방법 논문

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

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DOI:

10.3791/67141

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2024년 7월 12일

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1Florida Institute of Technology

이 논문에서

요약

여기에서는 모델 선충 C. elegans의 생식계에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터를 사용하여 수정 및 초기 배발생 중 칼슘을 시각화하기 위한 프로토콜과 도구를 제시합니다.

초록

칼슘은 난모세포에서 배아로의 전이(OET)와 초기 배발생 과정에서 중요한 신호 분자입니다. 자웅동체 선충인 Caenorhabditis elegans 는 투명하고 20°C에서 ~23분마다 하나의 성숙한 난모세포를 생산하는 정연한 생식선을 가지고 있기 때문에 OET 연구에 몇 가지 고유한 이점을 제공합니다. 우리는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표 jGCaMP7s를 수정하여 살아있는 유기체 내에서 수정되는 순간을 형광으로 표시했습니다. 우리는 이 리포터를 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수정 중 칼슘(Calcium during fertilization in C. elegans)에 대해 "CaFE"라고 명명했습니다. CaFE 리포터는 단일 사본으로 세이프 하버 소재지로 설계되었으며, 생리학이나 생식력에 큰 영향을 미치지 않으며, 수정 시 강력한 신호를 생성합니다. 여기에서는 OET 및 배발생을 해부하기 위한 생체 내 도구로 CaFE 리포터를 활용하기 위한 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 여기에는 웜을 동기화하고, RNAi 녹다운의 영향을 검사하고, 이미징을 위해 웜을 장착하고, 난모세포와 배아의 칼슘을 시각화하는 방법이 포함되어 있습니다. 또한 이러한 유형의 분석을 돕기 위해 추가 웜 균주의 생성을 제시합니다. 수정 시기를 시각화하기 위한 CaFE 리포터의 유용성을 입증하여, ipp-5 가 RNAi에 의해 표적화될 때 이중 배란이 발생하고 첫 번째 난모세포만 즉시 수정을 받는다고 보고합니다. 또한, 초기 배발생 중 단세포 칼슘 과도현상의 발견이 여기에 보고되어 있으며, 이는 CaFE 리포터가 초기 발달까지 지속된다는 것을 보여줍니다. 중요한 것은 worms의 CaFE 리포터가 코스 기반 학부 연구(CURE) 실험실 수업에 통합하는 데 사용할 수 있을 만큼 간단하다는 것입니다. CaFE 리포터는 정렬된 생식선 및 지렁이에서 RNAi의 용이성과 결합하여 내부 수정 및 조기 배발생을 조절하는 데 필요한 세포-세포 역학에 대한 조사를 용이하게 합니다.

서론

수정은 새로운 생명 주기의 시작을 의미하지만, 수정의 정확한 순간을 정의하는 것은 어려운 일입니다. 수정의 보존된 특징은 정자 융합 직후 난모세포를 가로지르는 칼슘의 파동입니다1. 칼슘파의 특성은 빈도와 속도 측면에서 종마다 다르지만 거의 모든 유기체는 수정 후 세포 내 칼슘의 일시적인 증가를 나타냅니다. 칼슘파는 다정자(polyspermy), 난자 활성화(egg activation) 및 기타 중요한 세포 사건을 차단하는 데 중요한 역할을 합니다2. 칼슘파는 정자 융합 부위에서 시작되기 때문에 칼슘은 수정의 표지자 역할을 합니다3.

Caenorhabditis elegans 는 초기 발달을 연구하기 위한 이상적인 모델 유기체입니다. 벌레는 유전적으로 다루기 쉬운 투명한 자웅동체입니다4. 수정 연구에서 가장 중요한 것은 예쁜꼬마선충(C. elegans) 성충은 엄격하게 정렬된 생식선을 사용하여 난모세포를 지속적으로 생산한다는 것입니다5. 사실, 난모세포(oocyte)는 성인기에 유사분열 후 소마(soma)가 생성되기 때문에 생성되는 유일한 새로운 세포입니다6. 그림 1 은 발달 중인 난모세포의 대칭적인 U자형 튜브 2개로 구성된 생식선을 강조합니다. 정자(spermatheca, 정자를 저장하는 기관)에 가장 가까운 난모세포(oocyte)는 -1 난모세포(-1 oocyte)라고 불립니다. 이 벌레 생식선의 조립 라인 디자인은 젊은 성인에서 20°C에서 ~23분마다 성숙한 난모세포를 정자로 배란시킵니다7. 그런 다음 새로 수정된 배아는 하나의 외음부를 통해 낳기 전에 공유 자궁으로 이동합니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 수정 중 칼슘을 시각화하는 이전 기술은 칼슘에 민감한 염료의 미량 주입에 의존했습니다 3,8. 정자-난자 융합 시 칼슘파를 보다 쉽게 볼 수 있도록 jGCaMP7s를 기반으로 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)7,9을 사용하여 세이프 하버 자리에서 단일 사본으로 삽입했습니다. 기자는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 수정 중 칼슘에 대한 CaFE라고 불렸습니다. 기자는 생리학이나 생식력에 중대한 결함을 보이지 않습니다.

여기에서는 CaFE 리포터를 사용하여 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 난모세포와 배아에서 칼슘파를 시각화하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. RNA 간섭(RNAi) 및 mCherry 생식선 마커와 같은 웜 커뮤니티에서 사용할 수 있는 수많은 도구와 결합하여 CaFE 리포터는 내부 수정 사건의 조절, 특히 수정 능력 및 수정 시기에 대한 조사를 용이하게 합니다. 또한 CaFE 리포터는 초기 개발 단계까지 지속되며 배발생을 조사하는 고유한 도구입니다.

프로토콜

1. C. 예쁜꼬마선충 유지 관리

  1. 선충 성장 배지(NGM) 플레이트 준비
    1. 염화나트륨(NaCl) 3g, 박토 펩톤 2.5g, 한천 20g, 탈이온수 1L를 4L 플라스크에 결합합니다( 재료 표 참조). 고압증기멸균하기 전에 플라스크 상단을 알루미늄 호일로 덮으십시오.
    2. 액체 멸균 주기 설정을 사용하여 멸균하는 오토클레이브. 멸균 주기는 121°C에서 30분 동안 설정하는 것이 좋습니다.
    3. 혼합물을 실온(RT)에서 약 50분 동안 ~20°C로 냉각시킵니다.
    4. 멸균 1 M KH2PO4 (물에 용해, pH = 6) 25 mL, 멸균 1 M CaCl2 (물에 용해 됨) 1 mL, 멸균 1 M MgSO4 (물에 용해) 1 mL 및 5 mg / mL 콜레스테롤 (100 % 에탄올에 용해 됨) 1 mL를 첨가 할 때마다 부드럽게 소용돌이 치십시오 ( 재료 표 참조).
    5. 멸균 기술을 사용하여 혼합물의 일부를 멸균 300mL 비커에 옮겨 쉽게 붓습니다. 따뜻한 매체를 부어 접시 바닥을 덮습니다.
      참고: 60mm x 15mm 멸균 페트리 플레이트( 재료 표 참조)의 플레이트당 약 10mL는 100개의 플레이트를 생산합니다. 또는 35mm x 10mm 멸균 페트리 접시를 사용할 수 있으며, 여기서 플레이트당 ~4mL는 ~250개의 플레이트를 생성합니다.
    6. 박테리아를 파종하기 전에 NGM 플레이트를 최소 1일 동안 RT에서 건조시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 플레이트를 4°C에서 거꾸로 보관합니다.
  2. OP50 세균성 잔디 준비
    1. 2L 플라스크에 효모 추출물 5g, Bacto-Tryptone 10g, NaCl 5g, 탈이온수 1L를 결합하여 Luria Broth(LB)를 만듭니다( 재료표 참조). 교반 플레이트와 교반 막대를 사용하여 녹을 때까지 섞습니다.
    2. 부분 표본 LB를 병에 넣고 액체 멸균 주기 설정을 사용하여 오토클레이브합니다. 멸균 주기는 121°C에서 30분 동안 설정하는 것이 좋습니다. 나사 캡이 있는 용기를 사용하는 경우 오토클레이브 주기 동안 적절한 환기를 위해 나사 캡을 1/4바퀴 풉니다.
    3. 사용하기 전에 육수를 RT로 식히십시오.
    4. 멸균 기술을 사용하여 250mL 삼각 플라스크에 LB 50mL에 OP50 박테리아를 접종하고 37°C에서 밤새 진탕하면서 성장시킵니다.
    5. 멸균 기술을 사용하여 300μL의 포화 배양물을 60mm x 15mm NGM 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. 35mm x 10mm 플레이트의 경우 100μL의 포화 배양이 권장됩니다.
    6. OP50 박테리아 반점이 더 이상 액체가 아닐 때까지 1-3일 동안 플레이트를 RT에서 건조시킵니다. 사용하기 전에 플레이트가 건조하고 오염되지 않았는지 확인하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 플레이트를 4°C에 보관하십시오. 플레이트를 거꾸로 보관하면 플레이트 표면의 결로 현상이 줄어듭니다.
  3. 웜 픽 구조
    1. 네 부분이 분리되도록 나사를 부드럽게 풀어 은색 칼라를 웜 픽 핸들( 재료 표 참조) 머리 쪽으로 풉니다.
    2. 가위를 사용하여 백금 와이어( 재료표 참조)의 1.5인치(엄지 손가락 길이 정도)를 자르고 네 섹션의 중간에 놓습니다. 핸들에서 약 1인치가 튀어나옵니다.
    3. 칼라를 조이면서 와이어를 중앙에 잡으십시오. 네 개의 섹션이 중간에 모여 백금 와이어를 제자리에 고정합니다.
    4. 한 쌍의 플랫 노즈 플라이어를 사용하여 와이어를 조심스럽게 형성합니다. 무지개 또는 호 모양이 피킹에 가장 적합한 경향이 있습니다.
    5. 플랫 노즈 플라이어로 반복적으로 조여 와이어 끝에 약 2-3mm "피트"를 만듭니다. 이 "발"을 사용하여 벌레를 집고 "발"을 플레이트 표면에 평평하게 유지하십시오.
      알림: 너무 세게 클램핑하면 백금 와이어가 절단됩니다. 웜이나 플레이트에 구멍이 뚫리는 것을 방지하기 위해 플랫 노즈 플라이어(또는 이에 상응하는 것)를 사용하여 날카로운 모서리를 만들지 마십시오.
  4. 웜 처리
    1. 연필과 비슷한 웜 픽을 잡고 밝은 주황색이 될 때까지 95% 에탄올 램프의 불꽃에 와이어를 넣어 "발"을 살균합니다.
    2. OP50 파종 플레이트를 해부 스코프의 스테이지에 놓고 뚜껑을 제거합니다. 곡괭이의 "발"을 박테리아가 많은 잔디밭 영역에 부드럽게 만지고 부드럽게 스와이프하는 동작을 사용하여 바닥에 박테리아를 모읍니다. 곡괭이에 붙어 있는 박테리아("끈적끈적"이라고 함)는 벌레를 집는 접착제 역할을 합니다.
    3. 벌레 플레이트를 해부 스코프 스테이지로 옮기고 곡괭이가 다른 표면에 닿지 않도록 하면서 뚜껑을 제거합니다. 곡괭이의 "발"을 빠르고 부드럽게 지렁이에 닿아 집어 올립니다. 이 기술을 사용하면 여러 웜을 플레이트 간에 동시에 이동할 수 있습니다.
    4. 곡괭이의 "발"을 새 판의 씨를 뿌리지 않은 부분에 부드럽게 만져 벌레를 옮깁니다. 일반적으로 이것은 섹션 1.4.2에서 박테리아를 제거한 것과 동일한 플레이트입니다.
    5. 오염을 방지하고 멸균 후 픽을 식히기 위해 각 플레이트 및/또는 웜 균주 사이의 픽을 살균합니다.
      알림: 지렁이의 핫 픽을 만지면 동물에게 스트레스를 주거나 죽일 수 있습니다. 지렁이 픽은 박테리아 잔디밭을 만진 후 냉각되어 지렁이 이동을 위해 "끈적끈적한 것"을 집어 듭니다.
  5. OP50 대장균 박테리아를 파종한 NGM 플레이트(1.1단계)에서 웜을 20°C로 유지합니다(1.2단계). 일주일에 2-3 번 지렁이 픽 (1.3-1.4 단계)을 사용하여 여러 성인을 새로운 접시 (60mm x 15mm)로 옮겨 다니며 생리학을 변화시킬 수있는 굶주림을 피하십시오.
    참고: 예쁜꼬마선충 균주 및 OP50 박테리아는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)를 통해 구할 수 있습니다.

2. 예쁜꼬마선충 발달 동기화

  1. 시간이 지정된 알을 낳는 것을 사용하여 웜의 나이를 동기화합니다(여기에 설명되어 있음). 교실이나 다른 목적을 위해 많은 수의 웜이 필요한 경우 Golden et al.10에 설명된 대로 표백제 동기화를 수행합니다.
  2. 백금 와이어 픽을 사용하여 성충을 새 시드 OP50 플레이트로 옮깁니다(섹션 1 참조). 웜의 수는 실험적 필요성에 따라 결정됩니다. 1일차 지렁이는 시간당 약 3개의 알을 낳습니다. 따라서 10 마리의 벌레는 1 시간에 약 30 개의 알을 생성합니다. 가급적이면 성충이 된 첫날(1일차)에 지렁이를 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 약 1시간 후 접시에서 성충을 제거하고 알만 남깁니다.
    참고: 실수로 웜을 남겨두는 것은 흔한 오류입니다. 남아 있는 벌레는 계속해서 알을 낳고 동기화를 방해합니다. 지렁이는 20°C에서 배양할 때 낳은 후 약 72시간 후에 1일차 성충으로 성숙합니다.

3. 이미징을 위한 장착 웜

  1. 수정 이벤트를 이미징할 때 1일차 성인을 사용하여 시각화 기회를 극대화하십시오.
    참고: 1일차 성인에서는 ~23분마다 난모세포가 수정됩니다. 그러나 배란은 나이가 들면서 느려지고 일반적인 자웅동체는 4일차 이후에 알을 낳는 것을 멈춥니다.
  2. 물 100mL에 아가로스 3g을 섞어 물에 3% 아가로스 용액을 준비합니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지를 사용하여 아가로스 용액을 가열합니다. 응고된 용액을 재사용하려면 완전히 용해될 때까지 가열하십시오. 여러 번 사용한 후 새로운 용액을 생성하십시오.
  3. 슬라이드의 긴 축을 가로질러 단일 층의 실험실 테이프가 있는 두 개의 다른 현미경 슬라이드 사이에 이미징을 위한 빈 현미경 슬라이드를 놓습니다( 재료 표 참조). 이 테이프는 아가로스 패드를 위한 스페이서를 생성하여 균일한 분포와 균일한 너비를 허용합니다. 세 개의 슬라이드가 긴 면이 닿는 일렬로 되어 있는지 확인합니다: 빈 현미경 슬라이드 옆에 테이프가 있는 두 개의 슬라이드.
    1. 가열된 3% 아가로스 용액(~100-150 μL)을 1mL 피펫을 사용하여 테이프로 감긴 슬라이드 사이에 있는 현미경 슬라이드 중앙에 떨어뜨립니다.
    2. 새 현미경 슬라이드를 아가로스 액적에 빠르게 배치하여 새 슬라이드가 아가로스 액적이 있는 슬라이드에 수직이 되고 인접한 테이프 슬라이드를 가로질러 놓이도록 합니다.
    3. 슬라이드를 부드럽게 분리합니다. 패드를 찢지 마십시오.
    4. 이미징을 위해 매일 아가로스 패드를 신선하게 준비하십시오. 이미징을 준비할 때 여러 개의 패드를 만드는 것이 좋지만 동시에 두 개 이상의 패드를 노출하는 것은 삼가는 것이 좋습니다. 노출된 패드는 빨리 건조됩니다.
  4. 20 μL 피펫을 사용하여 M9 완충액에 있는 1mM 레바미솔을 아가로스 패드 중앙에 소량(~7 μL) 떨어뜨려 기생충을 마비시킵니다. 필터 멸균된 100mM 레바미솔 원액을 사용하여 1mM 작동 용액을 만듭니다.
    1. M9 완충액을 만들려면 적절한 용기에 Na2HPO4 6g, KH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g 및 탈이온수 1L를 결합합니다( 재료 표 참조).
    2. 액체 멸균 주기 설정을 사용하여 용액을 오토클레이브하고 사용하기 전에 용액을 RT로 냉각시킵니다. 나사 캡이 있는 용기를 사용하는 경우 적절한 환기를 위해 나사 캡을 약 1/4바퀴 풉니다. 멸균 주기는 121°C에서 30분 동안 설정하는 것이 좋습니다.
  5. 최소 5개의 동기화된 웜을 선택하고 "발"을 레바미솔 방울에 부드럽게 터치하여 모든 웜을 옮깁니다. 몸의 방향에 따라 장이 생식세포를 가려 난모세포의 칼슘 파동이 시각화되는 것을 차단할 수 있으므로 슬라이드당 최소 5개의 벌레를 사용하십시오.
    참고: 아가로스 패드에 5분 이상 방치하면 레바미솔이 증발하므로 웜이 빠르게 옮겨지도록 하십시오.
  6. 커버 슬립으로 아가로스 패드를 조심스럽게 덮습니다. 커버슬립으로 인해 초기 배치에서 벌레가 분산될 수 있으므로 벌레의 위치를 확인하십시오. 현미경 슬라이드에 웜 균주의 이름과 같은 적절한 세부 정보를 표시하십시오( 재료 표 참조).
    알림: 레바미솔에 장기간 노출되면 독성이 있으므로 벌레를 장착한 후 가능한 한 빨리 이미징을 수행해야 합니다.

4.예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수정 중 칼슘 이미징  

  1. 선택한 현미경에서 4x와 같은 저전력 대물렌즈를 사용하여 벌레를 찾습니다. 명시야 조명을 사용하십시오.
  2. 난모세포의 칼슘파를 명확하게 시각화하기 위해 최소 20x 공기 대물렌즈를 사용합니다. 40x 이상의 이멀젼 대물렌즈를 사용합니다.
  3. 사용하는 시스템에 따라 여기 강도는 일반적으로 고정된 값입니다. 형광 리포터의 최적 시각화를 위해 게인 또는 노출 시간을 조정하십시오.
    참고: 지속적인 고강도 빛은 샘플을 손상시키고 지렁이 건강에 해롭습니다. 원하는 경우 지속적인 GFP 조명을 피하기 위해 수정 이벤트를 기다리는 동안 레이저를 끕니다. 시비 행사의 특징은 섹션 4.8 - 4.9에서 볼 수 있습니다.
  4. 488nm GFP 채널이 CaFE 리포터 신호를 쉽게 볼 수 있는 레이저 출력으로 설정되어 있는지 확인합니다.
    1. Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼의 경우 GFP 채널에 대해 30%의 레이저 출력과 75의 이득에서 CaFE 리포터를 감지합니다. Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼의 핀홀 크기는 30μm입니다.
    2. Zyla 카메라를 사용하는 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼의 경우 GFP 채널에 대해 30%의 레이저 출력에서 CaFE 리포터를 감지합니다. Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼의 핀홀 크기는 40μm입니다.
    3. 검사한 모든 샘플에 대한 레이저 설정과 노출 시간을 조정합니다.
  5. EAG28 (CaFE; PH-mCherry) 또는 EAG25(CaFE; H2B-mCherry) 변형을 위해 빨간색 채널이 GFP 채널 외에도 mCherry 신호를 쉽게 볼 수 있는 레이저 출력으로 설정되어 있는지 확인합니다.
    1. Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼의 경우 RFP 채널에 대해 15의 레이저 출력과 130의 게인에서 mCherry 리포터를 감지합니다.
    2. Zyla 카메라를 사용하는 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼의 경우 RFP 채널에 대해 30%의 레이저 출력에서 mCherry 리포터를 감지합니다.
    3. 검사한 모든 샘플에 대한 레이저 설정과 노출 시간을 조정합니다.
  6. 프레임 속도 또는 초당 프레임 수(fps)를 시스템에서 허용하는 한 빠르게 설정합니다.
    참고: CaFE 리포터는 일반적으로 Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼의 경우 약 1fps, Zyla 카메라를 사용한 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼의 경우 약 10fps로 관찰됩니다.
  7. 타임랩스 또는 시계열 프로토콜을 선택하고 원하는 설정으로 조정합니다. 30분 이하의 타임랩스 이미지를 획득하고 반복 옵션을 '1'로 설정합니다.
    참고: 시간 간격이 완료되기 전에 수정 이벤트가 발생하면 비디오를 중지하여 파일 크기를 보존합니다.
  8. 슬라이드에서 벌레를 찾고 근위 생식선이 보이는 벌레를 선택합니다. 장과 생식선은 기생충 안에서 서로 뒤틀립니다. 따라서 생식선 팔은 종종 장에 가려져 수정의 시각화를 방해합니다. -1 난모세포가 가려진 경우 시각화를 위해 다른 웜을 선택합니다. 선택한 웜이 보이는 생식선 팔을 가질 확률을 높이려면 슬라이드당 최소 5개의 웜을 장착하십시오. 이른 Day 1 성인을 사용하여 수정을 시각화하십시오.
  9. 기생충의 생식선 팔에 있는 각 -1 난모세포를 검사하여 수정 사건이 임박했는지 확인합니다.
    참고: 수정 전, 감수분열 성숙 동안 -1 난모세포의 핵은 난모세포의 뒤쪽으로 이동하고 핵막은 용해됩니다. 이러한 이벤트는 CaFE 리포터를 사용하여 Nomarksi 및 GFP 채널 모두에서 볼 수 있으며, 이러한 이벤트는 배란이 다음 ~10분 이내에 발생할 것임을 나타냅니다.
  10. 핵막이 파괴된 후, 가장 근위부인 -1 난모세포의 세포골격은 재배열되어 둥근 모양을 띠고 -2 난모세포와 분리됩니다. 이 시점에서 배란이 임박하게 발생합니다. 이러한 이벤트가 관찰되면 즉시 비디오 녹화를 시작하십시오. 광시야 설정에서 동영상을 촬영하세요.
    참고: 20분 후에도 핵의 움직임이나 난모세포의 둥글림이 보이지 않으면 배란 이벤트가 발생할 가능성이 낮습니다. 다른 웜에 초점을 맞추거나 새로운 슬라이드를 준비하십시오.

5. C. elegans 수정에서 칼슘 과도 현상의 정량화

  1. Nikon NIS Elements(여기에 설명되어 있음)와 같은 현미경 시스템 소프트웨어를 사용하여 수정 비디오에서 칼슘 과도 현상을 정량화합니다. ImageJ/FIJI는 이미지 분석에도 적합합니다11.
  2. 수정 비디오의 형광 변화를 정량화하려면 시간 0의 신호, 관심 프레임의 신호, 기준선 신호와 같은 신호 값을 사용합니다.
  3. -1 난모세포에서 형광이 발생하는 첫 번째 폭발을 포착하는 시간과 프레임을 식별합니다. 이 프레임을 시간 0으로 정의합니다.
  4. 관심 프레임에서 신호를 얻으려면 수정 전 -1 난모세포, 정자(spermatheca) 및 자궁에서 새로 수정된 난모세포를 포함하는 관심 영역(ROI)을 그립니다. ROI에 표시되는 신호를 F1이라고 합니다.
    참고: ROI가 난모세포에 의해 이동되는 전체 영역을 포괄하는지 확인합니다. ROI는 분석 중인 타임랩스 녹화의 모든 프레임에서 동일해야 합니다.
  5. 각 프레임의 배경 신호를 계산하기 위해 5.4단계에서 정의한 ROI와 동일한 치수를 사용하여 형광이 없는 이미지의 빈 영역을 정의합니다. 모든 프레임에서 배경 신호를 뺍니다.
  6. 기준선 신호(F0)를 얻으려면 시간 0 이전 최소 15프레임에서 프레임을 찾습니다. 5.4단계와 동일한 ROI를 사용하여 시간 0까지 각 프레임의 신호를 기록해 둡니다. 시작 프레임부터 시간 0까지 신호(배경 빼기 포함)의 평균을 구하여 기준선 신호를 계산합니다.
  7. 다음 공식 figure-protocol-1을 사용하여 형광의 변화(ΔF)를 계산합니다. F1 은 각 프레임에서 배경 신호가 없는 ROI의 신호로 정의됩니다. F0는 섹션 5.6에서 계산된 바와 같이 시간 0 이전 ≥15프레임의 평균 기준선 형광 신호입니다.
  8. 2 프레임 사이의 형광 변화를 빼고 시간으로 나누어 프레임 사이의 변화율을 결정합니다.

6. 예쁜꼬마선충의 RNAi

  1. RNAi 플레이트를 준비합니다.
    1. 1.1단계에 따라 플레이트를 준비하고 6.1.4단계에서 RNAi를 통한 유전자 녹다운을 허용하기 위해 다음 추가 시약을 추가합니다.
    2. 배지에서 1mM IPTG의 최종 농도를 위해 1M 멸균 여과된 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)(탈이온수에 용해) 1mL를 추가합니다( 재료 표 참조).
    3. 배지에서 100μg/mL 암피실린의 최종 농도를 위해 100mg/mL 멸균 여과된 암피실린(탈이온수에 용해됨) 1mL를 추가합니다( 재료 표 참조). 또는 40μg/mL 카르베니실린12를 사용합니다.
    4. 1.1.4 - 1.1.5 단계에 설명된 대로 부드럽지만 철저하게 소용돌이쳐 플레이트를 혼합하고 붓습니다.
  2. RNAi-포화 배양의 준비
    1. 필요한 seeded RNAi 플레이트의 수에 60 mm x 15 mm 플레이트를 사용하는 경우 300 μL를 곱하거나 35 mm x 10 mm 플레이트를 사용하는 경우 100 μL를 곱하여 포화 배양량을 계산합니다.
    2. 멸균 기술을 사용하여 100μg/mL 암피실린을 함유한 LB(1.2.1-1.2.3 단계에 설명됨)에서 원하는 RNAi 박테리아를 37°C에서 포화될 때까지 밤새 성장시킵니다. L4440 empty 벡터를 negative control로 포함하는 박테리아 균주와 RNAi positive control을 포함하는 bacterial strain (예: egg-5)을 포함하여 RNAi가 작동하는지 확인합니다. 또한 LB만 포함하는 "공백" 조건을 포함하여 재고 LB에 오염이 없는지 확인합니다.
    3. dsRNA 발현 유도를 위해 멸균 필터링된 IPTG를 포화 야간 배양액에 최종 농도 1mM에 추가하고 파종 전 37°C에서 최소 2시간 30분 동안 배양합니다. 또는 IPTG를 유도하기 전에 로그 단계에서 포화된 야간 배양을 다시 희석합니다.
      참고: IPTG는 최적의 dsRNA 발현을 위해 플레이트와 포화 배양 모두에 포함됩니다.
    4. 멸균 기술을 사용하여 유도 배양액 300μL를 60mm x 15mm RNAi 플레이트(응고)의 중앙으로 옮깁니다. 또는 35mm x 10mm 플레이트에 100μL의 포화 배양을 사용합니다.
    5. RNAi 박테리아 반점이 더 이상 액체가 아닐 때까지 플레이트를 RT에서 1-3일 동안 건조시킵니다. 사용하기 전에 플레이트가 건조하고 오염되지 않았는지 확인하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 플레이트를 4°C에서 거꾸로 보관합니다.
      참고: RNAi 효능은 시간이 지남에 따라 감소하므로 최적의 녹다운을 위해 가능한 한 빨리 RNAi 플레이트를 사용하십시오. >1개월이 된 경우 폐기하십시오.
  3. 섹션 2에서 설명한 대로 웜을 RNAi 플레이트에 동기화합니다.
    1. 알-알을 낳은 후 1-2일 후에 벌레의 발달 지연을 확인하십시오.
    2. 일부 RNAi는 알을 낳을 때 넉다운이 시작될 때 발달 결함을 유발할 수 있습니다. 필요한 경우 L3와 같은 나중 단계에서 RNAi 플레이트에 웜을 놓습니다.
  4. 섹션 3 및 4에서 설명한 대로 웜을 장착하고 GFP 형광을 검출할 수 있는 현미경 시스템을 사용하여 이미징을 준비합니다.

7. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초기 배발생 중 칼슘 이미징

  1. 섹션 2에 설명된 대로 웜을 동기화합니다. CaFE 리포터와 원형질막 경계를 강조하는 pleckstrin-homology domain-mCherry 마커를 결합한 EAG28 변형을 사용합니다. 또는 자궁 밖에서 수정된 배아를 시각화하려면 멸균 주사기 바늘을 사용하여 자궁을 따라 기생충을 부드럽게 잘라 배아를 방출합니다.
  2. 섹션 3에 설명된 대로 이미징을 위해 벌레 또는 배아를 준비하고, 이미징 매개변수를 설정하기 위해 섹션 4에 설명된 것과 동일한 지침을 따릅니다.
  3. 관심 영역을 기생충의 자궁 중앙에 배치하여 배아 또는 산란자를 시각화합니다.
    1. 자궁 내 배아의 경우, 자궁이 장 뒤에 있지 않은지, 자궁이 붐비지 않는지, 배아의 개별 세포가 초점면에서 투명한지 확인합니다.
    2. 자궁 외 난자의 경우, 세포의 단계가 웜 수명 주기의 쉼표 단계를 지나지 않도록 합니다.
  4. 타임랩스 또는 시계열 프로토콜을 선택하고 원하는 설정으로 조정합니다.
    1. 배아 칼슘 과도 현상을 최적으로 시각화하려면 장시간 영화의 시간 설정을 늘립니다. 레이저에 지속적으로 노출되면 장기간에 걸쳐 배아에 해를 끼칠 수 있음을 명심하십시오.
  5. 원하는 세포 단계에 있는 배아의 세포에 초점을 맞춰 비디오 또는 이미지를 캡처합니다.
  6. 이미징에는 40x immersion objective 이상을 사용하지만, 과도 현상은 20x air objective를 사용하여 쉽게 감지할 수 있습니다.

결과

이 원고에 요약된 프로토콜을 사용하여 수정과 배발생에서 칼슘 신호의 역동적인 패턴이 예쁜꼬마선충에서 관찰되었습니다.

CaFE 리포터를 포함하는 기생충의 일반적인 수정 순서는 그림 2에 나와 있습니다. 분석을 용이하게 하기 위해 CaFE 리포터와 플렉스트린 상동성 도메인(PH-mCherry) 전이유전자13을 결합한 EAG28 균주를 사용했습니다. PH-mCherry 마커는 원형질막에 국한되어 특히 생식선에서 세포 경계를 더 쉽게 시각화할 수 있습니다. EAG28 균주는 CaFE 리포터를 포함하는 EAG16 균주와 OD70 PH-mCherry 리포터 균주13을 교차시켜 생성되었습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서는 배란과 수정이 동시에 일어납니다. 수정의 시간 0은 배란 난모세포에서 형광 신호가 감지되는 첫 번째 프레임으로 간주됩니다(그림 2). 난모세포의 앞 가장자리가 정자의 저장 기관인 정자(spermatheca)에 들어가자마자 정자 융합 부위에서 밝은 형광이 발생합니다7. 배란이 완료되기 전에 신호가 나타납니다. 칼슘파는 이위상(biphasic)이며, 빠른 초기 폭발 후 진입점에서 반대쪽 극을 향한 형광파가 뒤따릅니다. 전체 난모세포는 <30초 후에 형광이 됩니다.

CaFE 리포터는 단일 사본에 있으므로 신호는 다른 transgenes만큼 밝지 않습니다. Z-stack 타임랩스는 회전 디스크 공초점이 사용 가능하고 최적화되지 않는 한 배란 중에는 권장되지 않습니다. 생식선 형태학의 3D 변화를 캡처하기 위해 영화 전후에 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다. 여기에 있는 이미지는 컨포칼 현미경으로 촬영한 것이지만, 과도 현상은 컨포칼보다 더 일반적이고 저렴한 광시야 형광 현미경을 사용하여 관찰되었습니다. 레이저 스캐닝 컨포칼을 사용하면 프레임 속도는 약 1fps입니다. 회전 디스크 컨포칼을 사용하면 프레임 속도가 10fps 이상입니다. CaFE 리포터의 배경 신호는 생식선에서 성숙한 난모세포를 비추기에 충분합니다. 수정 시 일반적으로 GFP 신호 강도가 1.5-2배 증가하는 것이 관찰됩니다.

정량 분석을 위한 몇 가지 대체 방법이 있습니다. 예를 들어, Oxford Instruments(Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼 현미경과 동일한 모회사)에서 만든 Imaris 이미지 분석 소프트웨어는 더 큰 ROI 대신 통과 난모세포에서만 각 프레임의 신호를 정량화할 수 있습니다. 그러나 Imaris 소프트웨어는 무료가 아닙니다. 또한, 난모세포 내 칼슘파를 측정하기 위한 상세한 이미지 분석 전략은 Takayama, Fujita 및 Onami에 의해 매우 상세하게 기술되었으며 무료로 사용할 수 있는 ImageJ를 사용합니다14. 또는 단일 난모세포를 가로지르는 형광 신호파를 설명하기 위한 카이모그래프는 여기에 설명된 것보다 더 광범위한 이미지 조작이 필요하지만 Takayama 및 Onami3에 설명되어 있습니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans)의 뚜렷한 장점은 내인성 RNAi15,16을 유발하기 위해 dsRNA를 발현하는 벌레 박테리아에 공급함으로써 거의 모든 유전자의 발현을 녹다운할 수 있다는 것입니다. 최적의 dsRNA 발현을 위해 RNAi 플레이트와 포화 RNAi 배양 모두에 IPTG가 포함되어 있습니다. dsRNA는 측면 프로모터(flanking promoter)로 관심 유전자를 발현하여 생성됩니다. 여기에서는 16,256개의 박테리아 균주를 사용하여 대부분의 웜 게놈을 표적으로 하는 Ahringer 라이브러리를 사용했습니다17. 또는 Vidal 실험실에서 Gateway 시스템을 사용하여 ~11,000개의 RNAi 클론으로 구성된 ORFeome을 생성했으며 Horizon Discovery18을 통해 구입할 수 있습니다.

RNAi와 결합한 CaFE 리포터의 유용성을 입증하기 위해 조배란을 조사했습니다. ipp-5 의 부분적 결실은 이중 배란 사건을 유발하여 -1 난모세포와 -2 난모세포가 동일한 배란 기간 동안 정자로 들어갑니다19. IPP-5는 IP3에 작용하여 IP3 두 번째 전달자의 수준을 효과적으로 감소시키는 인산가수분해효소입니다. 우리는 ipp-5 의 RNAi 녹다운이 돌연변이와 유사한 이중 배란 표현형을 유도한다는 것을 발견했습니다.

ipp-5 RNAi 녹다운에 의해 유도된 이중 배란 중 CaFE 리포터를 분석한 결과 OET의 새로운 측면이 밝혀졌습니다. 첫째, 칼슘 신호는 선행 -1 난모세포에서 정자로 진입하자마자 즉시 관찰되었지만 후행 -2 난모세포에서는 관찰되지 않았습니다(그림 3). 2개의 난모세포가 배란을 하지만, -1 난모세포는 여전히 적절한 성숙의 징후, 특히 핵막(NEBD)의 파괴를 보이는 유일한 난모세포입니다. 이러한 데이터는 -2 난모세포가 정자가 존재하더라도 아직 제대로 성숙하지 않았기 때문에 수정될 능력이 없음을 시사합니다. 둘째, -2 난모세포는 일반적으로 난모세포가 자궁을 위해 정자를 빠져나갈 때 지연된 칼슘파를 나타냅니다. 난모세포 성숙은 일반적으로 배란의 전제 조건이지만, 이러한 데이터는 난모세포의 성숙과 수정 능력이 배란 후에도 여전히 발생할 수 있음을 시사합니다. ipp-5 knockdown 중 지연된 칼슘파의 시각화는 수정 역량 및 타이밍을 조사하기 위한 CaFE 리포터의 이점을 강조합니다.

또한, 우리는 CaFE 리포터가 산란란에서 검출될 수 있으며 예쁜꼬마선충의 초기 배발생 동안 단세포 칼슘 과도 현상을 드러낸다는 것을 발견했습니다. 동기화된 1일차 성체 EAG28(CaFE; PH-mCherry) 웜은 Zyla 카메라를 사용하여 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼과 함께 섹션 1-5의 프로토콜을 사용하여 이미지화되었습니다(그림 4). 칼슘 과도 현상은 단일 세포에 국한되어 있으며 수정 칼슘파보다 완료하는 데 시간이 덜 걸립니다(~9 s, n=11). 그러나 배발생 중 칼슘파는 이위상(biphasic)으로 보이지 않습니다. 칼슘 과도현상은 8세포 단계 이전에는 관찰되지 않았습니다. 특히, 칼슘은 인간과 Xenopus20,21,22를 포함한 다른 많은 유기체에서 볼 수 있는 것처럼 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 분열 고랑에 국한되지 않습니다. 단세포 칼슘 과도 현상은 배아 형성 후(수정 후 ~200분) 및 산란란에서 잘 관찰되었습니다. 단일 배아는 시간이 지남에 따라 여러 칼슘 과도 현상을 나타내지만 다른 세포에서 일반적으로 한 번에 하나의 세포에서 나타납니다. 레이저 자극에 지속적으로 노출되면 배아가 손상될 수 있습니다. 낮은 LED/레이저 출력 또는 불연속 노출을 권장합니다. 그러나 칼슘파는 ~9초로 비교적 짧기 때문에 LED/레이저 자극 이벤트 사이에 2초 미만으로 느린 것은 권장하지 않습니다.

figure-results-1
그림 1: 예쁜꼬마선충 생식선 팔. EAG25 웜 균주의 한 생식선 팔의 이미지, CaFE 리포터 GFP (녹색)와 생식 계통의 핵을 강조하는 히스톤 2B-mCherry 마커 (빨간색)를 보여줍니다. 근위 난모세포는 정자가 저장되는 정자 바로 앞에 -1로 표시됩니다(화살표). 정자에 가장 가깝지만 자궁 내부에 위치한 배아는 가장 최근에 태어난 배아입니다. 이미지는 Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 눈금 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 수정 중 칼슘파의 시각화. EAG28 웜 균주에서 수정 중 세포 내 칼슘을 반영하는 형광의 시계열 이미지. EAG28 균주에는 CaFE 리포터 (녹색)와 pleckstrin-homology domain-mCherry 융합 (노란색)이 모두 포함되어 있으며, 이는 원형질막을 강조합니다. 시간 0은 난모세포에서 형광 신호의 명확한 증가를 나타내는 첫 번째 프레임을 나타냅니다. 시간 24.4초는 전체 난모세포 형광을 보여주는 첫 번째 프레임을 반영합니다. 시계열 이미지는 Zyla 카메라와 함께 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 눈금 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: ipp-5 RNAi에 의한 이중 배란 중 칼슘파. ipp-5 RNAi에 노출된 EAG16 균주(GFP 녹색의 CaFE)에서 -1 난모세포와 -2 난모세포의 순차적인 칼슘파의 저속 촬영 이미지. -40.0 s 프레임에는 -1 난모세포(-1), -2 난모세포(-2), 정자(*) 및 +1 배아(+1)에 대한 레이블이 포함됩니다. 시간 0 s는 -1 난모세포의 칼슘파의 형광의 초기 증가를 표시합니다. 시간 4.5초는 -1 난모세포의 반대쪽 극으로 퍼지는 칼슘파를 보여줍니다. 시간 70.5초는 기준선 GFP 신호에서 -2 난모세포와 함께 -1 난모세포의 전체 세포 형광을 표시합니다. 두 난모세포는 모두 정자(spermatheca)에 있습니다. 수정된 -1 난모세포와 수정되지 않은 -2 난모세포는 158.3초에 자궁으로 들어갑니다. 219.3초에서 -2 난모세포는 후기 형광 칼슘파를 나타냅니다. 이미지는 Zyla 카메라와 함께 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 스케일 바 = 30 μM 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 초기 배발생에서의 단세포 칼슘 과도현상. (A) 자궁 내 배아 및 (B) 자궁 밖 (낳은 난자)은 배아 발생 중 단일 세포에서 형광 신호를 나타냈습니다. 이미지는 Zyla 카메라와 함께 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 눈금 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

강력한 프로토콜을 갖춘 간단한 도구는 어려운 과학적 질문을 해결할 수 있는 강력한 조합입니다. 여기에서는 칼슘을 수정에 대한 쉽게 검출할 수 있는 대용물로서 시각화하는 방법이 CaFE 리포터를 사용하여 제시됩니다. 이 동일한 리포터는 초기 배발생(embryogenesis)까지 지속되며 칼슘 과도현상(calcium transients)을 더 나아가 시각화할 수 있습니다. 칼슘 신호전달은 특히 발달 생물학에서 세포 기능의 주요 변화를 구분하는 중요한 두 번째 전달자 역할을 합니다. 난모세포에서 칼슘파의 첫 번째 파열 단계는 수정 시기뿐만 아니라 정자 융합 부위를 나타냅니다3. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 A-P 축은 또한 정자 융합 부위에 의해 결정된다23. 따라서 난모세포와 배아에서 칼슘을 시각화할 수 있는 능력은 세포 및 발달 생물학의 핵심인 복잡한 질문을 조사할 수 있게 해줍니다.

CaFE 리포터와 함께 여기에 설명된 방법은 선충 초보자에게 충분히 간단해야 합니다. 예쁜꼬마선충의 난모세포에서 칼슘파를 검출하는 이전 방법은 염료 주입에 의존했습니다 3,8,14. 이러한 연구는 중요하고 시사하는 바가 많았지만, 염료 주입은 노동 집약적이며 모든 실험실에서 주입 장비를 사용할 수 있는 것은 아닙니다.

여기에 제시된 프로토콜은 건강한 웜에 최적화되어 있습니다. 성공 가능성을 극대화하려면 지렁이 배지 또는 지렁이가 먹이를 찾는 박테리아 잔디밭에 오염이 없는지 확인하십시오. 기생충을 온도와 같은 스트레스 조건에 노출시키면 배란과 수정에 영향을 미치므로 노출시키지 마십시오. 또한 시간이 지남에 따라 효능이 감소하므로 RNAi 효능에 대한 대조군을 모든 실험에 포함해야 합니다. 배아를 생성하는 난자-5와 같은 RNAi 효능에 대해 positive control을 사용하지만, 난자 껍질 형성이 손상되어 생존 가능한 자손이 없습니다24. 또한 이미지 캡처 매개변수는 각 현미경 시스템에 맞게 최적화되어야 합니다. 당사의 사양은 여기에 참조로 포함되어 있지만 편차가 예상됩니다. 이 시스템은 세포질 칼슘을 수정의 대용물로서 쉽게 감지하지만, 반드시 진정한 정자-난모세포 융합 사건을 나타내는 것은 아닙니다.

웜 커뮤니티 내에서 자유롭게 배포되는 다양한 도구와 돌연변이는 CaFE 리포터의 유용성을 향상시킵니다. 리포터는 웜 게놈에 통합되고 다른 돌연변이 또는 리포터 C. elegans 균주25로 쉽게 교차됩니다. 여기에보고된 것은 핵을 시각화하기 위해 히스톤 H2B-mCherry 마커로 CaFE 리포터를 표현하는 EAG25 및 CaFE 리포터와 세포 주변부를 강조하는 pleckstrin-homology domain-mCherry 마커로 EAG28을 표현하는 EAG28의 생성입니다(그림 2)13,26. 두 균주 모두 생식세포와 배발생 중에 세포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 또한, RNAi의 시설은
예쁜꼬마선충(C. elegans)을 CaFE 리포터와 함께 사용하면 수정 능력에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그림 3의 ipp-5 RNAi knockdown에 의해 유도된 이중 배란에서 볼 수 있듯이, 정자와 배란된 난모세포의 존재는 수정 이벤트를 자극하기에 충분하지 않습니다.

이러한 결과는 난모세포가 수정될 수 있도록 하는 다른 신호 또는 억제제의 부재가 존재해야 함을 나타냅니다. 조기에 배란된 난모세포는 난모세포가 자궁으로 이동할 때 지연된 칼슘 과도기를 나타냅니다. 이 늦은 칼슘 파동은 조기에 배란된 -2 난모세포가 시간이 지남에 따라 수정 능력을 발달시킬 수 있음을 시사합니다. 우리는 특히 세포-세포 신호 전달 및 조절과 관련된 수정 시기에 대한 연구가 CaFE 리포터의 사용에 의해 도움이 될 것으로 예상합니다. 또한, CaFE 리포터는 배발생(embryogenesis)을 지속하고 단세포 칼슘 과도 현상(single-cell calcium transients)을 나타냅니다. 이 배아 칼슘 신호는 제브라피시 발달 후 첫 24시간 이내에 보고되었습니다27. 칼슘 과도 현상의 역할은 알려져 있지 않지만, 그 존재는 아직 연구되지 않은 발달 중 세포 신호 전달 사건을 암시합니다. 특히, 칼슘 과도 현상은 새로 수정된 접합자에서 관찰되지 않았습니다. 그러므로, 칼슘은 Xenopus 및 인간을 포함한 여러 다른 유기체에서 문서화된 것처럼 분열 고랑에 국한되지 않습니다 20,21,22.

중요한 것은 CaFE 리포터가 최소한의 교육으로 학부생이 사용할 수 있을 만큼 쉽다는 것입니다. 우리는 여기에 설명된 균주와 프로토콜을 가진 생물학 학생을 위해 1학점의 CURE(Course-based Undergraduate Research Experience) 실험실을 설계하고 실행했습니다. 한 학기 동안 수업은 일주일에 한 번 3시간 동안 또는 일주일에 두 번 각각 1시간 30분씩 만났습니다. 학생들은 혼자 작업하거나 2명으로 구성된 그룹으로 작업할 수 있는 선택권이 주어졌습니다. 각 학생/쌍은 선별된 목록에서 연구할 다른 유전자를 선택했습니다. 그들은 EAG28 균주에서 선택한 유전자에 대해 RNAi를 수행하고 번식력, 수정 및/또는 생식선 형태에 미치는 영향에 대해 벌레를 검사했습니다. 그들의 결과와 1차 문헌을 사용한 배경 독서를 바탕으로 학생들은 후속 실험에서 테스트할 수 있는 가설을 개발했습니다. 이 반복적 설계는 학생 참여도를 높이는 데 매우 중요했다28. 학생들은 진정한 연구 경험을 쌓고 모델 유기체, 유전자 스크리닝 및 형광 현미경 검사에 대한 기술을 습득했습니다. CaFE 리포터의 사용 편의성을 감안할 때 연구 경험이 없는 학생들도 성공할 수 있었습니다. 그 후, 학생들은 전통적인 실험 수업보다 CURE 형식을 압도적으로 선호했으며, 많은 학생들이 연구를 계속하고 싶다는 의사를 표명했습니다. 종합하면, 이러한 도구와 프로토콜은 초기 발달 과정에 대한 교육과 연구를 모두 지원합니다.

공개 사항

저자는 경쟁 또는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

KSKG는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(R15HD111986)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD4010440)에서 자금을 지원하는 CGC에서 제공했습니다. WormBase에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천피셔 사이언티픽DF0140-07-42 킬로그램; 분말은 플레이크보다 쉽게 용해됩니다
AgaroseMidSciBE-A125500g
알코올 램프Fisher ScientificS1347595% 에탄
올 염화암모늄(NH4Cl)Fisher ScientificAAA1500030250g
암피실린Fisher ScientificBP1760-55g
AMSCO 400 시리즈 소형 스팀 살균기Steris 헬스케어N/A
박토 펩톤Fisher ScientificBP1420-500500 g
박토 트립톤Fisher ScientificDF0123-17-3500 g
염화칼슘(CaCl2)Fisher ScientificC69-500500 g
콜레스테롤Thermo ScientificA11470.1850 g
Dragonfly 200 스피닝 디스크 컨포칼Oxford Instruments AndorN/ALeica 현미경과 함께 사용됨
Fisherbrand Superfrost Cytogenics Microscope SlidesFisher Scientific22-035-900팩당 144개의 슬라이드
플랫 노즈 플라이어, 부드러운 턱Home Depot305530604플라이어가 부드러운 턱인지 확인
이소프로필 β- d-1-thiogalactopyranoside ( IPTG)Fisher ScientificBP1755-1010 g; 다이옥산이 없는
실험실 테이프Fisher Scientific15-901-10R0.5인치 테이프는 현미경 슬라이드를 테이프로 붙이는 데 사용됩니다
LevamisoleFisher ScientificAC18787010010g
황산마그네슘(MgSO4)Fisher ScientificM63-500500g
현미경 커버 유리Fisher Scientific125410161 oz 팩
Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼NikonN/A
Nikon NIS 요소 소프트웨어NikonN/A컨포칼
OP50 대장균Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Platinum WireTriTechPT-9010
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificP288-500500g
인산칼륨 일염기성(KH2PO4)Fisher ScientificAA1159436 500g
염화나트륨(NaCl)Fisher ScientificS271-500500g
인산나트륨이염기성 헵타하이드레이트(Na2HPO4)Fisher ScientificS471-33kg
실체 현미경LeicaKL300 LED
멸균 페트리 접시 (35mm x 10mm)CellTreat229638케이스당 960 페트리
접시 멸균 페트리 접시 (60mm x 15mm)CellTreat케이스당 229665 500 페트리 접시
균주 EAG16 spn-4p :: jGCaMP7s : :p ie-1u< / em>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG16Kim Guisbert Lab
Strain EAG25 spn-4p :: jGCaMP7s :: 파이-1U; ujIs113 II.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG25Kim Guisbert Lab
Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG28Kim Guisbert Lab
Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)JIM113Created by E. Preston - Murray Lab
Strain OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OD70Created by Audhya/Oegema - Greenstein Lab
Tritech 웜 픽 핸들TriTechTWPH1
효모 추출물IBI ScientificIB49160500g
과 함께 사용

참고문헌

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