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방법 논문

In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

1.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

2025년 1월 10일

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

이 논문에서

요약

적혈구 모델링은 이 과정에서 행위자의 생물학적 중요성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 새로운 치료 접근법을 평가할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 여기에서는 CD34+ 조혈모세포와 전구세포를 체외에서 효율적으로 구별할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

초록

적혈구(하루에 약 280± 200억 개의 세포)의 일일 할당량을 생성하는 매우 역동적이고 효율적인 과정인 적혈구증(Erythropoiesis)은 개인의 건강을 유지하는 데 매우 중요합니다. 이 경로가 중단되면 심각한 결과를 초래할 수 있으며 건강 문제로 이어질 수 있습니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계 인구의 약 25%가 빈혈 증상을 보입니다. 이 프로토콜은 제대혈(UCB) 또는 건강한 기증자로부터 채취한 혈액과 같은 출처에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(HSPC)를 사용하여 체외 에서 인간 적혈구 세포를 생성하는 방법과 환자의 골수에서 분리된 HSPC를 사용하여 생체 외 모두에서 인간 적혈구 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 유전적 접근법을 사용하여 HSPC에서 관심 유전자를 조절할 수 있으며, 분화 과정의 다양한 단계에서 적혈구증에 미치는 영향을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 HSPC가 성숙한 적혈구 세포로 분화하는 능력을 교란, 강화 또는 구출하는 화합물을 스크리닝하고 적혈구 분화 과정에서 관심 유전자의 역할을 조사할 수 있습니다.

서론

매일 약 2,800억 개의 적혈구(RBC)가 골수에서 생성되어 몸 전체에 산소를 운반할 수 있도록 합니다1. 적혈구증(Erythropoiesis)은 조혈모세포에서 성숙하고 기능적인 적혈구를 생산하는 미세하게 조정된 분화 과정입니다. 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 지중해빈혈(thalassemia), 선천성 적혈구이상빈혈(congenital dyserythropoietic anemia) 등 많은 질병이 이 과정에 영향을 미칠 수 있다2.

교란성 적혈구증의 임상적 증상은 빈혈이며, 이는 전 세계적으로 이환율의 주요 원인입니다. 빈혈의 증상은 피로, 숨가쁨, 현기증부터 심부전, 심정지와 같이 생명을 위협하는 질환에 이르기까지 다양하다3. 전 세계적으로 18억 명의 빈혈이 영향을 미치고있기 때문에 4 이러한 상태와 그 기저 메커니즘을 조사하기 위해 생체 외 적혈구 증을 모델링하는 것이 전 세계적으로 우선 순위로 남아 있습니다. 여기에 설명된 방법은 건강한 적혈구 분화와 병든 적혈구 분화를 모두 연구하기 위한 간단하고 강력한 모델을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 모델은 이 과정에서 특정 유전자의 역할을 해부할 수 있게 하고 빈혈 환자에게 도움이 될 수 있는 화합물을 테스트할 수 있게 합니다. 역사적으로 비효율적인 적혈구증을 모델링하는 데는 일부 병든 골수에 줄기세포가 부족하고 골수 틈새를 모방하는 데 어려움이 있는 등 많은 문제가 있었습니다.

이전 연구에서는 유사하거나 더 복잡한 프로토콜을 사용했습니다. 예를 들어, Bondu 등은 에리스로이드 분화 칵테일에서 IL6를 제거하기 전에 에리스로포이에틴(EPO), 줄기세포 인자(SCF) 및 인터루킨-6(IL6)를 포함한 사이토카인 칵테일을 사용한 반면, Yip 등은 액체 배양 7일 후에만 사이토카인 칵테일에 EPO를 추가했습니다. Elvarsdóttir 등은 CD34+ 세포에 대한 3차원(3D) 배양 모델을 개발하여 고리 sideroblasts 5,6,7,8와 같은 현상을 연구하는 데 중요한 적혈구 섬 및 적혈구 세포의 생성을 포함하여 적혈구 세포의 최고 확장 및 성숙을 촉진합니다. 이 프로토콜은 세포를 확장할 때 3개의 사이토카인(즉, SCF, 트롬보포이에틴[TPO] 및 FMS 유사 티로신 키나아제 3[FLT3])과 전 분화 과정에서 유지되는 3개의 사이토카인(즉, EPO, IGF1 및 SCF)만 사용합니다. 이러한 다양한 연구에서 공유되는 주요 기준 중 하나는 CD34+ 세포의 사용입니다. 이러한 세포의 기원은 다양하지만 이러한 다양한 프로토콜에서 일관되게 사용됩니다. 출처는 UCB의 비침습적 채취부터 과립구 집락자극인자(G-CSF) 동원 환자 또는 골수 천자에서 채취할 수 있는 성체 골수 샘플을 얻기 위한 보다 침습적인 절차에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 일반적으로 액체 배양 모델은 14일 동안 수행되는 반면 3D 모델은 더 오랜 기간 동안 세포를 유지할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 유전 질환 및 적혈구 증후군의 장애를 모델링하는 데 필수적입니다. 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 녹다운(knockdown)과 같은 유전적 접근법을 사용하여 관심 유전자를 침묵시키고 적혈구증에서 유전자의 역할을 연구할 수 있습니다. 그런 다음 다양한 분화 단계에서 유전자 침묵의 영향을 모니터링할 수 있으며, 건강과 질병 모두의 빈혈을 연구하기 위해 적혈구 생산에 대한 생체 외 인간 모델을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 Enhanced Green Fluorescence Protein(EGFP)과 같은 리포터 유전자를 구성적으로 발현하는 shRNA로 CD34+ 제대혈 세포를 transduction하여 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 샘플을 분류할 수 있습니다. 그런 다음 세포를 분화 배지에서 2주 동안 배양하고 유세포 분석 및 면역화학 염색을 통해 모니터링합니다.

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프로토콜

1차 샘플에 대한 연구는 기관 지침(REC 참조: 21/EE/0133; IRAS 프로젝트 ID: 283103).

1. 렌티바이러스 생산

참고: 렌티바이러스는 멸균 상태에서 생물 안전 수준 L2의 실험실에서 생산되어야 합니다. 이중 장갑을 포함하여 이 실험실에 필요한 모든 PPE를 착용해야 합니다. 오염된 물질은 오토클레이브 쓰레기통에 폐기하기 전에 바이러스제 소독제로 오염을 제거합니다. 여기에서는 EGFP 리포터 유전자를 보유한 shRNA scramble(control)을 사용하여 이 과정을 설명합니다.

1일차

  1. 젤라틴이 완전히 녹을 때까지 37°C의 수조에서 데웁니다. 젤라틴을 0.1%로 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석합니다.
  2. 150mm 접시에 0.1% 젤라틴 2mL를 코팅합니다. 바이러스당 2가지 요리를 사용하십시오. 접시를 30 ° C에서 37 분 동안 배양합니다.
  3. 젤라틴으로 코팅된 접시당 500만 HEK293T 세포를 10% Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium) 20mL에 파종하고 세포를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.

2일차

  1. 세포가 약 50% 농도에 도달했는지 확인합니다. transfection 2시간 전에 세포층을 방해하지 않고 22mL의 10% DMEM으로 배지를 변경합니다.
  2. 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다.
    참고: 접시당 하나의 transfection mix를 준비하는데, 더 큰 부피가 칼슘-인산염 침전물 형성에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.
    1. 15 mL 원심분리 튜브에서 플라스미드 32 μg, PAX(pCMVdR8.74) 플라스미드 20 μg, VSVG(pMD.G2) 플라스미드 9 μg과 같이 반응 혼합물을 준비하고 H2O를 사용하여 부피를 1125 μL까지 높입니다.
    2. 반응에 125 μL의 CaCl2 를 추가하고 롤러에서 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 별도의 1.25mL 원심분리 튜브에 2x HEPES 15mL를 준비합니다.
    4. 부드럽게 와류를 일으키면서 반응 혼합물에 2x HEPES를 한 방울씩 첨가 한 다음 RT에서 10 분 동안 혼합물을 롤러에 놓습니다.
  3. 반응을 나선형 패턴으로 세포에 한 방울씩 떨어뜨리고 플레이트를 십자형 방식으로 부드럽게 움직여 배지를 균질화한 후 세포를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.

3일차

  1. 세포층을 방해하지 않고 16mL의 10% DMEM으로 배지를 변경합니다.

4일차

  1. 상층액을 모아 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 세포층을 방해하지 않고 각 플레이트에 16mL의 새로운 DMEM을 추가합니다.

5일차

  1. 상층액을 모아 4일차부터 상층액과 함께 풀링합니다. 0.45μM 필터로 이물질을 제거하는 필터.
  2. 초원심분리를 위해 각 30mL(4일차 + 5일차) 상층액을 원뿔형 튜브에 전달합니다. 필요한 경우 원추형 바닥용 어댑터와 함께 스윙 버킷에 튜브를 추가합니다.
  3. 0.02 g 정확도로 튜브를 마주 보고 균형을 맞추고, 4 °C에서 2 시간 동안 90,000 x g 의 초원심분리기로 균형을 맞춥니다.
  4. 상층액을 버리고 튜브당 200μL의 줄기세포 배지를 추가합니다. 파라필름으로 튜브를 닫고 교반하면서 2-4시간 동안 차가운 방에서 튜브를 배양합니다.
  5. 각 바이러스에 대해 20μL의 분취량을 만들고 바이알을 -80°C에서 보관합니다. 각 바이러스를 2μL씩 유지하고 DMEM 400μL를 추가합니다.
    참고: 이 희석액은 적정에 사용됩니다.

2. 렌티바이러스 적정

참고: 렌티바이러스는 멸균 상태에서 생물 안전 등급 L2의 실험실에서 취급해야 합니다. 이중 장갑을 포함하여 이 실험실에 필요한 모든 PPE를 착용해야 합니다. 오염된 물질은 오토클레이브 쓰레기통에 폐기하기 전에 바이러스제 소독제로 오염을 제거합니다.

  1. 24웰 플레이트에 HEK293T 씨를 뿌립니다. 500μL의 10% DMEM에 50,000개의 세포/웰을 추가합니다.
    참고: 바이러스당 6개의 well을 사용하고 transduction되지 않은 세포를 위해 1개의 well을 보관하십시오.
  2. 변환을 수행합니다. 1.13단계에서 희석된 바이러스의 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL 및 64 μL의 다른 웰을 추가합니다. 부드럽게 균질화하십시오.
  3. 24시간 후에 500μL의 10% DMEM을 추가하여 배지를 변경합니다.
  4. transduction 후 4일차에 유세포분석을 위해 세포를 준비합니다.
    1. PBS, 2% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S), 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 1/2,000 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)으로 FACS 완충액을 준비합니다.
    2. 상층액을 제거하고 EDTA를 사용하여 500μL의 FACS 완충액을 각 웰에 직접 추가합니다.
    3. 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다.
  5. 40μm 스트레이너를 통해 세포를 여과하고 FACS 튜브로 전달합니다.
  6. 유세포 분석으로 EGFP 세포의 비율을 측정합니다.
  7. 다음 게이트를 설정합니다.
    1. DAPI 대 측면 산란(SSC-A)을 설정하여 죽은 세포를 제외합니다.
    2. SSC 높이(SSC-H) 대 SSC 면적(SSC-A)을 설정하여 세포 응집체를 제외하고 단일 세포를 선택합니다.
    3. SSC-A에 비해 전방 산란 영역(FSC-A)을 설정하여 크기에 따라 세포를 게이트하고 파편을 제거합니다.
    4. 녹색 형광 단백질(GFP)과 SSC-A를 비교하여 GFP+ 세포를 선택합니다.
  8. 바이러스를 역가에 넣습니다.
    1. 각 조건에 대한 입자 농도(입자 수/mL)를 계산합니다.
    2. EGFP 세포 x 희석 계수 바이러스(200) x 파종 세포 수 x1000)/ 바이러스 부피.
      참고: 예를 들어, 세포는 1/200로 희석된 64μL의 바이러스로 처리되었습니다. 유세포분석 결과, 세포의 54%가 EGFP+였습니다. 이러한 조건에서 역가는 (54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8.44 x 107 particles/mL입니다.

3. 제대혈에서 분리된 CD34+ 세포 형질전환

알림: 이 부품은 멸균 상태에서 수행됩니다. 여기서, CD34+ UCB 세포(순도 >85%)는 eGFP 리포터를 보유한 하나의 shRNA(대조군)로 transduction됩니다. 실험은 세 가지 기술적 반복실험으로 수행됩니다. 비율은 샘플 수에 맞게 조정해야 합니다.

1일차

  1. 다음 매체 및 버퍼를 준비합니다.
    1. 제상 매체 준비: 1% P/S 및 10μg/mL DNAse가 보충된 FBS
    2. FACS 완충액 준비: 1% P/S 및 2% FBS(± 10μg/mL DNAse)가 보충된 PBS
    3. 150ng/mL SCF, 150ng/mL FLT-3, 10ng/mL IL-6, 25ng/mL G-CSF, 20ng/mL TPO 및 1% HEPES를 첨가하여 자극 배지(줄기세포 배지)를 준비합니다.
  2. 100,000 CD34+ UCB 세포를 37°C의 수조에 30초 동안 담가 해동합니다. 각 바이알에 1mL의 해동 매체를 적가하여 적가한 다음 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 다시 현탁시킵니다.
  3. 세포 현탁액을 한 방울 한 방울 떨어뜨려 총 5mL 해동 매체를 부드럽게 옮깁니다.
    알림: 세포 손실을 방지하려면 팁과 바이알을 세척하는 데 마지막에 사용할 2mL의 해동 배지 분취액을 따로 보관하십시오.
  4. RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리기. 10mL의 FACS 완충액 + DNAse에서 세포를 세척합니다.
  5. RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리기. 세포 펠릿을 2mL의 자극 매체(자극 매체로 팁 및 튜브 세척)에 재현탁합니다.
  6. 5μL의 세포 현탁액과 5μL의 트리판 블루를 사용하여 세포를 계수합니다.
    참고: 총 최소 75,000개의 셀(25,000개의 셀/조건)을 목표로 합니다.
  7. 2mL의 세포 현탁액을 24웰 플레이트로 옮기고 37°C에서 ≥4-6시간 동안 배양합니다.
    참고: 이 단계에서 모든 세포(75,000-100,000)가 하나의 웰에 파종됩니다.
  8. FACS 튜브에 세포를 모으고 줄기 세포 배지 1mL를 채웁니다. 상온에서 320 x g 에서 8분간 원심분리기.
  9. 바이러스를 해동하고 30의 감염 다중성(MOI)에서 자극 매체에 필요한 부피를 추가합니다.
  10. 100μL 바이러스당 100,000개의 세포로 바이러스 함유 배지의 펠릿화된 세포를 96웰 플레이트의 1웰에 재현탁합니다. PBS를 빈 우물에 넣고 37°C에서 밤새 배양합니다.

2일차

  1. 150ng/mL SCF, 150ng/mL FLT3-L 및 20ng/mL TPO를 첨가하여 확장 배지(줄기세포 배지)를 준비합니다.
  2. 96웰 플레이트 웰의 세포 현탁액 전체를 1mL의 줄기세포 배지가 있는 FACS 튜브에 추가합니다. 웰과 팁을 줄기세포 배지로 세척하여 FACS 튜브의 세포 현탁액에 2mL 줄기세포 배지를 추가합니다.
  3. 상온에서 320 x g 에서 8분간 원심분리기.
  4. 상등액을 버리고 2mL의 확장 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 24웰 플레이트 웰에 추가합니다(이 과정에서 웰과 팁을 세척하여 총 2mL를 얻습니다). 37°C에서 4일 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 그런 다음 세포 분류는 7일째에 수행됩니다.

4. CD34+ EGFP+ 세포 분류 및 적혈구 분화

알림: 이 부품은 멸균 상태에서 수행됩니다.

  1. 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다.
    참고: 사이토카인이 있는 배지는 새로 준비해야 합니다.
    1. PBS에 1% P/S 및 2% FBS를 보충하여 FACS 완충액을 준비합니다.
    2. 150ng/mL SCF, 150ng/mL FLT3-L 및 20ng/mL TPO를 첨가하여 확장 배지(줄기세포 배지)를 준비합니다.
    3. 25ng/mL SCF, 3U/mL EPO 및 50ng/mL IGF1을 첨가하여 적혈구 분화 배지(줄기세포 배지 내)를 준비합니다.
    4. 50ng/mL SCF, 6U/mL EPO 및 100ng/mL IGF1을 첨가하여 2x 적혈구 분화 배지(줄기세포 배지)를 준비합니다.
  2. 전체 부피의 세포를 별도의 FACS 튜브에 추가합니다(줄기 세포 배지로 공정에서 웰과 팁을 세척). RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리기. 펠릿화된 세포를 100μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
  3. 5 μL의 CD34 Ab/tube를 첨가하고 4 °C의 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다.
  4. DAPI(FACS 완충액에서 1/2000 희석)를 사용하여 1mL의 FACS 완충액에 있는 세포를 재현탁하고 RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리합니다.
  5. DAPI(FACS 완충액에서 1/2000 희석)로 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하고 분류하기 전에 40μM 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
  6. 제어를 위해 비드를 준비합니다.
    1. 100μL의 PBS에 비드 1방울에 0.5μL의 CD34 항체(Ab)를 첨가하고 4°C의 암흑 속에서 20분 동안 배양합니다.
    2. PBS 1mL를 추가합니다. RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리기. 상등액을 버리고 500μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.
  7. GFP 조절을 위해 백혈병 세포주를 준비합니다.
    참고: 사용 가능한 모든 GFP+ 세포주를 대조군으로 사용합니다. 대신 구슬을 사용할 수 있습니다.
    1. FACS 튜브에 GFP- 세포(100,000개의 세포가 있는 2개의 FACS 튜브)와 GFP+(100,000개의 세포가 있는 1개의 FACS 튜브)를 추가합니다.
      참고: 총 3개의 튜브.
    2. 1mL의 FACS 버퍼로 셀을 세척합니다. 상온에서 320 x g 에서 8분간 원심분리기.
    3. 500μL의 FACS 완충액(염색되지 않음)에 100,000개의 GFP 세포, DAPI(FACS 완충액에서 1/2000 희석)(DAPI 염색)로 500μL의 FACS 완충액에 100,000개의 GFP- 세포, 500μL의 FACS 완충액(GFP+ 세포)에 100,000개의 GFP+ 세포를 재현탁합니다.
      참고: Control Tube는 유세포 분석기의 게이팅 및 보상 설정에 사용됩니다. 사용된 세포가 100% GFP인 경우 GFP- 세포를 튜브에 추가할 수 있습니다(50,000 GFP- 세포 및 50,000 GFP+ 세포).
    4. 분류하기 전에 40μm 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다.
  8. 다음 게이트를 설정합니다.
    1. DAPI 대 측면 산란(SSC-A)을 설정하여 죽은 세포를 제외합니다.
    2. SSC 높이 대 SSC 면적(SSC-A)을 설정하여 세포 응집체를 제외하고 단일 세포를 선택합니다.
    3. 크기에 따라 파편을 제거하기 위해 SSC-A에 비해 전방 산란 영역(FSC-A)을 설정합니다.
    4. GFP+ 셀을 선택하기 위해 GFP 대 SSC-A를 설정합니다.
    5. CD34+ 세포를 선택하기 위해 SSC-A와 CD34(PerCP-Cy5.5)를 설정합니다.
  9. 세포를 채취하기 전에 채취 FACS 튜브를 뒤집어 튜브의 벽을 FBS로 코팅합니다.
  10. 줄기세포 배지에서 세포를 수집합니다.
    참고: 75,000-80,000개 셀(25,000개 셀 x 3)을 목표로 합니다.
  11. RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리하고 3mL의 적혈구 분화 배지에 세포를 재현탁합니다.
  12. 재현탁시킨 후 웰당 1mL를 24웰 플레이트의 3웰에 분주합니다. 모든 외부 우물을 PBS로 채웁니다.
  13. 격일로 배지를 절반으로 고갈시키고 2x 적혈구 분화 배지로 교체합니다.
    1. 미디어를 새로 고치려면 셀이 플레이트 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. 플레이트를 부드럽게 기울여 500μL의 매체를 꺼냅니다.
    2. 2x 사이토카인 적혈구 분화 배지와 함께 500 μL를 추가하여 새로 고칩니다.
    3. 6일차에 세포를 12웰 플레이트로 옮기고 1mL의 배지를 추가하여 2mL의 최종 부피를 만듭니다.

5. 6일차부터 14일차까지 주 2회 유세포 분석을 통한 적혈구 분화 분석

  1. 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다.
    1. PBS에 1% P/S 및 2% FBS를 보충하여 FACS 완충액을 준비합니다.
    2. 25ng/mL SCF, 3U/mL EPO 및 50ng/mL IGF1을 첨가하여 적혈구 분화 배지(줄기세포 배지 내)를 준비합니다.
  2. 12웰 플레이트의 각 웰에서 200μL 세포를 수집하고 250μL의 2x 적혈구 분화 배지로 교체합니다. 각 튜브에 1mL의 FACS 버퍼를 추가합니다.
  3. RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리기. 펠릿화된 세포를 100μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
  4. CD71 Ab 1 μL (1/100), CD34 Ab 1 μL (1/100), CD235a Ab 1 μL (1/100)를 넣고 4 °C의 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다.
  5. DAPI(FACS 완충액의 1/2000 희석)를 사용하여 1mL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 상온에서 320 x g 에서 8분간 원심분리기.
  6. DAPI(FACS 완충액의 1/2000 희석)를 사용하여 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
  7. 제어를 위해 비드를 준비합니다.
    1. 100 μL의 PBS에 있는 두 개의 튜브에 1개의 방울 보상 비드를 추가한 다음 각 튜브에 0.55 μL의 단일 항체를 추가하여 단일 염색 제어(CD34용 1개, CD71용 1개, CD235a용 1개)를 만듭니다.
      알림: 두 컨트롤 모두에 1방울이면 충분합니다.
    2. 4 °C의 어둠 속에서 20 분 동안 배양하십시오. PBS 1mL를 추가합니다.
    3. RT에서 320 x g 에서 8분 동안 원심분리기. 상등액을 버리고 500μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.
  8. 조절을 위해 백혈병 세포주를 준비합니다.
    참고: K562 셀은 CD71 마커를 발현하며 FACS를 설정하기 위한 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
    1. FACS 튜브에 GFP- 세포(100,000개의 세포가 있는 2개의 FACS 튜브) 및 GFP+ (100,000개의 세포가 있는 1개의 FACS 튜브) 세포를 추가합니다.
    2. 1mL의 FACS 버퍼로 셀을 세척합니다. 상온에서 320 x g 에서 8분간 원심분리기.
    3. FACS 완충액에 있는 100,000개의 GFP- 세포(염색되지 않은), FACS 완충액에 있는 100,000개의 GFP- 세포를 DAPI(FACS 완충액에서 1/2000 희석)(DAPI 염색됨)로 재현탁하고, FACS 완충액에 100,000개의 GFP+ 세포(GFP+ 세포)를 재현탁합니다.
  9. 다음 게이트를 설정합니다.
    1. DAPI 대 측면 산란(SSC-A)을 설정하여 죽은 세포를 제외합니다.
    2. SSC 높이 대 SSC 면적(SSC-A)을 설정하여 세포 응집체를 제외하고 단일 세포를 선택합니다.
    3. 크기에 따라 파편을 제거하기 위해 SSC-A에 비해 전방 산란 영역(FSC-A)을 설정합니다.
    4. CD235a(APC-Cy7)와 CD71(PE)을 설정합니다.
    5. CD34(PerCP-Cy5.5)와 SSC-A를 설정합니다.
  10. 염색되지 않은 GFP 세포 와 완전히 염색된 세포의 샘플을 실행하여 세포가 올바른 위치에 놓이도록 전압을 조정합니다.
  11. 비드, GFP+ 세포 및 DAPI 염색 세포를 실행합니다. 세포분석기 설정을 보상하고 보상을 적용합니다.
  12. 샘플을 실행하고 이벤트를 기록합니다.

6. Giemsa 염색에 의한 적혈구 분화 분석

  1. 5개의 슬라이드 염색 항아리를 준비합니다.
    1. May-Grünwald의 eosin-methylene blue 용액 1:1 스톡과 PBS가 포함된 슬라이드 염색 용기를 준비합니다.
    2. Giemsa 스톡 2.5mL + PBS 50mL가 포함된 슬라이드 염색 용기를 준비합니다.
    3. 증류수로 슬라이드 염색 항아리를 준비합니다.
    4. PBS가 있는 슬라이드 염색 용기를 준비합니다.
    5. 얼음처럼 차가운 메탄올로 슬라이드 염색 용기를 준비합니다.
  2. 최적의 염색을 위해 100,000개의 세포를 수집하고, PBS 1mL를 첨가하고, 300 x g 을 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 배지를 버리고 150μL의 PBS에 재현탁합니다.
  4. 슬라이드, 여과지 및 원뿔형 어댑터를 세포 원심분리기에 준비하고 세포 준비물을 원뿔형 어댑터에 천천히 떨어뜨립니다.
  5. 800 x g 에서 3분 동안 회전합니다. 슬라이드를 제거하고 얼음에 넣은 메탄올 슬라이드 용기에 15분 동안 넣습니다.
  6. 슬라이드를 May-Grünwald 용액에 5분 동안 담그고 적절한 염색을 위해 가끔 저어줍니다.
  7. 그런 다음 얼룩이 떨어지지 않을 때까지 슬라이드를 PBS 용기에 담그십시오.
  8. 슬라이드를 Giemsa 용액에 20분 동안 담그고 적절한 염색을 보장하기 위해 가끔 저어줍니다.
  9. 얼룩이 떨어지지 않을 때까지 PBS로 슬라이드를 조심스럽게 담그십시오.
  10. 슬라이드를 PBS에 3분 더 그대로 둡니다.
  11. 슬라이드를 증류수에 빠르게 담그고 RT에서 자연 건조합니다.
  12. 세포의 각 지점에 합성 수지 한 방울을 넣고 그 위에 커버 슬립을 부드럽게 추가합니다.
  13. 슬라이드를 RT에서 1시간 동안 건조시키고 미끄럼 건조를 방지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.

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결과

제대혈 또는 골수에서 추출한 CD34+ 세포를 먼저 해동하고 자극한 후 GFP 발현 shRNA로 형질주입합니다(그림 1A). CD34+GFP+ 세포는 그림 1B에 예시된 게이팅 전략에 따라 형질도입 후 4일 후에 분류됩니다. 대표적인 결과는 transduction 및 FACS 분류 후 CD34+ 세포의 성숙을 보여주었습니다. 세포는 (1) CD71 / CD235a 9,10,11 염색을 사용하여 여러 성숙 단계에서 유세포 분석으로 분석됩니다 (그림 1A). (2) 현미경으로 시각화한 Giemsa 염색에 따른 면역화학에 의해.

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토론

여기에서는 성체 골수(BM) 또는 제대혈(UCB)에서 분리된 CD34+ 조혈모세포(HSPC)의 적혈구 분화를 유도하는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명했습니다. 이 파이프라인에는 적혈구 분화 과정에서 관심 유전자의 기능을 조사하기 위한 일차 세포의 편집/변형이 포함됩니다. 이 방법은 건강한 CD34+ HSPC에서 적혈구 분화 12,13,14,15 및 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군과 같은 조혈 악성 종양과 이전에 연결되지 않았던 유전자의 기능적 관련성을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 적혈구 분화 모델링은 이 과정에서 유전자의 생물학적 관련성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 ...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

C.P., S.B. 및 K.RP. HARP 프로그램, Barts Charity(G-002167), Kay Kendall Leukaemia fund(KKL1149) 및 Academy of Medical Sciences(SBF004\1099)의 지원을 받았습니다. MGG 염색 및 현미경 획득에 대해 Pantelitsa Protopapa 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 런던 퀸 메리 대학교(Queen Mary University of London)의 바츠 암 연구소(Barts Cancer Institute)의 유세포 분석 및 현미경 검사 시설을 인정합니다. 이 원고에 사용된 탯줄 혈액 단위를 제공해 주신 영국 자선단체 Anthony Nolan에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2x HEPESMerck51558
비드Thermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 항체BD Biosciences347222
CD71 PE 항체Biolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX 마운팅 매체 VWR1.00579.0500
FACS리아 퓨전 BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
젤라틴MerckG1393
Giemsa 솔루션Abcamab150670
HEPES,MerckH0887-100mL
인간 EPOPeproTech100-64
인간 Flt-3 리간드PeproTech300-19
인간 G-CSFPeproTech300-23
인간 IGF1PeproTech100-11
인간 IL-6PeproTech200-06
인간 SCFPeproTech300-07
인간 TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa 세포 분석기BD BiosciencesNA
May-Grunwald 해결책 Generon26250-01
Pannoramic 250 고처리량 스캐너 3DHISTECHNA
페니실린/스트렙토마이신써모 사이언티픽15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
줄기세포 배지 배지줄기세포 기술9655
, , ,

참고문헌

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