단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

요약

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

초록

게놈 중복은 헬리케이스를 포함한 플리솜 단백질에 의해 조율되며, 이들은 이중 가닥 DNA를 개별 반평행 단일 가닥으로 풀어내며, 각 복제는 연속(선도)과 비연속(지연) 복제 방식을 요구합니다. 생 체 내에서 크로마틴 연관 단백질과 복제 DNA 가닥의 상호작용을 이해하는 것은 DNA 복제와 연관된 크로마틴 조립 및 DNA 복구 메커니즘을 밝히는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 복제 포크에서 초기 선행 및 지연 DNA 가닥의 상대적 단백질 수준을 정량하기 위해 고안된 단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱(eSPAN) 방법을 제시합니다. eSPAN 절차는 염색질 면역침전(효모 내 ChIP) 또는 포유류 세포에서 표적 및 태그먼트 하에서 절단(CUT&Tag; 포유류 세포에서)으로 시작되며, 이어서 단백질 관련 초기 DNA를 브로모데옥시우리딘(BrdU) 면역침전으로 풍부하게 만듭니다. 가닥 특이적 차세대 시퀀싱은 분리된 ssDNA에 적용됩니다. 이 기술은 단백질이 선행 복제 포크에서 농축되어 있는지 또는 지연 복제 포크에서 농축되어 있는지 판단하는 데 사용될 수 있습니다. eSPAN은 복제 포크에서 히스톤을 포함한 염색마틴 관련 단백질의 유전체 가닥 선호도를 제공합니다.

서론

진핵생물에서는 복제 기원이라 불리는 여러 부위에서 게놈 중복이 시작되며, 여기서 기원 인식 복합체(ORC)가 결합하여 CMG 헬리케이스를 포함한 모집 단백질 기구를 활성화하여 DNA 복제를^{시작합니다.} 각 복제 원점의 리플리솜 기계는 양방향으로 움직이는 두 개의 복제 포크를 형성한다 ^2,3. 쌍복제 포크는 선행 가닥의 연속 합성과 지연 가닥의 불연속 합성을 통해 DNA의 두 모 가닥을 복제합니다. 각 복제 포크의 비대칭성 때문에, 선행 및 뒤진 가닥에 있는 DNA 중합효소를 포함한 복제 구성 요소는 다릅니다. 돌연변이 DNA 중합효소를 기반으로 한 이전 유전적 분석에 따르면, DNA Pol ε와 DNA Pol δ가 각각 주도가닥 복제와 지연 가닥 복제를 담당하는 주요 중합효소임이 ^{입증되었습니다.} DNA 중합효소의 가닥 선호도를 감지하기 위해 Pu-seq ^6,7, HydEn-seq⁸, emRiboSeq 또는 RiboSeq ^9,10 등 여러 방법이 개발되었습니다. 이러한 가닥 특이성 해부법은 DNA 중합효소에 한정되며, 각 단백질 4,5,11,12에 돌연변이를 도입해야 합니다. 표적 단백질과 선행 및 지연 가닥의 DNA 복제 포크 연관성을 추적하는 것은 DNA 복제에 대한 귀중한 통찰을 제공할 것입니다. 이 과정에서 우리는 먼저 효모 세포에서 eSPAN 기법(단백질 관련 신생 DNA의 농축 및 시퀀싱, 그림 1)을 개발했습니다. 원리 증명 연구로서 우리는 먼저 폴 δ와 폴 δ가 각각 선행 가닥과 뒤진 가닥에서 풍부함을 보였다. 또한 복제 DNA 헬리케이스, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(복제 단백질 A), 증식 세포 핵항원(PCNA) 램프 및 그 로더 복제 인자 C(RFC)를 포함한 주요 DNA 복제 구성 요소들의 가닥 선호도를 밝혀냈다¹³. 중요하게도, 저희와 다른 연구자들은 이 방법을 통해 40년 넘게 해결하기 어려운 부모 히스톤 전달 메커니즘을 밝혀냈^습니다.

eSPAN 방법은 두 단계로 구성되어 있습니다: ChIP¹⁸ 또는 CUT&Tag¹⁹에 의한 표적 단백질의 농축과 BrdU 면역침전으로 단백질과 관련된 초기 DNA의 농축입니다. 표준 효모 균주(W303 또는 S288C)에서는 세포외 BrdU 또는 EdU가 세포에 들어가 염색체에 통합될 수 없습니다. 이 균주들은 티미딘 흡수를 위한 적절한 뉴클레오사이드 수송체와 티미딘을 TMP로 인산화하는 데 필요한 티미딘 키나아제가 부족하며, 이는 BrdU(또는 EdU)를 BrdUMP(EdUMP)로 전환시킵니다. 인간 평형 뉴클레오사이드 수송체 1(hENT1)과 단순포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK)의 발현은 티미딘 흡수와 BrdU(또는 EdU)의 BrdUMP(EdUMP)로 전환을 촉진합니다²⁰. 따라서 효모에서 eSPAN 실험을 수행하기 위해서는 균주를 BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) 구조(HSV-TK 및 hENT1)^13,21로 삽입해야 했다.

이전에는 효모²²의 DNA 복제 단백질을 위한 eSPAN 프로토콜을 제공했습니다. 최근에는 CUT&Tag 방법을 포유류 세포의 eSPAN 프로토콜에 통합하여 가교 결합, 염색질 전단, 시작 세포 수^17,23 최소화 등 최적화가 필요한 기술적으로 어려운 단계를 해결했습니다. 여기서는 효모 세포를 이용한 시각화를 위한 히스톤 eSPAN(그림 2)을 제공했습니다. 이 방법은 주로 복제 DNA 가닥에서 변형된 형태의 히스톤 분포를 분석하는 데 사용됩니다. 여러 히스톤 표식을 시험하는 동안, 부모 히스톤 H3에 있는 H3K4me3를 예로 들었습니다. 복제 포크에서 DNA 수리에 관여하는 플리플리오스 구성 요소와 인자를 분석하기 위해, 저희는 첫 번째 논문²²에서 설명한 대로 초음파 검사를 이용해 크로마틴을 작은 조각으로 전단할 것을 권장합니다. 포유류 세포의 경우, 효모²³에서 설명한 ChIP 단계를 대체하기 위해 수정된 Cut&Tag 절차를 채택했습니다. 이 변형은 출발물질(세포)의 양을 줄이고, 무엇보다도 단일 가닥 DNA 준비 키트를 사용하지 않고도 시퀀싱을 위한 eSPAN 라이브러리 생성이 가능해집니다. 효모 프로토콜에서는 시작 물질의 양이 충분했기 때문에 Cut&Tag 방법을 사용하지 않았습니다. 더 중요한 것은, Cut&Tag 절차가 우리 손의 효모세포에 대해 일관되게 효과적이지 않다는 사실을 발견했다는 것입니다.

프로토콜

참고: 버퍼 및 시약 준비 지침은 버퍼 및 시약 준비 지침(보충 파일 1)을 참조하십시오.

1. 출아 효모에서의 히스톤 eSPAN

참고: 대부분의 효모 균주는 티미딘 흡수를 위한 기능적 뉴클레오사이드 수송체가 없습니다. eSPAN에 대해 BrdU 또는 EdU로 DNA를 효율적으로 표지하기 위해서는 티미딘 키나아제(TK+) 균주²¹ 이 필요합니다. 또한, 알파 인자를 이용한 교배형 'A' 효모 균주만이 세포 주기 정지에 사용할 수 있습니다.

1. 효모 세포 동기화 및 BrdU 표지 (8시간)
   1. 적절한 효모 균주(TK+) 단일 군락을 10mL의 YPD 배지에 접종하고, 진동하는 인큐베이터에서 30°C에서 220rpm 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 분광광도계로 광학 밀도 OD600 nm를 측정하고, 배양물을 OD600 ~0.2-0.3의 신선한 YPD 배지 200mL에 희석합니다.
   3. 배양물을 OD600 ~0.4-0.5(보통 3-4시간)까지 30°C에서 220rpm의 진동 인큐베이터에서 배양합니다.
   4. 300 μL α인자(5 mg/mL)를 추가하고 25 °C, 220 rpm에서 1.5시간 배양합니다.
   5. 300 μL α인자(5 mg/mL)를 추가하고 25 °C, 220 rpm에서 1.5시간 더 증육합니다.
   6. 세포 동기화 과정에서 37.5% 파라포름알데히드 고정액을 준비하고 배지(200 mL YPD +HU(하이드록시우레아)+ BrdU)를 30°C로 예열합니다.
      주의: BrdU는 잠재적인 돌연변이 유발 물질이자 기형유발 물질이므로 주의하여 다루어야 합니다. 파라포름알데히드는 잠재적 발암물질이므로 유해 연기에 노출되지 않도록 화학 연기 후드에 37.5% 파라포름알데히드 용액을 준비하세요.
   7. 세포의 형태(막대 모양)를 광학 현미경으로 확인하여 효모 세포의 최소 90%가 3시간 G1 정지 1분 전에 G1 단계에 있는지 확인하세요. 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 수행하여 G1 정지²⁴를 확인하겠습니다.
      참고: 이 단계에서 세포 형태를 확인하고 G1 정지(막대 모양 기준 90%)를 확인하세요.
   8. 세포(펠릿)를 1600g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 수집하고, 20mL의 얼음 차가운 이중 증류수로 세포 펠릿을 두 번 세척합니다.
   9. 세포를 예열(30 °C) 200 mL의 YPD +HU+ BrdU에 재현탁합니다.
      참고: HU 방출의 목적은 대부분의 효모 세포가 초기 복제 S 단계에 있도록 하여 일관성을 높이고 결과의 재현성을 보장하는 것입니다. 로그 위상 셀을 사용해야 할 경우 HU를 생략하는 것도 허용됩니다.
   10. 세포를 30°C, 220rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 45분간 배양합니다.
       참고: FACS 분석을 통해 초기 S기를 확인할 수 있습니다. FACS 분석의 경우, G1 세포 집단을 정확히 정의하기 위해 로그 상 샘플을 대조군으로 포함하는 것이 중요합니다. 효율적인 BrdU 통합을 위해서는 빠르게 성장하는 세포부터 시작하는 것이 유리합니다. 성장 지연 결함을 가진 일부 돌연변이는 BrdU 표지 효율이 낮은 경향이 있습니다. BrdU 도입의 효율성과 BrdU-IP의 성능은 1.6.7단계에서 분리된^{DNA를 사용} 해 복제된 영역과 복제되지 않은 영역을 비교하여 정량적 PCR로 평가합니다.
2. 샘플 고정 및 채취 (1시간)
   1. 갓 준비한 37% 파라포름알데히드 6mL를 최종 농도 1%에 넣고 잘 섞은 후 25°C에서 20분간 부드럽게 흔들며 90rpm 배양합니다.
   2. 고정을 완화하기 위해 2.5M 글리신 12mL를 넣고 잘 섞은 후 25°C에서 5분간 부드럽게 흔들며 90rpm 배양합니다.
   3. 세포를 1600g에 실온(RT)에서 5분간 먹이세요. 그 후 1600g에서 5분간 돌려 20mL의 찬물로 세포를 두 번 세척합니다.
   4. 세포를 2mL 스크류 캡 튜브(세포/튜브 50mL)에 모아 -80°C에 보관하세요.
      참고: 셀은 최대 1년(일시정지)까지 저장할 수 있습니다.
3. 효모 세포 용해와 크로마틴 분쇄 (5시간)
   1. 세포 펠릿을 해동한 후 부드러운 소용돌이 작용으로 재현지한 후, 프로테아제 억제제와 항생제 혼합물이 포함된 ChIP 용해 완충제(오염 박테리아 성장 방지)를 0.4mL로 세척한 후 5,000g에서 1분간 회전시킵니다.
   2. 프로테아제 억제제가 포함된 ChIP 용해 완충제를 0.1mL와 항생제 혼합물을 추가하고, 약 100μL의 유리 구슬(0.5mm)을 추가합니다.
   3. 용해는 4°C 냉랭실에서 3사이클(30초 켜고 끄기, 1분 휴식) 동안 비드 두드림으로 합니다.
   4. 16G 뜨거운 바늘로 튜브 바닥에 구멍을 뚫으세요.
      참고: 뜨거운 바늘을 유지하려면 튜브를 불 가까이에 두는 것이 좋습니다.
   5. 튜브를 1.5mL 빈 DNA 저결합관에 넣어 1600g 원심분리기에서 2분간 RT 상태로 보관합니다.
   6. 상정액은 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 흡입하세요(염색질은 세포 잔해 분획에 포함됩니다).
      주의: 진공청소기 사용 시 셀 펠릿을 실수로 흡입하지 않도록 주의하세요.
   7. 0.35 mL의 MNase 소화 버퍼에 0.5 mM 스퍼미딘과 0.1 mM 2-머캅토에탄올을 보충하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   8. 반응에 MNase 10 단위를 추가하고, 즉시 4-6번 뒤집어 부드럽게 섞은 후 37°C 수욕에서 20분간 배양합니다.
      참고: 각 MNase 효소 배치별로 단핵체, 디염염체 또는 삼염염체 분획을 농축하도록 소화 조건을 최적화해야 합니다.
   9. 0.5 M EDTA 5 μL을 첨가하여 최종 농도는 10 mM EDTA로 만듭니다. 부드럽게 반전시켜 섞고, 튜브를 얼음에 최소 30분 이상 넣어 두세요.
      참고: 이 단계에서 샘플은 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. MNase 소화 조건은 단핵체, 이염염체 또는 삼염염체(140-450염염계염기염소) 대부분을 얻도록 최적화되어야 합니다
   10. 바이오랍터 마이크로튜브(1.5mL)로 반응 혼합물을 초음파 처리하여 3분간 고출력 30초 온/오프 상태로 세척합니다. 10,000g에서 4°C 에서 5분간 돌립니다.
       참고: 이 짧은 초음파 검사는 크로마틴을 버퍼로 방출하는 데 도움을 줍니다.
   11. 상청액을 새 튜브로 옮기고, 10,000g, 4 °C에서 10분 더 회전 시킵니다.
   12. 상정액(약 400 μL)을 수집하고, 샘플 30 μL을 입력 DNA로 저장한 후 -20 °C에서 냉동합니다. 남은 (~370 μL) 세포 용해액을 다음 염색질 면역침전(단계 1.4.1)에 사용합니다.
4. 히스톤 염색질 면역침전(하룻밤)
   1. 용해액에 H3K4me3 항체 0.5 μg를 첨가하고 로터에서 10rpm, 4 °C에서 하룻밤 동안 터테이팅합니다.
      참고: 여기서는 H3K4me3를 예시로 사용합니다. 항체 양은 실험적으로 검사해야 합니다.
   2. 15,800 × g 에서 4 °C에서 10분간 돌린 후 상원액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
   3. 미리 세척된 단백질 G 세파로스 비즈 20 μL을 추가(ChIP 용해 버퍼로 3회 세척, 로터에 각각 3분간 튜테이팅, 350 × g, 4 °C에서 원심분리로 비즈 수집) 4 °C에서 2시간 배양.
   4. RT에서 350 × g으로 돌리고, 다음 순서대로 비즈를 세척하세요.
      1. 1mL 얼음 냉각 용해 버퍼로 각각 3분씩 10rpm으로 회전시켜 RT 자세로 세척합니다.
      2. 0.5M NaCl 완충액이 포함된 얼음 냉각 용해 버퍼 1mL로 1회 세척하며, RT 10rpm으로 회전시켜 3분간 세척합니다.
      3. 얼음처럼 차가운 Tris/LiCl 세척제 1mL로 10rpm으로 회전시켜 3분간 세척합니다.
      4. 1mL RT Tris/EDTA 세척 버퍼(TE 완파제가 아니라 레시피 보조 파일 1) 로 세척하세요. 16 G 1/2 바늘로 펠릿에서 가능한 모든 액체를 빼내세요.
5. DNA 추출 (2시간)
   1. 세척된 구슬(1.4.4.4단계), 입력 샘플(1.3.12단계에서), 그리고 소용돌이에 DNA 추출을 위해 잘 혼합된 10% 킬레이팅 수지 0.1mL를 첨가합니다.
   2. 100°C 열덩이에 10분간 끓인 후 RT로 식혀 역가교를 합니다.
      참고: 원심분리관용 스톱팝 잠금 클립은 닫힘 밀봉을 유지하기 위해 강력히 권장됩니다.
   3. 구슬에 20 mg/mL 프로테아제 K 5 μL 첨가하고 55 °C에서 30분간 배양하며 400 rpm으로 흔듭니다.
   4. 구슬을 100°C 열덩이에 10분 더 끓여 프로테아제 K 활성을 비활성화합니다.
      참고: 원심분리관용 스톱팝 잠금 클립은 닫힘 밀봉을 유지하기 위해 강력히 권장됩니다.
   5. 6000g에서 2분간 RT로 구슬을 돌려 상상액을 보관하세요.
   6. 펠릿에 2XTE 100 μL을 추가하세요. 6000g 회전 후 2분간 RT에서 회전 다운을 하세요.
   7. 위에서 언급한 1.5.5 및 1.5.6 단계의 상원액(약 180 μL)을 혼합하여 저장합니다.
   8. 30 μL 샘플을 18 μL 용출 버퍼(EB, PCR 정제 키트 제공)에 정제하여 SSDNA 라이브러리 준비를 위해 DNA 정제 컬럼을 사용합니다(입력 1.3.12 단계부터, H3K4me3 ChIP-seq 샘플 1.5.7단계부터).
      참고: DNA 샘플은 -20°C에서 최대 한 달(일시정지)까지 보관할 수 있습니다.
6. BrdU 면역침전(5시간)
   1. 샘플(약 150μL 입력량과 1.5.7단계의 H3K4me3 ChIP)을 100°C 열블록에서 5분간 끓인 후 즉시 얼음에 5분간 냉각합니다. 10x PBS 15 μL 및 BrdU IP 완충제 + 1.35 mL + 항 BrdU Ab 0.5 μL + 대장균 tRNA 1 μL (10 mg/mL)을 추가합니다.
      참고: 이는 매우 중요한 단계입니다. 비특이적 DNA 결합을 피하려면 저결합 원심분리관을 사용하세요.
   2. 로터에서 4°C, 10rpm에서 2시간 동안 튜테이션을 수행하세요.
   3. 혼합물을 1.5mL 튜브에 20 μL 단백질 G 세파로스 비즈를 넣어 1mL 튜브로 옮기고(1mL BrdU IP 버퍼로 세 번 세척하고, RT 세척 시 각 10rpm 각각 3분씩 회전), 로터에 4 °C에서 1시간 동안 10 rpm 동안 튜테이팅합니다.
   4. 800 × g에서 RT에서 1분간 돌린 후 다음 방식으로 세척합니다: 1mL 차가운 BrdU IP 버퍼로 3회, 로터에서 3분, TE 완퍼 1회, 3분간 1mL TE 버퍼로 3분간 세척합니다.
   5. 800 × g 에서 1분 동안 RT에서 돌린 후 상정액을 흡인하세요.
   6. 남은 비즈에 TE + 1% SDS 버퍼 100 μL ×를 추가하세요. 65 °C에서 5분간 배양합니다. RT에서 800 g × 1분간 회전하세요.
   7. DNA 정제 컬럼(BrdU IP 및 H3K4me3 eSPAN 샘플)을 사용하여 상청액을 18 μL EB로 정제합니다.
      참고: 비특이적 DNA 결합을 피하려면 저결합 원심분리관을 사용하세요. DNA 샘플은 -20 °C에서 최대 한 달(정지 지점) 보관할 수 있습니다.
7. ssDNA 라이브러리 준비 및 서열 분석 (3시간)
   1. ssDNA와 저입력 DNA 라이브러리 준비 키트에서 제공하는 매뉴얼에 따라 15 μL 정제 입력, BrdU IP, H3K4me3 ChIP, eSPAN 샘플(1.5.8 및 1.6.7단계)(어댑터아저, 확장 및 연결화 단계 포함)을 사용하여 단일 가닥 DNA 라이브러리 라이브러리를 준비하고, 얻은 연결 생성물을 20 μL 저 EDTA 용출 버퍼(DNA 라이브러리 준비 키트에서 제공)로 정제합니다.
      참고: 키트에는 두 가지 연결 정제 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 200 bp, <1 ng 절차를 따릅니다.
   2. 총 50 μL 반응 혼합물(ssDNA 라이브러리 준비 키트에서 제공된 시약)을 사용하여 DNA 라이브러리를 증폭합니다: 정제 DNA 라이브러리 20 μL, 시약 W2 4 μL, 시약 W3 10 μL, 효소 W4 1 μL, 인덱스 I7 프라이머 1.5 μL (10 μM, 보충 올리고 서열 참조), 인덱스 I5 프라이머 1.5 μL (10 μM, 보충 올리고 서열 참조), DNase 프리 ddH₂O 16 μL PCR 혼합물을 98 °C에서 30초간 가열한 후, 98 °C에서 10초씩 18회, 60 °C에서 30초, 68 °C에서 1분, 68 °C에서 10분 1회 사이클을 거행합니다.
      참고: 각 라이브러리는 i7과 i5 프라이머의 고유한 조합을 사용해야 합니다. 증폭 사이클 수는 라이브러리 양에 따라 조절하여 과도한 증폭을 방지해야 하며, 과도한 증폭은 PCR 아티팩트로 이어질 수 있습니다. eSPAN 샘플의 DNA 수량이 일반적으로 적기 때문에 최대 18사이클을 사용하세요.
   3. PCR 산물은 30°C로 예열하여 60 μL(1.0x 부피)의 비드를 혼합하여 정제합니다(재료 표 참조).
   4. PCR 제품과 구슬을 충분히 섞으세요.
      1. RT 상태로 5분간 두세요. 구슬을 자기 스탠드에 3분간 묶고, 각 200 μL의 갓 준비된 80% 에탄올로 두 번 세척합니다.
      2. 구슬을 2분간 자연 건조한 후 20 μL 저EDTA 버퍼(DNA 라이브러리 준비 키트에 제공됨)에 용출합니다.
   5. 고해상도 전기영동 시스템을 사용하여 라이브러리 농도와 조각 크기 분포를 측정합니다( 재료표 참조).
   6. 입력, H3K4me3 ChIP, BrdU IP, eSPAN 샘플을 포함한 동일한 수의 개별 라이브러리를 모아 Illumina 시퀀싱 플랫폼과 병렬 쌍 끝 시퀀싱을 수행합니다. 데이터 분석 과정에 대해서는 3절을 참조하십시오.
      참고: 품질 관리 결과 평가 기준은 다음과 같습니다: (i) 어댑터/프라이머-다이머 피크(180 bp 미만)는 검출되지 않음. (ii) 풀링될 모든 라이브러리는 비슷하고 좁은 크기 분포(~300 bp 폭)를 가집니다. 구슬을 과도하게 건조하면 수확량이 낮아질 수 있습니다; 오염을 피하려면 DNA 워크스테이션을 사용하세요. 라이브러리는 -20°C(일시정지점)에서 무한정 저장할 수 있습니다.

2. 마우스 ES 셀을 사용하는 히스톤 eSPAN

참고: 마우스 ES 세포를 이용한 히스톤 eSPAN은 본질적으로 이전에 발표된 프로토콜²³과 동일합니다.

1. 쥐 ES 세포의 BrdU 표지 및 샘플 채취 (3시간)
   1. 마우스 ES 세포를 37°C의 가습 5%_CO2 대기 환경에서 ES 세포 배양 배양지에서 70%-80% 합류 비율로 배양합니다. 일반적으로 히스톤 eSPAN에는 약 100만 개의 세포가 필요했습니다. 실험 1일 전에 세포를 씨앗 심어 세포가 기하급수적으로 성장하는지 확인합니다.
   2. 배지를 교체하고 최종 농도 50 μM에서 37°C에서 30분간 BrdU로 세포를 배양하고, 가습된 5%_CO2 대기 상태에서 배양합니다.
      참고: BrdU 표지 효율성은 정량적 PCR 분석을 통해 모니터링할 수 있습니다. 또는 면역형광 또는 FACS 분석을 통해 BrdU 통합 효율을 모니터링할 수 있습니다. 표지되지 않은 세포는 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 이것이 쥐 ES 세포의 표준 표지 조건입니다. 증식률과 S상 지속 기간이 다양한 세포에 따라 표지 조건을 적절히 조정할 것이 권장됩니다.
   3. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 부드럽게 두 번 헹구세요.
   4. 트립신화하여 세포를 200× g에서 5분간 페 일릿으로 채취합니다.
   5. 세포를 부드럽게 배지에 피펫팅해 재현탁시키고, 그 후 셀을 세세요. 500 × g 에서 필요한 셀 수를 5분간 RT 원심분리합니다.
   6. 피펫팅으로 세포 펠릿을 4mL 세척 버퍼에 재현탁한 후 상원액을 버립니다. 원심분리기 500 × g에서 5분간 RT 측정.
   7. 펠릿을 다시 4mL 세척 버퍼와 함께 재현탁하고 500 × g에서 원심분리기에서 RT에서 5분간 사용 하세요.
   8. 상청액을 버리고 세포를 세척 완충기에 다시 부탁하세요.
   9. ConA 코팅된 자기 비즈를 넣고(250,000 세포에 10 μL 비즈 사용; 더 많은 세포를 사용할 때는 확대) 1 mL의 결합 버퍼에 재현탁합니다. 여러 번 뒤집은 후, 튜브를 자석 스탠드 위에 올려 비즈가 가라앉도록 합니다.
   10. 피펫이나 저속 진공청소기를 사용해 상청액을 버리세요. 세척 과정을 두 번 반복한 후 구슬을 다시 결합 버퍼에 고정하세요.
   11. 샘플에 미리 세척된 ConA 코팅 자석 비즈를 추가하세요. 잘 섞고 RT로 10-20분 돌려보세요.
   12. 튜브를 자석 받침대에 올려 상정액을 모두 제거하세요.
2. 마우스 ES 세포 태그멘테이션¹⁹ (2일)
   1. 구슬(2.1.10단계의 세포와 결합된 ConA 코팅 자석 구슬)을 200 μL 얼음 차가운 항체 버퍼에 재현탁합니다. IgG를 음성 대조군으로 추가하거나 관심 단백질에 대한 적절한 1차 항체 농도로 추가하세요.
   2. 잘 섞고 4°C에서 하룻밤 동안 튜테이팅하세요.
   3. 2차 항체 2 μg와 적절한 pA-Tn5를 1:2 몰 비율로 혼합합니다. 전체 부피를 샘플당 8 μL로 50% (v/v) 글리세롤과 함께 모으세요. 피펫을 여러 번 사용해 잘 섞고 RT에서 1시간 배양하세요.
   4. CUT&Tag 샘플을 자석 스탠드에 30초 올려놓고 모든 상상액을 버립니다. 비즈 펠릿에 1mL의 Dig-wash 버퍼를 넣고 여러 번 뒤집으세요.
      참고: 이 단계부터 다음 세척 단계(2.2.5-2.2.6단계)까지, 비특이적 결합을 방지하기 위해 반전 단계 후 버퍼 안에서 3-5분간 구슬을 배양하는 것이 권장됩니다.
   5. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고 모든 상원액을 제거하세요. 각 샘플에 200 μL Dig-300 버퍼를 추가하여 비즈를 재현탁하고, 2차 항체와 pA-Tn5 혼합물 8 μL을 각 샘플에 첨가합니다. 피펫팅과 함께 여러 번 잘 섞은 후, RT에서 1시간 동안 배양하세요.
   6. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고 모든 상원액을 제거하세요. Dig-300 버퍼 1mL를 추가해 비즈를 재현탁하고 여러 번 뒤집습니다.
   7. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고 모든 상원액을 제거하세요. 세척 과정을 3번 더 반복하세요.
   8. 상원액을 완전히 제거하고 250 μL 태그멘테이션 버퍼를 추가해 구슬을 재현탁한 후 37 °C에서 1시간 배양합니다.
      참고: 열믹서에서 반응 단계에서는 구슬이 튜브 바닥에 침전될 수 있으므로 부드러운 흔들기가 권장됩니다.
   9. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고 모든 상원액을 제거하세요. 1mL의 TAPS 워시 버퍼를 사용해 비즈를 재현액하고 여러 번 뒤집으세요.
   10. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고 모든 상정액을 버리세요.
   11. 남은 구슬에 15 mM EDTA, 0.1% (w/v) SDS, 0.1 mg/mL 단백질효소 K를 포함한 Dig-300 버퍼 250 μL을 첨가합니다. 보텍스를 잘 섞어 37°C에서 밤새 부드럽게 흔들며 부화시킵니다.
3. 마우스 ES 세포에서의 유전체 DNA 정제 및 시험관 내 표지 지정(하룻밤)
   참고: eSPAN과 동일한 세포에서 유전체 DNA를 추출하여 시험 관 내 태그먼트를 준비하며, 이는 BrdU-IP-ssSeq에 사용됩니다. 유전체 DNA 태그멘테이션과 그 뒤따르는 BrdU-IP-ssSeq는 eSPAN 정규화 목적을 위한 것입니다.
   1. 세포를 300 μL 유전체 DNA 용해 완충제에 재현탁하고 최대 속도로 소용돌이를 돌려 펠릿이 보이지 않을 때까지 반복합니다.
   2. 모든 샘플마다 100 μg/mL의 RNase A를 첨가합니다. 혼합 후에는 37°C에서 10분간 배큐합니다.
   3. 각 샘플에 단백질 침전 용액 100 μL을 추가하세요. 15,000g RT에서 3분간 소용돌이 후 원심분리기로 잘 섞으세요.
   4. 상원액을 1.5mL 튜브로 옮겨 보존하세요. 샘플에 1배 용량의 이소프로판올을 추가하고 잘 섞으세요.
   5. RT에서 최대 속도로 3분간 회전시켜 유전체 DNA를 펠릿으로 남깁니다. 상정액을 조심스럽게 부어주세요.
   6. 각 샘플에 신선하게 준비한 70%(v/v) 에탄올 1mL를 첨가하고 여러 번 뒤집습니다. RT에서 최대 속도로 원심분리기를 3분간 돌립니다.
   7. 15,000g에서 RT 1분간 원심 분리기로 사용한 후 P20 피펫으로 남은 에탄올을 제거합니다. 5-10분 동안 자연 건조시키세요.
   8. ddH₂O 50 μL을 추가한 후 잠시 소용돌이를 하여 유전체 DNA를 재현탁합니다. 65°C에서 30분간 녹여.
   9. 원심분리기를 잠시 하고 상원액을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 분광광도계로 DNA 농도를 정량화하세요.
   10. 표 1에 명시된 시험관 내 표지 반응을 설정하세요.
   11. 잘 섞은 후 37°C에서 30분간 부드럽게 흔들며 배양하세요.
   12. 각 샘플에 10 mM EDTA, 0.1% (w/v) SDS, 0.1 mg/mL 단백질효소 K를 첨가합니다. 소용돌이로 잘 섞은 후 37°C에서 하룻밤 동안 흔들면서 배양하세요.
4. DNA 추출 및 올리고 치환 (3시간)
   참고: DNA 추출에는 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(PCI)과 컬럼 정제가 모두 적용될 수 있습니다. 여기서는 컬럼 정제를 이용한 상세 절차가 제공됩니다.
   1. 샘플에 1.25 mL(5배 용량)의 결합 버퍼(PCR 정제 키트에 제공됨)를 첨가하고(2.2.11 및 2.3.12 단계), 여러 번 역전하여 잘 혼합합니다.
   2. 혼합물을 DNA 정제 컬럼(2mL 채집관)에 적재한 후 RT 10,000 × g에서 30초간 원심분리합니다. 흐름 액체는 버립니다.
   3. 600 μL 용출 완충제(키트에 포함됨)를 컬럼에 추가하고, 10,000 × g RT 조건에서 1분간 원심분리합니다. 플로우 스루 버립니다.
   4. 남은 완충제를 완전히 제거하기 위해 최대 속도로 2분간 원심분리기를 사용하세요. 캡슐을 뚜껑을 열린 새 1.5mL 튜브에 넣고 1분간 자연 건조하세요.
   5. 막 중앙에 32 μL DNase 프리 ddH₂O(또는 10 mM Tris·HCl, pH = 8.0)를 넣고 1분간 휴지시킵니다. 최대 속도로 2분간 원심분리기를 하면 CUT&Tag DNA가 용액에 들어갔습니다.
   6. 새로운 PCR 튜브에 CUT&Tag DNA 샘플 32 μL을 추가한 후, dNTP 혼합물 2 μL(각각 2.5 mM), 10x 앰플리게이제 버퍼 4 μL, rep-B 2 μL(10 μM)를 추가합니다. 살짝 두드리고 피펫으로 섞으세요.
   7. 잠시 스핀다운하여 올리고 치환²³에 대한 다음 프로그램을 실행하세요.
      50 °C, 1분
      45 °C, 10분
      37 °C, 0.1 °C/s 상승
      37 °C, 멈춰
   8. 열사이클러에서 각 튜브(최종 부피, 샘플당 40 μL)에 T4 DNA 중합효소 1 μL과 암리게이제 1 μL을 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅으로 섞으세요.
   9. 37°C에서 열순환기에서 30-60분간 반응을 계속합니다.
      참고: 이 단계 직후 BrdU IP로 진행하지 않으면 DNA는 -20°C에서 저장할 수 있습니다(안전 일시정지).
5. BrdU 면역침전법(본질적으로 효모 프로토콜과 동일) (2시간)
   1. 샘플을 1.5mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다. 샘플을 100°C 열덩이에 5분간 끓인 후 즉시 얼음에 5분간 식힙니다. 10x PBS 15 μL 및 BrdU IP 완충제 + 1.35 mL + 항 BrdU Ab 0.5 μL + 대장균 tRNA 1 μL (10 mg/mL)을 추가합니다.
   2. 4 °C에서 로터에 2시간 동안 튜테이팅합니다.
   3. 혼합물을 20 μL 단백질 G 세파로스 비즈가 들어있는 튜브로 옮기세요(1 mL BrdU IP 완충액으로 3회 세척, 각 3분).
   4. 4°C에서 1시간 동안 배양하세요.
   5. 800 × g에서 1분간 회전 시키고 다음 순서대로 세척합니다: 1mL의 차가운 BrdU IP 버퍼로 세 번, 로터에서 3분; 한 번은 1mL TE 버퍼와 함께 3분간 투여했습니다.
   6. 800 × g 에서 1분간 돌린 후 상청액을 흡인하세요.
   7. 남은 비즈에 TE + 1% SDS 버퍼 100 μL 추가. 65°C에서 15분간 배양하세요. 800 × g 에서 1분간 돌리세요.
   8. DNA 정제 컬럼(BrdU IP 및 H3K4me3 eSPAN 샘플)을 사용하여 상청액을 18μL 용출 버퍼(키트 제공)로 정제합니다.
6. PCR 증폭 및 시퀀싱 (1.5시간)
   1. 다양한 인덱스 조합을 사용하여 단일 가닥 DNA 라이브러리 샘플을 증폭하고 라벨링합니다. 다음 성분을 첨가하여 PCR 반응을 준비합니다((정제 DNA [ChIP 또는 ESPAN], I5-인덱싱 프라이머 [1 μL], I7-인덱싱 프라이머 [1 μL], NEBNext 고충도 2X PCR 마스터 믹스(2x) [10 μL], ddH₂O에서 최대 20 μL까지), 피펫팅으로 샘플을 혼합하고 잠시 회전시킵니다.
   2. PCR 혼합물을 98 °C에서 30초간 가열한 후, 98 °C에서 10초, 63 °C에서 20초씩 12-14회 사이클, 그리고 72 °C에서 2분씩 한 번 가열합니다.
   3. PCR 산물을 18 μL 파라자성 비드(0.8배 부피)로 정제하여 20 μL 저 EDTA 버퍼로 만듭니다.
   4. 고해상도 전기영동 시스템을 사용하여 라이브러리 농도와 조각 크기 분포를 측정합니다.
   5. 입력, H3K4me3 ChIP, BrdU IP, eSPAN 샘플을 포함한 동일한 수의 개별 라이브러리를 모아 Illumina 시퀀싱 플랫폼과 병렬 쌍 끝 시퀀싱을 수행합니다.

3. 효모 세포 데이터 분석 (1일)

참고: 이 데이터 분석 과정은 효모 데이터에만 적용됩니다; ES 셀에 대한 eSPAN 데이터 분석은 최근 논문²³에서 설명한 대로 따라갈 수 있습니다.

1. 원시 시퀀스 파일을 추출하고, Trim Galore 도구로 어댑터 시퀀스를 트림하며, 출력 파일 크기를 줄이고 정렬 프로그램 충돌을 방지하기 위해 10 bp 미만의 리드를 제거하세요. 파일이 file1_1.fq, file1_2.fq 형식으로 읽기 위해 반드시 확인하세요:
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --length 10 - 쌍
2. 참조 유전체에 대한 보타이 인덱스 파일 생성:
   보우타이2-빌드 Genome.fa
3. Bowtie 2를 사용하여 해당 참조 게놈(효모의 경우 Saccharomyces 게놈(sacCer3))과 매핑할 수 있습니다:
   보타이2 -x 게놈 -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --국소 --비둘기조리 없음 --불협화음 없음 --맥신 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
4. SAMtools로 멀티맵 리드를 제거하고 Sambamba 도구로 중복 리드를 제거하세요:
   Samtools 뷰 -BHS - Q 40 input.bam -o output.bam
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
5. deeptools를 사용해 깨끗한 bam 파일에서 각 샘플별로 Watson과 Crick 스트랜드의 주요 리드 커버리지 파일을 별도로 생성합니다:
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
   bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
6. 각 샘플에 대해 각 뉴클레오좀 위치²⁵ 에서 평균 편향을 공식에 따라 계산합니다: log2 참조 뉴클레오좀 위치 추적 후 순방향(왓슨 가닥)/역방향(크릭 가닥) 측정값은²⁵ 분리되었습니다. 이 계산을 위한 R 스크립트는 https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias 에서 제공됩니다. 표준 계산을 위해서는 다음 명령어를 사용하세요.
   참고: 이 단계는 효모 데이터에만 적용됩니다; ES 셀에 대한 편향 계산은 최근 논문인²³에서 설명한 대로 따라갈 수 있습니다.
   cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins. 침대
7. 필요하다면 BrdU 편향으로 가닥 바이어스를 조정하세요:
   normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --목표 target_list --제어 control_list
   참고: "matrix_files"은 cal_bias에서 생성된 파일 목록입니다. 쉼표로 구분된 R 스크립트. 예를 들어 'file1', 'file2', 'file3' 등이 있습니다. "classes_list"은 쉼표로 구분된 각 파일에 대응하는 샘플 클래스 목록입니다(예: 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list"는 각 파일에 대응하는 샘플 조건 목록이며 쉼표로 구분되어 있습니다. 각 파일은 클래스와 조건별로 편향 조정을 위해 쌍으로 배정됩니다. "target_list"는 classes_list에서 수강한 수업 목록입니다. 컨트롤이 조정할 데이터 클래스(예: 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN')를 정의합니다. "control_list"은 수업 목록에서 수강된 수업 목록입니다. 이 클래스는 컨트롤이 조정할 데이터 역할을 할 클래스를 정의합니다. 목록 길이가 target_list와 같은지 확인하세요(예: 'brdu')
8. 계산과 조정 후, 샘플을 그룹화하고 데이터의 시각화를 만드세요.
   draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g 군 1,군 2 --간격=T
   -s는 위 스크립트들로 생성된 편향 파일 목록이 필요합니다
   -o는 출력 파일입니다
   -g는 계산할 실험 그룹, 즉 생물학적 복제를 정의하여 평균 편향을 도표합니다.
   --구간 T 또는 F를 사용하여 실험 그룹 내 그래프에서 표준오차를 표시합니다.
   참고: 복제 출처에 관한 정보는 BrdU IP 데이터로 정의되었습니다. 단일 염기체 위치 정보는 이전에 발표된^{논문 25}에서 얻어졌습니다. 마우스 ES 세포 데이터 분석의 경우, 기원 정보는 OK-seq 데이터셋²⁶에서 얻었으며, 평균 편향 계산은 이전 연구²³에서 제시한 프로토콜을 따라야 합니다.

결과

eSPAN은 히스톤 및 히스톤 변형과 같은 표적 단백질에 관한 가닥 특이적 정보를 얻는 데 활용될 수 있습니다. 이 대표적인 결과에서는 표본 채취와 eSPAN 공정이 그림 2에 제시된 도식에 따라 출아 효모 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 샘플 처리 및 채취는 하이드록시우레아 처리 초기 S상 조건을 따릅니다. 두 가지 효모 균주인 WT(야생형)와 mcm2-3A 돌연변이체가 사용되었다. DNA 헬리케이스 소단위체 MCM2는 부모 히스톤 H3-H4 샤페론 역할을 하는 반면, 3개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 mcm2-3A 돌연변이는 부모 히스톤 H3-H4^14,27에 결합하는 능력이 없습니다. 그림 3A는 일정한 길이의 배수를 가진 DNA 조각을 보여주며, 준비된 시퀀싱 라이브러리를 위해 ...

토론

선행 및 지연 복제 가닥과 관련된 단백질 검출은 염색질 복제 메커니즘과 관련 과정을 이해하는 데 중요하며, 이는 인간 암 연구와 약물 내성 메커니즘에 직접적으로 관련이 있습니다. 2D 겔, 천연 크로마틴 면역침전(nChIP), iPOND, 신생 염색질 캡처 ^29,30,31과 같은 여러 방법이 DNA 복제와 DNA 수리와 같은 관련 과정을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 신생 염색질의 생체 내 지도화를 위한 방법들, 예를 들어 MINCE-Seq(EdU 및 시퀀싱을 이용한 생체 신생 염색질 매핑)³², CHOR-seq(복제 후 염색질 점유)³³와 같은 방법들이 DNA 복제 과정에서 히스톤 및 기타 염색질 결합 단백질의 역학을 연구하기 위해 개발되었...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 M EDTA, pH 8.0	써모피셔 사이언티브	15575020
1.5 mL DNA 저결합 튜브	에펜도르프	22431021
10배 앰플리게이제 버퍼	루시겐	A1905B
10배 PBS	코닝	21-040-CV
10배 TBS	바이오래드	1706435
16 G x 1-1/2인치. BD 프리시전글라이드 바늘	BD 생명과학	305198
ACCEL-NGS 1S 플러스 DNA 라이브러리 키트	통합 DNA 기술	10009817	ssDNA 및 저입력 DNA 라이브러리 준비 키트
애질런트 2100 바이오분석기	애질런트	2100 생물분석
애질런트 DNA 1000 키트	애질런트	5607-1504
앰리가이제	루시겐	A0110K	파라포름알데히드는 조심해서 다루세요. 가연성 고체이고 위험합니다.
AMPure XP	벡맨	A63881
AMPure XP SPRI 시약	벡먼 쿨터	A63882
항-BrdU 항체	BD 생명과학	555627
항-H3K4me3 항체	ABCAM	AB8580
자동 셀 카운터 , 모델 TC10	바이오래드	145-0001
바치트라신	시그마	11702
박토 펩톤	써모피셔 사이언티브	211830
벤자미딘 하이드로클로라이드	시그마	B2417	가연성 고형물
BrdU	시그마	B5002	BrdU는 잠재적인 돌연변이 유발 물질이자 기형유발 물질이므로 조심해서 다루세요.
BSA	뉴잉글랜드 바이오랩스	B9000S
CaCl2	시그마	C4901
세포 배양 인큐베이터	서모 피셔 사이언티픽   모델 포르마 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터	3140
세포 배양 배양지
세포주 ES-E14
Chelex-100	바이오래드	1422842	200– 400 드라이 메쉬 사이즈
클로로포름	시그마	366919
콘카나발린 A(ConA) 코팅된 자기 구슬	폴리이언스	86057-10
디지토닌	밀리포어	300410-5MG
DMSO	시그마	D8418
대장균과 nbsp; tRNA	시그마	10109541001
에탄올	써모피셔 사이언티브	BP2818100	에탄올은 가연성이니 조심해서 다루세요
포도당	시그마	G7021
글리세롤	시그마	G5516
HCl	시그마	H1758
HEPES	시그마	H3375
이소프로판올	써모피셔 사이언티브	BP26324	이소프로포놀은 조심해서 다루세요, 인화성 물질이니까요
KAPA 하이파이 핫스타트 레디 믹스	로슈	7958889001
KCl	시그마	P9541
코	시그마	221473	KOH는 조심해서 다루세요, 부식성이 있습니다
저속 진공
자석 스탠드	밀리포어	LSKMAGS08
마스터사이클러 그라디언트 PCR 열 사이클러	에펜도르프	5331
MgCl2	시그마	M8266
미세세포 뉴클레아제  (MNase)	워딩턴	LS004798
MinElute PCR 정제 키트	치아겐	28006
미니 비즈 비터	미니 비드비터 24 디스럽터	607
소형 원심분리기;	에펜도르프	5424R
MnCl2	시그마	244589
멀티플랫폼 셰이커	피셔브랜드	02-217-765
멀티플랫폼 셰이커 인큐베이터	벤치마크	인쿠-셰이커 10L
멀티서열 히트 블록	에펜도르프	써모믹서 C
N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산과 nbsp; (톡톡 두드리는 소리)	시그마	T5130	200– 400 드라이 메쉬 사이즈
NaCl	시그마	S9888
NaOH	시그마	S8045	NaOH는 조심해서 다루세요, 부식성이 있습니다
NEBNext HiFi 2× PCR 마스터 믹스	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0541
NP-40 이게팔 CA-630	써모 사이언티픽	J61055. AP
파라포말드하이드	시그마	158127	파라포름알데히드는 조심해서 다루세요. 가연성 고체이고 위험합니다.
pA-Tn5 효소	애드진	121137
페파블록	시그마	11429868001
페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 & nbsp;	인비트로젠	15593049
피펫 P1000, P200, P20 및 P2	에펜도르프	2231300004
PMSF	시그마	10837091001
프로테아제 억제제 칵테일 정제	시그마	S8830
프로테아제 억제제 칵테일 정제	시그마	S8830
단백질 G-세파로스 비즈와 nbsp;	GE 헬스케어	17-0618-02
단백질 침전 용액	치아겐	848023
단백질 침전 용액	치아겐	848023	KOH는 조심해서 다루세요, 부식성이 있습니다
단백질 침전 용액	치아겐	848023
단백질분해효소 K	시그마	311584401
QIAquick PCR 정제 키트	치아겐	28106
RNase A	시그마	10109169001
SDS	시그마	L3771
분광광도계	열과학.	2000/2000c
스퍼미딘	시그마	S2626
T4 DNA 폴	뉴잉글랜드 생물연구소, 그리고 nbsp;	M0203
탁상용 원심분리기	벡먼 쿨터	알레그라 X-5
트리스	시그마	11814273001
트리톤 X-100	시그마	T8787
효모 추출물	써모피셔 사이언티브	212730