적혈구 모델링은 이 과정에서 행위자의 생물학적 중요성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 새로운 치료 접근법을 평가할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 여기에서는 CD34+ 조혈모세포와 전구세포를 체외에서 효율적으로 구별할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인
이 논문에서
요약
초록
적혈구(하루에 약 280± 200억 개의 세포)의 일일 할당량을 생성하는 매우 역동적이고 효율적인 과정인 적혈구증(Erythropoiesis)은 개인의 건강을 유지하는 데 매우 중요합니다. 이 경로가 중단되면 심각한 결과를 초래할 수 있으며 건강 문제로 이어질 수 있습니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계 인구의 약 25%가 빈혈 증상을 보입니다. 이 프로토콜은 제대혈(UCB) 또는 건강한 기증자로부터 채취한 혈액과 같은 출처에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(HSPC)를 사용하여 체외 에서 인간 적혈구 세포를 생성하는 방법과 환자의 골수에서 분리된 HSPC를 사용하여 생체 외 모두에서 인간 적혈구 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 유전적 접근법을 사용하여 HSPC에서 관심 유전자를 조절할 수 있으며, 분화 과정의 다양한 단계에서 적혈구증에 미치는 영향을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 HSPC가 성숙한 적혈구 세포로 분화하는 능력을 교란, 강화 또는 구출하는 화합물을 스크리닝하고 적혈구 분화 과정에서 관심 유전자의 역할을 조사할 수 있습니다.
서론
매일 약 2,800억 개의 적혈구(RBC)가 골수에서 생성되어 몸 전체에 산소를 운반할 수 있도록 합니다1. 적혈구증(Erythropoiesis)은 조혈모세포에서 성숙하고 기능적인 적혈구를 생산하는 미세하게 조정된 분화 과정입니다. 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 지중해빈혈(thalassemia), 선천성 적혈구이상빈혈(congenital dyserythropoietic anemia) 등 많은 질병이 이 과정에 영향을 미칠 수 있다2.
교란성 적혈구증의 임상적 증상은 빈혈이며, 이는 전 세계적으로 이환율의 주요 원인입니다. 빈혈의 증상은 피로, 숨가쁨, 현기증부터 심부전, 심정지와 같이 생명을 위협하는 질환에 이르기까지 다양하다3. 전 세계적으로 18억 명의 빈혈이 영향을 미치고있기 때문에 4 이러한 상태와 그 기저 메커니즘을 조사하기 위해 생체 외 적혈구 증을 모델링하는 것이 전 세계적으로 우선 순위로 남아 있습니다....
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프로토콜
1차 샘플에 대한 연구는 기관 지침(REC 참조: 21/EE/0133; IRAS 프로젝트 ID: 283103).
1. 렌티바이러스 생산
참고: 렌티바이러스는 멸균 상태에서 생물 안전 수준 L2의 실험실에서 생산되어야 합니다. 이중 장갑을 포함하여 이 실험실에 필요한 모든 PPE를 착용해야 합니다. 오염된 물질은 오토클레이브 쓰레기통에 폐기하기 전에 바이러스제 소독제로 오염을 제거합니다. 여기에서는 EGFP 리포터 유전자를 보유한 shRNA scramble(control)을 사용하여 이 과정을 설명합니다.
1일차
- 젤라틴이 완전히 녹을 때까지 37°C의 수조에서 데웁니다. 젤라틴을 0.1%로 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석합니다.
- 150mm 접시에 0.1% 젤라틴 2mL를 코팅합니다. 바이러스당 2가지 요리를 사용하십시오. 접시를 30 ° C에서 37 분 동안 배양합니다.
- 젤라틴으로 코팅된 접시당 500만 HEK293T 세포를 10% Dulbecco의 DMEM(Modi....
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결과
제대혈 또는 골수에서 추출한 CD34+ 세포를 먼저 해동하고 자극한 후 GFP 발현 shRNA로 형질주입합니다(그림 1A). CD34+GFP+ 세포는 그림 1B에 예시된 게이팅 전략에 따라 형질도입 후 4일 후에 분류됩니다. 대표적인 결과는 transduction 및 FACS 분류 후 CD34+ 세포의 성숙을 보여주었습니다. 세포는 (1) CD71 / CD235a 9,10,11 염색을 사용하여 여러 성숙 단계에서 유세포 분석으로 분석됩니다 (그림 1A). (2) 현미경으로 시각화한 Giemsa 염색에 따른 면역화학에 의해.
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토론
여기에서는 성체 골수(BM) 또는 제대혈(UCB)에서 분리된 CD34+ 조혈모세포(HSPC)의 적혈구 분화를 유도하는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명했습니다. 이 파이프라인에는 적혈구 분화 과정에서 관심 유전자의 기능을 조사하기 위한 일차 세포의 편집/변형이 포함됩니다. 이 방법은 건강한 CD34+ HSPC에서 적혈구 분화 12,13,14,15 및 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군과 같은 조혈 악성 종양과 이전에 연결되지 않았던 유전자의 기능적 관련성을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 적혈구 분화 모델링은 이 과정에서 유전자의 생물학적 관련성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 .......
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
C.P., S.B. 및 K.RP. HARP 프로그램, Barts Charity(G-002167), Kay Kendall Leukaemia fund(KKL1149) 및 Academy of Medical Sciences(SBF004\1099)의 지원을 받았습니다. MGG 염색 및 현미경 획득에 대해 Pantelitsa Protopapa 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 런던 퀸 메리 대학교(Queen Mary University of London)의 바츠 암 연구소(Barts Cancer Institute)의 유세포 분석 및 현미경 검사 시설을 인정합니다. 이 원고에 사용된 탯줄 혈액 단위를 제공해 주신 영국 자선단체 Anthony Nolan에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2x HEPES | Merck | 51558 | |
| 비드 | Thermo Scientific | 01-2222-42 | |
| CD235a APC Cy7 | Biolegend | 349115 | |
| CD34 PerCP Cy5.5 항체 | BD Biosciences | 347222 | |
| CD71 PE 항체 | Biolegend | 334106 | |
| DAPI | Merck | D9542 | |
| DMEM | Thermo Scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Merck | D4527-200KU | |
| DPX 마운팅 매체 | VWR | 1.00579.0500 | |
| FACS리아 퓨전 | BD Biosciences | NA | |
| FBS | Merck | F9665 | |
| 젤라틴 | Merck | G1393 | |
| Giemsa 솔루션 | Abcam | ab150670 | |
| HEPES, | Merck | H0887-100mL | |
| 인간 EPO | PeproTech | 100-64 | |
| 인간 Flt-3 리간드 | PeproTech | 300-19 | |
| 인간 G-CSF | PeproTech | 300-23 | |
| 인간 IGF1 | PeproTech | 100-11 | |
| 인간 IL-6 | PeproTech | 200-06 | |
| 인간 SCF | PeproTech | 300-07 | |
| 인간 TPO | PeproTech | AF-300-18 | |
| LSRFortessa 세포 분석기 | BD Biosciences | NA | |
| May-Grunwald 해결책 | Generon | 26250-01 | |
| Pannoramic 250 고처리량 스캐너 | 3DHISTECH | NA | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 써모 사이언티픽 | 15140-122 | |
| Shandon Cytospin 3 | Thermo Scientific | NA | |
| 줄기세포 배지 배지 | 줄기세포 기술 | 9655 |
참고문헌
- Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
- Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
- Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M.
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재인쇄 및 허가
