Method Article

인간 Myosin-7a의 MultiBac 시스템 기반 정제 및 생물물리학적 특성 분석

DOI:

10.3791/67135

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August 23rd, 2024

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1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 MultiBac Baculovirus 시스템을 사용하여 인간 myosin-7a holoenzyme을 재조합 생산하고 맞춤형 in vitro 필라멘트 글라이딩 분석을 사용하여 운동성을 연구하는 절차를 자세히 설명합니다.

Abstract

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Myosin-7a는 청각 및 시각 과정에 필수적인 액틴 기반 운동 단백질입니다. myosin-7a의 돌연변이는 인간에게 가장 흔하고 심각한 형태의 청각 실명인 어셔 증후군 1형을 유발합니다. myosin-7a는 다른 Usher 단백질과 함께 막관통 접착 복합체를 형성하며, 이는 광수용체와 달팽이관 유모 세포의 구조적-기능적 무결성에 필수적이라는 가설이 있습니다. 그러나 순수하고 온전한 단백질을 얻는 데 어려움이 있기 때문에 인간 myosin-7a의 정확한 기능 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵고 제한된 구조 및 생체 역학 연구가 있습니다. 최근 연구에 따르면 포유류의 미오신 -7a는 중쇄와 세 가지 유형의 경쇄, 즉 조절 경쇄(RLC), 칼모듈린 및 칼모듈린 유사 단백질 4(CALML4)로 구성된 다중체 운동 복합체입니다. 칼모듈린과 달리 CALML4는 칼슘 이온에 결합하지 않습니다. 칼슘에 민감한 칼모듈린과 둔감한 칼모듈린은 모두 포유류의 미오신 -7a의 기계적 특성을 적절하게 미세 조정하는 데 중요합니다. 여기에서는 MultiBac Baculovirus 단백질 발현 시스템을 사용하여 재조합 인간 myosin-7a 홀로효소를 생성하는 자세한 방법을 설명합니다. 이를 통해 밀리그램 단위의 고순도 전장 단백질을 생성하여 생화학적 및 생물물리학적 특성을 분석할 수 있습니다. 또한 맞춤형 in vitro motility assay 및 fluorescence microscopy를 사용하여 기계적 및 운동성 특성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 여기에 설명된 상세한 기능적 특성 분석 프로토콜과 함께 온전한 인간 myosin-7a 단백질의 가용성은 시력 및 청각에서 myosin-7a의 분자 측면에 대한 추가 연구를 위한 길을 열어줍니다.

Introduction

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미오신 (Myosin)은 액틴과 상호 작용하여 수많은 세포 과정을 주도하는 분자 운동 단백질입니다 1,2,3,4. 인간은 12개의 유전자와 39개의 미오신 유전자(myosin gene)5를 가지고 있으며, 이 유전자들은 근육 수축6 및 감각 과정7과 같은 광범위한 생리적 기능에 관여한다. 각 미오신 분자는 중쇄와 경쇄로 구성된 다중체 복합체입니다. 무거운 사슬은 머리, 목, 꼬리 영역으로 나뉩니다. 헤드에는 ATP 가수분해를 담당하고 액틴 필라멘트에 힘을 생성하는 액틴 및 뉴클레오티드 결합 부위가 포함되어 있습니다2. 목은 특정 라이트 체인 세트가 바인딩 된 여러 개의 α 나선형 IQ 모티브로 형성됩니다. 그들은 함께 모터의 구조적 변화를 큰 움직임 8,9,10으로 증폭시키는 레버 암으로 기능합니다. 꼬리는 부류별 하위 도메인을 포함하며 미오신 운동 활동을 조정하고 세포 결합 파트너와의 상호 작용을 중재하는 조절 역할을 합니다 2,11.

인간 미오신 -7a는 클래스 7 미오신 (myosin)의 구성원으로, 청각 및 시각 과정에 필수적이다 12,13. 인간 myosin-7a의 IQ 모티프는 조절 경쇄(RLC), 칼모듈린 및 칼모듈린 유사 단백질 4(CALML4)를 포함한 경쇄의 고유한 조합과 관련이 있습니다.14,15,16. 레버 암을 안정화하는 것 외에도, 이 경쇄는 칼슘 신호전달에 반응하여 미오신-7a의 기계적 성질을 조절하는데, 이는 포유류 동형14에 고유한 것으로 보인다.

myosin-7a 중쇄(MYO7A/USH1B)를 암호화하는 유전자의 결함은 인간에서 가장 심각한 형태의 시력 및 청력 상실인 어셔 증후군 1형의 원인이 된다17. 또한 경쇄 유전자 CALML4는 1형 어셔 증후군 15,18의 또 다른 변이체인 USH1H의 원인 대립유전자를 포함하도록 매핑된 후보 유전자중 하나입니다. 망막에서 myosin-7a는 망막 색소 상피와 광수용체 세포에서 발현됩니다13. 이는 망막 색소 상피(RPE)19에서 멜라노좀의 국소화와 RPE 세포(20)에 의한 광수용체 외부 분절 디스크의 식세포작용과 관련이 있습니다. 내이(inner ear)에서 미오신 -7a는 주로 입체섬모(stereocilia)에서 발견되며, 여기서 모발 다발을 형성하고 기계-전기 전달 과정을 게이팅하는 데 중요한 역할을 합니다 12,21,22.

감각 세포에서 myosin-7a의 중요성은 잘 확립되어 있지만, 분자 수준에서의 기능적 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식의 격차는 부분적으로 온전한 단백질, 특히 포유류 동형을 정제하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 최근에는 MultiBac 시스템을 사용하여 완전한 인간 미오신 -7a 홀로엔자임14를 재조합 발현하는 데 상당한 진전이 이루어졌습니다. 이러한 발전은 이 운동 단백질의 구조적 및 생물물리학적 특성을 가능하게 하여 포유류의 청각 기능에 특별히 적응된 인간 미오신 -7a의 몇 가지 고유한 특성을 발견하게 되었습니다14,23.

MultiBac 시스템은 진핵생물 다중체 복합체24,25의 발현을 위해 특별히 설계된 고급 baculovirus/곤충 세포 플랫폼입니다. 이 시스템의 주요 특징은 단일 MultiBac 바큘로바이러스 내에서 복합체의 소단위를 암호화하는 여러 유전자 발현 카세트를 호스팅할 수 있다는 것입니다. 다유전자 발현 카세트의 조립은 소위 증식 모듈, 즉 귀환 엔도뉴클레아제(HE) 부위와 다중 클로닝 부위(MCS) 측면에 있는 정합 설계된 BstXI 부위를 통해 촉진됩니다. 이 모듈은 제한/접합을 통해 단일 발현 카세트를 반복적으로 조립할 수 있으며, HE 및 BstXI 제한 부위가 접합 시 제거된다는 사실을 활용합니다. 이 논문에서는 human myosin-7a heavy chain, RLC, calmodulin 및 CALML4를 각각 pACEBac1 벡터 내의 곱셈 모듈로 클로닝한 다음(그림 1A) 반복 과정을 통해 다유전자 발현 카세트로 조립합니다(그림 1B). myosin-7a 다유전자 카세트는 pACEBac1 벡터의 mini-Tn7 요소를 게놈의 mini-attTn7 표적 부위로 전위함으로써 baculoviral 게놈(bacmid)에 통합됩니다(그림 1C). 바미드 정제, 바큘로바이러스 생산 및 증폭 절차(그림 1D,E)에 따라 재조합 미오신-7a MultiBac 바큘로바이러스를 준비하여 대규모 단백질 생산에 사용할 수 있습니다(그림 1F). 또한, 미오신 -7a 경쇄는 대장균에서 별도로 생산할 수 있으며 절단 가능한 His6-SUMO 태그 26,27,28을 사용하여 정제할 수 있습니다. 정제된 경쇄는 결합 역학과 myosin-7a의 조절을 연구하는 데 유용합니다.

정제된 myosin-7a 단백질은 구조적, 생화학적, 생물물리학적 연구를 통해 이 운동 단백질의 구조적 기능적 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한, 액틴 네트워크 및 다른 결합 단백질(29)과의 상호 작용은 다양한 시험관 내 재구성 접근법을 사용하여 검사할 수 있습니다. 이러한 분석의 결과는 이 myosin의 생물물리학적 특성을 알리고, myosin-7a가 어떻게 세포골격 변화를 주도하고 궁극적으로 감각 세포의 고유한 형태와 기능을 형성하는지에 대한 기계론적 이해로 이어질 것입니다. 이 논문에서는 포유류 myosin-7a에 특별히 적용된 액틴 필라멘트 글라이딩 분석을 위한 워크플로우에 대해 자세히 설명합니다. Actin 필라멘트 글라이딩 분석은 커버슬립 표면30,31,32에 고정된 다수의 미오신 모터에 의해 추진되는 형광 액틴 필라멘트의 움직임을 정량적으로 연구하는 강력한 시험관 내 운동성 분석법입니다. 이 분석법의 장점으로는 설정이 간단하고, 장비 요구 사항이 최소화되고(디지털 카메라가 장착된 광시야 형광 현미경), 높은 재현성이 있습니다. 또한 액틴 필라멘트의 운동은 고정된 미오신 모터 클러스터에 의해 구동되기 때문에 이 분석은 미오신 -7a14,33과 같은 단량체 미오신 운동성을 연구하는 데 특히 유용합니다. 프로토콜에는 실험 절차에서 이미징 분석에 이르기까지 여러 가지 수정 사항이 포함되어 있으며, 특히 포유류 myosin-7a의 고유한 운동성 특성에 맞게 조정되었습니다. 온전한 myosin-7a 단백질의 가용성과 여기에 설명된 기능적 특성 분석 프로토콜을 통해 이 논문은 생리학적 및 병리학적 과정 모두에서 myosin-7a의 분자 역할에 대한 추가 연구를 위한 토대를 마련합니다.

Protocol

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참고: 여기에서는 온전한 인간 myosin-7a holoenzyme을 합성하고 in vitro에서 그 운동성을 특성화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다: 첫째, MultiBac baculovirus 단백질 발현 시스템을 사용하여 human myosin-7a를 발현하는 것; 둘째, E.coli His6-SUMO 시스템을 사용하여 myosin-7a 경쇄를 개별적으로 정제하는 단계; 마지막으로 Actin-Filament Gliding Assay를 사용하여 인간 Myosin-7A의 운동성을 연구합니다.

1. MultiBac 시스템 기반 myosin-7a 복합체 생산

  1. human myosin-7a complex를 발현하기 위한 baculovirus multigene cassette 생성(16일)
    참고: myosin-7a subunit의 cDNA를 pACEBac1 벡터에 삽입하는 데 1회의 클로닝 주기(4일)가 필요하고, myosin-7a 복합체를 발현하는 데 필요한 모든 증식 모듈의 단계적 결찰을 완료하기 위해 3회의 클로닝 주기가 필요하므로 총 16일이 소요됩니다.
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 myosin-7a 중쇄(HC), 칼모듈린, CALML4 및 RLC 를 암호화하는 cDNA를 pACEBac1 벡터로 클로닝합니다( 재료 표 참조; 그림 1A). FLAG 태그는 정제를 돕기 위해 myosin-7a HC의 C-말단에 삽입됩니다.
      참고: 포유류 미오신 -7a는 두 개의 접합 동형으로 생성되며, N-말단23에서 11개의 아미노산 세그먼트에 의해서만 다릅니다. 이 짧은 N-말단 확장은 myosin-7a14의 ATPase 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. N-말단 태그를 추가하는 것은 이러한 N-말단 확장에 의한 정상적인 조절을 방해할 수 있고, 모터의 효소 활성 및 운동성(14)을 현저하게 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 따라서 단백질의 자연적인 조절을 방해하지 않기 위해 C-말단 FLAG 태그가 사용됩니다.
    2. 아래 설명된 대로 homing endonuclease/BstXI multiplication을 사용하여 myosin-7a holoenzyme에 대한 multigene expression cassette를 구성합니다(그림 1B).
      참고: 원점 엔도뉴클레아제 I-CeuI는 BstXI digest에 의해 생성된 말단과 호환되는 응집성 말단을 생성합니다. 접합 시 어느 효소로도 절단할 수 없는 homing endonuclease/BstXI hybrid restriction site가 생성됩니다. 더 많은 곱셈 모듈을 통합하기 위해 동일한 절차를 반복할 수 있습니다. 삽입체 또는 벡터 구조체에 I-CeuI 및 BstXI에 대한 여러 제한 부위가 존재하는 경우, 이러한 추가 부위는 I-CeuI 및 BstXI 절단 부위가 고유하도록 하기 위해 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 제거되어야 합니다.
    3. 인서트 준비: 인서트 구조체(예: pACEBac-M7a HC)를 homing endonuclease I-CeuI( 재료 표 참조)로 분해한 다음 PCR Purification Kit( 재료 표 참조)를 사용하여 선형화된 플라스미드를 정제합니다. 또한, 선형화된 플라스미드를 BstXI로 절단하고( 재료 표 참조), 겔 전기영동을 사용하여 유전자 발현 카세트를 포함하는 단편을 분리하고, 겔 추출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 정제합니다.
      참고: I-CeuI 및 BstXI는 100% 활성을 달성하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 서로 다른 완충 조건이 필요합니다. 또한 I-CeuI로 완전히 절단하려면 최소 3시간이 필요한 반면 BstXI는 배양 시간이 15분밖에 걸리지 않습니다. 따라서 소화는 순차적으로 수행되어야 합니다.
    4. 벡터 준비: BstXI 분해를 통해 벡터 구조(예: pACEBac-CaM)를 선형화합니다. Alkaline Phosphatase는 벡터 플라스미드가 그 자체로 결합하는 것을 방지하기 위해 벡터 준비에 포함됩니다( 재료 표 참조). 전기영동으로 분해 산물을 얻고 Gel Extraction Kit로 정제합니다.
    5. 접합: I-CeuI/BstXI 처리된 삽입물과 BstXI 처리된 벡터를 T4 DNA 리가아제로 결찰합니다( 재료 표 참조). 인서트 DNA와 벡터 DNA의 질량을 1:1 비율로 하여 실온(20°C -25°C)에서 10분 동안 ligation 반응을 수행하여 각 ligation 반응에서 총 질량을 100ng에 가깝게 유지합니다.
    6. 형질전환 및 플라스미드 분석: 제조업체의 권장 사항에 따라 ligation 혼합물을 DH5α 세포( 재료 표 참조)로 형질전환하고 양성 콜로니에서 겐타마이신 내성을 스크리닝합니다. 상용 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 플라스미드를 정제하고, 특정 제한 분해 패턴 및 삽입체의 DNA 염기서열분석을 기반으로 올바른 클론(예: M7a HC 및 CaM을 모두 포함하는 플라스미드)을 검증합니다.
    7. 다중 유전자 발현 카세트의 통합: 1.1.2단계부터 1.1.6단계까지 반복하여 다른 myosin-7a subunit을 발현하는 추가 유전자 카세트를 통합합니다.
  2. 재조합 bacmid DNA 생산 및 정제(4일; 그림 1C).
    참고: 1일차 - 박테리아 변형 및 변형된 콜로니의 성장. 2-3일차 - 콜로니를 성장시키고 성공적인 형질전환을 위한 스크리닝. 3일차 - 양성 콜로니를 선택하고 줄무늬를 그리며 야간 접종을 시작합니다. 4일차 - bacmid DNA 정제.
    1. 제조사의 권고사항에 따라 DH10Bac 유능한 세포( 재료 표 참조)를 염기서열분석된 pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM 플라스미드 1ng로 형질전환시킵니다.
    2. 50 μg/mL 카나마이신, 7 μg/mL 겐타마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 100 μg/mL 할로겐화 인돌릴-β-갈락토시드 및 40 μg/mL IPTG( 재료 표 참조)를 포함하는 한천 플레이트에 20-200 μL의 세포를 플레이트하고 37°C에서 48시간 동안 플레이트를 배양하여 음성 클론에서 짙은 파란색을 발달시킵니다.
      참고: 할로겐화 인돌릴-β-갈락토사이드는 LacZ를 계속 발현하는 콜로니를 염색하여(전치가 실패했음을 나타냄) 전치가 성공한 백색 콜로니를 선택할 수 있습니다.
    3. 분리된 백색 콜로니를 신중하게 선택하고 225rpm의 오비탈 셰이커에서 37°C에서 50μg/mL 카나마이신, 7μg/mL 겐타마이신, 10μg/mL 테트라사이클린을 함유한 5mL의 LB 배지에서 밤새 세포를 성장시킵니다.
    4. 배양액을 2,465 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 대장균을 펠릿화합니다. 상층액을 버리고 키트에서 300μL의 완충액 P1에 펠릿을 재현탁시킵니다.
      참고: 여기에는 Miniprep 키트의 완충액이 사용되지만 bacmid 제품을 정제하기 위한 프로토콜은 키트와 함께 제공된 프로토콜과 다릅니다.
    5. 키트에서 버퍼 P2 300μL를 추가합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞은 다음 실온에서 3분 동안 배양합니다.
    6. 키트에서 N3 완충액 300μL를 추가하고 반역으로 혼합하여 용해 반응을 중지합니다. 17,885 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    7. 상층액을 깨끗한 멸균 튜브로 옮기고 원심분리를 10분 더 반복합니다.
    8. 상층액 800μL를 다른 멸균 1.7mL 미세 원심분리 튜브( 재료 표 참조)로 옮기고 600μL의 콜드 이소프로판올( 재료 표 참조)을 넣고 엄격한 반전으로 혼합합니다. 그런 다음 17,885 x g 에서 4 ° C에서 20 분 동안 원심 분리합니다.
    9. 상층액을 버리고 작고 하얀 펠릿을 찾으십시오. 펠릿을 800μL의 차가운 70% 에탄올( 재료 표 참조)로 세척하고 17,885 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 튜브 벽을 따라 에탄올을 조심스럽게 첨가하십시오.
    10. 상층액을 버리고 에탄올 세척을 한 번 반복합니다. 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다. 필요한 경우 과도한 액체를 조심스럽게 흡입하십시오.
    11. 키트에서 20μL의 EB 완충액으로 펠릿을 용해합니다. 튜브를 튕기거나 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인합니다. 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
    12. 필요에 따라 완충액 부피를 조정하여 bacmid 농도를 약 1μg/μL로 만듭니다. P0 바이러스 생산이 준비될 때까지 bacmid DNA를 4°C에서 보관합니다.
      참고: 정제된 bacmid는 4°C에서 보관할 수 있으며 몇 달 동안 효과가 유지됩니다. 우리는 최대 1년 된 bacmid 제품으로 성공적인 transfection을 보았습니다. 대안적으로, bacmid는 -20 °C에서 분주되어 보관될 수 있습니다. 여러 번의 동결/해동 주기는 transfection 효율을 감소시키므로 피해야 합니다.
  3. Sf9 곤충 세포에 bacmid를 transfection하여 재조합 baculovirus 생성(6일; 그림 1D)
    참고: 1일차 - bacmid DNA로 세포 transfection. 2-6일차 - 세포의 성장과 발현을 관찰합니다. 6일차 - P0 바이러스 수집.
    1. 배양 배지( 재료 표 참조)의 Sf9 세포를 웰당 3mL로 0.33 x 106 cells/mL의 농도로 6웰 플레이트에 추가합니다. 셀이 플레이트 바닥에 부착될 수 있도록 플레이트를 실온에서 30분 동안 두십시오.
    2. 각 웰에 대해 10μL의 양이온성 지질 transfection 시약( 재료 표 참조)과 250μL의 개선된 MEM(Minimal Essential Medium) 매체( 재료 표 참조)를 제균 마이크로 원심분리 튜브에 결합하여 transfection 혼합물을 준비합니다. 반역으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 희석되지 않은 미오신 -7a bacmid 1μg(1.2.12단계에서 결정된 농도 기준)을 transfection 혼합물에 추가합니다. 반역으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    4. 전체 DNA-지질 혼합물을 웰에 적하 방식으로 균등하게 분배합니다. transfection되지 않은 세포를 위해 음성 대조군으로 하나의 웰을 남겨 두십시오.
    5. 6-well plate를 필름으로 밀봉하고( 재료 표 참조) 27°C에서 6일 동안 배양합니다. 이 기간 동안 성장과 초연함을 관찰하십시오. 구조물에 형광 태그가 있는 경우 형광 발생을 확인합니다(그림 2).
    6. 형질주입된 세포가 말기 감염의 징후를 보이면 감염된 웰에서 바이러스가 포함된 배지를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 805 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
    7. 상층액을 깨끗한 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 알루미늄 호일로 싸서 4°C에서 보관합니다. 이 제품은 이제 P0 바이러스이며 당사의 경험에서 최대 4 개월 동안 효과적으로 보관 및 사용할 수 있습니다.
  4. 바큘로바이러스 재고 증폭 (3-5일; 그림 1E)
    1. 250mL 삼각 플라스크의 Sf9 세포 배양 배지에서 2 x 106 cells/mL 농도로 100mL(또는 원하는 부피)의 Sf9 세포를 준비합니다( 재료 표 참조).
    2. P0 바이러스 스톡의 1:100 비율(v/v)을 Sf9 세포 현탁 배양에 추가하고 27°C에서 135rpm의 궤도 셰이커에서 배양합니다.
    3. 세포가 ~90%의 세포 사멸을 달성할 때까지 24시간마다 성장을 모니터링합니다. 이 범위에서 세포 현탁액을 500 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 P1 바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다.
    4. 0.22μm 진공 여과를 사용하여 상층액을 여과합니다( 재료 표 참조). 여과된 제품을 어두운 곳에 보관하고 4°C에서 보관하십시오. 이 제품은 이제 P1 바이러스입니다.
      참고: 바이러스 역가는 4 °C에서 장기간 보관하면 감소합니다. 4개월 이상 보관된 경우 새로운 바이러스 스톡을 만들거나 식34에서 사용하기 전에 바이러스 스톡을 역가화하는 것을 고려하십시오.
  5. 단백질 발현 (세포 펠릿의 발현 시작과 수집 사이의 60 -72 시간; 그림 1E)
    1. 2 x 106 cells/mL 농도로 로그 단계 성장 Sf9 세포를 준비하고 바이러스 12mL와 세포 현탁액 300mL의 비율로 P1 바이러스를 추가합니다.
      참고: 단백질 수율은 약 1mg/L입니다. 이 단백질 발현을 위해 최소 1.5L의 세포 현탁액을 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 27°C에서 135rpm의 오비탈 셰이커에서 약 60시간 동안 세포를 배양합니다.
      참고: 다양한 시점에서 작은 샘플을 수집하고 SDS 겔을 사용하여 단백질 발현 수준을 평가하여 분석할 수 있습니다. 또한 단백질이 형광 태그와 융합되면 형광 현미경을 사용하여 발현 수준을 평가할 수 있습니다. 세포는 세포 사멸이 시작되기 전에 늦어도 수확해야 합니다.
    3. 셀 현탁액을 3,735 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 셀을 펠트합니다. 펠릿은 -80 °C에서 계속 사용하거나 장기간 보관할 때까지 보관할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 몇 주 이내에 세포 펠릿을 사용하지만 냉동 후 몇 개월 후에 활성 단백질을 회수합니다.
  6. 단백질 정제 (2일; 그림 1F)
    참고: 1일차 - FLAG-친화성 크로마토그래피를 사용한 단백질 추출 및 정제. 2일차 - 하룻밤 투석 후 시료 분취 및 동결. 아래에 설명된 프로토콜은 1.5L 세포 펠릿에서 myosin-7a를 정제하기 위한 것입니다.
    1. 10mM MOPS(pH 7.2), 500mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM EGTA, 1μg/mL 류펩틴 및 100μg/mL 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 포함하는 마스터 버퍼를 준비합니다. 0.22μm 공극 크기 필터로 여과하고 버퍼를 4°C에서 보관합니다( 재료 표 참조).
      알림: PMSF는 수용액에서 불안정합니다. PMSF 원액을 100% 에탄올에 1M으로 준비하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
    2. 마스터 버퍼에 EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 3정, 2mM ATP 및 0.1mM 디티오트레이톨(DTT, 재료 표 참조)을 보충하여 추출 버퍼 75mL를 준비합니다.
    3. 75mL의 추출 완충액을 펠릿이 아직 얼지 않은 상태에서 추가합니다. 추출 버퍼의 펠릿을 해동될 때까지 얼음 위에 두십시오. 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 분해하여 해동 과정을 가속화합니다.
    4. 1/2인치(13mm) 팁을 사용하여 50% 진폭, 5초 켜짐, 5초 꺼짐으로 10분 동안 얼음에 리서스펜션을 초음파 처리합니다.
    5. 33,746 x g 에서 4 °C에서 30 분 동안 총 용해물을 원심 분리합니다. 원심분리하는 동안 Anti-FLAG 친화성 수지( 재료 표 참조)의 50% 슬러리 3mL를 PBS 40mL로 세척하여 1.5mL의 FLAG 수지를 준비합니다. 800 x g 에서 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리하여 수지를 펠릿합니다. 레진을 방해하지 않고 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
    6. 용해물 원심분리의 상층액을 세척된 수지에 추가하고 4°C에서 1시간 동안 연속 회전하여 배양합니다.
    7. 800 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 수지를 펠릿합니다. 수지를 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오.
    8. 마스터 버퍼 40mL에 레진을 재현탁시키고 800 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다. 수지를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 세탁을 1회 반복합니다.
    9. 세척된 수지를 두 개의 폴리프로필렌 스핀 컬럼으로 옮깁니다( 재료 표 참조). 각 컬럼을 2mL의 마스터 버퍼로 1회 세척합니다. 4°C에서 2분 동안 1,400 x g 에서 컬럼을 원심분리하여 마스터 버퍼를 제거합니다. 수지는 바닥에 포장됩니다.
    10. 마스터 버퍼에 100μg/mL의 FLAG-펩타이드( 재료 표 참조)를 첨가하여 용리 버퍼를 준비합니다.
    11. 각 컬럼의 충전된 레진에 300μL의 용리 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 레진이 용리 버퍼에 의해 완전히 수화되도록 합니다. 수지를 용출 완충액으로 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    12. 1,400 x g 에서 4°C에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다. 플로우스루를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 이것이 첫 번째 분수입니다.
    13. 1.6.11-1.6.12단계를 반복하여 각 열에서 4개의 분수가 수집되도록 합니다.
    14. 용리 분획으로 SDS-PAGE 겔 전기영동35 를 수행하여 상대 농도를 측정합니다. 겔이 작동하는 동안 500mM NaCl, 10mM 걸레, 2mM MgCl2, 0.1mM EGTA 및 1mM DTT를 포함하는 투석 완충액을 준비합니다.
    15. 가장 농축된 분획을 결합합니다. 샘플을 10K MWCO 투석 카세트( 재료 표 참조)로 옮기고 4°C에서 밤새 투석합니다. 약 500 μL의 단백질에 대해 1 L 투석 완충액을 사용하십시오. 투석 완충액을 최소 3회 교체합니다.
      참고: 스핀 컬럼 및 원심분리 용출 방법을 사용하면 단백질을 고농도(0.5-1mg/mL)로 용리할 수 있습니다. 추가 집중 단계는 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나 더 농축된 단백질이 필요한 경우 100,000MWCO 농축 튜브( 재료 표 참조)에 샘플을 로드하고 1,400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 원하는 단백질 용액 부피에 도달할 때까지 이 과정을 반복합니다.
    16. 다음 날, 투석 카세트에서 검체를 조심스럽게 꺼냅니다. PCR 튜브당 15μL를 분취하고 급속 동결을 위해 튜브를 액체 질소 용기에 떨어뜨립니다. 동결된 단백질은 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관할 수 있습니다(그림 3A).
      참고: 이 방법을 사용한 myosin-7a의 수율은 일반적으로 0.5에서 1mg/L 사이입니다.

2. E. coli His6-SUMO 시스템을 이용한 경쇄 RLC 및 CALML4 정제 (7일)

참고: 1-4일차 - 플라스미드의 클로닝 및 정제. 5일차 - 박테리아 변형. 6-7일 - 최종 단백질의 정제, 분취 및 동결.

  1. RLC 및 CALML4를 인코딩하는 cDNA를 pET-SUMO 벡터로 클로닝하고, 이 벡터에는 SUMO 이전의 His6 서열이 포함되어 있어 정제를 돕습니다. 필요한 경우, SENP2 프로테아제26,36을 사용하여 융합 단백질로부터 His6-SUMO 도메인을 절단할 수 있다.
  2. 각 경쇄 단백질에 대해 플라스미드로 BL21 E. coli 유능한 세포( 재료 표 참조)를 형질전환하고 형질전환된 세포로 5mL의 야간 액체 배양을 시작합니다.
  3. 다음 날, 50μg/mL 카나마이신이 함유된 1L의 Luria-Bertani(LB) 육수에 5mL의 야간 배양액을 접종합니다. 광학 밀도(O.D.)가 0.6 - 1.0에 도달할 때까지 270rpm에서 지속적으로 흔들면서 37°C에서 배양액을 성장시킵니다.
    참고: O.D. 값은 0.2에 도달하면 약 20분마다 두 배가 됩니다. OD를 자주 모니터링하십시오.
  4. 배양액에 250μM 이소프로필 b-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 시작합니다. 37 °C 또는 16 °C에서 270 rpm에서 지속적으로 흔들면서 밤새 3-5 시간 동안 배양합니다.
  5. 4,347 x g의 세포 현탁액을 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 대장균을 펠릿화합니다. 상층액을 버리십시오.
  6. 50mM Tris-HCl, 1M NaCl, 5mM 이미다졸 및 10% 글리세롤, pH 7.4를 포함하는 재현탁액 완충액을 준비합니다( 재료 표 참조). 얼음 위에 두십시오.
  7. 펠릿을 15-25mL의 재현탁 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 깨끗한 비커로 옮겨 총 부피를 35mL로 조정합니다. DNase 및 RNase를 1:1000(v/v) 비율로 현탁액에 첨가하여 각각 1 μg/mL 및 2 μg/mL의 최종 농도를 만듭니다. EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 1정, 4mM 2-메르캅토에탄올 및 1% Triton X를 현탁액에 첨가합니다( 재료 표 참조). 20분 동안 얼음 위에 두십시오.
  8. 1% 진폭에서 총 1분 동안 1초 동안 1초 동안 펠릿 현탁액을 얼음물에 초음파 처리합니다. 균질화된 용해물을 4°C에서 2시간 동안 연속 회전시키면서 그대로 둡니다.
    참고 : Triton X를 추가하면 초음파 처리를 준비하기 위해 세포를 용해하는 데 도움이됩니다.
  9. 26,900 x g 에서 4°C에서 45분 동안 용해물을 원심분리합니다. 이 작업이 진행되는 동안 코발트 수지를 준비하기 시작합니다( 재료 표 참조). 대장균 배양 1L에 500μL의 코발트 수지를 사용합니다. 초순수로 레진을 2번 세척하고 4,347 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 현탁액 버퍼로 한 번 세척합니다.
  10. 용해물 원심분리 후 상층액과 세척된 수지를 결합하고 4°C에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
  11. 용해물-수지 현탁액을 4,347 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다. 수지는 튜브 바닥에 포장됩니다. 수지를 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오.
  12. Resuspension Buffer로 4,347 x g 에서 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리하여 수지를 세척합니다. 상층액을 제거합니다. 상층액이 무색이 될 때까지 세척을 반복합니다.
  13. 50mM Tris HCl, 300mM NaCl, 5mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 4mM 2-메르캅토에탄올 및 0.25μM SENP2 프로테아제를 포함하는 용출 완충액을 준비합니다( 재료 표 참조). 얼음 위에 두십시오.
  14. 1mL의 Resuspension Buffer에 수지를 재현탁시키고 연속 회전으로 4°C에서 밤새 배양합니다.
  15. 다음 날, 4,347 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 수지를 펠릿화합니다. 절단된 경쇄 단백질과 프로테아제를 포함하는 상층액을 수집합니다.
  16. 레진에 용출 완충액 1mL를 추가합니다. 원심분리를 반복하고 상층액을 수집합니다.
  17. 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)로 프로테아제를 제거합니다. 간단히 말해서, 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% 글리세롤 및 5mM DTT(pH 7.4)를 포함하는 완충액으로 크기 배제 컬럼( 재료 표 참조)을 준비합니다. 10,000MWCO 농축 튜브를 사용하여 상층액을 500μL로 농축합니다. 주사기를 사용하여 자동 크로마토그래피 시스템에 연결된 컬럼에 농축된 시료를 로드하고 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% 글리세롤 및 5mM DTT(pH 7.4)를 포함하는 완충액으로 통과시킵니다. 자외선 분광 광도계를 사용하여 수집된 분획을 모니터링합니다. 경쇄에 해당하는 분자량을 가진 단백질 분획을 수집합니다.
    참고: 정제 태그(예: GST 태그)가 프로테아제에 엔지니어링된 경우 프로테아제는 친화성 크로마토그래피로 제거할 수도 있습니다.
  18. 용리 분획과 함께 SDS-PAGE 겔을 실행하여 각 분획에서 경쇄 단백질의 순도와 상대 농도를 측정합니다. 원하는 분획은 눈에 보이는 프로테아제 띠 없이 농축된 경쇄 단백질을 포함하는 분획입니다. 원하는 단백질 분획을 결합하고 10,000MWCO 농축 튜브(35)를 사용하여 농축합니다.
  19. 액체 질소에서 단백질의 부분 표본을 급속 동결하고 장기 보관을 위해 즉시 -80°C로 옮깁니다(그림 3B).
    참고: E. coli His6-SUMO 시스템을 사용한 RLC 및 CALML4의 수율은 약 1-2mg/L입니다.

3. Myosin-7a 맞춤형 액틴 필라멘트 글라이딩 분석(3시간)

참고: 이 섹션에서 사용된 방법은 다른 미오신31 에 대해 설명된 방법과 유사하며, 주요 수정 사항은 이온 강도가 높은 완충액에서 미오신 배양 및 적용이며 프레임 간 변위의 정확한 측정을 달성하는 데 필요한 긴 간격입니다.

  1. 4°C에서 밤새 중합 완충액(50mM KCl, 25mM MOPS, 2mM MgCl2, 1mM DTT(pH 7.0))에 구상 액틴(G-actin)을 중합하여 20μM 필라멘트 액틴(F-actin)을 준비합니다. 1.2x 몰 초과 로다민-팔로이딘을 첨가하여 F-액틴을 라벨링합니다( 재료 표 참조). 알루미늄 호일로 덮고 얼음 위에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
    참고 : G- 액틴은 상업 공급 업체 (재료 표 참조)에서 구입하거나 토끼 근육 아세톤 분말31,37에서 정제 할 수 있습니다. 표지된 F-액틴은 이 농도에서 4°C에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 앞서 설명한 대로 유동 챔버를 준비합니다31. 간단히 말해서, 청소하고 니트로셀룰로오스 처리된 현미경 슬라이드에 2-3mm 간격으로 양면 테이프 두 스트립을 놓습니다( 재료 표 참조). 커버슬립 니트로셀룰로오스 면이 아래로 향하게 하여 대략 10μL 부피의 플로우 챔버를 만듭니다(그림 4).
  3. 액틴 필라멘트 글라이딩 분석 수행
    1. 플로우 챔버에 500mM NaCl 운동성 완충액(500mM NaCl, 20mM MOPS, 5mM MgCl2, 0.1mM EGTA(pH 7.4))에 0.2mg/mL 정제된 인간 미오신 -7a 단백질의 챔버 부피 1개를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 고염 완충액에 myosin-7a를 추가하는 것이 중요한데, 이렇게 하면 자동 억제 상태가 완화되고 myosin-7a가 활성화된 형태로 표면에 부착할 수 있기 때문입니다.
    2. 150mM NaCl 운동성 완충액(150mM NaCl, 20mM MOPS, 5mM MgCl2, 0.1mM EGTA, 1mM DTT(pH 7.4))에서 1mg/mL BSA(재료 표 참조)의 3챔버 부피로 유동 챔버를 세척하고 배출구에서 깨끗한 닦음으로 액체를 끌어당겨 과도한 액체를 흡수합니다. 3차 세척 후 1분 동안 배양합니다.
    3. 150mM NaCl 운동성 완충액에 10nM 로다민 팔로이딘 표지된 F-액틴의 챔버 부피를 플로우 챔버를 통해 흘립니다. 100x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 액틴 필라멘트의 표면 결합을 모니터링합니다. 액틴 필라멘트의 밀도는 최적이어야 하며(그림 5A), 추적을 위해 시야에 충분한 필라멘트를 확보하면서도 추적을 복잡하게 만드는 여러 필라멘트의 겹침을 방지할 수 있을 만큼 충분히 희박해야 합니다.
    4. 150mM NaCl Motility Buffer의 3개 챔버 용량으로 플로우 챔버를 세척하여 결합되지 않은 액틴 필라멘트와 과도한 로다민-팔로이딘을 제거합니다.
    5. 최종 완충액(200mM NaCl, 20mM MOPS, 5mM MgCl2, 0.1mM EGTA, 50mM DTT, 2mM ATP, 2.5mg/ml 포도당, 100μg/mL 포도당 산화효소, 2μM RLC, 2μM CaM, 2μM CALML4)의 챔버 부피 하나를 추가하여 운동성을 시작합니다.
    6. 561nm 여기를 사용하여 형광 현미경으로 이미지를 기록하여 로다민 팔로이딘 표지 액틴을 시각화할 수 있습니다. 슬라이드에서 원하는 액틴 밀도를 가진 영역을 찾고(그림 5A) 30분 동안 30초마다 이미지를 캡처합니다.
      참고: 포유류 myosin-7a의 속도는 약 5nm/s입니다. 획득 프레임 속도를 설정할 때 프레임 간 필라멘트의 변위가 정확한 추적을 허용할 수 있을 만큼 충분히 긴(두 픽셀 이상) 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 프레임 간의 하위 픽셀 이동으로 인해 속도가 과대 평가될 수 있습니다. 30초의 프레임 속도는 액틴 필라멘트가 프레임 사이에서 약 150nm를 이동할 수 있도록 하며, 이는 현미경에서 두 개 이상의 픽셀에 해당합니다. 그러나 사용 중인 현미경에서 상당한 변위를 관찰할 수 있도록 주의해야 합니다. 사용 가능한 경우 다중 위치 기록을 사용하여 분석을 위해 여러 시야를 동시에 수집할 수 있습니다.
  4. FAST 프로그램(Mac에 설치)을 사용하여 액틴 필라멘트의 움직임을 분석하는 단계38.
    참고: 여기에 사용된 FAST 프로그램은 필라멘트 모션을 정량화하기 위한 여러 옵션 중 하나일 뿐입니다. FAST는 자동화되고 빠르며 유료 소프트웨어가 필요하지 않기 때문에 FAST를 사용하기로 결정했습니다. 다른 옵션으로는 FIESTA와 같은 MATLAB 기반 알고리즘, MTrack2 및 Manual Tracking과 같은 ImageJ/FIJI 기반 방법, Philament39와 같은 Python 기반 방법이 있습니다.
    1. 추가 모듈이 포함된 FAST 프로그램(github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3 호환 버전)을 다운로드하여 설치합니다. ND2 파일 변환. 주의 : 원래 python2 버전은 github.com/turalaksel/FASTrack)에서 찾을 수 있습니다.
    2. 부드럽게 움직이는 필라멘트만 유지하려면 허용 오차 값33을 사용하여 38 에 설명된 대로 FAST 프로그램을 실행합니다.
      참고: 이미지에 스테이지의 기계적 문제로 인한 드리프트가 포함되거나 여러 시리즈를 동시에 수집하는 경우 먼저 영화를 안정화해야 합니다. 이를 위해 다음 주소에서 다운로드할 수 있는 FIJI 플러그인 Image Stabilizer(https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html)를 권장합니다.
    3. FAST 프로그램을 사용하여 먼저 -xmax 및 -ymax 값을 설정하여 새로 생성된 .tif 이미지를 분석합니다. 이는 프로그램에서 출력하는 산점도에 대한 매개변수를 설정하고 가장 긴 필라멘트 길이(nm)와 최대 필라멘트 속도(nm/s)를 나타냅니다. 이 예에서는 모든 데이터가 캡처되도록 하기 위해 -xmax에 20,000nm, -ymax에 20nm/s를 사용했습니다(그림 5D).
    4. -px를 사용하여 획득한 이미지의 픽셀 크기(여기서는 65nm)를 설정하고 -minv를 사용하여 분석에 포함할 필라멘트에 필요한 최소 속도(nm/s)를 설정합니다. 이 예에서 myosin-7a의 낮은 속도의 경우 0.1nm/s를 사용합니다.
    5. -maxd를 사용하여 필라멘트가 연결될 프레임 사이에 허용되는 최대 거리를 설정합니다. 이는 프레임 간에 별도의 필라멘트를 연결하지 않도록 설정되며 이 예에서는 기본 2000nm를 사용합니다.
    6. -pt를 사용하여 필라멘트 속도의 변동에 대한 허용 오차를 설정하고 움직임이 부드러운 필라멘트만 포함합니다. 이 예에서는 33%의 허용오차 임계값을 사용합니다. 이는 속도 표준 편차가 속도 평균의 33%보다 큰 필라멘트는 추가 분석에서 제외됨을 의미합니다.
    7. 마지막으로 -d를 사용하여 분석을 위한 .tif 스택이 포함된 폴더를 나타냅니다. 주어진 매개 변수와 값을 가진 전체 명령 문자열은 fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [영화가 들어있는 폴더 이름]입니다.
      참고: FAST 프로그램은 관련 원시 데이터와 함께 산점도(그림 5D)를 출력하며, 이 데이터는 다른 프로그램에서 분석 및 시각화를 위해 추출할 수 있습니다(그림 5C). 또한 추적된 필라멘트의 경로 플롯(그림 5B)을 출력하며, 이는 추적이 예상대로 작동하는지 확인하는 데 사용해야 합니다. 플롯 및 기타 가능한 데이터 시각화의 예는 다음과 같습니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

정제된 myosin-7a 복합체 및 경쇄 단백질은 그림 3과 같이 SDS-PAGE 겔 전기영동으로 평가할 수 있습니다. 200kDa 마커 위의 밴드는 myosin-7a 중쇄(255kDa)에 해당합니다. 위에서 아래로 22kDa와 14kDa 마커 사이를 이동하는 3개 대역은 각각 RLC(20kDa), 칼모듈린 및 CALML4입니다. 칼모듈린과 CALML4는 약 17kDa의 유사한 분자량을 갖지만 두 단백질은 16% 트리스-글리신 겔을 사용하여 분리할 수 있습니다.

비디오 1 과 그림 5 는 포유류 myosin-7a를 사용한 특징적인 액틴 필라멘트 글라이딩 분석을 보여줍니다. 이 분석에 의해 밝혀진 즉각적인 특징은 myosin-7a의 느린 운동성입니다. 이 비디오는 이 미오신에 의해 구동되는 액틴 필라멘트의 움직임을 더 잘 시각화하기 위해 정상 속도의 500배로 재생됩니다. 이 분석은 온도, 이온 강도 및 용액 점도와 같은 외부 요인이 myosin-7a의 활성에 어떻게 영향을 미치는지 추가로 연구하기 위해 수정할 수 있습니다. 또한 myosin-7a 결합 단백질을 플로우 셀에 도입하여 악토미오신 상호 작용 및 운동성에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: MultiBac-system-based myosin-7a holoenzyme 생산을 위한 워크플로우. (A) myosin-7a 중쇄, RLC, CALML4 및 칼모듈린을 암호화하는 cDNA를 pACEBac1 벡터의 다중 클로닝 사이트(MCS)에 삽입합니다. (B) myosin-7a 중쇄, RLC, CALML4 및 calmodulin의 cDNA를 포함하는 pACEBac1 벡터를 반복적으로 ligating하여 myosin-7a 복합체를 인코딩하기 위한 다유전자 발현 카세트를 구성합니다. (C) pACEBac1 벡터의 mini-Tn7 요소를 게놈의 mini-attTn7 타겟 부위로 전위하여 myosin-7a 다유전자 카세트를 바큘로바이러스 게놈에 통합합니다. (D) myosin-7a 다유전자 카세트를 포함하는 재조합 bacmid로 Sf9 세포를 transfection하여 myosin-7a 복합체를 발현하는 baculovirus를 생성합니다. (E) 바큘로바이러스는 P0 바이러스를 Sf9 세포 현탁 배양액에 접종하고 상층액을 수집하여 증폭할 수 있습니다. 그 결과로 생성된 P1 바이러스는 대규모 단백질 발현에 사용할 수 있습니다. (F) myosin-7a 복합체의 FLAG-affinity 컬럼 기반 정제를 위한 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: C-말단 GFP 태그가 있는 myosin-7a를 발현하는 bacmid로 transfection된 Sf9 세포의 대표적인 형광 이미지. 이미지는 바큘로바이러스 감염의 정상적인 진행을 보여줍니다: 세포는 형질주입 후 4일째 경에 myosin-7a를 발현하기 시작하며, 거의 모든 세포가 1주일 이내에 감염됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 정제된 myosin-7a 복합체 및 경쇄 단백질의 SDS-gel. (A) MultiBac 시스템을 사용하여 정제된 전장 인간 미오신 -7a 홀로엔자임. 중쇄(HC) 및 경쇄가 표시됩니다. (B) His6-SUMO 시스템을 사용하여 RLC 및 CALML4를 정제했습니다. 칼모듈린(CaM)을 구입하여( 재료표 참조) 소의 뇌에서 정제합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: flow chamber assembly 및 actin gliding assay를 위한 워크플로우. 니트로셀룰로오스 처리된 커버슬립은 두 개의 양면 테이프를 사용하여 현미경 슬라이드에 부착됩니다. 이렇게 하면 약 10μL 부피의 유동 챔버가 생성됩니다. 단백질은 챔버에 순차적으로 추가되는 반면 과도한 용액은 티슈 페이퍼를 사용하여 채널을 통해 암호화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 및 추적 분석의 대표적인 결과. (A) 표면으로 장식된 myosin-7a 모터에 의해 구동되는 액틴 필라멘트 움직임을 보여주는 타임랩스 기록의 예시 프레임. (B) (A)와 동일한 시야에 대해 FAST 프로그램에서 출력된 필라멘트 추적 이미지. (C) 포유류 myosin-7a에 의해 생성된 액틴 활주 속도의 대표 히스토그램: 4.2 ± 1.4 nm/s (평균 ± 표준 편차; 트랙 수 = 550). (D) 계산된 필라멘트 길이와 속도를 보여주는 FAST 프로그램의 자동 생성 출력의 예. %STUCK은 사용자가 제공한 최소 속도 컷오프를 기준으로 고착된 것으로 간주되는 필라멘트의 백분율을 표시합니다. MVEL은 고착되지 않은 모든 필라멘트의 평균 속도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 1: myosin-7a로 수행한 Actin 필라멘트 글라이딩 분석. 정제된 전장 human myosin-7a가 표면에 부착되어 있습니다. 이 동영상은 200ms 노출로 30초마다 1프레임씩 촬영했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에는 곤충 세포에서 재조합 인간 myosin-7a 단백질을 생산하기 위한 자세한 프로토콜이 제시되어 있습니다. Sf9/바큘로바이러스 시스템이 다양한 미오신40,41,42,43을 생성하는 데 사용되었지만, 최근에야 포유류 미오신 -7a가 MultiBac 바큘로바이러스 시스템(14)을 사용하여 성공적으로 정제되었다. 포유류의 미오신 -7a는 세 가지 유형의 경쇄와 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, 이들 모두는 단백질의 구조적 및 기능적 무결성에 필수적이다14. 이것은 무척추 동물 상동체 및 대부분의 다른 myosins와 대조되며, 일반적으로 하나 또는 두 개의 경쇄 유형44,45에만 결합합니다. 이는 인간 미오신 -7a 홀로엔자임을 합성하기 위해서는 각 Sf9 세포에서 최소 4개의 서로 다른 유전자가 동시에 발현되어야 함을 의미합니다. 이 경우, MultiBac 시스템은 감염된 각 세포에서 myosin-7a 복합체 subunit의 재현 가능한 비율을 보장하기 때문에 여러 baculovirus와의 동시 감염에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 실제로, Belyaev 등은 바이러스 유형의 수가 증가함에 따라 세포가 동일한 바이러스 비율을 받을 가능성이 급격히 감소한다는 것을 통계적으로 입증했습니다46. 예를 들어, 두 가지 바이러스 유형의 경우 세포의 12.78%만이 동일한 비율을 달성하는 반면, 각 바이러스 유형이 세포 간에 독립적으로 분포되어 있다고 가정할 때 네 가지 바이러스 유형을 사용하면 이 비율이 0.29%로 떨어집니다. 이러한 변동성은 subunit 단백질이 복합체의 최대 수율을 생성하기 위해 일관된 비율로 조립해야 할 때 문제가 될 수 있습니다. 이 논문은 포유류의 myosin-7a에 초점을 맞추고 있지만, MultiBac 시스템이 특히 더 많은 소단위를 가지며 낮은 수율로 생산되는 단백질에 대해 동시 감염 방법보다 다중 복합체 생성에 더 최적화된 접근 방식을 제공한다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다.

이 방법을 사용하여 myosin-7a 단백질의 고수율 생산을 달성하는 데 중요한 몇 가지 요인이 있습니다. 첫째, Sf9 세포를 수확하기 위한 최적의 타이밍을 결정하는 것이 중요합니다. 이를 통해 단백질 생산을 극대화하는 동시에 세포 용해 및 바이러스로 인한 사멸의 해로운 영향을 최소화할 수 있습니다. MultiBac-based protein complex production은 monocistronic baculovirus system에 비해 또는 더 작은 단백질을 발현할 때 발현이 지연되는 경우가 많습니다. myosin-7a MultiBac 바이러스에 감염된 세포를 채취하는 가장 좋은 시기는 감염 후 60 - 65시간 사이인 것으로 나타났습니다. 공정 전반에 걸쳐 단백질 발현 수준을 지속적으로 모니터링하는 것이 좋습니다. 이는 형광 단백질 태그가 융합된 경우 형광 현미경을 사용하거나 그렇지 않은 경우 SDS-PAGE 분석을 통해 달성할 수 있습니다. 또한 세포 사멸을 최소화하면서 최고의 단백질 수율을 달성하기 위한 최적의 타이밍을 식별하기 위해 세포 생존율을 동시에 모니터링하는 것이 중요합니다.

Myosin-7a는 단백질 분해에 취약한 큰 단량체 myosin이다14. 정제 공정 중 분해를 방지하려면 모든 완충액을 사전 냉각하고 모든 절차를 4°C에서 수행하는 것이 중요합니다. 또한 단백질 분해 효소에 대한 myosin-7a의 노출을 최소화하는 것이 중요합니다. 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하는 것 외에도 FLAG-resin을 사용한 세포 용해물의 배양을 1시간으로 유지하는 것이 좋습니다. 이 기간을 연장해도 수지 결합이 크게 개선되거나 총 단백질 수율이 증가하지 않는 것으로 나타났으며 단백질 분해 위험이 더 높을 수 있습니다.

포유류 미오신 -7a의 특징은, 하급 종44의 동형과 비교했을 때, 독특한 경쇄 구성 요소의 조합이다. 이러한 경쇄는 미오신 -7a의 기능에서 중요한 조절 역할을 합니다. 예를 들어, 칼모듈린(calmodulin)은 Ca2+-의존적 방식으로 미오신 중쇄(myosin-heavy chain)와 동적으로 상호작용하여(47), 이의 운동성과 기계적 출력을 조절하는데, 이러한 메커니즘은 포유류의 청각 유모세포(auditory hair cells)14에 특별히 적응된 것으로 보인다. 개별 IQ 모티프에 대한 칼모듈린의 정확한 결합 친화도는 전체 분자의 맥락에서 아직 결정되지 않았지만, 정제 중에 세포 용해물의 과도한 경쇄가 제거됨에 따라 일부 칼모듈린이 점차 해리되는 것을 관찰했습니다. 이것은 myosin-7a의 기계적 성질을 변화시킬 수 있습니다. 이를 완화하기 위해 당사는 용출 단계에서 부드러운 원심분리와 결합된 스핀 컬럼을 사용합니다. 이를 통해 단백질을 소량과 고농도로 용출할 수 있어 농축 단계의 필요성을 없앨 수 있습니다. 이 방법은 전체 단백질 정제 과정을 단축하고 경쇄 해리의 위험을 최소화합니다. 액틴 글라이딩 분석에서는 최종 완충액에 과도한 경쇄 단백질을 포함하여 천연 경쇄가 미오신 -7a 중쇄와 결합된 상태를 유지하도록 합니다.

과도한 경쇄에 대한 요구 사항은 myosin-7a를 사용한 액틴 글라이딩 분석과 myosin-2와 같이 잘 연구된 다른 myosin의 분석 간의 몇 가지 차이점 중 하나를 나타냅니다. Myosin-2 분석은 일반적으로 낮은 이온 강도(예: 50mM)에서 수행됩니다. 이온 강도가 생리학적(150mM)으로 높아짐에 따라 액틴 필라멘트가 분리되는 경향이 있고 운동성이 느려집니다. 미오신 -7a의 경우, 운동성은 낮은 이온 강도에서 정체되며, 글라이딩은 150mM 이상에서만 관찰됩니다. full-length myosin-7a의 자가억제로 인해, 단백질이 후속 글라이딩을 허용하는 방향과 형태로 결합할 수 있도록 도포 전에 myosin 필라멘트가 용해되는 방식과 유사한 방식으로 고이온 강도 용액의 커버슬립에 적용됩니다.

myosin-7a를 사용한 액틴 글라이딩 분석에서 관찰된 낮은 속도는 운동성 데이터를 획득하고 분석하는 데 몇 가지 문제를 야기합니다. 실제로, 전위는 이 분석법이 처음 개발되었을 때 사용되었던 골격근 미오신 (skeletal muscle myosin)에 비해 몇 배 더 느립니다30. 이러한 낮은 속도는 정확한 측정의 어려움과 프레임 속도48에 따라 확장되는 속도의 과대 추정으로 이어질 수 있습니다. 모든 추적 방법의 위치 파악 정밀도는 유한하며, 심지어 정적 물체조차도 연속적인 이미지 간에 명백한 위치 이동이 있습니다. 샘플링 속도가 증가함에 따라 이는 속도에 대해 인위적으로 높은 값으로 이어집니다. 이 효과는 모든 유형의 운동성 분석에 적용되지만, 프레임 간에 여러 픽셀의 큰 움직임이 발생하는 분석의 경우 상대적 효과가 매우 작습니다. 매우 긴 간격(60초, 90초 등)으로 데이터 포인트를 취하면 값이 샘플링 속도의 영향을 받지 않아야 하므로 측정된 속도가 정확한지 확인할 수 있습니다. myosin-7a의 기록 간격이 너무 길기 때문에 동일한 획득 중에 여러 위치에서 기록하는 데 지연을 활용할 수 있습니다. 이를 통해 한 번에 여러 영화를 효과적으로 녹화할 수 있습니다. 이 방법의 단점은 스테이지의 기계적 결함으로 인해 위치 전환으로 인해 추가 드리프트가 발생한다는 것입니다. 이는 위에서 설명한 대로 이미지 안정화를 사용하여 설명할 수 있습니다.

FAST 소프트웨어(github.com/turalaksel/FASTrack)의 원래 Python2 버전에서 각 출력 데이터 포인트는 N-프레임 창(기본적으로 5프레임) 내에서 필라멘트의 속도를 나타냅니다. 소프트웨어의 수정된 Python3 버전(github.com/NeilBillington/FASTrack3)에는 데이터 포인트가 필라멘트별로 표시되는 추가 출력이 포함되어 있습니다. 소프트웨어에 의해 생성되는 디폴트 플롯은 N개의 윈도우형 데이터셋을 기반으로 합니다. 두 출력 유형 모두 동등하게 유효하며, 원래 출력은 영화당 더 많은 데이터 포인트를 생성하지만, 필라멘트 글라이딩을 정량화하는 기존 방법과 더 직접적으로 비교할 수 있고 특정 영화에서 특정 속도를 가진 필라멘트 수에 대한 보다 직관적인 정보를 생성하기 때문에 일반적으로 필라멘트 기반 데이터를 사용합니다. 이 필라멘트 유형 분석에서도 필라멘트가 경로를 교차할 때 추적이 중지되고 교차 후 새 트랙이 나타날 때 감지되기 때문에 데이터 포인트의 수가 실제 필라멘트의 수와 정확히 일치하지 않습니다.

본 논문에서 설명한 방법의 한계는 포유류 단백질이 곤충 세포에서 발현되고 있다는 점이다. 이 단백질을 포함한 많은 단백질이 이러한 방식으로 성공적으로 발현되었지만, 단백질의 본래 환경을 보다 밀접하게 모방할 수 있는 다른 발현 시스템이 있습니다. 포유류 발현 시스템은 곤충 시스템에 없는 단백질에 중요한 번역 후 변형을 도입할 수 있습니다. 박테리아 시스템에서의 발현에 대해서도 마찬가지이며, 여기에서 미오신 경쇄를 생성하는 데 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 우리는 이러한 경우 상대적인 단순성과 높은 수율이 잠재적인 한계보다 중요하다고 믿습니다. 단백질을 특성화하는 데 사용되는 체외 운동성 분석은 단백질에 대해 얻을 수 있는 정보의 양이 제한적입니다. 예를 들어, 미오신 조절의 많은 측면은 분석에 의해 가려지거나 우회되므로 이 기술을 사용하여 조사할 수 없습니다. single-molecule motility, optical trapping, 생화학 및 생물물리학 기술과 같은 많은 다른 분석 유형이 in vitro 에서 myosin의 특성을 조사하기 위해 존재하지만, 필라멘트 글라이딩 분석은 많은 생화학 분석법보다 단백질이 덜 필요하고 수행이 간단하며 성공적인 운동성을 입증할 수 있기 때문에 myosin 활성을 측정하는 방법으로 여기에서 선택됩니다. 단백질이 생화학적으로 그리고 기계적으로 활성화되어 있음을 알려줍니다.

여기에 설명된 워크플로우는 고품질 myosin-7a 단백질을 생산하고 그 기계적 특성을 특성화하기 위한 일련의 방법을 나타냅니다. 이러한 방법은 이 미오신 부류에 특별히 맞춰져 있지만, 발현 및 정제 절차는 여러 별개의 폴리펩티드로 구성되고 해리 및 분해 경향이 있는 이러한 유형의 불안정한 단백질을 생산하는 방법에 대한 지침으로 더 일반적으로 유용합니다. 또한 특성화 방법은 모든 유형의 운동 단백질에 유용하며, 특히 데이터 수집 및 분석 매개변수에 대한 고려 사항은 저속 분자 모터의 전위 속도를 측정하는 모든 사람에게 유용하도록 고안되었습니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이미지 분석에 대한 논의와 도움을 주신 West Virginia University의 Microscopy Imaging Facility와 Visual Function and Morphology Core에 감사드립니다. 이 연구는 West Virginia University School of Medicine에서 R.L.에 이르는 정년 트랙 스타트업 펀드의 지원을 받습니다. 이 연구는 또한 NIGMS(National Institute of General Medical Sciences), Vs-CoBRE(Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence)(P20GM144230) 및 NIGMS WV-INBRE(West Virginia Network of Biomedical Research Excellence)(P20GM103434)의 지원을 받습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브VWR87003-294
1X FLAG 펩타이드GenScriptN/A맞춤형 펩타이드 합성
22x22mm No. 1.5 커버슬립VWR48366-227
250 mL 원추형 원심분리기 튜브Nunc376814
250 mL 벤티드 Erlenmyer 셰이커 플라스크IntelixBioDBJ-SF250VP
2-메르캅토에탄올VWRM131
75x25x1 mm Vistavision 현미경 슬라이드VWR16004-42
Actin Protein (>99% Pure)CytoskeletonAKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 친화 젤Millipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin 일회용 크로마토그래피 컬럼Bio-Rad732-6008
BL21 유능한 대장균New England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher
소 혈청 알부민Millipore Sigma5470
BstXI 효소New England BiolabsR0113S
CalmodulinMillipore Sigma208694
CatalaseMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Expression SystemThermo FisherK30001
cOmplete, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일Roche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
양면 테이프Office Depot909955
EGTA, 분자 생물학 등급Millipore Sigma324626-25GM
EGTA, 분자 생물학 등급Millipore Sigma324626-25GM
에탄올Thermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Transfection 시약GibcoA38915
FAST 프로그램http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
피셔브랜드  모델 505 소닉 디스멤브레이터Fisher ScientificFB505110
겐타마이신 시약 용액Gibco15710-064증류수 내 10mg/mL
포도당밀리포어 시그마G5767
포도당 산화효소밀리포어 시그마G2133
글리세롤인비트로겐15514-011
HisPur 코발트 수지Thermo Fisher89966
I-CEUI 효소New England BiolabsR0699S
이미지 안정화 플러그인https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
이미다졸Millipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly 마스터 믹스TaKaRa638948
IPTG써모 피셔15529019
이소프로판올피셔 사이언티픽A451SK
카나마이신피셔 사이언티픽AAJ67354AD
대형 오리피스 피펫 팁피셔 사이언티픽02-707-1341-200uL
LB 한천, 기성품 분말써모 피셔J75851-A1
류펩틴 프로테아제 억제제Thermo Fisher78435
염화마그네슘Thermo FisherJ61014.=E1M
염화마그네슘Thermo FisherJ61014.=E1M
최대 효율 DH10Bac 역량 셀Gibco10361012
마이크로 원심분리기 튜브, 1.7mLVWR87003-294
마이크로 원심분리기 튜브, 1.7mLVWR87003-294
마이크로 원심분리기 튜브, 1.7mLVWR87003-294
현미경Nikon모델: 100X TIRF 대물
ORCA-Fusion BT
현미경 레이저 장치Andor iXon Ultra
Miller' s LB BrothCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis 분광 광도계Thermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis 분광 광도계Thermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha 유능한 대장균 (고효율)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS 원소Nikon
NIS-원소Nikon
니트로셀룰로오스LADD Research Industries53152
Opti-MEM I 환원 혈청 매체Gibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR 정제 키트 (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
SENP2 proteasePMID:17591783실험실
에서 정제Sf9 세포Thermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - 무혈청 매체 완전한Gibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 투석 카세트, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
염화나트륨Millipore SigmaS7653
염화나트륨Millipore SigmaS7653
Stericup 퀵 릴리스 진공 구동 일회용 여과 시스템Millipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATPNew England BiolabsB0202A
Tetracycline HydrochlorideMillipore SigmaT7660-5G
트리스밀리포어 시그마10708976001
트리톤 X미국 생물 분석9002-93-1
15519028현미경 카메라가 있는 H-TIRF 시스템이 있는 Eclipse Ti

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