Bergmeyer 포도당 정량화는 포도당의 양을 정확하고 민감하게 측정하는 임상 검사에 주로 사용되는 분광 광도계 효소 기술입니다. 여기에서는 미생물 시료에 대해 이 방법을 사용하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포도당 농도는 세포 대사의 핵심 지표이며 총 대사 속도, 포도당 대사의 이상, 그리고 경우에 따라 세포가 포도당 대사를 에너지 대사와 결합하는 방법을 나타낼 수 있습니다. 또한 세포 내 및 세포 외 포도당 수치는 세포 대사 상태를 나타냅니다. Bergmeyer 포도당 정량화와 같은 효소 기술은 일반적으로 미생물학에서 사용되는 디니트로살리실산 또는 형광 방법과 같은 다른 기술보다 더 정확하고 민감합니다. Bergmeyer 포도당 정량화는 주로 임상 분야에서 사용되지만 모든 세포에 적용할 수 있지만 박테리아, 곰팡이, 효모 또는 기타 미생물에 대해서는 자세히 보고되지 않았습니다.
여기에서는 효소 Bergmeyer 포도당 정량화 방법을 사용하여 박테리아 및 효모 샘플의 포도당을 정량화하는 방법론을 제시합니다. 이 절차에는 효소 포도당 산화효소, 과산화효소 및 o-dianisidine dihydrochloride를 37°C에서 20분 동안 배양한 다음 황산을 첨가하는 것이 포함되었습니다. 그런 다음 흡광도를 545nm에서 측정합니다. 이 기술은 고농도의 포도당(60g/L 이상)을 측정하는 데 어려움이 있지만 희석 계수를 사용하여 50g/L 미만의 농도를 측정할 수 있다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이 효소학적 접근 방식은 미생물학 및 기타 과학 분야의 연구 및 분석에 유용합니다. 이 방법의 정밀도와 감도는 미생물 샘플에서 낮은 농도의 포도당을 검출하는 데 도움이 됩니다.
서론
포도당은 박테리아, 효모 및 곰팡이를 포함한 수많은 미생물의 주요 에너지 및 탄소원 역할을 합니다. 이 미생물은 세포외막에 위치한 수송체를 통해 포도당을 흡수하며, 해당작용 대사 경로 내에서 일련의 생화학적 반응을 거쳐 피루브산1로 전환됩니다. 포도당과 같은 당을 환원시키는 정량화를 위한 다양한 기술이 있습니다. 예를 들어, 베네딕트 시약2, 3,5-디니트로살리실산(DNS)3,4, 안트로나 방법5 또는 페놀-황산6 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 과당 및 맥아당과 같이 샘플에 존재하는 환원당을 검출하며, 이는 신호에 기여하고 특정 당의 정확한 정량을 복잡하게 만들 수 있습니다.
또한 엄격한 온도 제어와 유해 물질 취급이 필요하여 공정을 복잡하게 만들고 정확도에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 샘플에 존재하는 다른 화합물의 간섭을 받아 정확한 포도당 정량화를 어렵게 만들 수 있습니다. 반대로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 보다 정확한 대안을 제공하여 운영 비용은 높지만 포도당과 다른 환원당을 구별할 수 있습니다. 이러한 대조적인 방법은 정확하고 비용 효율적인 포도당 정량화 기법 개발의 지속적인 필요성을 강조합니다7.
포도당 산화효소-과산화효소-황산(GOX-H2SO4) 방법은 포도당 산화효소(GOD)와 과산화효소(POD)의 두 가지 효소를 사용합니다. GOD는 β-D-포도당의 산화를 위해 매우 선택적인 산화환원효소효소입니다 8. 이 복합체는 포도당이 산소가 존재할 때 발생하는 반응 중에 촉매로 작용하여 글루콘산과 과산화수소 (H2O2 )를 생성합니다. H2O2 는 발색 산소 수용체 인 o- 디아니시딘 (o-dianisidine)을 통해 검출되며, POD와 상호 작용하면 산화 및 H2O2 방출을 일으켜 글루콘산이 포도당으로 다시 전환되는 것을 방지합니다 (그림 1 참조). 얻어진 색은 황산 (H2SO4 )의 첨가에 의해 안정화되며, 이는 또한 효소 반응을 중지시켜 반응이 계속될 경우 발생할 수있는 가능한 간섭을 피합니다9.
그림 1: 포도당 산화효소를 사용한 포도당 정량화 방법의 개요.포도당과 반응하여 과산화수소(H2,O2)와 글루콘산을 생성합니다. 결과적으로, 과산화효소는 O-디아니시딘 디하이드로클로라이드의 존재 하에서H2O2와 반응한다. 마지막 단계에서 황산(H2SO4)을 첨가하여 효소 반응을 중단하여 529nm에서 측정된 분홍색을 생성합니다. 약어: POD = 과산화효소; GOD = 포도당 산화효소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
GOX-H2SO4 효소 방법은 생물학적 샘플에서 포도당의 농도를 측정하는 데 널리 사용되는 기술이며, 그 중 대부분은 임상적으로 관심이 있습니다. 그러나 성장 배지의 포도당 섭취량을 정량화하여 소비량을 평가할 수 있는 기술을 조사한 연구는 거의 없습니다. 따라서, 본 프로토콜에서는 미생물 액체 샘플에서 포도당 산화효소, 과산화효소, o-디아니시딘 디하이드로클로라이드 및H2SO4의 효소 반응을 통해 포도당을 정량화하는 방법론을 제시하며, 이는 50%(v/v)H2SO4이하의 시약을 사용하여 Bergmeyer9에 의해 수행된 작업의 변형으로 발생합니다.
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프로토콜
1. 용액 준비
- 0.1M 인산염 완충액 100mL를 준비합니다. 인산이수소칼륨 1.28g(KH2PO4)과 인산이칼륨(K2HPO4) 0.1304g의 무게를 달아 유리 비커에 넣습니다. 이제 70mL의 탈이온수(H2Odi)를 넣고 1M 염산(HCl) 또는 수산화칼륨(KOH)을 사용하여 pH를 5.5로 조정합니다. 용액을 부피 플라스크로 옮기고 최종 부피를 100mL로 조정합니다. 그런 다음 용액을 호박색 용기에 옮기고 용액을 4-8°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.
주의: o-dianisidine dihydrochloride는 잠재적으로 발암성이므로 준비 과정 전반에 걸쳐 니트릴 장갑을 착용하여 피부 접촉 및 잠재적인 오염을 방지하십시오. - o-dianisidine dihydrochloride의 1% w/v 용액을 준비합니다. o-dianisidine dihydrochloride 0.01g의 무게를 달아 2.0mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 1,000mL 마이크로피펫을 사용하여 1.0mL의 H2Odi를 첨가하여 화합물을 용해한 다음 위아래로 피펫팅하여 천천히 혼합합니다. 용기를 알루미늄 호일로 싸서 용액을 빛으로부터 보호하고 -20°C에서 보관하여 안정성을 유지합니다.
참고: 분석 저울에서 측정하는 동안 튜브를 쉽게 지지할 수 있도록 10mL 비커를 추가 지지대로 사용할 수 있습니다. 이는 튜브를 안정화하는 데 도움이 되며, 저울에서 얻은 결과를 변경할 수 있는 변위 또는 기울어짐의 위험을 최소화하여 정확한 측정을 보장합니다. - 100mL 부피 플라스크에 10mL의 인산염 완충액과 1mL의 1% v/v o-디아니시딘 디하이드로클로라이드 용액을 추가합니다. 그런 다음 인산염 완충액을 사용하여 최종 부피를 100mL로 조정하여 0.01% o-디아니시딘-완충액 혼합물의 최종 농도를 얻습니다. 용액을 호박색 플라스크에 옮기고 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호합니다. 용액을 4-8 °C에서 최대 3-4 개월 동안 보관하십시오.
참고: 냉장 보관은 실험 측정의 무결성을 손상시킬 수 있는 분해를 방지하는 데 필수적입니다. o-dianisidine-buffer 혼합물의 분해를 방지하기 위해 13mL의 소량(12개 샘플에 충분)을 사용할 때까지 얼음 위의 14mL 플라스틱 튜브에 넣을 수 있습니다. - 50% H2SO4 용액을 준비합니다. 100mL 용량 플라스크와 30mL의 H2Odi를 얼음 수조에 넣고 10분 동안 식힙니다. 그런 다음 51mL의 H2SO4 (98 % v / v)를 플라스크 벽 아래로 천천히 붓고 조심스럽게 흔들어 용액을 균질화합니다. 반응이 발열성(열 생성)이므로 혼합물이 식을 때까지 기다립니다. H2Odi를 사용하여 최종 부피를 100mL로 조정하고 용액을 유리 호박색 플라스크로 옮깁니다.
알림: 흄 후드를 사용하고 모든 안전 프로토콜을 따르고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 발생할 수 있는 유출 가능성을 중화하기 위해 50% 탄산칼슘 용액 40mL를 준비합니다. - 비이커에 0.04g의H2Odi에 0.04g의 아세트산나트륨을 용해하여 50mM 아세트산나트륨 용액을 준비합니다. 빙초산을 사용하여 pH를 5.1로 조정합니다. 마지막으로 H2Odi로 부피를 10mL로 조정합니다.
2. 효소의 제조
- 2.0mL 멸균 마이크로튜브에 0.01g의 포도당 산화효소의 무게를 측정하고 1mL의 50mM 아세트산나트륨, pH 5.0과 혼합하여 10mg/mL의 최종 농도를 얻습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 -20 °C에서 보관하십시오.
참고: 이 용액은 -20°C에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다. - 식 (1)을 사용하여 각 플라스틱 큐벳(총 부피 1.5mL)에서 원하는 효소 활성을 달성하는 데 필요한 효소 용액V2의 부피를 계산합니다: V1C1 = V2C 2, 여기서 V1은 1,500 μL, C1은 28.5 U의 효소 활성, C2 (효소 용액의 농도)는 1 mL 중 12,970 U/mL (129,000 units/g) 12,970 U/mL (129,000 units/g) H2Odi).
V2 = (1,500 μL × 28.5 U)/12,970 U = 3.29 μL (1)
참고: 보다 정확한 피펫팅을 위해 값을 3.3 μL로 반올림할 수 있습니다. - 새로운 2mL 마이크로튜브에 0.0031g의 과산화효소의 무게를 측정하고 pH 5.5의 인산염 완충액 1mL를 추가하여 최종 농도 3.1mg/mL를 달성합니다. 마이크로튜브를 알루미늄 호일로 덮고 -20°C에서 보관합니다.
- Eq (1)를 사용하여 큐벳당 원하는 효소 활성을 달성하는 데 필요한 과산화효소 용액의 부피를 계산합니다. 총 큐벳 부피 1,500μL와 표적 효소 활성도 1.25U로 시작합니다. 그런 다음 1,551 U의 농도를 감안할 때 효소 용액의 필요한 부피를 결정하십시오.
V2 = (1,500 μL × 1.25 U) / 1,551 U = 1.208 μL
참고: 보다 정확한 피펫팅을 위해 값을 1.20 μL로 반올림했습니다.
3. 포도당 기준
- 부피 플라스크에 0.01mL의 H2Odi에 0.01g의 D-포도당을 첨가하여 1g/L D-포도당 표준물질을 준비합니다. 농도를 0.5g/L로 희석하려면 500μL의 원액을 취하여 500μL의 H2Odi와 혼합하여 1mL의 최종 부피를 얻습니다.
참고: 이 희석 공정은 정확한 표준물질을 만드는 데 필수적입니다.
4. 표준 곡선 준비
- 새로운 2mL 마이크로튜브를 사용하여 표 1에 표시된 완충액과 포도당 부피를 추가합니다.
- 건식 열조를 37°C로 설정합니다. 온도가 안정되면 모든 튜브에 3.3μL의 포도당 산화효소를 추가한 다음 각 튜브에 1.2μL의 과산화효소를 추가합니다. 튜브를 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 배양 후 즉시 각 마이크로 튜브에 750 μL의 50 % H2SO4 (v / v)를 첨가하고 혼합물을 얼음 수조에서 2 분 동안 냉각시킵니다. 그 결과 최종 부피는 1,500μL가 됩니다. 마지막으로 용액을 플라스틱 큐벳으로 옮기고 529nm에서 흡광도를 측정합니다.
표 1: GOX-H2SO4 방법에 대한 포도당 검량선. 약어: GOD = 포도당 산화효소; POD = 과산화효소; H2SO4 = 황산. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
5. 미생물 샘플 테스트
- 액체 배양 배지에서 박테리아 또는 효모를 배양하여 온도, 교반 속도 및 배양 시간을 포함한 특정 조건에서 샘플을 얻습니다. 배양액이 원하는 광학 밀도(OD) 또는 세포 농도에 도달하면 추가 처리를 위해 배양물을 수집합니다.
참고: 슈도모나스 렙틸리보라(Pseudomonas reptilivora)는 300rpm 및 28°C의 일정한 교반 속도로 배양된 반면, Debaryomyces hansenii는 궤도 쉐이커에서 30°C에서 200rpm의 교반 속도로 배양되었습니다. D. hansenii의 경우, 식용 카놀라유는 리파아제 생산의 유도제로도 사용되었습니다. - 생물 안전 프로토콜에 따라 70% 알코올 용액 또는 적절한 세척제로 작업 영역을 청소하십시오. 무균 상태를 확인하기 위해 버너에 불을 붙입니다.
- 멸균 팁을 사용하여 100μL의 배양 배지를 1.5mL 또는 2mL 마이크로 튜브로 옮깁니다.
- 4°C에서 7 분 동안 7,500×g에서 샘플을 원심분리하거나 온도 제어 없이 10,000× g 에서 7분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후, 용액에 포도당이 포함된 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 버립니다.
- 1에서 20 g/L 범위의 포도당 농도에 대해 0.5 μL의 상등액을 사용한 다음 749.5 μL의 o-dianisidine-buffer, 3.3 μL의 GOD, 1.2 μL의 POD와 혼합합니다. 단계 4.2에 설명된 대로 37°C에서 20분 동안 마이크로튜브를 배양하고 즉시 750μL의 50% H2SO4를 첨가하고 얼음 수조에서 2분 동안 냉각시킵니다.
- 농도가 20g/L 이상인 경우 진행하기 전에 멸균 H2Odi로 1:1 희석을 수행합니다.
- 상등액 샘플이 이전에 -80 °C 또는 -20 °C에서 동결된 경우 사용하기 전에 실온에서 해동하고 30초 동안 와류로 가열합니다. 희석이 필요한 경우 멸균 H2Odi를 사용하십시오.
- 포도당 농도가 30g/L 이상인 샘플의 경우 멸균 H2Odi로 1:1 희석을 수행하여 희석 계수 2를 얻습니다.
- 스프레드시트 프로그램에서 Eq (2)를 사용하여 각 샘플의 총 포도당 농도를 계산합니다.
(2)
어디:
x = 포도당 농도(g/L) δ = 최종 반응 부피(0.0015 L)
y = 흡광도 M.S. = 사용된 시료의 양*
참고: b 및 m 값은 분석법에 대한 검량 곡선의 추세선을 모델링하는 방정식에서 가져온 것입니다(y = mx + b). *M.S. 값은 해당 희석액에서 비율을 구하는 데 사용된 샘플의 양을 기준으로 해야 합니다(즉, 상등액 0.5μL를 취하는 경우 M.S. = 0.0000005 L = 0.5 × 10-6 L). 희석 계수(DF)를 사용하는 경우 얻어진 흡광도에 DF를 곱합니다.
예를 들어, 0.5의 흡광도를 얻고 DF 2를 사용한 경우 결과는 1.0이 됩니다. 따라서 y = 1.0이며, 이 값은 앞에서 설명한 대로 Eq (2)에 입력해야 합니다.
6. 분석적 검증
- National Metrology Center 및 Mexican AccreditationEntity 10(CENAM-ema)에서 정한 바에 따라 GOX-H2SO4 분석법의 분석 검증 매개변수를 계산합니다.
- 정밀도를 변동 계수의 백분율 또는 %CV = (S/x) × 100으로 계산하며, 여기서 x 는 표본 그룹 평균이고 S 는 합격 값이 ≤10%인 표준 편차입니다.
- 표준 곡선을 0.995 이상의 선형 모델 R2 에 피팅하여 선형성을 결정합니다.
- LOQ = yB + 10sB 방정식을 사용하여 정량화 한계(LOQ)를 계산하며, 여기서 yB는 목표 신호와 동일한 신호를 생성하는 분석물 농도를 나타내고 10sB는 블랭크 표준 편차의 10배를 나타냅니다.
- 다음 방정식을 사용하여 계통 오류를 계산합니다: Slant = x - m, 여기서 x = 실험 농도의 평균이고 m은 이론적 농도입니다.
- 정확도를 실제 값과 이론 값 사이의 일치 정도로 결정합니다.
회복 % = (CR / CV) × 100
여기서 CR은 실험 농도의 평균이고 CV는 이론 농도의 변동 계수입니다.
7. 다른 환원당에 의한 간섭
- 0.5g/L 원액에서 포도당, 과당, 갈락토오스 및 자일로스의 4가지 환원당을 개별적으로 평가합니다. 또한 트레할로스를 음성 대조군으로 사용하십시오. 모든 샘플에 대한 프로토콜을 따르고 545 및 529 nm에서 흡광도를 측정합니다.
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결과
GOX-H2SO4 의 분광 광도계 분석은 529 nm (λmax)에서 단일 최대 흡광도를 나타 냈으며 (그림 2A) 545 nm에서 추가 흡광도 값이 관찰되었습니다. 다양한 포도당 농도에서 흡광도 값을 분석하여 λ529 nm에 대해 0.9977의 선형성(R²)과 λ545 nm에 대해 0.9967의 R²를 얻었습니다(그림 2B). 주어진 범위 내에서 선형성은 샘플의 포도당 농도에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 나타냅니다. 이는 0에서 1.0의 흡광도 범위 내에서 회귀 모델(그림 2A)의 정확도를 반영하는 결정 계수를 사용하여 평가되었습니다.
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토론
포도당은 많은 미생물의 주요 에너지원 역할을 하기 때문에 배양 배지에서 포도당을 정량화하는 것은 미생물 성장과 대사 활동을 이해하는 데 필수적입니다. 이 연구에서는 박테리아 또는 효모 발효에서 미생물 과정을 최적화하는 것을 목표로 배양 배지의 포도당 수준을 정확하게 측정하기 위해 GOX-H2SO4 방법을 사용했습니다. 우리의 연구 결과는 Yuen과 McNeill11의 연구 결과와 일치한다. 그러나 그들과 달리 우리의 연구 결과는 수치가 더 높은 포도당 수치에서 정확하다는 것을 나타냅니다. 실험에서 중요한 단계는 POD 솔루션을 튜브에 추가한 후의 타이밍입니다. 추가는 정확해야 합니다. H2SO4를 추가하지 않고 37°C에서 반응 시간이 25분을초과하면 Bergmeyer9에서 언급한 바와 같이 부정확한 판독값이 발생할 수 있습니...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다
감사의 글
2023년과 2024년 과학 연구, 기술 개발을 위한 제안 요청(16432.23-P y 19545.24-P)에서 Tecnológico Nacional de México의 부분 기부에 감사드립니다. 박사 과정 (IHRH) 기간 동안 장학금 (No. 832315)을 받아 주신 CONAHCyT (National Council for Humanities, Sciences, and Technologies)에 감사드리며, Wendolyne Monroy-Martínez의 참여와 협력에 감사드립니다. 그림 1은 BioRender.com 사용하여 만들어졌습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로튜브 | Eppendorf | - | |
| -2.0 mL 마이크로튜브 | Eppendorf | - | - |
| CaCO3 | Meyer | 471-34-1 | 칼슘 카보네이 |
| D-Glucose | Meyer | 50-99-7 | D-Glucose |
| 드라이 배스 | 피셔 사이언티픽 | 11-718-4 | 시리얼 911NO251. 블록 WxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5 |
| 포도당 산화효소 | Sigma Aldrich | G6125-50KU | 효소 분말 |
| H2O | - | - | 탈이온수 |
| H2SO4 | Meyer | 7664-93-9 | 황산 |
| HCl | Meyer | 7647-01-0 | Hydrochloridric acid |
| K2HPO4 | Meyer | 7758-11-4 | 인산이칼륨 |
| KH2PO4 | Meyer | 7778-77-0 | 인산일칼륨 |
| KOH | Meyer | 1310-58-3 | 수산화칼 |
| Lambda 35 | PerkinElmer | - | 분광 광도계 |
| 마이크로튜브 원심분리기 | - | - | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma Aldrich | D3252 | Chromogenic |
| Peroxidase | Sigma Aldrich | P8125-50KU | 효소 분말 |
| pH-meter | Hanna | 1131 | Hanna 1170 |
| 소듐 아세테이트 | Meyer | 127-09-3 | Meyer |
| 계량 주걱 | - | - | - |
참고문헌
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- Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
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- De Abreu, J. R., Santos, C. D. D., De Abreu, C. M. P., Corrêa, A. D., De Oliveira Lima, L. C. Sugar fractionation and pectin content during the ripening of guava cv. Pedro Sato. Food Sci Technol. 32 (1), 156-162 (2020).
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- Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de espectrofotometría de ultravioleta-visible. , CENAM-EMA. (2008).
- Yuen, V. G., McNeill, J. H. Comparison of the glucose oxidase method for glucose determination by manual assay and automated analyzer. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (3), 543-546 (2000).
- Hansen, O. Specificity of glucose oxidase reaction and interference with quantitative glucose oxidase-peroxidase-O-dianisidine method. Scand J Clin Lab Investig. 14 (6), 651-655 (1962).
- Kumar, V., Gill, K. D. Estimation of blood glucose levels by glucose oxidase method. Basic concepts in clinical biochemistry: A practical guide. , Springer eBooks. 57-60 (2018).
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재인쇄 및 허가
