새로운 사이클로필린 A 억제제 및 가노데리올-F 유도체의 구조 유도 설계 및 개발: 실리코 내 접근법

요약

여기서는 신약 개발에 필수적인 Sanglifehrin A와 Cyclophilin A/Ganoderiol-F 간의 단백질-리간드 결합 상호작용을 구조 중심으로 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 리간드-수용체 복합체의 안정성은 분자 역학 시뮬레이션을 통해 평가되었습니다.

초록

사이클린 Ds-CDKs 축(사이클로필린 A(Cyp / Ganoderiol F))은 증식 조절과 암세포 억제 등 다양한 과정을 통해 암에서 중요한 역할을 합니다. 가노데올 F 유도체는 여러 암 유형에서 종양 유발 표적으로 작용할 수 있습니다. 이 연구는 새로운 Cyp A 억제제와 가노데리올 F 유도체의 구조 유도 설계 및 개발을 통해 화학 억제제와 선택한 수용체와의 상호작용에서 효과를 높이기 위한 계산된 위치를 선택할 수 있음을 입증했습니다. 이 접근법을 위해 최적의 분자 상호작용을 달성하기 위해 수많은 소프트웨어 애플리케이션이 활용되었습니다. 전체적으로 Chemsketch 소프트웨어를 사용해 117개의 새로운 사이클로필린 억제제 리간드 분자가 구성되었습니다. 새로운 Cyp A 억제제 리간드의 변환된 PDB 파일은 Sanglifehrin A 효소 수용체에 도입하기 위해 준비되었다. 리간드-단백질 도킹 상호작용은 AutoDock 4.2.6 소프트웨어를 사용하여 수행되어 최적의 기하학적 상호작용을 밝혀냈습니다. 도킹 확인은 PyMOL 2.5 소프트웨어를 사용해 수행되었습니다. 마지막으로, 키메라와 마에스트로 소프트웨어를 사용해 수소 결합을 검출했습니다. 선택된 리간드-수용체 결합 복합체는 분자 역학 시뮬레이션을 받았다. MD 시뮬레이션 과정은 복합체의 안정성을 입증했으며, 선택한 리간드가 암세포의 약물 억제제로 활용될 수 있음을 보여주었습니다. 결과에서 결합 부위의 활성 아미노산은 1.53Å 운동 중인 아르기닌 55, 아스파라긴(Asn), 글리신(Gly), 트레오닌(Thr), 라이신(Lys), 이솔류신(Iso), 히스티딘(HID), 페닐알라닌(Phe), 시스테인(Cys)으로 확인되었으며, 수소 결합 리간드 수가 45 하이드록시망지페로닉으로 가장 많았습니다. 이 장치는 X 38.86의 격자 박스 좌표에 있는 1nmk 수용체, Y는 10.987, Z는 40.734에 연결되었습니다. Gromacs 버전 CHARMM 36 힘장에서 분자 역학(MD) 시뮬레이션에서 1nmk 수용체-리간드 복합체 평가는 최적 차수를 가집니다.

서론

사이클로필린 A는 인간 Cyp A의 강력한 억제제입니다. 사이클로필린은 면역 체계를 저해하지 않고 더 우수한 약리학적 특성을 가지며 수송체 억제를 감소시키는 강력한 억제제입니다. 예후가 좋지 않은 것은 펩티딜-프롤릴 이성질^{활성 1}을 가진 단백질인 사이클로필린의 과발현과 연관되어 있습니다. 사이클로필린은 간세포암을 포함한 여러 암에서 과발현된 것으로 보고되었습니다. 간세포암(HCC)에서 사이클로필린은 암 약물 내성과 증식에 매우 중요합니다^. 이 억제제는 원자 수준의 분자 도킹과 MD 시뮬레이션을 활용하여 DC838과 Cyp A³의 정확한 결합 부위를 규명함으로써 퀴녹살린 유도체를 기반으로 한 새로운 면역억제제를 식별하는 데 필수적인 정보를 획득합니다.

또한, 생체 내 연구에서는 사이클로필린 DC838이 콘카나발린에 의해 유도된 쥐 비장 세포 증식을 방지하는 것으로 나타났습니다. 여러 연구에서 자연물질인 상리페린 A(SFA)를 기반으로 합성된 일련의 다대환 사이클로필린 억제제가 보고^{되었습니다.} 초기 화합물 최적화 결과, m5 티로신 잔기의 하이드록실기, C14 및 C15의 입체 중심, 그리고 상글리페린 코어의 valine5m5tyrosine5piperazic acid 삼펩타이드가 화합물 효능⁵에 영향을 미치는 필수 요인임이 밝혀졌습니다. SFA의 C185C21 디엔 단위는 스티릴기로 대체되어, 스티렌 모이에티가 Cyp A의 아르기닌(Arg)55⁶과 스태킹 상호작용을 통해 상호작용하는 새로운 결합 방식을 보이는 강력한 화합물을 만들 수 있습니다. 비면역억제성 사이클로필린 억제제는 C형 간염 바이러스 치료에 효과적입니다. 사이클로스포린^A1, 알리스포리버 및 대부분의 다른 사이클로스포린은 MRP2, MDR1, OATP1B1 및 기타 중요한 약물 수송체의 강력한 억제제입니다 ^7,8.

반면, Ganoderma leucocontextum에서 정제된 Ganoderiol F는 CDK4/CDK6⁹ 사이클린을 억제하여 세포 주기 진행을 지연시키며, 사이클린 의존성 키나제(CDK)는 포유류 세포 주기 조절에 핵심적입니다. 사이클린 D-CDK4/CDK6와 사이클린 E-CDK2는 가노데리올 F가 세포 주기 진행을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 따라서 가노데리올 F는 유방암 치료에 CDK4/CDK6 억제제로 사용될 수 있다^10,11. FA는 세포 주기의 G1 단계를 억제하여 M-CSF 의존성 대식세포 성장을 막으면서도 세포 생존력에 영향을 주지 않습니다¹². 면역억제제는 CDK2의 활성을 비활성화하여 증식을 억제합니다. 암 맥락에서 사이클린 D-CDK4/6과 다른 사이클린 및 CDK의 역할은 잘 알려져 있습니다. 암은 사이클린-CDK 경로의 비정상적인 탈조절이 특징입니다. 구체적으로, 세포가 DNA 합성을 시작할 준비가 되면 CDK4는 D형 사이클린과 함께 G1 단계를 통과하는 과정을 매개합니다. 이 과정은 암의 발병과 진행에 매우 밀접하게 연결되어^{있습니다.}

Cyp A의 활성 부위는 불변 촉매성 아르기닌(Arg55)과 Arg55, 글루타민(Gln), 글리신(Gly), 트레오닌(Thr⁾1,13,14와 같은 소수성, 방향족, 극성 잔기의 매우 보존된 혼합물로 특징지어집니다. 사이클로필린 계열의 활성 부위는 알라닌(Ala)과 아스파라긴(Asn⁾¹도 포함합니다. 한편, SFA 활성 부위는 Arg55¹⁵, Gln, Gly, Thr, Ala, Asn 아미노산으로 구성되어 있으며, 이들은 SFA의 피페라진 산 모이에티를 감싸는 소수성 주머니를 형성합니다. 리간드가 없는 Cyp A와 달리, SFA의 매크로사이클과 스핀 바이시클 사이의 링커는 Trp121이 측사슬¹⁶을 재정렬하도록 강제합니다.

1nmk는^{이전 연구에서} 언급된 바와 같이 Sanglifehrin A의 특정 PDB 코드로 선택되었습니다. 면역억제 자연물질인 SFA는 스트렙토마이세스 속 A92-3081 ^5,18에서 처음 발견되었습니다. SFA는 Cyp A에 높은 친화성을 보이며, CsA와 비교해 독특한 구조를 가지고 있어 면역 체계를 억제하는 독특한 방법을 사용합니다. SFA의 복잡한 분자 구조는 22원으로 이루어진 매크로사이클과 23번 위치에 9탄소 테더가 위치하며, 고도로 치환된 스피로-이환 모이에티로 끝납니다. 섬유화된 인간 폐섬유아세포와 특발성 폐섬유증 환자 샘플을 대상으로 한 시험관 내 연구에서 SFA가 사이클로필린 B 생성을 증가시키고 콜라겐 I형 분비를 억제한다는 것이 입증되었습니다^19,20. 전체적으로 20종의 서로 다른 상글리페린이 SFA(C16)를 분리하는 데 사용되었습니다. 세포 없는 경쟁 결합 실험에서 사이클로필린에 대한 친화력은 SFA 그룹의 다른 구성원들보다 약 60배 높다¹⁵. 예를 들어, SFA는 수지상 세포에서 분비되는 IL-12의 주요 공급원인인 생체 활성 IL-12p70의 양을 크게 줄여 수지상 세포 활동을 억제합니다. 이 연구는 SFA가 강력한 새로운 면역억제제임을 시사합니다^.

이 프로토콜에서는 Chemsketch 소프트웨어를 이용한 실리코 방법을 사용하여 Ganoderiol F/Cyp A의 새로운 리간드 구조를 생성한 후, 호환 소프트웨어를 사용해 PDB 파일로 변환했습니다. 단백질-리간드 결합 개념은 신약 발견 및 설계 과정에서 중요한 문제입니다^21,22. 리간드-수용체 상호작용은 AutoDock 4.2.6 소프트웨어를 사용해 도킹되었습니다. 계산 도킹 시스템은 일반적으로 여러 개의 잠재적 단백질-리간드 복합체 구성을 생성합니다. 1nmk 수용체에 결합하는 에너지가 가장 낮은 후보 중 하나 또는 몇몇을 다음 단계의 신약 설계에 선발하여 실리코 신약 설계 시험의 효과를 보장할 수 있습니다. 키메라 소프트웨어를 사용해 최적의 수소 결합 리간드를 식별하였습니다. 마지막으로, 리간드-수용체 복합체에 대해 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 수행하여 안정성을 측정하였습니다. 이 방법은 아래 프로토콜에 설명되어 있습니다.

프로토콜

1. ChemSketch 소프트웨어에서의 리간드 및 리간드 준비의 실리코 내 생성

참고: 이 소프트웨어는 리간드/분자의 구조를 그리는 데 사용되며, 즉 분자 편집을 수행합니다.

1. 소프트웨어에서 제시한 도면 과정에 따라 리간드/구조를 그리세요. 보 완 파일 1 (스크린샷 1)에 표시되어 있습니다.
2. 전체 구조를 그린 후 f9 키를 눌러 구조물을 청소하세요.
3. 파일을 클릭한 후 '다른 이름으로 저장'을 선택하세요. (폴더로 이동하세요. 예를 들어, 분자 1은 폴더 1에 저장됩니다.
4. Save An. 유형을 mdl molfiles로 변경한 후 저장을 클릭하세요(파일 이름을 지정할 필요 없이, 소프트웨어에서 제공하는 기본 파일 이름(예: noname)을 사용하세요).
   참고: 폴더 내에 하나의 파일이 생성되며, 각 파일은 2D 구조 리간드의 mdl 형식을 갖게 됩니다.
5. 위의 단계를 모든 분자에 대해 반복합니다.

2. 파일 형식 변환 (Open Babel 소프트웨어)

참고: 소프트웨어는 파일 형식을 변환합니다. 여기서 .mol 파일은 보조 파일 1 (스크린샷 2)에 나와 같이 .pdb 형식으로 변환됩니다.

1. 왼쪽 입력 형식에서 드롭다운 메뉴에서 mol--mdl mol 형식을 선택하세요. 마찬가지로 오른쪽 출력 양식에서 pdb--단백질 데이터 뱅크 형식을 선택하세요.
2. 입력 형식(왼쪽)에서 ... 버튼을 클릭하세요 (탐색 버튼).
3. 폴더(예: 폴더 1)로 이동해 방금 그린 Chemsketch 파일을 클릭한 후 열 어보세요.
4. 출력 형식 아래에서 ....
5. 기본 창이 열립니다. 파일 이름을 여기서 1.pdb 입력하세요. 구조 1에 대해 1.pdb 를 입력하고 저장을 클릭하세요. 이 과정을 분자/구조 2에 대해 반복하고, 2.pdb 등을 입력하는 식으로 반복합니다.
6. 마지막으로, 소프트웨어 인터페이스 중간에서 변환을 클릭하세요. 이 과정에서 좌표가 mdl mol 형식에서 PDB 형식으로 변환됩니다.
   참고: 이제 폴더에 파일이 하나 더 추가될 예정입니다. 각 파일에는 다음 단계에서 사용할 리간드 pdb 파일이 하나씩 있습니다.
7. 새로 생성된 파일을 우클릭하고, '함께 열기 '를 선택한 후 메모장을 선택하세요.
8. 모든 분자에 대해 같은 과정을 반복하세요.
   참고: MGL 1.5.7 도구를 설치하면 AutoDock 4.2.6이 데스크톱에 나타납니다.
9. 아래에 설명된 입력 1nmk.pdb 파일을 준비하세요.
10. 1nmk.pdb 파일에서 pdb.org 웹사이트에 접속하여 1nmk 구조를 선택하여 모든 외부 리간드를 제거하세요. 보조 파일 1(스크린샷 3)에서 보시는 것처럼 1nmk 구조의 소분자 제목 아래에 있는 리간드를 찾아보세요.
11. 보조 파일 1(스크린샷 4)에 표시된 SFM이라는 리간드를 찾아 1nmk 파일을 엽니다. PDB 웹사이트에서 1nmk PDB 파일을 다운로드하세요. 종료 잔여물(TER.)을 찾으세요. 보완 파일 1(스크린샷 5)에 표시되어 있습니다.
12. 1nmk 구조 내 외부 리간드(SFM) 잔기들을 제거하는데, 이는 TER 이후의 잔기부터 끝나기 전 잔기의 전까지 이어집니다. 수정된 1nmk PDB 파일을 시스템에 저장하세요.
    참고: 1nmk PDB 파일은 준비되었으며, 표 1의 수용체 활성 좌표 사이트 파일 준비가 진행 중입니다.
13. 1nmk 파일을 열고 아미노산 번호 55에서 Arg를 찾으세요.
14. 보조 파일 1(스크린샷 6)에 표시된 대로 x, y, z 좌표를 찾으세요.

3. AutoDock 4.2.6 소프트웨어를 이용한 도킹 매개변수 준비.

1. 데스크톱에서 AutoDock 4.2.6 툴 소프트웨어를 실행하세요.
2. 보조 파일 1(스크린샷 7)에 표시된 대로 1nmk 수용체 준비를 위해 AutoDock 4.2.6 4.0을 선택하세요.
3. 파일 메뉴를 열고 분자 읽기를 선택한 뒤, 폴더로 이동해 1nmk를 선택한 후 열기 버튼을 누르세요.
4. 편집 버튼을 누르고, 수소를 선택한 후 추가를 클릭하세요. Polar 전용을 선택하고 확인 버튼을 누르세요. (보조 파일 1, 스크린샷 8).
5. 편집 버튼을 누르고, Charges를 선택한 다음 Kollman Charges를 선택하세요.
6. 편집 버튼을 누르고 Atoms를 선택한 다음, Assign ad4 타입을 선택하세요(그 중 하나를 선택하세요).
7. 파일 메뉴를 열고 저장을 선택한 후 pdbqt를 입력하세요. 창문이 열릴 거야. 폴더 1을 탐색하고 파일명 1nmk.pdbqt를 입력한 후 저장을 클릭하세요.
8. Atom에서 선택한 후, 보조 파일 1(스크린샷 9)에 표시된 대로 추가하세요. 정렬 노드 박스를 체크하고, 변환 좌표를 저장하고, 모든 레코드를 쓰고, 확인 버튼을 누르세요.
9. 리간드를 열고 입력을 선택한 후 열어. 폴더 1로 이동해 파일 형식을 '모든 파일'로 변경하고, 1.pdb를 선택한 후 '열기'를 클릭하세요. 작은 창이 나타나 선택 리간드에 대한 정보를 제공하며, 보충 파일 1(스크린샷 10)에 표시됩니다.
10. 리간드를 열고, 토션 트리를 열고, Detect the Root를 사용하세요. 보조 파일 1(스크린샷 11)에서 확인할 수 있습니다.
11. 리간드를 열고, Output을 실행한 뒤 pdbqt로 저장하세요. 폴더 1로 이동해 파일 이름 1. pdbqt를 입력한 후 저장을 클릭하세요. 보조 파일 1(스크린샷 12)에 표시되어 있습니다.
    참고: 모든 리간드 pdbqt 파일이 준비됩니다.
12. 그리드를 열고 고대분자를 선택한 후 1nmk를 선택한 후 분자를 선택하세요. 경고가 나타납니다; 보충 파일 1(스크린샷 13)에 표시된 대로 확인을 클릭하세요. 폴더 1로 이동해 파일 이름 1nmk.pdbqt를 입력한 후 저장을 클릭한 후 교체 창이 열리면 '예'를 클릭하세요. 이는 보조 파일 1(스크린샷 14)에 표시되어 있습니다.
13. 그리드를 열고 맵 유형을 설정한 후 리간드를 선택한 후 1을 클릭한 후 리간드를 선택하세요. 이는 보조 파일 1(스크린샷 15)에서 보입니다.
14. 표 1에 표시된 GPF 수용체 활성 좌표 부위 파일을 준비합니다.
    참고: 파일 GPF는 수용체의 활성 좌표 부위를 나타냅니다(표 1).
15. 그리드를 클릭한 후 그리드 박스로 가서 센터를 선택한 후 원자를 선택한 후 센터 그리드 박스를 입력하세요 (보조 파일 1, 스크린샷 16).
    1. 파일을 선택한 후 닫기, 현재 설정을 저장하세요.
    2. 그리드를 선택한 다음 출력을 선택한 후 GPF로 저장하세요. 폴더 1로 가서 파일 이름 1nmk.gpf를 입력하세요.
    3. Docking > Macromolecule > Set Rigid File Name을 선택한 후 폴더 1로 이동한 뒤 1nmk.pdbqt를 클릭한 후 Open을 선택하세요. 이는 보조 파일 1(스크린샷 17)에 표시되어 있습니다.
    4. 도킹을 선택하고 1을 찾은 후 리간드를 선택하세요 (보조 파일 1, 스크린샷 18). 기본 매개변수가 있는 창이 열립니다. 기본 매개변수를 수용하세요, 보조 파일 1(스크린샷 19)에 표시되어 있습니다.
    5. 그 다음 도킹을 선택하고 매개변수 검색 모드로 가서 기본 매개변수가 표시된 창을 열어주는 유전 알고리즘을 선택한 후 수락을 선택하세요. 보조 파일 1(스크린샷 20)에 나와 있습니다.
    6. 도 킹을 선택한 후 출력, 라마르크 GA를 선택하세요. 보 충 파일 1 (스크린샷 21)에 표시되어 있습니다.
    7. 폴더 1에 들어가서 파일 이름 "1nmk.dpf"를 입력한 뒤, 보조 파일 1(스크린샷 22)에 표시된 대로 저장을 클릭하세요.
       참고: AutoDock 4.2.6 소프트웨어 창을 닫고 다시 열어 다음 분자 작업을 반복하세요. 또한 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf, 1nmk.dpf는 도킹 과정 단계에 준비가 완료됩니다.

4. 시그윈-I (도킹 과정)

참고: GLG 와 DLG 파일을 생성하려면 알고리즘을 실행하세요. 이 알고리즘(AutoGrid)은 이 Cygwin 터미널에서 실행됩니다. Cygwin에서 폴더로 이동하세요. 예를 들어, 1번 폴더가 C 드라이브에 있다면, "project"라는 폴더 하나, 그 다음에 "molecules"라는 폴더, 그리고 그 안에 있는 모든 폴더가 들어가야 합니다. 다음 단계를 따라가세요.

1. 사이그윈 단말기를 열어.
2. cd c:/를 입력하고 엔터를 누르세요. 그다음 cd project를 입력하고 Enter를 누르세요.
3. cd 분자를 입력하고 Enter를 누르고, cd 1을 입력하고 Enter를 누르세요. 이제 폴더 1은 Cygwin 터미널에 있습니다.
4. . /autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & 입력한 후 Enter를 누르세요. 보조 파일 1 (스크린샷 23)에 나와 있습니다.
   참고: "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &"에서 -l은 마이너스 작은 l입니다.
5. tail -f 1nmk.glg 를 입력하고 Enter를 누르세요. 보조 파일 1 (스크린샷 4)에 표시되어 있습니다.
6. AutoGrid가 성공적으로 완료되면, 이 Cygwin 창을 닫고 새 Cygwin 창을 열어 분자 2에 대해 위의 과정을 반복합니다.
7. 이 과정을 모든 분자에 대해 반복하고 알고리즘(AutoDock 4.2.6)을 실행하세요.
   참고: AutoDock 4.2.6의 경우, 폴더로 이동하는 과정을 반복하고, 폴더에 접근하면 'Enter'를 입력한 후 AutoDock 4.2.6을 누르세요.
8. . /autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & 를 입력한 후 Enter를 누르세요. 보조 파일 1 (스크린샷 24)에 표시되어 있습니다.
   참고: 위 단계에서 "-l"은 음수 부호가 있는 소문자 "L"입니다.
9. 타입 꼬리 -f 1nmk.dlg
   참고: AutoDock 4.2.6이 완료되면 Cygwin 창을 닫고 분자 2에 대해 같은 과정을 반복하세요.
10. 모든 분자에 대해 이 Cygwin 절차를 따르세요.
11. 분자 DLG 파일을 만든 후에는 폴더 1로 가서 WordPad에서 DLG 파일을 열어보세요. Ctrl + F를 누르고 타이핑한 후 Enter 키를 세 번 누르면 RMSD 테이블로 이동하세요. 이는 보조 파일 1 (스크린샷 25)에 표시되어 있습니다.
12. Microsoft Excel 창을 열거나 페이지를 메모하고 세 개의 열을 만드세요: No., Min. 결합 에너지, 그리고 Run.
13. 로그 파일의 RMSD 테이블에 따라 데이터를 기록하세요. 결합 에너지는 표 상단에 있으며, 관찰된 주행 속도도 함께 표시됩니다. 모든 분자에 대해 이 작업을 하세요.
    참고: 결합 에너지가 낮은 분자가 다른 분자보다 더 우수한 것으로 간주됩니다.
14. 상위 20개 분자의 세부사항(일련번호, 최소 결합 에너지, 연속 횟수)을 정리한 또 다른 스프레드시트를 만드세요.
    참고: 다음 절차는 상위 20개 분자에만 적용됩니다.

5. 시그윈-II

1. Cygwin 터미널을 열고 cd c:/ 를 입력한 후 Enter를 누르세요.
2. cd project를 입력하고 Enter를 누르고, cd molecules를 입력한 후 Enter를 누르세요.
3. 선택한 가장 위쪽 분자의 폴더 번호 cd 를 입력하고 엔터를 누르세요.
   참고: 번호는 Cygwin 터미널의 폴더와 일치해야 합니다.
4. grep '^docked' 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt 입력하고 Enter를 누르세요. AutoGrid나 AutoDock과 달리, 이 경우 성공적인 완료 메시지가 나타나지 않으며, 보조 파일 1(스크린샷 26)에서 확인할 수 있습니다.
5. 엔터 키를 누르면 파일이 생성됩니다.
6. cut -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb를 입력하고 엔터를 누르세요. 파일은 보조 파일 1(스크린샷 27)에 표시되어 생성됩니다.
7. 시그윈 창을 닫아.
   참고: PyMOL 2.5 소프트웨어를 사용하여 도킹 후 리간드와 수용체의 상호작용을 시각화하기 위해
   1. PyMOL 2.5 소프트웨어를 실행한 후 파일을 열고, 수용체를 선택하세요.
   2. 파일을 열고, 보조 파일 1 (스크린샷 28)에 표시된 대로 선택한 리간드 구성을 선택하세요.
   3. PyMOL 2.5에서 Hide Molecule과 Hide Receptor를 선택하세요. 수용체 메뉴에서 그림 1A에 표시된 것처럼 표면 표시를 선택하세요.
      참고: 리간드-1nmk 수용체 복합체의 수소 결합을 시각화하기 위해 UCSF 키메라 소프트웨어는 결합 에너지가 가장 낮은 20개의 리간드에 사용됩니다.

6. 수소 결합 시각화 및 결과 분석을 위한 UCSF 키메라 소프트웨어

1. UCSF Chimera를 열고 Select File, Open, 드라이브 c:/, Project, Molecules로 이동한 후 1nmk.pdb를 선택하고 열어보세요.
2. 분자가 위치한 드라이브를 선택한 후 UCSF 프로그램에서 단백질을 엽니다.
3. 잔여물을 선택한 후 UNL 줌을 선택하세요.
4. 존 을 선택한 후 확인 버튼을 누르 고, 액션을 선택한 다음, 라벨, 잔류물, 그리고 이름 + 명세자를 선택하세요.
5. 도구를 선택한 후 구조 분석을 선택한 후 H -본드 찾기를 선택하세요. 이는 보조 파일 1 (스크린샷 29)에 표시되어 있습니다.
6. 기본 창을 열고 정확한 기준을 충족하지 않는 색상 H-결합 박스를 체크하고, 선택된 H-결합만 찾으세요.
7. 새 조사를 시작하려면 선택 제거(Clear Selection)를 선택한 후, 확대하여 그림 3에 나타난 H-결합을 나타내는 파란색/주황색 선을 검색하세요.
8. 몇 개의 채권이 있는지 확인하세요.
   참고: 확대 영상에서는 Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, Isoleucine 156²³, Histidine 54²⁴, Phenylalanine (Phe)53, Cysteine (Cys)52, Gly72, Asn71, Hid 70과의 H-결합 상호작용을 보여주고, 이들이 단백질의 활성 부위 내에 있는지 여부를 나타내야 합니다( 그림 3A - D에 나타난 것).
9. 수소-결합의 수와 분자 수를 주목하세요.
10. 마우스를 H-결합이 표시된 선 위에 올려놓으면, Arg55와 메티오닌, Gln, Gly, Thr과의 상호작용을 나타냅니다.
11. 프린트 스크린 키를 누르세요.
12. 페인트 애플리케이션을 열고 보조 도표를 붙여넣은 뒤, 지정된 폴더에 저장하세요.
    참고: 수소 결합과 활성 부위 아미노산을 명확히 보여주기 위해서는 선택한 리간드와 수용체의 2차원 구조가 다음과 같아야 합니다:

7. 도킹 확인을 위한 리간드 상호작용 다이어그램 준비 및 H-결합 표시

1. AutoDock 4.2.6 소프트웨어를 열어보세요.
   1. 분석을 선택하고 Macromolecule을 열고, 보조 파일 1(스크린샷 30)에 표시된 대로 1nmk를 선택하세요.
   2. 분석을 선택하고 도킹을 열고, 그 다음 열기(Open)를 선택한 뒤, dlg.pdb 파일로 이동해 선택 가능한 항목입니다. 보조 파일 1(스크린샷 31)에서 확인할 수 있습니다.
   3. 분석을 선택하고 도킹을 열고, 보조 파일 1(스크린샷 32)에 표시된 대로 AutoDock 가상 스크리닝 리간드를 작성하여 PDB 파일로 저장하세요.
2. 보조 파일 1(스크린샷 33)에 표시된 PyMOL 2.5 소프트웨어를 엽니다.
   1. 저장된 dlg.pdb 파일을 열고, 1nmk.pdb 파일을 열어보세요.
   2. 파일을 열고 분자 내보내기를 선택한 후 저장을 선택하세요. 보조 파일 1(스크린샷 34)에 표시되어 있습니다.
   3. Maestro 소프트웨어를 열고 파일을 열고, 보조 파일 1(스크린샷 35)에 표시된 대로 구조 가져오기를 선택하세요.
   4. 리간드 상호작용 다이어그램을 가져오고, 보조 파일 2에 표시된 2D 구조를 저장하세요.

8. MD 시뮬레이션

참고: 리눅스에서 GROMACS를 열려면 다음 단계를 따르세요

1. Ubuntu 20.04.6을 다운로드하세요.
   1. PC에서 Windows 기능 애플리케이션을 켜세요. 그리고 리눅스용 Windows Subsystem을 선택하고 확인 버튼을 누르세요.
   2. 이 질문들을 따라 Enter 를 눌러 GROMACS를 설치하세요:
      1. sudo apt-get update를 입력하고 Enter를 누른 다음, sudo apt-get upgrade를 입력하고 Enter를 누르세요.
      2. sudo apt-get install gcc를 입력하고 Enter를 누르고, sudo apt-get install cmake를 입력한 후 Enter를 누르세요.
      3. sudo apt-get install built-essential을 입력하고 Enter를 누른 다음, sudo apt-get install liDevfftw3-d를 입력한 후 Enter를 누르세요.
      4. sudo apt-get install GROMACS를 입력한 후 Enter를 누른 다음, Shift + Ctrl + T 키를 누르세요.
   3. 개인용 컴퓨터 PC에서 폴더를 열고 GROMACS라는 이름을 붙이세요. 보 완 파일 1 (스크린샷 36)에 표시되어 있습니다.
   4. GROMACS 폴더를 열고 Shift + Ctrl + Right 키를 눌러 리눅스에 진입하세요.
      참고: 시뮬레이션은 수상 모델과 GROMACS 4.0 버전, 즉 CHARMM 36 힘장을 포함한 Win64 멀티코어 버전을 사용했습니다. 타임스텝은 2 fs로 설정되었고, 컷오프 거리는 1.0에서 1.2 nm로 선택되었습니다.

9. GROMACS pdb2gmx 모듈을 이용한 리간드 토폴로지 생성 (보조 파일 1, 스크린샷 37)

1. lig.gro 파일을 만들고, lig.pdb > grep UNL 135_clean.pdb 입력한 뒤 Enter를 눌러 단백질 구조에서 리간드를 추출한 후, 파일 내에서 "UNL"을 "LIG"로 이름을 바꿉니다.
2. PyMOL 2.5에서 lig.pdb를 열고, 원하지 않는 원자를 선택 버튼을 누르고 원자 삭제를 누르면 제거됩니다. 저장을 클릭하면 정리된 버전을 lig_clean.pdb로 저장하세요.
3. Avogadro에서 정리된 파일을 열어 Build 도구를 사용해 수소를 추가하고 lig.mol2로 저장하세요. 텍스트 편집기에서 파일 상단을 편집하여 잔여 이름이 LIG로 설정되어 있는지 확인하세요.
4. 펄sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2를 입력하고 엔터를 누르세요.
5. CGenFF를 사용해 리간드 토폴로지를 생성하세요: lig_fix mol2를 업로드하고 입력을 처리한 후 lig_fix.pdb를 다운로드하세요. 파이썬 환경을 활성화하고 파이썬을 cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff 실행한 후 엔터를 누르세요.
   참고: 이 단계에서는 네 개의 리간드 파일(lig.prm, lig.itp, lig.top, lig_ini.pdb)을 생성합니다.
6. ligand.gro 파일을 생성하고, gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro를 입력한 후 Enter를 누르세요.
7. 단백질을 분리하여 비리간드 원자만 prot_clean.pdb에 저장하고, 결합된 복합체 상단에 UNL 원자가 표시되도록 하세요.

10. GROMACS pdb2gmx 모듈에서 단백질 위상수 생성 (보충 파일 1, 스크린샷 38).

1. 단백질 위상을 준비하고, 입력 gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter 키를 입력한 후 Enter 버튼을 누르세요.
2. pro.gro 파일 끝에 lig.gro 파일을 추가한 후 단백질과 리간드 복합체를 만듭니다. 그 다음 gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt 입방형을 입력한 후 Enter를 누르세요.
3. 특정 점전하 수분 모델을 사용해 용매를 생성하여 평형을 유지하고, gmx 용매 -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top 입력한 후 Enter를 누르세요.
4. 이온 파일을 만들고 gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr 을 입력한 후 Enter를 누르세요. gmx geneon -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral을 입력한 후 Enter를 누른 후 그룹 15를 선택해 이온을 추가하세요.
5. 에너지 최소화 생성 em.gro.
6. gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr을 입력한 후 Enter를 누르고, gmx mdrun -v -deffnm em을 입력한 후 Enter를 누르세요.
   참고: 용매 시스템은 최대 50,000 단계로 에너지 최소화되며, 힘 수렴 기준은 1,000 kJ/mol/nm입니다.
7. 인덱스 파일을 만들고 gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx를 입력한 후 Enter를 누르세요.
8. 입력: gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 그리고 Enter를 누르세요.
9. index.ndx 파일을 생성하고, gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx를 입력한 후 Enter를 누르세요.
10. NVT 평형 생성 nvt.gro 파일을 입력하고, gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr 키를 입력하고 Enter를 누릅니다. 그다음 gmx mdrun -deffnm nvt 를 입력하고 Enter를 누르세요.
    참고: 시스템의 평형은 원자 수(N), 부피(V), 온도(V)(NVT) 앙상블에 대해 27.35 °C(300.5 K) 온도에서 100 ps 동안 수행되었습니다.
11. NPT를 만들기 위해 리간드 토폴로지와 매개변수를 포함하도록 topol.top 토 폴로지 파일을 업데이트하세요.
12. NPT 평형을 생성합니다.
13. 2단계 NPT 평형을 생성하고, gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr 입력한 후 Enter를 누르고, gmx mdrun -deffnm npt 를 입력한 후 Enter를 누르세요.
    참고: 평형 NVT는 입자의 수, 부피, 온도를 의미하며, 평형 NPT는 입자 수, 압력, 온도의 안정성을 의미합니다. MD 시뮬레이션 결과를 산출하기 위해 NVT.mdp 및 NPT.mdp 파일이 필요합니다.

11. 위치 구속 해제 및 생산 분자 역학 시뮬레이션 실행을 통해 데이터를 수집

1. 입력: gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr 키를 입력하고 Enter를 누르세요. 그 다음 gmx mdrun -deffnm md_0_10 입력하고 엔터를 누르세요.
2. 복합체의 안정성을 테스트하기 위해 시스템을 1 ns MD 시뮬레이션에 적용합니다.
   참고: 평균제곱근편차(RMSD)는 원자의 평균 구조 편차를 기준 구조와 비교한 값을 정량화하며, 변동 평균편차(FMSD)는 원자의 평균 위치 주변의 시간 평균화된 원자 변동을 측정합니다. 이 두 값은 주전 시뮬레이션 실행을 최종 확정하는 데 필요합니다.
3. RMSD, FMSD, 수소 결합, 자유 에너지 등 구조 분석을 수행합니다.
4. qtgrace_v026_win7 소프트웨어와 md_0_10.gro 파일을 사용해 VMD 소프트웨어를 사용해 궤적 상자를 표시하는 분석 그래프를 그립니다.

결과

서론에서 언급했듯이, 생체 내 및 시험관 내 연구는 사이클로필린 억제제가 상글리페린의 구조를 단순화하여 생쥐^{세포 주기를} 방해하여 비장 증식을 줄이는 데 중요함을 입증한다. 또한, 사이클로필린 A는 가노데리올 F 유도체와 함께 PPIASE 활성을 통해 단백질 접힘, 면역 반응, 세포 신호 전달에 중요한 역할을 합니다. 다양한 암에서 상향 조절이 이루어지는 것은 치료의 표적으로서의 잠재력을 시사합니다 ^2,25. 리간드-수용체 상호작용에 대한 지식은 특정 질병을 이해하고 더 효과적인 약물을 개발하는 데 매우 중요합니다. 이 수준의 세부 정보를 달성하려면 빠르고 향상된 분자 시각화가 필요합니다^26,27

토론

SFA 또는 1nmk 분자 수용체라는 새로운 면역억제 천연 물질이 스트렙토마이세스에서 추출되었습니다. 분자 결합 분석을 통해 구축된 리간드와 표적 단백질의 결합 에너지를 측정하였습니다. 연구 결과, 설계된 모든 리간드 중에서 SFA는 구조적으로 CsA와 다르며, Cyp A¹⁶과 상당한 친화성을 보인다는 것을 보여주었습니다. 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성질체 활성을 가진 Cyp A는 외부 수용체에 결합하여 다양한 세포 과정을 조절^합니다. 이 연구는 새로운 Cyp A 억제제와 SFA 1nmk 수용체에 대한 리간드의 친화력 전하를 계산하였습니다. AutoDock 4.2.6의 초기 응용 분야는 단백질 및 핵산 복합체의 결합 메커니즘과 촉매 특성 분석이었습니다.

AutoDock 4.2.6 소프트웨어의 정확도 비율은 약 68

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Autodock	Autodock	v4.2.6	http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFF	CGenFF	v2024	https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch	Chemsketch	v2024	http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal	Cygwin terminal	v3.6.3	http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorial	Gromacs tutorial	v25.04 (Plucky Puffin)	http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools	MGL tools	v1.5.7	mgl tools 1.5.6 rc3
Open babel	Open babel	v3.1.1	http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOL	PyMOL	v3.1.6.1	PyMOL | pymol.org
Ubuntu	Ubuntu	v25.04l	https://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimera	UCSF chimera	v1.19	chimera-1.17.3-win64.exe