이 백서는 테더링된 광유전학 또는 섬유 측광 실험을 위한 최소한의 수정으로 표준 설치류 케이지에서 구현할 수 있는 대체 뚜껑 및 케이지 수정과 함께 자동 공급 시스템의 설계, 조립 및 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 공급 시스템은 시간 제한 공급 및/또는 칼로리 제한을 위한 비용 효율적인 도구를 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
집 우리에서 실험실 설치류의 예정된 먹이를 위한 DIY 시스템
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
간헐적 단식과 시간 제한 칼로리 제한이 체중 조절 및 노화 결과에 미치는 영향을 둘러싼 연구가 사회와 실험실 모두에서 추세에 있습니다. 실험실에서 시간 제한 섭식 및/또는 칼로리 제한을 연구하기 위해 할당된 양의 음식을 예정된 시간 간격으로 분산시킵니다. 설치류의 일정 먹이를 주는 현재 기술에는 게이트 식품 입력 포트가 있는 특수 케이지, 시간 잠금 디지털 호퍼 또는 수동 식품 배달이 포함됩니다. 이러한 실험을 위한 특수 장비는 비용이 많이 들 수 있으며 수동 수유는 종종 조사관이 늦은 밤/이른 아침 시간대에 와야 하므로 장기간의 연구를 할 수 없습니다. 여기에 설명된 자동 급식 시스템은 최소한의 수정으로 표준 설치류 케이지에서 구현할 수 있는 시간 제한 수유 및/또는 칼로리 제한을 위한 비용 효율적인 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 표준 마이크로 아이솔레이터 케이지 뚜껑(마우스, 햄스터, 쥐 또는 기니피그 케이지 뚜껑)이 장착된 기성품 자동 공급기를 사용하며 동물의 가정 케이지에서 프로그래밍된 시간 간격으로 원하는 사료 할당량을 투여할 수 있습니다. 우리의 디자인은 다양한 피더 또는 케이지 치수의 약간의 변화를 수용하도록 수정할 수 있습니다. 당사는 공급 시스템을 위한 설계, 조립 및 프로토콜과 함께 테더링된 광유전학 또는 섬유 측광 실험을 위한 대체 뚜껑 및 케이지 수정을 제공합니다.
서론
간헐적 단식은 신진대사 및 노화 연구의 중요한 영역입니다. 수유와 일주기 리듬의 적절한 정렬은 체중에 대한 식단의 효과를 바꿀 수 있습니다 1,2,3,4. 또한, 간헐적 단식을 장기간 지속하면 수명이 늘어나고 노화 관련 질환이 개선되는 것으로 나타났습니다 5,6,7,8. 장기 단식 프로토콜(>20일)을 시행하는 연구에는 일반적으로 특수 장비가 필요합니다. 예정된 수유 프로토콜에 따라 수동으로 음식을 배달하는 것이 가능하지만, 이를 위해서는 조사관이 장기간 수많은 근무 외 시간에 참석해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 4시간 간격인 세 번의 수유 시간은 오후 8:00, 오전 12:00, 오전 4:00에 수동 배송이 필요합니다. 며칠 이상 지속해야 하는 규정 준수 문제일 수 있습니다.
실험실 설치류를 위한 수동 식품 배달의 대안은 1) 식품에 대한 자동 게이트 접근이 가능한 특수 케이지 또는 2) FED39와 같은 식품에 대한 자동화 및 프로그래밍된 접근을 제공하는 디지털 호퍼 시스템입니다. 게이트 식품 접근이 가능한 케이지 시스템은 비용이 많이 들고 일부는 장기 연구를 위한 적절한 가정용 케이지 환경을 제공하지 않습니다. 예를 들어, 기존의 작동 컨디셔닝 박스는 자동 음식 배달이 가능하지만 장기 주택에 적합하지 않은 철사 강판 바닥이 있습니다. Research Diets의 BioDAQ 시스템은 게이트 외부 포트를 통해 음식과 물을 제공합니다. 프로그래밍 가능한 자동 게이트를 통해 장기간 예정된 섭식 또는 음용 연구가 가능하지만 이 시스템은 비용이 많이 드는 투자입니다. 기계화된 호퍼 시스템은 자동화된 예정된 공급 프로토콜을 위한 또 다른 도구입니다 9,10. 인용 된 두 가지 기계화 호퍼는 가정용 케이지 생활 공간을 줄인다는 경고와 함께 제공됩니다. 음식이 제한된 배고픈 동물은 먹이 기구를 씹을 수 있으며 케이지 파편은 장기 연구를 위한 호퍼 역학을 방해할 수 있습니다. 마지막으로, Takahashi 연구 그룹이 Phenome Technology와 함께 개발한 기계화 호퍼는 장기 정기 섭식 연구를 위해 특별히 설계되었습니다3. 이 시스템에서 기계화 된 호퍼는 음식을 배달하는 슈트가있는 표준 케이지의 와이어 랙 위에 배치됩니다. 그러나 페놈 시스템은 패치 케이블에 묶인 동물(광유전학/섬유 측광 실험)에 유연성을 제공하지 않으며 여기에 설명된 자동 공급 장치에 비해 상대적으로 비쌉니다.
예정된 수유 프로토콜에 만연한 문제에 대응하여 우리는 비용 효율적인 해결책을 제안합니다. 당사의 자동화 시스템은 미리 결정된 간격으로 정확한 음식 배달을 용이하게 합니다. 시중에서 판매되는 자동 어류 사료 공급기와 함께 3D 프린팅 부품을 결합하여 마이크로 아이솔레이터 상단을 사용하는 독립형 설치류 케이지에 장착할 수 있는 DIY(Do-It-Yourself) 외부 공급 시스템을 고안합니다. 여기에 설명된 먹이 시스템 및 부품은 독립형 케이지가 미세 절연체 상단을 사용하는 경우 쥐, 쥐, 햄스터 또는 기니피그와 같은 설치류 케이지에 직접 적용할 수 있습니다. 케이지의 크기가 다양하기 때문에 배치가 약간 다를 수 있지만 3D 프린팅 브래킷, 공급 시스템 및 외부 물병 디자인은 일반적으로 미세 절연체 뚜껑이 있는 독립형 설치류 케이지에 적용할 수 있습니다.
한 가지 예시로 자동 공급기를 소개하지만, 다른 많은 기성품 자동 공급기를 사용할 수 있으며 3D 프린팅 부품을 약간 변경하여 모듈식 시스템에 장착할 수 있습니다. 3D 프린팅 홀더를 대체 피더로 쉽게 조정하거나 케이지 치수를 약간 변경할 수 있도록 함께 제공되는 STL 파일로 수정 가능한 3차원 SolidWorks 파일을 증명합니다.
자동 급이통의 외부 배치는 가정용 케이지 내에 완전한 공간을 제공하고 동물을 방해하지 않고 급식기의 분리, 살균 및 재장전 또는 교체를 가능하게 합니다. 자동 공급 시스템은 장기 기록에 효율적이고 저렴하며 다양한 시간 제한 공급 및/또는 칼로리 제한 프로토콜을 준수할 수 있습니다. 우리는 샘플 데이터와 함께 공급 시스템을 구현하기 위한 케이지 어셈블리, 설계 및 프로토콜에 대한 자세한 기술 도면을 제공합니다. 둘째, 광유전학 또는 섬유 측광 실험을 위해 패치 케이블에 묶인 동물과 함께 자동 급이기를 사용하기 위한 표준 케이지를 수정하기 위한 일련의 지침을 제공합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 절차는 매사추세츠 대학교 애머스트 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 표준 마이크로 아이솔레이터 케이지 덮개에 자동 공급기 조립(그림 1)
- 1.5인치 절단 휠이 있는 회전 도구를 사용하여 20 x 25mm 정사각형을 미세 절연체 케이지 뚜껑으로 잘라냅니다. 뚜껑 가장자리에서 2.75cm 떨어진 곳에 구멍을 놓고 와이어 랙 위의 중앙에 배치합니다(그림 1B, 왼쪽).
- 브래킷을 3D 프린팅하여 자동 공급기를 케이지 덮개에 연결합니다(그림 1A 및 보충 파일 1). 브래킷을 케이지 뚜껑의 구멍에 끼웁니다(1.1단계; 그림 1B, 중앙)을 누르고 자동 급전 장치를 고정 브래킷 상단(그림 1B [오른쪽], C)으로 밀어 넣습니다.
그림 1: 자동 급지대 브래킷과 케이지 덮개 수정 및 조립. (A) 자동 급지대 브래킷의 기술 도면(3D 배율에 대해서는 보충 파일 1 의 SolidWorks/STL 파일 참조). (B) 왼쪽에서 오른쪽으로, 20 x 25mm 구멍이 있는 케이지 상단; 케이지 상단에 설치되고 Petbank 자동 공급기로 장착된 브래킷. (C) 물병이 있는 표준 와이어 랙에 떨어뜨린 식품 펠릿이 있는 케이지에 조립된 Petbank 자동 공급기. 스케일 바 = 25cm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 기성품 자동 공급 장치 예제의 프로그래밍 및 사용
- 시간 제한 실험의 경우 수유 시간을 먼저 설정하고 동기화된 피더 시계를 마지막에 설정하면 후속 조정으로 시계 시간이 변경됩니다.
- 피더가 충분히 충전되었는지 확인하십시오. 화면의 시간 설정이 깜박일 때까지 설정 버튼을 길게 누릅니다.
- 시간 설정을 계속합니다. 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 원하는 첫 번째 예정된 수유 시간으로 시간을 조정합니다.
- 이 시점에 대한 할당량 수를 설정합니다(피드 설정 옆에 있는 점 수로 표시됨). 최대 두 개의 시간 지점에 대해 2.2-2.4단계를 반복합니다.
- 자동 공급기 챔버에 표준 설치류 차우 ≤1.5g의 원하는 음식 할당량을 적재합니다. 더 많은 음식이 필요한 경우 지정된 시점에 여러 할당량을 배달하도록 피더를 설정합니다. 예시 피더에는 16개의 챔버가 있습니다.
참고: 음식은 크기에 맞게 주문하거나 가위로 다듬을 수 있습니다. - 프로그래밍된 챔버 회전 및 음식 전달을 확인하기 위해 하나의 챔버에 테이프 또는 페인트로 라벨을 붙입니다. 모이통을 운영하는 동안 매일 확인하십시오.
3. 자동 공급기가 있는 밧줄로 묶인 동물을 위한 수정된 케이지 시스템
- 패치 코드에 묶인 동물을 위한 교체용 뚜껑 삽입(옵션)(그림 2)
- 그림 2A의 사양에 따라 3mm 두께의 투명 아크릴 조각을 레이저로 절단합니다(보충 파일 2 참조). 아크릴 인서트는 케이지 상단에 끼울 수 있는 탭으로 설계되었습니다. 중앙 슬릿(190 x 5mm)을 통해 패치 케이블을 통과할 수 있습니다. 20 x 25mm 정사각형 구멍은 자동 급지 장치 브래킷에 맞습니다. 20개의 통풍구는 신선한 공기 순환을 가능하게 합니다.
- 일자 드라이버나 쐐기 도구를 사용하여 표준 마이크로 아이솔레이터 뚜껑의 구멍이 뚫린 케이지 상단 덮개를 들어 올립니다. 탭 슬롯에서 탭을 분리하고 구멍이 뚫린 삽입물과 여과지를 모두 제거합니다(그림 2C, 왼쪽 및 중앙).
- 천공된 상단과 여과지 아래에는 내부 늑골이 있는 지지 그리드가 있습니다. 회전 공구와 1.5인치 절단 휠을 사용하여 지지 그리드를 제거합니다. 그림 2C의 중앙에 표시된 화살표 표시기를 따릅니다. 지지 그리드를 제거하기 위해 절단한 후 줄로 절단면을 매끄럽게 합니다.
- 교체용 아크릴 플레이트 인서트(3.1단계)를 케이지 상단에 끼웁니다. 플레이트 탭을 짧은 모서리 중 하나를 따라 탭 슬롯으로 밀어 넣은 다음 긴 가장자리 중 하나를 따라 플레이트가 제자리에 고정될 때까지 부드럽게 눌러 설치를 시작합니다(그림 2C [오른쪽], D).
- 패치 코드에 묶인 동물을 위한 외부 물병 브래킷(옵션)(그림 3)
- 물병 시퍼용 포트를 뚫습니다: 케이지의 짧은 가장자리 중앙에 바닥에서 50mm 떨어진 직경 11mm의 구멍(그림 3B 및 보충 파일 3).
- 중앙 구멍(± 27.5mm)의 양쪽에 직경 6mm의 구멍 두 개를 뚫습니다. 선택적으로 8mm 사각 펀치 도구를 사용하여 사각 구멍을 뚫습니다( 그림 3B 참조).
- 외부 물병 브래킷을 3D 프린팅합니다(그림 3A 및 보충 파일 4). 캐리지 볼트(길이 2cm, 6 x 1mm 또는 0.75인치 길이 1/4 x 20; 그림 2B,C).
- 물병의 경우 외부 브래킷에 시퍼/스토퍼 어셈블리(#7 스토퍼 W/ 3-1/2" 곡선형 시퍼, 재료 표 참조)로 덮인 표준 50mL 원추형 튜브를 맞춥니다. 2-3일마다 물을 보충하십시오.
그림 2: 케이지 상단에 아크릴 판 조립. (A,B) 아크릴 플레이트 및 피더 포트 플러그의 기술 도면. (C) 구멍이 뚫린 인서트와 필터가 있는 왼쪽, 표준 케이지 상단. 중앙, 천공된 인서트 및 필터 제거(늑골이 있는 그리드는 화살표로 표시된 선을 따라 잘라내야 함). 오른쪽, 아크릴 판이 제자리에 끼워졌습니다. (D) 완전한 뚜껑 조립. 눈금 막대 = 25cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 물병 브래킷 어셈블리. (A) 3D 프린팅된 물병 브래킷의 기술 도면. (B) 케이지 개조 및 물병 브래킷 조립; (C) 브래킷이 설치되었습니다. (D) 완전한 케이지 어셈블리. 스케일 바 = 10cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 오토피더가 있는 전체 케이지 어셈블리 요약. (A) 와이어 랙이 있는 표준 케이지, (B) 테더링된 동물을 위한 수정된 케이지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
암컷 마우스의 불임을 유도하기 위한 칼로리 제한 연구(21일)(오토피더 및 케이지 설계, 그림 4A)
만성 에너지 결핍은 포유류의 생식력을 억제하기에 충분하며, 이러한 반응은 설치류와 인간 모두에게 보존되어 있습니다11,12. 이 연구에서는 장기적인 체중 감소를 유도하기 위해 칼로리 제한을 사용합니다. 15-18주 된 성체 암컷 C57BL/6 마우스는 단독 주택으로 12:12시간 라이트:다크 사이클을 진행하고 Zeitgeber Time 12(ZT12)에 소등을 해제했습니다. 먹이가 들어 있는 철사 선반은 기준 음식 섭취량인 3.80 ± 0.64g/일(평균 ± SE)을 설정하기 위해 일주일 간격으로 각 동물에 대해 매일 무게를 잰다. 다음으로, 체중 감소를 유도하기 위해 음식을 제한했습니다. 식품은 세 부분으로 나누어 배급하고 자동 공급기...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
전임상 동물 모델에서 칼로리 제한은 신진대사를 정밀하게 조작하고 연구할 수 있는 강력한 실험 도구입니다. 지속적인 체중 감량은 비만, 당뇨병, 노화, 생식력 및 폐경(생식 노화의 일종)에 영향을 미치며, 이 모든 것은 중요한 번역 종점입니다. 그러나 칼로리 제한 패러다임은 장기간 지속하기 어려울 수 있습니다. 이 원고에서는 실험실 환경에서 장기적인 칼로리 제한을 달성할 수 있는 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다. 기성품 자동 급식기를 표준 마이크로 아이솔레이터 뚜껑이 있는 설치류 케이지에 연결하는 지침이 제공됩니다. 모이통은 동물의 집 우리에 조립되며 예정된 시간에 음식을 배달하도록 프로그래밍되어 있습니다. 예정된 음식 배달은 음식 접근의 양과 시간을 제어하며 직원이 방에 들어올 필요가 없습니다. 또한 비용 효율적인 시스템은 장기간(수개월) 동안 실행할 수 있어 실험실 환경에서 장기적인 칼로리 제한을 달성할 수 있는 능력을 향상시킵니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Jason Lê는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받는 학사 후 연구 교육 프로그램의 지원을 받고 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #7 스토퍼 W/ 3-1/2" 곡선 시퍼 튜브 볼 없음 | Labex | 2067 | |
| AN75 마우스 케이지 바닥 | Ancare | AN75HT | |
| 수족관용 자동 물고기 모이통 | Petbank-tek.com | 아마존 유통 (#B0BRCWP16K) | |
| 설치류 마이크로 필터 탑 | Ancare | N10MBTPLF | |
| 고무 마개, 원 홀 | 유나이티드 사이언티픽 | S24009 | |
| 표준 설치류 차우 | Prolab IsoPro 3000 |
참고문헌
- Arble, D. M., Bass, J., Laposky, A. D., Vitaterna, M. H., Turek, F. W. Circadian timing of food intake contributes to weight gain. Obesity (Silver Spring). 17 (11), 2100-2102 (2009).
- Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metab. 15 (6), 848-860 (2012).
- Acosta-Rodriguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metab. 26 (1), 267-277.e2 (2017).
- Gallop, M. R., Tobin, S. Y., Chaix, A. Finding balance: understanding the energetics of time-restricted feeding in mice. Obesity (Silver Spring). 31 (Suppl 1), 22-39 (2023).
- Hua, L., et al. Time-restricted feeding improves the reproductive function of female mice via liver fibroblast growth factor 21. Clin Transl Med. 10 (6), e195(2020).
- Strilbytska, O., Klishch, S., Storey, K. B., Koliada, A., Lushchak, O. Intermittent fasting and longevity: From animal models to implication for humans. Ageing Res Rev. 96, 102274(2024).
- Di Francesco, A., Di Germanio, C., Bernier, M., de Cabo, R. A time to fast. Science. 362 (6416), 770-775 (2018).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian rhythms, and time-restricted feeding in healthy lifespan. Cell Metab. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Matikainen-Ankney, B. A., et al. An open-source device for measuring food intake and operant behavior in rodent home-cages. Elife. 10, e66173(2021).
- Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of rhythmic food intake in mice using a custom-made feeding system. J Vis Exp. (190), (2022).
- Kreisman, M. J., Tadrousse, K. S., McCosh, R. B., Breen, K. M. Neuroendocrine basis for disrupted ovarian cyclicity in female mice during chronic undernutrition. Endocrinology. 162 (8), ebqab103(2021).
- Allaway, H. C., Southmayd, E. A., De Souza, M. J. The physiology of functional hypothalamic amenorrhea associated with energy deficiency in exercising women and in women with anorexia nervosa. Horm Mol Biol Clin Investig. 25 (2), 91-119 (2016).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Chen, Y., Lin, Y. C., Kuo, T. W., Knight, Z. A. Sensory detection of food rapidly modulates arcuate feeding circuits. Cell. 160 (5), 829-841 (2015).
- Mandelblat-Cerf, Y., et al. Arcuate hypothalamic AgRP and putative POMC neurons show opposite changes in spiking across multiple timescales. Elife. 4, e07122(2015).
- Kahnau, P., et al. A systematic review of the development and application of home cage monitoring in laboratory mice and rats. BMC Biol. 21 (1), 256(2023).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rhythms in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 271-281 (2015).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
