미생물 시료에 대한 Bergmeyer 포도당 정량화

요약

Bergmeyer 포도당 정량화는 포도당의 양을 정확하고 민감하게 측정하는 임상 검사에 주로 사용되는 분광 광도계 효소 기술입니다. 여기에서는 미생물 시료에 대해 이 방법을 사용하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

포도당 농도는 세포 대사의 핵심 지표이며 총 대사 속도, 포도당 대사의 이상, 그리고 경우에 따라 세포가 포도당 대사를 에너지 대사와 결합하는 방법을 나타낼 수 있습니다. 또한 세포 내 및 세포 외 포도당 수치는 세포 대사 상태를 나타냅니다. Bergmeyer 포도당 정량화와 같은 효소 기술은 일반적으로 미생물학에서 사용되는 디니트로살리실산 또는 형광 방법과 같은 다른 기술보다 더 정확하고 민감합니다. Bergmeyer 포도당 정량화는 주로 임상 분야에서 사용되지만 모든 세포에 적용할 수 있지만 박테리아, 곰팡이, 효모 또는 기타 미생물에 대해서는 자세히 보고되지 않았습니다.

여기에서는 효소 Bergmeyer 포도당 정량화 방법을 사용하여 박테리아 및 효모 샘플의 포도당을 정량화하는 방법론을 제시합니다. 이 절차에는 효소 포도당 산화효소, 과산화효소 및 o-dianisidine dihydrochloride를 37°C에서 20분 동안 배양한 다음 황산을 첨가하는 것이 포함되었습니다. 그런 다음 흡광도를 545nm에서 측정합니다. 이 기술은 고농도의 포도당(60g/L 이상)을 측정하는 데 어려움이 있지만 희석 계수를 사용하여 50g/L 미만의 농도를 측정할 수 있다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이 효소학적 접근 방식은 미생물학 및 기타 과학 분야의 연구 및 분석에 유용합니다. 이 방법의 정밀도와 감도는 미생물 샘플에서 낮은 농도의 포도당을 검출하는 데 도움이 됩니다.

서론

포도당은 박테리아, 효모 및 곰팡이를 포함한 수많은 미생물의 주요 에너지 및 탄소원 역할을 합니다. 이 미생물은 세포외막에 위치한 수송체를 통해 포도당을 흡수하며, 해당작용 대사 경로 내에서 일련의 생화학적 반응을 거쳐 피루브산¹로 전환됩니다. 포도당과 같은 당을 환원시키는 정량화를 위한 다양한 기술이 있습니다. 예를 들어, 베네딕트 시약², 3,5-디니트로살리실산(DNS)^3,4, 안트로나 방법⁵ 또는 페놀-황산⁶ 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 과당 및 맥아당과 같이 샘플에 존재하는 환원당을 검출하며, 이는 신호에 기여하고 특정 당의 정확한 정량을 복잡하게 만들 수 있습니다.

또한 엄격한 온도 제어와 유해 물질 취급이 필요하여 공정을 복잡하게 만들고 정확도에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 샘플에 존재하는 다른 화합물의 간섭을 받아 정확한 포도당 정량화를 어렵게 만들 수 있습니다. 반대로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 보다 정확....

프로토콜

1. 용액 준비

1. 0.1M 인산염 완충액 100mL를 준비합니다. 인산이수소칼륨 1.28g(KH₂PO₄)과 인산이칼륨(K₂HPO₄) 0.1304g의 무게를 달아 유리 비커에 넣습니다. 이제 70mL의 탈이온수(H₂Odi)를 넣고 1M 염산(HCl) 또는 수산화칼륨(KOH)을 사용하여 pH를 5.5로 조정합니다. 용액을 부피 플라스크로 옮기고 최종 부피를 100mL로 조정합니다. 그런 다음 용액을 호박색 용기에 옮기고 용액을 4-8°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.
   주의: o-dianisidine dihydrochloride는 잠재적으로 발암성이므로 준비 과정 전반에 걸쳐 니트릴 장갑을 착용하여 피부 접촉 및 잠재적인 오염을 방지하십시오.
2. o-dianisidine dihydrochloride의 1% w/v 용액을 준비합니다. o-dianisidine dihydrochloride 0.01g의 무게를 달아 2.0mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 1,000mL 마이크로피펫을 사용하여 1.0mL의 H₂Odi를 첨가하여 화합물을 용해한 다음 위아래로 피펫팅하여 천천히 혼합합니다. ....

결과

GOX-H₂SO₄ 의 분광 광도계 분석은 529 nm (λmax)에서 단일 최대 흡광도를 나타 냈으며 (그림 2A) 545 nm에서 추가 흡광도 값이 관찰되었습니다. 다양한 포도당 농도에서 흡광도 값을 분석하여 λ529 nm에 대해 0.9977의 선형성(R²)과 λ545 nm에 대해 0.9967의 R²를 얻었습니다(그림 2B). 주어진 범위 내에서 선형성은 샘플의 포도당 농도에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 나타냅니다. 이는 0에서 1.0의 흡광도 범위 내에서 회귀 모델(그림 2A)의 정확도를 반영하는 결정 계수를 사용하여 평가되었습니다.

토론

포도당은 많은 미생물의 주요 에너지원 역할을 하기 때문에 배양 배지에서 포도당을 정량화하는 것은 미생물 성장과 대사 활동을 이해하는 데 필수적입니다. 이 연구에서는 박테리아 또는 효모 발효에서 미생물 과정을 최적화하는 것을 목표로 배양 배지의 포도당 수준을 정확하게 측정하기 위해 GOX-H₂SO₄ 방법을 사용했습니다. 우리의 연구 결과는 Yuen과 McNeill¹¹의 연구 결과와 일치한다. 그러나 그들과 달리 우리의 연구 결과는 수치가 더 높은 포도당 수치에서 정확하다는 것을 나타냅니다. 실험에서 중요한 단계는 POD 솔루션을 튜브에 추가한 후의 타이밍입니다. 추가는 정확해야 합니다. H2SO4를 추가하지 않고 37°C에서 반응 시간이 25분을초과하면 Bergmeyer⁹에서 언급한 바와 같이 부정확한 판독값이 발생할 수 있습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로튜브	Eppendorf	-
-2.0 mL 마이크로튜브	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	칼슘 카보네이
D-Glucose	Meyer	50-99-7	D-Glucose
드라이 배스	피셔 사이언티픽	11-718-4	시리얼 911NO251. 블록 WxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
포도당 산화효소	Sigma Aldrich	G6125-50KU	효소 분말
H2O	-	-	탈이온수
H2SO4	Meyer	7664-93-9	황산
HCl	Meyer	7647-01-0	Hydrochloridric acid
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	인산이칼륨
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	인산일칼륨
KOH	Meyer	1310-58-3	수산화칼
Lambda 35	PerkinElmer	-	분광 광도계
마이크로튜브 원심분리기	-		-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma Aldrich	D3252	Chromogenic
Peroxidase	Sigma Aldrich	P8125-50KU	효소 분말
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
소듐 아세테이트	Meyer	127-09-3	Meyer
계량 주걱	-	-	-

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