전뇌 영상 중 모성 행동 반응 프로파일링(Profiling Maternal Behavior Responses During Whole-Brain Imaging

요약

여기에 제시된 비디오 분석 파이프라인은 MRI 환경 내 행동 모니터링의 문제를 극복하여 외부 신호에 대한 지시되지 않은 행동 반응을 감지할 수 있도록 합니다. 이 분석은 유발된 내부 상태 변화와 뇌 전반의 활동에 대한 보다 포괄적인 이해를 촉진할 것입니다.

초록

최근 전뇌 이미징 도구의 발전으로 신경과학자들은 조정된 뇌 활동이 어떻게 외부 신호를 처리하여 내부 상태 변화에 영향을 미치고 행동 반응을 이끌어내는지 조사할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 기능적 자기공명영상(fMRI)은 비침습적 기법으로, 혈액 산소화 수준 의존적(BOLD) 반응을 사용하여 깨어 있고 행동하는 마우스의 전뇌 활동을 측정할 수 있습니다. 그러나 외부 자극에 의해 유발된 대담한 반응을 완전히 이해하려면 실험자가 스캔 중 행동 반응도 평가하는 것이 중요합니다. MRI 환경은 이러한 목표에 도전을 제기하여 일반적으로 사용되는 행동 모니터링 방법을 양립할 수 없게 만듭니다. 이러한 문제에는 (1) 제한된 시야 및 (2) 강자성 구성 요소가 없는 장비의 제한된 가용성이 포함됩니다. 여기에 제시된 행동 비디오 분석 파이프라인은 이러한 환경적 제약 내에서 획득한 비디오에서 귀중한 정보를 추출하여 이러한 한계를 극복하여 전뇌 신경 데이터를 수집하는 동안 행동을 평가할 수 있도록 합니다. 광학 흐름 추정 및 차원 축소와 같은 방법을 사용하면 fMRI 스캔 중에 나타나는 자극에 대한 행동 반응에서 강력한 차이를 감지할 수 있습니다. 예를 들어, 대표적인 결과는 순수한 음색이 아닌 새끼 쥐의 발성이 모계 암컷 쥐와 처녀 암컷 쥐에서 상당히 다른 행동 반응을 불러일으킨다는 것을 시사합니다. 앞으로 처음에는 fMRI 실험의 문제를 극복하기 위해 맞춤화된 이 행동 분석 파이프라인은 다양한 신경 기록 방법으로 확장되어 제한된 환경에서 다양한 행동 모니터링을 제공할 수 있습니다. 행동 및 신경 반응에 대한 조정된 평가는 자극에 대한 인식이 어떻게 복잡한 행동 출력의 조정으로 이어지는지에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공할 것입니다.

서론

신경 기록 중 행동 반응을 모니터링하는 것은 뇌 전반에 걸쳐 자극이 유발하는 조정 활동을 이해하는 데 필수적입니다. 동물이 자극에 구체적이고 목표 지향적인 방식으로 반응할 것으로 예측되지 않는 경우, 지시받지 않은 행동을 관찰하면 외부 신호가 내부 상태에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다 ^1,2. 최근 광시야 칼슘 이미징 및 기능적 자기 공명 이미징(fMRI)과 같은 신경 이미징 도구의 발전으로 신경과학자들은 단일 뇌 영역을 넘어 연구를 확장할 수 있게 되었습니다. 그러나 이러한 고차원 신경 데이터를 보다 포괄적으로 이해하려면 이러한 복잡한 패턴의 행동 출력을 평가하는 능력도 그에 따라 발전해야 합니다.

신경 과학 연구에서는 냄새를 맡는 것을 감지하는 온도 및 압력 센서 ^3,4, 핥는 것을 감지하는 광선⁵, 미리 결정된 신체 부위를 추적하기 위한 마커 없는 포즈 추정⁶ 등을 포함하여 작업 지시 행동을 특성화하는 최첨단 방법이 널리 사용됩니다. 그러나 지시되지 않은 행동 패턴에 대한 데이터 기반 평가는 이 분야의 과제로 남아 있습니다⁷. 데이터 기반 행동 분석 방법이 빠르게 발전하고 있지만, 기존 방법은 일반적으로 상당한 계산 능력, 특수 장비 또는 동물에 대한 매우 명확한 관점을 필요로 합니다 ^2,6,8,9. 여기에 제시된 것은 모든 비디오 촬영 데이터에 쉽게 적용할 수 있고 수동 자극 중에 획득한 비디오에서 가치 있는 행동 측정을 추출할 수 있는 행동 비디오 분석 파이프라인입니다.

이 행동 분석 파이프라인은 광범위한 외부 자극과 여러 기록 환경, 심지어 상당한 제약이 있는 환경에 노출된 머리가 고정된 동물의 신경 및 비디오 데이터의 조정된 수집과 호환되도록 설계되었습니다. 예를 들어, MRI 환경은 제한된 시야와 강자성 구성 요소가 없는 장비의 제한된 가용성을 포함하여 행동 모니터링에 특정한 문제를 제기합니다. 이러한 제약으로 인해 일반적으로 사용되는 방법들이 양립할 수 없게 되어, 머리의 움직임(즉, 체적 습득 사이에 뇌가 어떻게 움직이는지)과 같은 측정법은 스캔 중 신체 반응을 평가하기 위한 가장 접근하기 쉽지만 제한된 방법 중 하나가 되었습니다¹⁰. 이러한 한계를 극복함으로써 이 프로토콜은 MR 호환 비디오 촬영 데이터의 분석을 용이하게 했으며, 다른 모계 경험을 가진 암컷 마우스가 청각 자극에 대해 뚜렷한 행동 반응을 보인다는 것을 보여주었습니다. 어미와 처녀는 fMRI 스캔 중에 고통받는 강아지 발성("강아지 울음소리")과 순수한 음색을 포함한 청각 자극을 받았습니다. 이러한 자극은 수동적으로 제시되었기 때문에 지시된 행동 산출 없이 제시되었습니다. 어미는 처녀에 비해 새끼 울음소리에 더 높은 반응을 보이는 것으로 예측되었지만, 머리를 고정한 환경에서 암컷 쥐가 새끼 신호에 어떻게 반응하는지에 대한 문헌은 거의 없습니다. 따라서 선험적으로 추적할 특정 행동 출력이 없었기 때문에 이 실험은 제안된 데이터 기반 행동 분석을 위한 완벽한 테스트였습니다. 광학 흐름 추정 및 차원 축소와 같은 방법을 사용하여 크기와 공간적 발현 모두에서 행동 반응의 그룹 차이를 감지했습니다.

앞으로 행동 및 신경 반응에 대한 조정된 평가를 활용하여 외부 자극이 내부 상태를 어떻게 변경하고 복잡한 행동 결과를 알리는지에 대한 보다 포괄적인 이해를 달성할 수 있습니다. 이러한 이해는 부과된 과제와 지시된 행동이 없을 때 나타나는 자극으로 확장되어야 한다. 여기에 제시된 분석 파이프라인은 다양한 신경 기록 기술로 확장될 수 있으며, 제한된 환경에서도 다양한 행동 모니터링을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며 모든 방법은 관련 지침, 규정 및 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 사용된 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 소프트웨어

1. Mathworks 웹 사이트에서 MATLAB 을 다운로드합니다.
   참고: 이 분석 파이프라인을 구성하는 코드는 MATLAB을 통해서만 실행할 수 있으며 MATLAB 2023a와 호환되도록 특별히 작성되었습니다.
2. 이 파이프라인을 사용하려면 MATLAB 내의 Computer Vision Toolbox와 Image Processing Toolbox가 필요합니다. Manage Add-Ons(애드온 관리), Get Add-Ons(애드온 가져오기)를 클릭하여 MATLAB 애드온에 툴박스를 추가한 다음 검색하고 추가합니다.
   참고: 5개의 MATLAB 스크립트가 보충 파일로 제공되며, 제목은 script1_videocoreg.m(Supplementary Coding File 1), script2_optflow_roiselect.m(Supplementary Coding File 2), script3_optflow_analysis.m(Supplementary Coding File 3), script4_optflow_pca.m(Supplementary Coding File 4) 및 script5_optflow_pca_analysis.m(Supplementary Coding File 5)입니다. 두 개의 예제 비디오(비디오 1 및 비디오 2)와 해당 이벤트 타이밍 파일(보충 파일 1 및 보충 파일 2)도 제공됩니다. 먼저 예제 데이터를 사용하여 파이프라인을 실행하는 것이 좋습니다.
   주의: 코드에서 느낌표가 포함된 주석은 실행 전에 조치가 필요한 영역이므로 주의하십시오. 예를 들어, "아래 코드 블록을 편집하십시오!"와 같은 주석은 파일 구조, 실험 세부 정보 또는 분석 요구 사항에 맞게 편집해야 하는 위치를 강조합니다. 이러한 선택 항목은 제공된 두 예제 비디오에 맞게 기본적으로 설정되지만 자체 데이터로 파이프라인을 실행하기 시작하면 조정이 필요합니다.
3. 각 스크립트의 각 섹션을 실행하려면 Editor 메뉴에서 Run and Advance를 클릭합니다.

2. 동영상 공동 등록

참고: 이 분석 파이프라인에 제공된 첫 번째 스크립트는 script1_videocoreg.m(Supplementary Coding File 1)으로, 공동 등록을 통해 모든 비디오를 서로 공간적으로 정렬합니다. 이 스크립트의 입력은 원시 비디오이고 기본 출력은 변환된 비디오입니다.

1. 데이터 구조에 맞게 표시된 스크립트의 섹션 1, 2, 3, 4, 5 및 6 을 편집합니다.
2. 섹션 1을 실행합니다.
3. 그림 1A와 같이 각 비디오에서 레이블을 지정할 지점을 3개 선택합니다. 이 세 점은 모든 프레임을 서로 공동 등록하는 데 사용됩니다. 스크립트의 섹션 2를 실행하여 각 비디오의 첫 번째 프레임을 가져오고 마우스를 사용하여 처음 두 점을 한 번 클릭한 다음 세 번째 점을 두 번 클릭합니다. 마지막 동영상의 포인트를 선택한 후 Enter 키를 누릅니다.
4. 섹션 3 및 섹션 4를 실행합니다.
5. 정렬된 플래그를 0으로 설정하고 섹션 5를 실행합니다. 그런 다음 플래그를 1로 정렬하고 섹션 5를 다시 실행합니다.
6. 섹션 6을 실행하고 결과 그림을 그림 1B와 나란히 비교합니다. 왼쪽의 정렬되지 않은 평균 이미지에서 관찰된 모든 수차는 오른쪽의 정렬된 평균 이미지에서 감소되어야 합니다.

3. 광학 흐름 추정 : 전체 FOV

참고: 스캔 비디오를 통한 움직임을 평가하려면 변환된 각 비디오에 대한 광학 흐름을 추정해야 합니다. 이 작업은 제공된 스크립트 script2_optflow_roiselect.m(Supplementary Coding File 2)을 사용하여 각 비디오의 전체 시야(FOV)에 대해 수행할 수 있습니다. 이 스크립트의 입력은 변환된 비디오이고 출력은 각 비디오에 대한 시간에 따른 각 픽셀의 광학 흐름 크기를 나타내는 3D 매트릭스입니다. 그림 2A 는 광학 흐름 벡터가 파란색으로 오버레이된 예시 프레임을 보여주며, 여기서 각 벡터의 길이는 해당 픽셀의 상대적인 광학 흐름 크기를 나타냅니다. 출력을 비디오로 저장하는 것이 3D 매트릭스로 저장하는 것보다 더 효율적인 것으로 밝혀졌습니다.

1. 데이터 구조에 맞게 표시된 스크립트의 섹션 1 을 편집합니다.
2. 섹션 1을 실행합니다.

4. ROI 선정

참고: 다음 분석 단계는 분석에 집중할 전체 FOV 내에서 관심 영역(ROI)을 선택하여 계산 로드 및 데이터 스토리지 요구 사항 측면에서 훨씬 더 쉽게 관리할 수 있습니다. ROI는 관심 있는 실험 및 동작에 따라 또는 보다 데이터 중심적인 접근 방식을 통해 선택할 수 있습니다. 여기에 제시된 대표적인 결과의 경우, 전체 FOV에서 각 픽셀의 광학 흐름 크기의 표준 편차는 스크립트 script2_optflow_roiselect.m, Section 2 (Supplementary Coding File 2)를 사용하여 계산되었습니다. 스크립트의 이 부분에 대한 입력은 섹션 1의 출력이며, 기본 출력은 모든 비디오의 모든 픽셀에 걸쳐 광학 흐름 크기의 표준 편차를 시각화한 것입니다. 제시된 대표적인 결과에서 미러 FOV는 광학 흐름의 상대적으로 높은 표준 편차를 보여주었으며, 이는 입증된 ROI 선택을 안내했습니다.

1. 데이터 구조에 맞게 표시된 스크립트의 섹션 2 를 편집합니다.
2. 섹션 2를 실행하고 결과 이미지를 사용하여 분석된 비디오에서 광학 흐름이 가장 크게 변동하는 위치를 확인합니다. 이 이미지의 예가 그림 2B에 나와 있습니다.

5. 광학 흐름 정량화: ROI

참고: 스크립트 script2_optflow_roiselect.m(Supplementary Coding File 2)의 섹션 3을 사용하면 사용자가 그리기 도구로 ROI를 선택하고 경계 좌표를 저장할 수 있습니다. 스크립트의 이 부분에 대한 입력은 섹션 1의 출력이고 출력은 각 비디오에 대한 시간 경과에 따른 ROI의 평균 광학 흐름 크기를 나타내는 1D 벡터입니다.

1. 데이터 구조 및 분석 요구 사항에 맞게 표시된 스크립트의 섹션 3 을 편집합니다.
   참고: ROI 선택을 진행하는 방법에 대한 몇 가지 옵션이 있습니다. 다음 옵션 중 하나를 선택합니다.
   1. 옵션 1: 전체 비디오 FOV를 분석합니다.
      1. 플래그 selectROI를 0으로 설정하고 provideROI를 0으로 설정합니다.
   2. 옵션 2: 새로운 ROI를 분석합니다.
      1. 플래그 selectROI를 1로 설정하고 provideROI를 0으로 설정합니다. 그런 다음 newCoordsName을 편집합니다.
   3. 옵션 3: 이전에 도출된 ROI를 분석합니다.
      참고: 이전에 이 코드를 실행하고 ROI를 생성한 경우에만 이 옵션을 선택하십시오.
      1. 플래그 selectROI를 0으로 설정하고 provideROI를 1로 설정합니다. 그런 다음 inputCoords를 편집하여 미리 결정된 좌표 집합을 제공합니다.
2. 섹션 3을 실행합니다.

6. 광학 흐름 크기 비교

참고: 제공된 스크립트 script3_optflow_analysis.m(Supplementary Coding File 3)은 사용자 데이터에 맞게 가장 전문화되어야 합니다. 주요 입력은 각 비디오에 대한 시간 경과에 따른 ROI의 평균 광학 흐름 크기를 나타내는 1D 벡터이며, 이벤트 시작 및 그룹/조건 정보와 적절하게 결합될 때 주요 출력은 분석 관심 분야에 맞게 조정할 수 있는 통계적 비교입니다.

1. 스크립트의 섹션 1-3 을 데이터 구조 및 분석 요구 사항에 맞게 편집합니다.
2. 섹션 1에서 원하는 대로 분석 옵션 플래그 zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial 및 applyLPfilter를 0 또는 1로 설정합니다. 제시된 대표 결과에서 zsc, blrm 및 applyLPfilter는 1로 설정되었고 다른 모든 옵션은 0으로 설정되었습니다.
3. LPfilter를 원하는 저역통과 필터(단위: 헤르츠(Hz)를 나타내는 숫자로 설정합니다. 제시된 대표적인 결과에서는 행동 반응이 5Hz보다 빠른 속도로 변동할 것으로 예상되지 않았기 때문에 5Hz 저역 통과 필터가 적용되었습니다.
4. 섹션 1-3을 실행합니다. 섹션 3은 그림 3에 표시된 것과 같은 플롯을 포함하여 그룹 평균 광학 흐름 시계열, 그룹 평균 누적 광학 흐름 및 요약 누적 광학 흐름에 대한 플롯을 생성해야 합니다. 섹션 3은 그룹/조건 비교의 모든 조합에 대해 실행할 수 있습니다.

7. 광학 흐름 PCA

참고: 광학 흐름 크기의 추정을 기반으로 script2_optflow_roiselect.m(Supplementary Coding File 2)의 출력에는 비디오당 프레임별 광학 흐름의 공간 분포에 대한 정보도 포함되어 있습니다. 이 공간 정보의 차원을 줄이기 위해 제공된 스크립트 script4_optflow_pca.m(Supplementary Coding File 4) 은 추정된 광학 흐름에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행합니다. 주요 입력은 이전에 각 동작 비디오에 대해 비디오로 저장되었던 3D 광학 흐름 매트릭스이며, 기본 출력은 PC와 설명된 분산 정보를 포함하는 비디오당 하나의 .mat 파일입니다.

1. 스크립트의 섹션 1 을 데이터 구조 및 분석 요구 사항에 맞게 편집합니다.
2. 분석 옵션 플래그 stimnum, dsfactor, fnfactor를 섹션 1에서 원하는 대로 설정합니다. 제시된 대표적인 결과에서는 각 자극 유형을 개별적으로 분석했으며, dsfactor 및 fnfactor에 대해 기본값 1을 유지하여 공간 또는 시간에서 다운샘플링이 발생하지 않았습니다.
3. 섹션 1을 실행합니다.

8. 광학 흐름 PCA 비교

참고: 제공된 스크립트 script5_optflow_pca_analysis.m(Supplementary Coding File 5)은 그룹 간에 PCA 결과의 탐색적 비교를 수행합니다. 주요 입력은 script4_optflow_pca.m(Supplementary Coding File 4)에서 얻은 자극 관련 PC 및 설명된 분산 정보이며, 주요 출력은 첫 번째 PC의 부하를 묘사하는 통계적으로 임계값화된 히트 맵이지만 다른 PC도 이 스크립트로 분석할 수 있습니다.

1. 스크립트의 섹션 1 을 편집하여 데이터 구조 및 분석에 맞춥니다.
2. 섹션 1 및 섹션 2를 실행합니다.
3. 섹션 3 입력값, 특히 group 변수와 myTitle 변수를 편집하여 원하는 그룹 분석과 threshT를 반영합니다. threshT는 결과가 유의한 것으로 간주되는 T-통계량 임계값을 나타내며, 이는 공개적으로 사용 가능한 T-통계량에서 p-값 테이블 및 자유도를 기반으로 계산할 수 있습니다.
4. 각 관심 그룹에 대해 섹션 3 을 실행합니다. 이 코드는 그림 4의 왼쪽 및 가운데 패널에 표시된 것과 같은 그룹 요약 통계 맵을 생성해야 합니다. caxis의 범위를 조정하여 시각화를 위해 원하는 대로 색상 막대 제한을 조정합니다.
5. 섹션 4 입력값, 특히 mag 및 myTitle 변수를 편집하여 원하는 그룹 비교를 반영하고 threshT를 선택합니다. threshT는 결과가 유의한 것으로 간주되는 T-통계량 임계값을 나타내며, 이는 공개적으로 사용 가능한 T-통계량에서 p-값 테이블 및 자유도를 기반으로 계산할 수 있습니다.
6. 관심 있는 각 그룹 비교에 대해 섹션 4 를 실행합니다. 이 코드는 그림 4의 오른쪽 패널에 표시된 것처럼 그룹 비교 통계 맵을 생성해야 합니다. caxis의 범위를 조정하여 시각화를 위해 원하는 대로 색상 막대 제한을 조정합니다.

결과

이 분석 파이프라인의 잠재력을 입증하기 위해 머리가 고정된 암컷 마우스(특히 어미와 처녀)의 행동 비디오를 획득하고 기능적 자기 공명 영상(fMRI) 스캔 중에 마우스에 청각 자극을 제공했습니다. 자극은 강아지 울음소리와 수동적으로 제시된 순수한 음색으로 구성되었기 때문에 지시된 행동 출력은 없었습니다. 새끼 울음소리는 둥지에서 임시로 격리된 생후 6일 된 새끼 쥐가 내는 초음파 발성을 녹음한 것이었다. 이러한 새끼 울음소리는 전형적으로 어미가 새끼를 찾고, 그쪽으로 이동하고, 조사하고, 새끼를 집어 올려 둥지의 안전한 곳으로 돌려보내는 어미의 새끼 회수 행위를 이끌어냅니다 - 처녀 암컷은 일반적으로 이러한 행동을 보이지 않습니다¹¹. 이전 연구는 강아지의 울음소리는 처녀가 아닌 어미의 1차 청각 피질에서 강력한 유발 활동을 이끌어내는 반면, 순수한 음색 반응은 집단의 차이를 보여주지 않는다는 것을 보여주었다¹². 따라서 강아지 울음소리에 대한 행동 반응의 집단 차이는 확인되지만 순수한 음색은 확인되지 않을 것이라는 가설이 세워졌습니다. 그러나 머리가 고정된 환경에서 새끼 신호에 반응하는 암컷 쥐의 특정 행동에 대한 문헌은 거의 없습니다. 따라서 특정 행동 결과가 예상되지 않았으므로 이 실험은 제안된 데이터 기반 행동 분석을 위한 완벽한 테스트였습니다.

8일 동안 모든 동물은 점차 실험자 다루기, 머리 고정, MRI 환경에 익숙해졌습니다. 머리 고정과 실험 환경에 대한 습관화는 제시된 자극에 대한 행동 반응을 평가하는 데 중요합니다. 환경에 적절하게 익숙화되지 않으면 동물은 스트레스 반응만 보일 수 있으며, 그렇지 않으면 비디오 촬영 을 통해 분석할 수 있는 자극 유발 효과를 씻어낼 수 있습니다.

행동 장치 설정은 일반적으로 모든 데이터 수집 세션에서 동일했지만, fMRI 스캔을 위해 동물의 머리를 고정할 때마다 카메라 시야(FOV)가 약간 이동했을 수 있습니다( 그림 1A의 FOV 예시 참조). 이는 카메라 마운트의 위치가 약간 변경되었을 뿐만 아니라 각 동물에 대한 헤드-포스트 두개골 부착물의 개별적인 차이 때문일 수 있습니다. 따라서 스캔의 비디오는 스캔과 동물 간에 포함된 공간 정보를 비교할 수 있도록 선형 공동 정합을 통해 서로 정렬되어야 했습니다. 공동 등록은 대표 데이터에 맞게 조정되었습니다. 예를 들어, 표준 스캔일에는 동물당 3-4개의 스캔을 획득하여 하루에 동물당 3-4개의 비디오를 얻을 수 있습니다. 각 스캔 사이에는 카메라 및 머리 고정 구성 요소를 포함한 요람 구성 요소의 움직임이 없었습니다. 따라서 하루에 동물 한 마리당 하나의 비디오에 대한 공동 정합 변환이 결정되면 같은 날 해당 동물의 다른 2-3개의 비디오에 적용할 수 있습니다. 이렇게 하면 이 파이프라인의 공동 정합 단계에서 시간이 절약되지만 필요한 경우 각 비디오에 대해 공간 변환을 개별적으로 계산할 수도 있습니다. 각 비디오에 있는 세 가지 특징은 공간 변형에 레이블을 지정하고 계산하기 위한 포인트로 선택되었습니다. 표시된 대표 데이터에서 이 세 점은 머리 기둥의 중심, 동물의 오른쪽 눈의 정면 시야, 동물의 오른쪽 눈의 옆모습(45도 각도로 배치된 거울에서 볼 수 있음)입니다. 비디오 공동 정합(coregistration)의 예가 그림 1A, B에 나타나 있으며, 이 단계의 효과를 입증하기 위해 이 실험 중에 촬영된 모든 비디오에서 계산된 평균 프레임을 보여줍니다.

이 파이프라인은 연속 프레임¹³ 사이의 겉보기 속도를 추정하여 비디오에서 물체의 움직임을 추정하는 데 사용되는 컴퓨터 비전 방법인 광학 흐름에 크게 의존합니다. 광학 흐름이 선택된 이유는 미리 결정된 신체 부위나 관심 있는 행동 없이 움직임(행동 반응의 대리물)을 정량화할 수 있기 때문입니다. 또한 이 방법은 실험 당시 액세스할 수 있는 유일한 MR 호환 카메라로 획득한 대표 비디오의 제한된 이미지 품질에 적합했습니다. 이 파이프라인에서는 전역적이고 조밀한 광학 흐름 추정의 Horn-Schunck 알고리즘이 사용됩니다. 그러나, 루카스-카나데 알고리즘과 같은 다른 알고리즘들은 제공된 MATLAB 스크립트^들(14,15,16)을 약간 변경하여 쉽게 채용될 수 있다. 그림 2A는 각 픽셀에 대해 오버레이된 상대 광학 흐름 속도 벡터가 있는 비디오 프레임의 예를 보여줍니다. 더 큰 벡터는 동물의 주둥이와 발과 같이 움직임이 예상되는 영역에 나타납니다.

파이프라인은 전체 FOV에 걸쳐 모든 비디오의 광학 흐름을 추정했지만, 나머지 분석 단계는 FOV 내에서 관심 영역(ROI)을 선택하여 컴퓨팅 로드 및 데이터 스토리지 요구 사항 측면에서 훨씬 더 쉽게 관리할 수 있도록 했습니다. ROI는 실험 및 미리 결정된 관심 행동에 따라 또는 보다 데이터 중심적인 접근 방식을 통해 선택할 수 있습니다. 대표 데이터에는 선험적으로 추적할 수 있는 특정 행동 결과가 포함되어 있지 않다는 점을 감안하여 데이터 기반 접근 방식을 추구했습니다. 광학 흐름 크기의 표준 편차는 그림 2B에 시각화된 바와 같이 각 픽셀의 모든 비디오에서 계산되었습니다. 표준 편차가 가장 높은 영역에는 눈과 주위와 같은 동물의 윤곽이 포함되었으며, 이는 관찰된 광학 흐름 변동이 비디오의 소음이 아닌 동물의 움직임에 의해 유도되었다는 확신을 심어줍니다. 표준 편차가 더 작은 영역에는 크래들의 윤곽이 포함되었으며, 이는 스캔 중에 발생한 카메라와 크래들의 작은 진동의 결과일 수 있습니다. MRI 환경은 그래디언트의 전환으로 인해 데이터 수집 중에 불가피하게 진동에 시달리게 되며, 이는 크래들의 반사 구성 요소에서 관찰되는 광학 흐름 변동에서 나타날 수 있습니다. 다행히도 이러한 진동은 데이터 수집 전반에 걸쳐 일정하므로 자극 조건과 무관하며 행동 분석 결과에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않습니다. 특히 동물의 얼굴의 옆모습에 해당하는 거울의 픽셀에서 광학 흐름 표준 편차가 관찰되었으며, 이는 대표 데이터에 대한 ROI 선택에 도움이 되었습니다. 이것은 또한 휘젓는 것과 냄새 맡는 것과 같은 행동 반응이 새끼 울음소리를 내는 고립된 새끼를 찾는 암컷 쥐의 전형적인 행동 레퍼토리의 일부로 예상될 수 있는 영역이었습니다¹⁷.

ROI를 선택하고 모든 비디오에 대한 광학 흐름의 평균 프레임 단위 크기를 추출한 후, 관심 에포크 동안의 광학 흐름을 그룹 및 조건 간에 비교할 수 있습니다. 각 비디오의 광학 흐름 벡터의 처음 20초는 밝기 안정화를 위해 마스킹되었습니다. 그러나 이는 실험적 필요에 맞게 조정할 수 있습니다. 각 비디오에 대해 선택한 ROI에 대한 프레임별 광학 흐름 벡터를 Z 점수로 매긴 다음, 얼굴 표정 분류에 대한 이전 작업에 따라 카메라의 30Hz 프레임 속도가 예상되는 동작 변동보다 빠르다는 점을 고려하여 5Hz에서 저역 통과 필터링을 수행했습니다². 마지막으로, Z-스코어링되고 필터링된 벡터를 자극 제시 에포크로 청크하여 광학 흐름에 대한 자극 제시의 효과를 평가했습니다. 각 epoch에 대해 평균 pre-stimulus baseline 신호를 빼서 optical flow를 pre-stimulus period로 정규화했습니다. 그림 3A는 그림 3B-E의 요약 그룹 데이터와 함께 두 개의 비디오, 즉 한 개의 어미와 한 개의 처녀에 대한 예시적인 광학 흐름 시계열을 보여줍니다. 그림 3B와 그림 3D는 기준선을 기준으로 자극이 표시되는 동안 시간 경과에 따른 누적 광학 흐름을 보여주며, 그림 3C와 그림 3E는 자극 시작 후 2.5초 후의 누적 광학 흐름을 요약합니다. 누적 광학 흐름은 자발적인 행동 반응이 시간 고정 방식으로 발생할 것이라고 가정하지 않고 시간 경과에 따른 전반적인 움직임을 포착하기 위해 계산되었습니다. 전반적으로, 이러한 대표적인 결과는 순수한 음색이 아닌 새끼 울음소리가 예측된 대로 모계 암컷 마우스와 처녀 암컷 마우스에서 유의하게 다른 행동 반응을 불러일으켰음을 보여줍니다(그룹 간 Mann-Whitney U 테스트: 강아지 울음소리: p = 0.026; 순수한 톤: p = 0.093). 그러나 이 자극 효과는 2원 분산분석에서 살아남지 못한 반면, 집단 효과는 살아남았다(자극: F(1,10) = 0.19, p = 0.67; 그룹: F(1,10) = 8.61, p = 0.015). 전반적으로, 이러한 결과는 어미가 처녀에 비해 더 높은 자극 유발 움직임을 보였으며, 새끼 울음소리에 대한 어미의 반응이 순수한 음색보다 더 일관적이었다는 것을 시사합니다. 이것은 어미의 높아진 주의력이나 스트레스를 반영할 수 있을 뿐만 아니라 순수한 음색과 달리 자연주의적 환경에서 어미의 새끼 회수 반응을 불러일으키는 강아지 울음소리의 행동 관련성을 반영할 수 있습니다. 종합하면, 이러한 대표적인 결과는 외부 자극 프레젠테이션 중 광학 흐름 추정이 미묘하고 자발적인 행동 반응에 관한 정보를 추출할 수 있음을 시사합니다.

마지막으로, 대표 데이터에 포착된 행동의 공간적 특성을 밝히기 위해 보다 탐색적인 분석이 수행되었습니다. 자극이 제시되는 동안 ROI의 어떤 픽셀이 조정된 방식으로 변동했는지 조사하기 위해 시간 경과에 따른 공간 광학 흐름 정보에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행했습니다. 이 분석을 통해 그림 4와 같이 첫 번째 PC에 가장 많이 기여한 픽셀과 각 자극 조건에 대한 그룹 차이를 보여주는 픽셀이 나타났습니다. 그림 4A, B 의 가장 오른쪽 패널은 두 가지 자극 유형이 모두 나타나는 동안 어미가 처녀에 비해 코에서 더 많은 움직임을 보였음을 시사합니다. 두 그룹과 두 가지 자극 조건에서 첫 번째 PC는 광학 흐름 분석에서 총 분산의 5.41%± 0.59%를 설명했습니다. 분석의 이 부분에 대해서는 미러 ROI가 유지되었지만, 향후 분석은 자극에 대한 반응으로 얼굴 너머의 조정된 움직임을 특성화하기 위해 FOV의 더 넓은 부분으로 확장될 수 있습니다. 예를 들어, 발의 움직임을 비교하면 일반적으로 새끼 울음소리가 처녀가 아닌 어미에게서 새끼 회수를 시작한다는 점과 발이 동물의 머리보다 더 자유롭게 움직일 수 있다는 점을 감안할 때 더 중요한 그룹 차이를 드러낼 수 있습니다.

지금까지의 대표적인 결과는 이 파이프라인이 제한된 비디오 촬영 환경에서 외부 자극에 대한 지시되지 않은 행동 반응을 평가할 수 있음을 시사했지만, 관찰된 광학 흐름의 변동이 실제로 의미 있는 동물 행동을 반영하는지에 대해서는 의문이 남아 있습니다. 이 질문에 답하기 위해 동일한 파이프라인을 사용하여 별도의 검증 데이터 세트를 분석했습니다. 별도의 실험에서, 수분 제한 수컷 마우스는 6μL("높은 보상") 또는 1μL("낮은 보상")의 물 보상의 전달과 광 신호를 연관시키도록 훈련되었습니다. 특히, 청각 자극 실험과 달리 이 실험은 선험적 행동 판독값, 즉 핥는 속도를 가지고 있었습니다. lickometer는 비디오 기반 lick 감지를 통해 확립되었으며, 물 주둥이에 가까운 픽셀 밝기 분석을 통해 촉진되었습니다. 따라서 리코미터에 의해 제공되는 동작 판독값은 광학 흐름 추정에 의해 제공되는 이 파이프라인의 동작 판독값을 비교하는 데 사용할 수 있으며, 이는 자발적인 행동을 감지하는 데 있어 타당성을 뒷받침합니다. 비디오 공동 정합, 광학 흐름 추정, ROI 선택(다시 한 번 미러 FOV 포함) 및 광학 흐름 정량화에 이어 광학 흐름 크기를 비교한 결과 높은 보상과 낮은 보상에 대한 행동 반응 간에 상당한 차이가 나타났습니다. 이 분석의 결과는 그림 5A,B에 나와 있으며, 여기서 그림 5A는 그룹 평균 시계열을 보여주고, 그림 5B는 자극 시작 후 2.5초 후의 누적 광학 흐름을 요약합니다(조건 쌍을 이룬 Wilcoxon 부호 순위 검정 : p = 0.031). 광학 흐름 값이 대표 데이터에 기록된 자발적인 행동에 비해 더 컸다는 점에 주목하십시오. 그림 5C는 두 가지 보상 조건 각각에 대해 리코미터에 의해 기록된 실제 릭 비율을 보여주며, 그림 5D는 보상 전달 후 2.5초 이내에 낮은 보상 조건에 비해 높은 보상 조건 동안 더 많은 릭이 기록됨을 보여줍니다(조건 간 쌍을 이루는 Wilcoxon 부호 순위 테스트: p = 0.031). 전체적으로 두 분석 모두 높은 보상 응답과 낮은 보상 응답의 비교에서 유사한 추세를 보여주었으며, 조건에 따른 동물 행동의 의미 있는 차이를 포착하기 위해 제시된 비디오 분석 파이프라인을 검증했습니다.

종합하면, 여기에 표시된 대표적인 결과는 새끼 울음소리의 표현이 모계 암컷 마우스와 처녀 암컷 마우스에서 상당히 다른 반응을 불러일으킨 반면 순수한 음색은 그렇지 않았음을 시사합니다. 검증 데이터 세트의 분석은 광학 흐름에서 관찰된 차이가 외부 자극에 대한 행동 반응의 의미 있는 차이를 반영한다는 확신을 제공합니다.

그림 1: 비디오 공동정합. (A) 서로 다른 동물의 서로 다른 비디오에서 각각 촬영된 3개의 프레임으로 라벨링된 미리 결정된 특징(헤드포스트 중앙, 오른쪽 눈의 정면도, 오른쪽 눈의 옆모습)을 묘사하는 비디오 공동정합의 예. 오버레이에서 세 지점이 정렬되지 않은 방법을 기록하여 데이터 수집 세션 간에 동작 설정이 어떻게 약간 변경되었는지 보여줍니다. (B) 각 비디오의 마지막 10초에 걸친 평균 프레임은 비디오 공동 정합을 수행하기 전(왼쪽)과 후(오른쪽)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 광학 흐름 추정.(A) 상대적인 광학 흐름 벡터가 파란색으로 오버레이된 예시 프레임. (B) 모든 비디오에서 광학 흐름의 평균 픽셀 단위 표준 편차입니다. 거울을 통해 동물의 얼굴 옆모습 주변에서 선택한 ROI는 자홍색으로 표시됩니다. 색상 막대는 표준 편차에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 그룹 및 조건 전반에 걸친 광학 흐름의 시각화 및 비교. (A) 어미의 비디오 1개와 처녀의 비디오 1개에 대한 광학 흐름의 예시적인 Z 점수 및 5Hz 저역 통과 필터링 시계열. (B) 및 (D) 강아지 울음소리(B)와 순수한 톤(D)의 자극 기간 동안 측정된 누적 광학 흐름. 음영은 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. (C) 및 (E) 강아지 울음소리(C) 및 순수한 톤(E)에 대한 자극 발표의 처음 2.5초 동안 누적 광학 흐름. * p < 0.05, 그룹 간 Mann-Whitney U 테스트(강아지 호출: p = 0.026, 순음: p = 0.093), 그룹당 N = 6을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 그룹 간 PC₁ 비교. (A,B) 강아지 울음소리(A) 및 그룹 전체의 순수한 톤(B) 동안 광학 흐름의 첫 번째 주성분(PC₁)의 부하를 묘사한 지도로, 다중 비교를 위한 보정 없이 p < 0.05에서 통계적으로 임계값이 설정되었습니다. 히트 맵은 각 픽셀의 광학 흐름 변동이 다른 픽셀에 비해 PC₁에 기여한 정도를 나타냅니다. 작은 검은색 텍스트는 PC₁에 의해 설명되는 분산의 백분율을 나타냅니다(어미 새끼 울음소리: 4.95% ± 0.72%; 처녀 새끼 울음소리: 4.44% ± 0.59%; 어미 순음: 4.95% ± 0.39%; 처녀 순음: 4.72% ± 1.24%(평균 ± 표준 편차)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 행동 분석 파이프라인의 검증. (A) 높은 보상 및 낮은 보상 전달 중 광학 흐름의 평균 Z-점수, 자극 전 기준선 빼기, 5Hz 저역 통과 필터링된 시계열. 음영은 SEM을 나타내고, 흰색 수직선은 보상 전달을 나타내며, 빨간색 별표는 광 신호의 시작 및 오프셋으로 인한 일시적인 광학 흐름 아티팩트를 나타냅니다. (B) 보상 지급 후 처음 2.5초 동안의 누적 광학 흐름 요약. *는 p < 0.05, 조건 간 쌍체 Wilcoxon 부호 순위 검정(p = 0.031)을 나타냅니다. (C) 높고 낮은 보상 전달 동안 lickometer에 의해 얻은 평균 핥기 속도. 음영은 SEM을 나타내고 흰색 세로선은 보상 전달을 나타냅니다. (D) 보상 지급 후 처음 2.5초 동안 기록된 릭 횟수. *는 p < 0.05, 조건 간 쌍을 이루는 Wilcoxon 부호 순위 검정(p = 0.031), N = 6을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 1: 예시 동영상 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 2: 예시 동영상 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 비디오 1에 대한 이벤트 타이밍 파일. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.매트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 비디오 2에 대한 이벤트 타이밍 파일. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.매트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 1: script1_videocoreg.m. 이 스크립트는 공동 등록을 통해 모든 비디오를 서로 공간적으로 정렬합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 코딩 파일 2: script2_optflow_roiselect.m. 이 스크립트는 변환된 각 비디오의 전체 FOV에 대한 광학 흐름을 추정하고 파이프라인의 나머지 부분에 대한 ROI를 선택할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 3: script3_optflow_analysis.m. 이 스크립트는 선택한 ROI에 대한 여러 그룹/조건 간의 광학 흐름 크기를 비교합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 4: script4_optflow_pca.m. 이 스크립트는 선택한 ROI의 예상 광학 흐름에 대해 PCA를 수행합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 5: script5_optflow_pca_analysis.m. 이 스크립트는 선택한 ROI에 대한 그룹/조건 간의 PCA 결과를 비교합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

제시된 행동 분석 파이프라인을 사용하면 수동적으로 제시된 자극에 반응하여 지시받지 않은 행동을 보이는 동물의 비디오에서 귀중한 정보를 추출할 수 있습니다. 이러한 대표적인 행동 비디오는 전뇌 기능 자기 공명 영상(fMRI) 데이터와 함께 획득되었으며, MRI 환경에서 행동 반응을 포착하기 위해 여러 제약 조건을 극복했습니다. 광학 흐름 추정 방법을 사용하여 어미와 처녀가 새끼 울음소리에 반응하는 방식의 차이가 밝혀졌지만 순수한 음색은 그렇지 않음이 밝혀져 초기 가설 ^13,14,15,16을 뒷받침했습니다. 광학 흐름 정보의 차원 감소를 활용하여 이 발견은 이러한 동작의 공간 분포에 대한 탐색적 분석으로 확장되었습니다.

이 분석 파이프라인은 다양한 실험 패러다임에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 획득한 신경 데이터의 유형에 완전히 구애받지 않으며 과도한 계산 능력이나 특수 장비가 필요하지 않습니다. 주요 실험 요구 사항은 자극 프레젠테이션 시작의 관련 타임스탬프와 함께 비디오 촬영 데이터를 기록하는 것입니다. 또한 시연된 분석을 수행하는 데 사용되는 MATLAB 스크립트를 제공함으로써 이 파이프라인의 구현은 MATLAB 경험이 거의 없는 사용자도 매우 간단해야 합니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이 일반적인 단계는 비디오 공동 정합, 광학 흐름 추정, 관심 영역(ROI) 선택, ROI별 광학 흐름 정량화, 광학 흐름 크기 비교, 주성분 분석(PCA) 및 PCA 비교로 구성됩니다. 각 단계에서 프로토콜에 명시되고 코드 전체에서 주석으로 강조 표시된 대로 실험 및 분석 요구 사항에 맞게 파이프라인을 수정할 수 있습니다.

제시된 비디오 분석 파이프라인을 사용할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 행동 장치의 설계를 신중하게 고려해야 합니다. 어떤 행동 반응을 기대할 수 있는지 불분명한 경우, 동물에 대해 가능한 한 많은 관점을 갖는 것이 향후 분석에 도움이 될 수 있습니다. 따라서 하나 또는 여러 개의 거울을 설치하여 그림 1A의 예시 비디오 프레임과 같이 동물의 정면 및 옆모습 보기를 동시에 캡처하는 것이 좋습니다. 둘째, 비디오 획득을 위해 제공되는 조명은 시야(FOV)의 모든 관련 기능을 볼 수 있을 만큼 충분히 밝지만 포화에 도달할 정도로 밝지 않은 것이 좋습니다. 그림 1A에서 관찰할 수 있듯이, 생쥐 코의 정면 모습은 거의 포화 상태에 있어 움직임을 나타내는 밝기의 변동을 포착하기 어렵습니다. 이는 그림 2B에서 볼 수 있듯이 FOV의 이 부분에서 관찰되는 광학 흐름 변화의 부족에 기여했을 수 있습니다. 다행히 코의 옆모습은 이 문제에 직면하지 않아 거울 ROI를 분석할 수 있었습니다. 또한 시각적 자극이 실험에 관련된 경우 채도 가능성을 고려해야 합니다. 검증 데이터 세트 실험에서 물 보상의 전달을 알리는 데 사용되는 광 신호는 획득한 비디오에 일시적인 채도를 유발하여 광학 흐름 추정에 일시적인 아티팩트를 제기했습니다. 이 아티팩트는 그림 5A에서 관찰할 수 있으며, 두 보상 조건에 대한 광학 흐름 트레이스의 두 개의 날카로운 피크는 라이트 큐를 켜고 끌 때와 정확히 일치합니다. 이 아티팩트로 인해 제시된 파이프라인으로 이러한 짧은 시간 창을 분석하기 어려웠으며, 이 파이프라인이 없었다면 그림 5B에 제시된 결과가 훨씬 더 중요했을 수 있습니다. 일정한 장면 조명은 대부분의 광학 흐름 알고리즘^14,16에 필요한 가정입니다. 따라서 이 비디오 분석 파이프라인은 임상시험 내에서나 임상시험 사이에 환경 조명이 급격히 변하는 실험에는 권장되지 않습니다. 셋째이자 마지막으로, 동물이 기록 환경에 충분히 익숙해지는 것은 이 파이프라인을 활용하는 모든 실험의 핵심 구성 요소입니다. 적절하게 습관화되지 않으면 동물은 상당한 스트레스 반응을 보일 수 있으며, 비디오 분석을 통해 분석할 수 있는 미묘한 자극 유발 효과를 씻어낼 수 있습니다.

앞으로 이 행동 분석 파이프라인을 사용하여 동시에 기록된 행동 및 신경 반응의 조정된 평가를 용이하게 할 수 있습니다. 위에서 살펴본 바와 같이, 지시받지 않은 행동을 정량적으로 평가하면 복잡한 기록 환경에서 자극의 현저성을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 실험 그룹 및 조건에 걸쳐 다양한 행동 반응을 테스트할 수 있습니다. 추가 분석을 수행하여 행동 반응의 개인차 또는 시행 별 경향을 탐색하여 해당 신경 활동을 검사 할 수 있습니다. 또한 자극 유발 움직임에 대한 공간 정보를 얻기 위해 PCA를 통합하는 것은 자극 제시 중에 관찰된 특정 유형의 행동 순서가 그룹과 조건에 따라 다른지 여부를 추가로 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석 파이프라인은 다양한 신경 기록 방법으로 쉽게 확장할 수 있어 제한된 환경에서 다양한 행동 모니터링을 제공할 수 있습니다. 외부 자극이 뇌와 행동 모두에서 어떻게 표현되는지 조사함으로써 연구자들은 자극에 대한 인식이 내부 상태와 외부 징후에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 포괄적인 이해를 얻을 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MATLAB 컴퓨터 비전 도구 상자	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB 이미지 처리 도구 상자	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
MATLAB 소프트웨어	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
MR 호환 카메라 " 12M-i" 통합 LED 조명 MRC	Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf