배양합니다( 재료 표 참조). 엑소좀 또는 exo@MN을 추가하고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
   2. 각 컨포칼 접시에 Hoechst 33342 한 방울을 넣고 37°C의 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다.
   3. 60x 대물렌즈를 사용하여 CLSM( 재료 표 참조)으로 이미징을 수행합니다. 렌즈에 이멀젼 오일 한 방울( 재료 표 참조)을 바르고 컨포칼 접시를 s에 놓습니다.tag이자형. x/y/z 축을 조정하여 셀의 적절한 초점면을 찾습니다.
   4. DAPI/TRITC/TD 채널로 이미징을 시작하고 1024px의 해상도를 선택한 다음 고속 모드를 1/8초로 설정합니다.
5. 유세포 분석
   1. 각 웰에는 5 x 10⁵ 세포와 2mL의 1640 배지가 들어 있는 6-웰 플레이트에서 DC를 배양합니다. DPBS, 엑소좀, 엑소좀이 없는 마이크로니들, exo@MN액을 각각 동일한 용량으로 넣고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
   2. 각 웰의 매체를 원심 튜브로 옮깁니다. 300 x g 에서 4 °C에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
   3. 5% BSA 용액 100μL에 FITC-CD11c 항체 0.5μL, APC-CD80 항체 2.5μL, Pacific Blue I-A/I-E 항체 0.5μL( 재료 표 참조)를 추가합니다. 잘 섞고 세포를 재현탁시킨 다음 얼음과 어두운 곳에서 셰이커에 20분 동안 배양합니다.
   4. DPBS 1mL를 넣고 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 세척을 두 번 반복하여 결합되지 않은 항체를 제거한 다음 유세포 분석을 통해 해당 형광 채널을 분석합니다( 재료 표 참조).
      1. 먼저 FSC-A/SSC-A 산점도에서 주 세포 집단을 P1으로 게이트합니다. P1 세포 집단의 SSC-A/SSC-H 산점도에서 대각선을 따라 정사각형 P2 영역을 게이트하여 응집된 세포를 제거합니다.
      2. FITC, APC 및 Pacific Blue 채널을 사용하여 P2 세포 집단에 대한 형광 분석을 수행합니다. P2 게이트에서 10,000개의 셀을 수집하도록 중지 조건을 설정합니다.

5. 통계 분석

1. 정량적 데이터를 표준 편차(SD)± 평균으로 표현합니다. 적절한 데이터 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 t-검정 분석을 사용하여 통계적 유의성을 평가합니다. 통계적 유의성을 나타내기 위해 0.05보다 작은 p-값을 고려하십시오. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

결과

여기에서는 엑소좀의 분리, 패치의 제작 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시exo@MN. 그림 1 은 exo@MN 패치 제작을 위한 프로세스 흐름도를 보여줍니다. 엑소좀에 트레할로스와 HA를 혼합한 후 혼합물을 마이크로니들 몰드에 첨가하고 원심분리했습니다. 이 과정은 바늘 끝에서 엑소좀의 응집을 촉진하여 빠른 방출을 촉진했습니다. 건조 후 PVP 용액을 첨가하고 원심 분리하여 금형을 완전히 채웠습니다. 완전히 건조되면 금형을 제거하여 exo@MN 패치를 얻었습니다. 마이크로니들의 형태는 그림 2와 같이 현미경 및 SEM을 사용하여 특성화되었습니다. exo@MN 패치의 팁은 10 x 10 배열로 배열된 원뿔 모양으로 나타났으며 날카롭고 손상되지 않은 바늘 팁이 있습니다. 미세 바늘의 끝은 2N의 힘을 견딜 수 있어 피부 장벽을 관통할 수 있습니다. 또한, 돼지 피부는 exo@MN 패치의 적용을 시뮬레이션하기 위해 인간 피부의 대리물로 사용되었습니다. 패치를 돼지 피부에 압착하여 방출 시간을 관찰한 결과, 마이크로니들 팁이 60초 이내에 완전히 녹았습니다. exo@MN 패치를 DPBS에 용해시키고 그림 3과 같이 특성화했습니다. TEM 이미지는 엑소좀의 형태와 일치하는 전형적인 컵 모양의 구조를 가진 소포를 캡처했습니다. NTA에 의한 exo@MN 용액의 입자 크기 분포는 입자가 주로 50-250nm 범위 내에 집중되어 있음을 보여주었습니다. 그러나 HA 물질의 접착 특성에 기인할 수 있는 더 큰 입자도 존재하여 엑소좀 응집을 일으켰습니다. exo@MN액 내 CD63/Alix 단백질의 WB 분석 결과, exo@MN 엑소좀의 단백질을 부분적으로 보유할 수 있는 것으로 나타났습니다. exo@MN에서 방출된 엑소좀의 생물학적 기능성은 그림 4에서 검증되었으며, 신선한 엑소좀과 비교하여 세포에 의한 엑소좀의 흡수와 수지상세포의 활성화에 초점을 맞췄습니다. CLSM 이미지는 DC가 exo@MN 내에서 신선한 엑소좀과 엑소좀을 모두 효율적으로 흡수하는 것을 확인했으며, 유세포 분석의 대표 이미지와 비례 통계는 exo@MN의 엑소좀이 신선한 엑소좀과 유사한 DC의 활성화를 촉진하는 생물학적 기능을 가지고 있음을 보여줍니다.

그림 2: exo@MN 패치의 특성화. (A) exo@MN 패치의 실체 현미경 이미지. 스케일 바 = 400 μm. (B) exo@MN 패치의 SEM 이미지. 스케일 바 = 200 μm. (C) exo@MN 패치의 하중 대 변위 프로파일. (D) 서로 다른 시기에 돼지 피부에 삽입된 exo@MN 패치의 현미경 이미지. 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: exo@MN에서 새로운 엑소좀과 엑소좀의 특성 분석. (A) TEM에 의한 엑소좀의 형태. 스케일 바 = 100nm. (B) NTA에 의한 엑소좀의 입자 크기 분포. (C) WB에 의한 엑소좀의 CD63 및 Alix. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: exo@MN의 새로운 엑소좀 및 엑소좀에 대한 생물학적 테스트. (A) DC가 차지하는 엑소좀의 CLSM 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (B) 유세포 분석에 의한 DC 활성화의 대표적인 플롯. (C) CD11c⁺CD80⁺MHCII⁺ DC의 백분율 정량화. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

현재 엑소좀을 분리하는 주요 방법으로는 초원심분리(ultracentrifugation), 밀도-구배 원심분리(density-gradient centrifugation), 한외여과(ultrafiltration), 침전(precipitation), 면역친화성 마그네틱 비드(immunoaffinity magnetic beads), 미세유체역학(microfluidics)^{등이 있습니다 24}. 마이크로니들은 바늘 끝 공간이 작아 로딩 용량이 제한되어 있기 때문에 더 많은 로딩을 하기 위해서는 엑소좀의 농도를 높여야 합니다. 그래서 한외여과법을 선택하여 세포배양 상층액을 농축한 후 초원심분리법을 사용하여 엑소좀을 분리하였습니다. 엑소좀의 농도는 소량의 액체 재현탁에 의해 증가되어 마이크로니들에 수십 마이크로그램에서 수백 마이크로그램의 엑소좀을 로드할 수 있었습니다. 그러나 이 방법은 분리된 엑소좀 용액에 상당한 단백질이 존재한다는 결과를 낳습니다. 또한 원심분리 과정에서 엑소좀의 상당한 손실이 발생합니다. 오늘날 엑소좀의 치료적 적용의 한계 중 하나는 고순도의 대량으로 엑소좀을 분리할 수 있는 효과적인 방법이 없다는 것입니다. 엑소좀의 임상적 잠재력에 대한 연구가 점점 더 활발히 이루어지고 있는 가운데, 엑소좀 추출과 관련된 문제를 해결하기 위해 앞으로 더 발전된 기술을 개발할 필요가 있습니다.

이번 연구의 핵심 기술은 엑소좀 기반 마이크로니들 설계다. 엑소좀의 낭비를 최소화하고 더 강력한 치료 효과를 얻기 위해 2단계 주조 방법을 채택하여 exo@MN 패치를 제작했습니다. 트레할로스는 엑소좀의 동결건조 보존에 적합한 물질로 이미 보고된 바 있다²⁵ HA는 생체적합성, 친수성이 우수하며 염증 억제 및 피부 회복 촉진 기능을 발휘한다²⁶. 이 두 가지 소재를 사용하여 엑소좀이 함유된 바늘 끝을 제작하면 엑소좀의 생물학적 활성을 유지하여 피부 내에서 빠르게 용해 및 방출할 수 있습니다. 또한 이 방법은 감염 위험을 최소화하고 피부의 빠른 회복에 기여합니다. 원심분리와 진공 건조를 통해 엑소좀을 마이크로니들 끝에 집중시켰습니다. 에탄올과 트레할로스의 비호환성을 고려하여, 절대 에탄올에 용해된 PVP를 백킹 물질로 선택하였다. 이 적층 제조 방법은 엑소좀의 전달 효율을 효과적으로 향상시켰습니다.

4 °C, 37 °C, -80 °C 중 어느 곳에 보관하든 in vitro 엑소좀의 안정성이 낮으면 엑소좀 구조의 변화나 성능 저하가 발생할 수 있다¹¹. 이 문제를 해결하기 위해 여러 연구에서 동결 건조와 같은 엑소좀의 보관 방법을 탐구했습니다. 마이크로니들 기술은 또 다른 새로운 전략을 제공합니다. 마이크로니들 기술은 RT에서 건조함으로써 엑소좀의 안정성을 향상시킬 수 있으며, 다른 치료 없이 엑소좀 전달에 직접 사용할 수 있습니다. 또한 엑소좀의 추출 과정은 복잡하고 분해되기 쉬워 대규모 적용이 어렵습니다. 마이크로니들 기술을 사용하여 추출한 엑소좀을 보관하면 추출 단계가 간소화되는 것이 아니라 필요한 추출 횟수가 줄어듭니다. 한 번의 추출로 장기간 보관할 수 있는 대량의 exo@MN 패치를 생성할 수 있습니다. 각 치료에 동일한 배치의 엑소좀 마이크로니들을 활용하면 서로 다른 배치 간의 변동이 치료 결과에 미치는 잠재적 영향을 최소화하여 엑소좀 나노플랫폼²⁷의 반복성과 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다. 이는 엑소좀의 임상 적용에 더 많은 가능성을 제공합니다.

향후 연구에서는 페이로드를 정밀하게 제어하고 바늘 팁 간의 약물 변동을 최소화할 수 있는 방법을 모색하는 것이 좋습니다. 이는 프로세스 최적화, 품질 관리 조치의 구현 및 고급 기술의 활용을 통해 달성 할 수 있습니다. 이러한 측면을 해결하면 신뢰할 수 있고 일관된 약물 전달 시스템을 개발하는 데 크게 기여할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100x 페니실린-스트렙토마이신 솔루션	Jrunbio Scientific	MA0110	세포 배양
180 kDa 사전 염색 단백질 마커	Thermo	26616	웨스턴 블로팅
3% 우라닐 아세테이트	허난 루이신 실험 용품	GZ02625엑	소좀의 형태학적 특성화
3D 프린터	BMF 기술	nanoArch S130	금형 준비
4%– 20% 프리캐스트 젤	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	웨스턴 블로팅
5× SDS-PAGE 로딩 버퍼	Titan	04048254	Western blotting
Anti-mouse Alix 항체	Biolegend	12422-1-AP	Western blotting
Anti-mouse CD63 항체	Biolegend	ab217345	Western blotting
APC anti-mouse CD80 항체	Biolegend	104713	항체
자동 미세 coater	ZIZHU	JBA5-100	마이크로니들
BCA 분석 키트	Beyotime	P0012	단백질 농도 분석
원심분리기	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	세포 원심분리기
순환수 진공 펌프	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	여과
CO2 인큐베이터	Eppendorf	CellXpert C170	세포 배양
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Nikon	A1HD25	형광 이미징
구리 메쉬	베이징 Zhongjingkeyi 기술	JF-ZJKY/300	엑소좀의 형태학적 특성화
D- (+) -트레할로스 디하이드레이트	알라딘	5138-23-4	마이크로니들 제작
둘베코' s 변형 된 독수리' s 배지	Meilunbio	MA0212	세포 배양
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수	Meilunbio	MA0010	세포 배양
전기 영동 시스템	Bio-rad	PowerPac-basic	웨스턴 블로팅
태아 혈청	Jrunbio Scientific	JR100	세포 배양
FITC 안티 마우스 CD11c 항체	Biolegend	117305	항체
유세포 분석	BD	LSR Fortessa	형광 검출
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HRP-conjugated anti-rabbit IgG	CST	7074S	웨스턴 블로팅
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히알루론산 (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	마이크로니들 제작
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퍼시픽 블루 안티 마우스 I-A/I-E 항체	Biolegend	107619	항체
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플라즈마 클리너	Hefei Kejing Material Technology	PDC-36G	마이크로 니들 제작
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폴리비닐피롤리돈 (MW = 40 kDa)	알라딘	9003-39-8	마이크로니들 제작
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