Small Extracellular Vesicles에서 MicroRNA의 차세대 염기서열분석을 위한 초고감도 cDNA 라이브러리 준비

요약

세포외 소포체(EV)에는 수용 세포를 조절하는 세포 특이적 microRNA가 포함되어 있으며, 이를 식별하면 바이오마커로서의 기능과 역할을 밝힐 수 있습니다. 당사의 최적화된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜은 Illumina 염기서열 분석기와의 호환성을 위해 쌍단 이중 인덱스 바코드를 사용하는 동시에 시료 다중화 및 저입력 EV의 향상된 처리를 가능하게 하는 고유한 바코드를 도입합니다.

초록

최근 연구에 따르면 모든 생체 유체에서 발견되는 작은 세포외 소포체(sEV)는 단백질, DNA 및 RNA를 채널링하여 세포 간 통신에 중요한 역할을 합니다. sEV에 패키징된 MicroRNA(miRNA)는 수용 세포에서 중요한 전달 조절자로 부상했습니다. 정상 세포와 병든 세포에서 분비되는 sEV는 서로 다른 miRNA 화물을 운반하기 때문에 최근의 sEV-miRNA 프로파일링 연구는 새로운 순환 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 그러나 다양한 생체 유체에서 순환하는 세포/질병 특이적 sEV는 일단 분리되면 일반적으로 기존의 분광 방법론을 사용하여 정량화하기 어려운 낮은 miRNA 양을 제공합니다. 복제된 miRNA 염기서열의 증폭을 가능하게 하는 소형 비코딩 RNA NGS(Next Generation Sequencing)는 sEV의 miRNA 화물을 평가할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 불행히도, 상용 cDNA 라이브러리 준비 절차는 종종 분리된 sEV에서 사용할 수 있는 정량화할 수 없는 양보다 훨씬 높은 RNA 입력을 필요로 합니다.

따라서 기존 cDNA 라이브러리 준비 절차의 견고성과 다중화 기능(즉, 초기에는 저입력, 고도로 분해된 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) RNA 분석에 최적화됨)을 고려하여 sEV miRNA 분석에 대한 적용 가능성을 평가하고자 했습니다. 중요한 점은, 염기서열분석 칩의 최근 기술적 클러스터링 개선을 고려하여, 염기서열분석 및 다중화 기능을 향상시키기 위해 쌍단(paired-end), 이중 인덱스 호환 cDNA 라이브러리 준비 워크플로우 내에서 전사체 바코드 접근 방식을 조정하고자 했다는 것입니다. 16회 반복에서 8.4 × 10⁹ sEV에서 추출한 RNA를 사용하여 10¹⁰ sEV에서 2.5 × 10⁷ sEV로 감소한 sEV를 사용하여 이 방법론의 재현성과 민감도를 평가했습니다. 이 데이터는 16개의 3' 아데닐화된 DNA 바코드를 통해 총 3.15pg의 작은 비암호화 RNA 또는 1.35pg의 miRNA를 사용하여 반복 전반에 걸쳐 sEV-miRNA 프로파일의 재현성이 높고 감도가 높은 검출을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.

서론

작은 세포외 소포체(sEV)는 인지질 이중막으로 둘러싸인 나노 크기(직경 ~30-200nm)의 세포 유래 입자로, 인지질 이중층막으로 둘러싸여 있으며, 이는 기원 세포에서 유전되고 분자 화물을 견고하게 보호합니다 ^1,2. 거의 모든 세포가 sEV를 생산하여 세포간 구획으로 방출하며, 이는 대부분의 생체 유체 (즉, 혈액, 소변, 타액 등)에서 감지 될 수 있습니다 ^{2 , 3 , 4} . 최근 연구에 따르면 안정적으로 캡슐화된 분자 화물(즉, DNA, RNA, 단백질, 지질 등)^5,6,7 sEV는 일단 수용 세포와 접촉하거나 전달되면 세포 간 통신을 매개합니다⁸. 현재 연구 노력은 이러한 분자 화물을 정확하게 식별하고 모니터링하기 위해 다양한 생체 유체에서 세포 특이적 sEV의 격리를 개선하는 데 중점을 두고 있습니다 ^9,10. sEV가 세포 전달 시 조절 기능을 유지하는 작은 비암호화 RNA, 특히 microRNA(miRNA)를 포함한다는 점을 고려할 때, 많은 연구는 기원 세포의 상태를 밝힐 수 있는 바이오마커로서 miRNA의 유용성을 평가하는 데 중점을 두었습니다 11,12,13.

MicroRNA (miRNAs)는 19 및 25 뉴클레오티드 (nt) 사이의 크기를 가진 작은 비 코딩 RNA의 큰 종류 (~ 2,000)를 대표하며, 이는 mRNA 표적의 3 '번역되지 않은 영역에있는 불완전한 상보적 부위에 결합하고 분해 및 / 또는 전사 후 억제를 지시합니다^14,15. 기능적으로, miRNA는 많은 생물학적 과정을 제어하는 것으로 설명되었으며, 그 발현의 탈조절은 암을 포함한 질병의 시작 및 발병에 기여하는 분자, 생화학 및 생리학적 과정의 변화와 관련이 있습니다 16,17,18. 중요한 것은, 연구에 따르면 병든 세포, 특히 암세포는 정상 세포와 비교하여 miRNA를 차별적으로 발현할 뿐만 아니라¹⁸ sEV로의 패키징도 다르다는 것입니다^19,20.

여러 연구가 정상 세포와 질병 세포에서 sEV의 포장을 지시하는 분자 과정과 경로를 규명하는 데 초점을 맞추고 있지만^, 19,21,22 바이오마커 연구는 현재 sEV를 통해 특정 질병/암 세포에 의해 포장되고 분비되는 구별 가능한 작은 비암호화 RNA 및/또는 miRNA 시그니처를 식별하는 데 중점을 두고 있습니다. 따라서 다양한 인간 생체유체에서 병든 세포 특이적 sEV를 표적 분리하고 다중 오믹 분자 화물을 평가하면 다양한 인간 질병 및 암의 비침습적 검출을 위한 진단 및 예후 분석법을 개발할 수 있습니다 23,24,25,26. sEV-miRNA가 가장 많이 연구된 비암호화 전사체이지만, 다른 작은 비암호화 RNA 종(즉, miRNA isoforms(isomiRs), piwiRNA, transfer RNA fragment(tRF), rRNA, orphan non-coding RNA(oncRNA 등)도 다양한 암의 검출에 특히 중점을 두고 순환 sEV-바이오마커로서의 잠재적 유용성에 대해 평가되고 있습니다 27,28,29,30,31,32.

유리하게는, 바코드 및 cDNA 라이브러리 준비 후 작은 비암호화 RNA 전사체(miRNA 포함)의 차세대 염기서열분석(NGS) 분석은 질병과 관련될 수 있는 순환 sEV에 포함된 알려지거나 알려지지 않은 작은 비암호화 RNA 종을 탐색하는 데 이상적입니다²⁷. 실제로, sEV small-RNA NGS는 표적 특이적 기술(즉, 멀티플렉스 PCR, 마이크로어레이, 맞춤형 패널 등)로 전 세계적으로 평가될 경우 알려지지 않은 세포 특이적 소형 비암호화 RNA 전사체의 발견을 위한 고처리량 접근 방식을 제공합니다. 32,33,34. 이전에 고도로 분해되고 저농도 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) RNA^35,36의 분석을 위해 개발한 초민감하고 재현성이 높은 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 최적화한 점을 고려하여 sEV ^37,38,39,40 내에 캡슐화된 작은 비암호화 RNA 및 miRNA의 분석에 적용하려고 했습니다.

수년간 sEV 화물^37,40에 대한 고품질 single-end dual index miRNA 분석을 제공하던 Illumina HiSeq2500 기기가 중단됨에 따라, 우리는 현재 paired-end dual index chemistry를 사용하여 업데이트된 염기서열분석 기기에 적용할 때 프로토콜의 재현성과 감도를 조사하고자 했습니다. 원래 프로토콜의 multiplexing 기능을 유지하기 위해 paired-end dual index chemistry에 통합하기 전에 small-RNA cDNA transcript 준비를 위해 기존 16개의 바코드를 유지했습니다. 한 쌍의 i5 및 i7 바코드만 사용하여 최대 16개의 개별 시료를 동시에 처리하고 분석하여 저입력 sEV RNA의 분석 재현성을 향상시키는 강력한 실험실 기반 cDNA 라이브러리를 준비할 수 있습니다. 따라서 인간 플라즈마 sEV에서 분리된 초소량의 miRNA를 사용하여 재현성이 높은 cDNA 라이브러리를 생성하는 데 필요한 생화학적 프로세스, 업데이트된 바코드, PCR 및 크기 마커 프라이머, 분리 단계를 제시합니다.

프로토콜

1. 모든 시약 및 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 제조됩니다.

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 뉴클레오티드는 이 프로토콜을 구현하는 데 사용되는 농도에서 그림 1 및 보충 파일 1 에 자세히 설명되어 있습니다. 프라이머 염기서열에 대해서는 Supplemental File 2 를 참조하십시오.

1. 다양한 효소 반응에 대한 대조군으로 각 개별 결찰에 사용될 캘리브레이터 칵테일의 스톡 용액을 준비합니다.
   1. 캐리어 올리고뉴클레오티드(0.5μM)(보충 파일 1)를 RNase가 없는 물로 재현탁합니다.
   2. 10개의 캘리브레이터(각 10μL, 보충 파일 1)를 단일 1.5mL 튜브에 결합하여 100μM 스톡에 도달하고, 캐리어 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 희석하여 0.0052nM 용액에 도달한 다음 -20°C에서 보관합니다.
2. 17개의 고유한 어댑터(16개의 실험용 어댑터와 1개의 테스트 바코드 어댑터) 아데닐화된 3' 어댑터(그림 1A)를 각각 50μM 농도의 뉴클레아제가 없는 물로 재현탁합니다.
   참고: 각 어댑터는 -80°C에서 최대 2년 동안 보관하기 위해 2.5μL가 포함된 개별 튜브에 분주되어 더 큰 재고의 동결-해동 주기를 방지합니다.
3. RNA 추출 캐리어(보충 파일 1), RNA 3'-결찰 캐리어(보충 파일 1), RNA 결찰 테스트(보충 파일 1) 및 3' 라이게이션(보충 파일 1; 19 nt-3' 어댑터 및 24 nt-3' 어댑터) 및 5' 라이게이션(5'어댑터-19 nt-3' 어댑터 및 5'어댑터-24 nt-3'어댑터) DNA 크기 마커를 포함한 다양한 실험용 RNA 올리고뉴클레오티드를 250 ng/μL로 재현탁합니다.
4. HPLC 정제 5' 어댑터를 뉴클레아제가 없는 물로 100μM로 희석합니다(그림 1A).
5. RT와 첫 번째 PCR 5' 및 3' RT/PCR 프라이머를 뉴클레아제가 없는 물로 100μM로 재현탁합니다(그림 1B).
6. 두 번째 PCR 5' 및 3' PCR i7 및 i5 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물로 100μM로 재현탁합니다(그림 1B).
   참고: 최대 10회 실험을 위해 각 DNA 프라이머를 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
7. 염료를 주입하는 PAA(PolyAcrylamide denAturing) 겔을 준비하고 1mL를 튜브에 혼합하고 분취한 후 -80°C에서 보관합니다.
   1. 뉴클레아제가 없는 물 50mL에_Na2H2EDTA18.6g을 첨가하여 0.5MNa2H2EDTA 용액을 준비합니다. 준비된 Na₂H₂ EDTA 용액에 NaOH 펠릿을 천천히 첨가하여 8.0의 pH에 도달한다. 0.5 M Na₂H₂ EDTA (pH 8.0) 원액을 얻기 위해 ddH₂O를 사용하여 최대 100 mL의 부피를 구성합니다.
   2. 15mL 튜브에 15mg의 브로모페놀 블루를 계량하고 600μL의 뉴클레아제가 없는 물에 분말을 재현탁하고 14.25mL의 탈이온화 포름아미드를 추가합니다. 마지막으로 0.5 M Na₂H₂ EDTA, pH 8.0 용액 150 μL를 첨가합니다. 최종 PAA 용액을 1mL 튜브에 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
   3. 5x 아가로스 젤 로딩 염료를 준비합니다.
      1. RNase가 없는 물 50mL에 Na₂H_2-EDTA 1.86g을 계량하여 용해시키고 NaOH 펠릿을 첨가하여 pH를 8.0으로 조정합니다. RNase가 없는 물을 100mL에 첨가하여 50mM Na₂H₂ EDTA 용액을 얻습니다.
      2. 50 mM Na₂H₂ EDTA 5 mL에 브로모페놀 블루 20 mg, 자일렌 시아놀 FF 20 mg, 피콜 타입-400 2 g을 첨가한다. 세 가지 염료가 들어있는 튜브를 소용돌이하여 50mM Na₂H₂ EDTA 5mL를 추가로 첨가합니다. 5x 아가로스 젤 로딩 염료의 개별 1mL 튜브를 분취하고 -80°C에서 보관합니다.

2. EV RNA 시료 준비

1. sEV를 분리한 후 투과전자현미경(TEM; 그림 2), 나노 입자 추적 분석(NTA; 그림 3) 및 초고해상도 나노이미징(그림 4) 또는 이에 상응하는 sEV 정량화 기술을 사용한 표면 단백질 분포.
2. 다른 튜브에 동일한 수의 sEV를 분주하고 RNase-A(12.5μg/mL)를 첨가한 다음 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
3. small-RNA 추출 키트를 사용하여 sEV에서 miRNA를 포함한 small non-coding RNA의 추출을 시작하고 RNA 상 분리를 시작합니다.
4. RNA 용해 완충액의 하부 수성상을 분리하여 새 튜브에 추가한 다음 제조업체의 지침에 따라 컬럼 분리를 수행하기 전에 각 RNA 샘플에 4ng의 RNA 운반체 올리고뉴클레오티드(보충 파일 1)를 추가합니다.
5. 각 개별 RNA 샘플을 9.5μL로 고속 진공화하여 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 시작합니다.

3. 16개의 RNA 샘플과 1개의 테스트 샘플이 있는 3' 바코드 어댑터의 결찰을 설정합니다.

1. 16개의 개별 sEV-RNA 검체를 식별하고, 9.5μL의 뉴클레아제가 없는 물에 1.5mL 실리콘 미세 원심분리 튜브에 분취한 다음 실험을 시작하기 최소 10분 전에 얼음 위에 놓습니다.
2. 실험 전에 10x RNA 리가아제 완충액(ATP 없음)을 새로 준비합니다.
   1. 1.5mL 실리콘 튜브에서 343μL의 뉴클레아제가 없는 이중 증류수(ddH₂O), 500μL의 1M Tris pH 7.5, 100μL의 1M MgCl₂, 50μL의 20mg/mL 소 혈청 알부민 및 7μL의 14M 2-메르캅토에탄올을 결합합니다.
   2. 튜브를 튕겨 용액을 섞고 탁상용 원심분리기에서 실온(RT)에서 2,000 ×g 으로 2초 동안 원심분리한 다음 얼음 위에 놓습니다.
      참고: "2초 동안 원심분리기"를 설명하는 모든 단계는 모두 2,000 × g 이하의 속도로 RT에서 마이크로 원심분리기로 수행됩니다.
3. 튜브를 얼음 위에 0.0052분 동안 올려 10nM 캘리브레이터 칵테일을 해동합니다.
4. 40 μL의 10x RNA 리가아제 버퍼, 10 μL의 0.0052 nM 캘리브레이터 칵테일 및 40 μL의 뉴클레아제가 없는 ddH₂O를 결합하여 1.5 mL 실리콘화 튜브에서 18회 반응을 위한 Ligation Master Mix를 준비합니다.
5. 1.5mL 튜브를 빙빙 돌리고 얼음 위에 올려 놓습니다.
6. 개별적으로 분주된 16개의 sEV RNA 샘플 각각에 4.5μL의 결찰 마스터 믹스를 추가하고, 이전에 분주된 100ng의 RNA 결찰 테스트 올리고뉴클레오티드(보충 파일 1)를 9.5μL 부피로 포함하는 테스트 결찰 반응을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 다시 놓기 전에 튜브를 섞고 돌리기 위해 튕깁니다.
7. 16개의 샘플과 테스트 반응을 90°C에서 1분 동안 가열 블록에 옮기고 다시 얼음으로 옮깁니다.
8. 4μL의 50% PEG를 각 튜브에 개별적으로 옮기고, 튜브를 튕겨서 섞고, 빙판에 다시 놓기 전에 튜브를 돌립니다.
9. 17개의 3' 바코드 어댑터(16개의 실험용 어댑터(#1 - #16) 및 테스트 어댑터(#17)) 각각에서 2.5μL 분취액을 해동하고 얼음 위에 올려 해동합니다.
10. 17개의 어댑터 각각을 1개의 sEV-RNA와 1개의 테스트 샘플이 포함된 16개의 샘플로 Ligation Master Mix(즉, 4.5μL) 및 50% PEG(즉, 4μL)를 사용하여 전송합니다.
    참고: 모든 용액과 반응은 재료 손실을 방지하기 위해 용액을 위아래로 피펫팅하는 대신 튜브를 튕기고 회전시켜 혼합됩니다.
11. 새로운 1.5mL 실리콘 튜브에 10μL의 효소와 10μL의 뉴클레아제가 없는 ddH2O를 첨가하여 희석된 T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q 결찰 효소를 준비합니다.
12. 희석된 T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q ligation enzyme 1μL를 17개의 튜브(16개의 실험용 RNA 샘플과 1개의 테스트 RNA 샘플) 각각에 전달합니다. 위아래로 피펫팅하지 말고, 각 튜브 사이의 팁을 변경하고, 튜브를 얼음 위에 두고, 믹스를 플릭하고, 원심분리기를 하고, 튜브를 얼음 위에 놓지 마십시오.
13. 추운 방의 얼음 양동이에 있는 튜브 홀더에 있는 새 얼음 위에 결찰물을 최대 18시간 동안 밤새 놓습니다.

4. 3' 어댑터 결찰 Small RNA의 PAGE 분리

1. 17개의 튜브를 90°C의 열 블록에 1분 동안 올려 T4 RNA Ligase 2를 비활성화하고 얼음 위에 2분 동안 올려 식힙니다.
2. 1 μL의 GlycoBlue와 26 μL의 5M nuclease-free NaCl을 새 튜브에 결합하고 이 침전 용액 1.2 μL를 17개의 튜브 각각으로 옮깁니다.
3. 17개의 튜브 각각에 63μL의 100% 에탄올을 넣고 닫고, 가볍게 치고, 회전한 후 얼음 위에 다시 놓습니다.
4. 16개의 sEV RNA 튜브의 내용물을 단일 1.5mL 실리콘 튜브로 결합하면서 테스트 RNA 연결 튜브는 별도로 유지합니다.
5. 결합된 샘플이 들어있는 튜브를 3번 뒤집어 혼합하고 2초 동안 잠시 원심분리한 다음 얼음 위에 60분 동안 올려 침전시킵니다.
6. 다음과 같이 큰(16 x 20cm²) 15% 폴리아크릴아미드(PAGE) 겔을 준비합니다.
   1. 실리콘화(즉, 실리콘 기반 용액 사용)하고 짧고 긴 유리판을 0.1cm 스페이서로 함께 주조합니다.
   2. 50mL 코니컬 튜브에 시스템 희석제 9mL, 시스템 농축액 18mL, 시스템 완충액 3mL, APS 240μL(9%) 및 TEMED 12μL를 결합하여 15% PAGE 젤 혼합물을 준비합니다.
   3. 30 mL 피펫을 사용하여 유리판 간에 용액을 빠르게 옮깁니다. 겔이 중합되기 전에 14웰 빗(0.1cm 두께)을 넣고 실온에서 30분 동안 젤을 똑바로 세웁니다.
7. 얼음에서 결합된 RNA 샘플이 포함된 튜브를 회수하고 16,000 × g 에서 4°C에서 60분 동안 원심분리합니다.
8. 한편, 빗을 부드럽게 제거하고 싱크대 위의 분무기로 뉴클레아제가 없는 H₂O로 웰을 세척한 후 450V에서 30분 동안 사전 실행하기 전에 상부 및 하부 저장고에 0.5x Tris-Borate EDTA(TBE) 용액으로 채워진 겔 장치에서 15% PAGE를 건조하고 설정하여 15% PAGE 설정을 마칩니다.
9. 원심분리기에서 튜브를 제거하고(단계 4.6) 펠릿을 방해하지 않고 진공 시스템에 연결된 끝에 10μL 비필터 팁이 있는 파스퇴르 피펫을 사용하여 RNA 펠릿을 조심스럽게 건조시킵니다.
10. 20μL의 뉴클레아제가 없는 ddH₂O에 침전된 16개의 RNA 결찰을 포함하는 RNA 펠렛을 재현탁하고 20μL의 PAA 겔 로딩 용액을 추가합니다. 튜브를 튕겨 섞고 2초 동안 원심분리한 다음 얼음 위에 놓습니다.
11. 0.5x TBE의 겔 장치를 새 0.5x TBE로 교체합니다.
12. 20bp RNA 크기 ladder가 있는 튜브, 2개의 3'-ligation short DNA size marker(보충 파일 1) 각각이 있는 튜브 2개, RNA ligation test oligonucleotide(즉, 바코드 어댑터 #17로 ligation)가 포함된 튜브 1개를 설정합니다.
13. 각 튜브(즉, ladder, 3' ligation short DNA oligo 및 RNA ligation test)에 20μL의 PAA gel loading solution을 추가합니다.
14. 16개의 결찰된 RNA 샘플관과 1개의 RNA 결찰 시험관을 90°C에서 1분 동안 설정하고 얼음 위에 다시 놓습니다.
15. 하부 및 상부 저장소 모두에서 0.5x TBE 완충액을 교체하고(즉, 적재 중 웰 간에 교차 오염이 발생하지 않도록 웰 수준 아래에 완충액을 추가) 겔 끝, RNA 테스트 결찰, 16개의 결합된 3' 바코드 RNA 결찰을 포함하는 웰 양쪽에 있는 두 개의 짧은 DNA 크기 마커에 래더를 로드합니다( 그림 5 참조).
16. 냉각 조건(즉, 유리판에 공기를 불어넣는 팬)에서 450V(~35mA)에서 90분 동안 모든 샘플과 함께 15% PAGE 젤을 실행합니다.
17. 유리에서 15% PAGE를 제거하고 SYBR Gold 용액(0.5x TBE 25mL 중 10μL SYBR Gold)을 가볍게 분사한 후 어두운 곳에서 5분 동안 기울어진 상태로 둡니다.
18. 청색광 transilluminator(그림 5)에 겔을 설정하고 19 nt-3' 어댑터와 24 nt- 3' 어댑터 크기 마커 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드를 눈금자로 정렬하고 ligated miRNA 구조체를 포함하는 겔의 영역을 절제합니다(그림 6 은 3' ligation 및 결과 구조체를 표시함). 이와 별도로 RNA 테스트 결찰의 상부 밴드를 절제하며, 이는 다음 날 테스트 5' 결찰에도 사용됩니다.
19. 두 개의 개별 절제된 겔 조각(즉, 16개의 RNA 샘플 및 테스트 결찰용)을 1.5mL 실리콘 튜브로 설정된 다른 0.5mL 겔 브레이커 튜브에 넣고 실온에서 3분 동안 16,000 × g 에서 원심분리한 다음 두 세트의 단편화된 겔 조각을 300μL의 400mM NaCl 용액으로 재현탁하고 튜브를 닫습니다. 파라필름으로 밀봉하십시오.
20. 1,100 °C에서 4 rpm으로 교반하면서 밤새 (16-17 시간) 셰이커에 튜브를 놓습니다.

5. 5' 어댑터의 접합

1. 두 개의 개별 단편화된 겔 및 해당 용액(16 x 3' 바코드 샘플(바코드 #1 - #16) 및 3' 바코드 테스트 RNA(바코드 #17))를 각각 1.5mL 실리콘 튜브로 설정된 두 개의 별도 5μm 필터 튜브로 옮기고 파라필름으로 밀봉한 다음 실온에서 2,300× g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
2. 여과된 각 용액에 950μL의 100% 에탄올을 첨가하고, 튜브를 닫고, 뒤집어 혼합하고, 2초 동안 회전시키고, 파라필름으로 튜브를 밀봉하고, 얼음 위에 1시간 동안 놓습니다.
3. 뉴클레아제가 없는 물 1mL와 DMSO 1mL를 결합하여 50% 수성 DMSO 스톡을 갓 준비하고 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 어두운 곳에서 RT로 보관합니다.
4. 15% PAGE 젤을 준비하고 섹션 4.6에 설명된 단계에 따라 미리 실행합니다.
5. 3' 결찰된 16개의 RNA 샘플과 16,000 × g 에서 4°C에서 60분 동안 테스트 RNA 결찰을 포함하는 튜브를 원심분리하여 결찰된 RNA를 침전시킵니다.
6. RNA 펠릿을 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 진공 건조합니다.
7. 16개의 RNA 샘플의 3' 결찰 펠릿을 재현탁하고 위아래로 피펫팅하지 않고 8μL의 뉴클레아제가 없는 ddH₂O에서 각각 RNA를 테스트합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 혼합하고 RT에서 2초(2,000× g) 동안 원심분리한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
8. 500 μL의 1 M Tris(pH 7.5), 1 M MgCl₂ 100 μL, 50 μL의 20 mg/mL 아세틸화 BSA, 200 μL의 10 mM ATP, 7 μL의 2-메르캅토에탄올 14 M 및 143 μL의 RNase-free 물을 1.5 mL 튜브에 혼합하여 10x RNA 리가아제 완충액(ATP 포함)을 준비합니다.
9. 각 튜브에 2μL의 10x RNA 리가제 완충액(즉, ATP 포함), 1μL의 100μM 5' 어댑터, 4μL의 50% 수성 DMSO를 추가합니다. 플릭하여 혼합하고 RT에서 2초 동안 회전한 다음 튜브를 90°C에서 1분 동안 설정하여 RNA를 변성시키고 얼음 위에 다시 놓습니다.
10. 3μL의 50% DMSO를 추가하고, 플릭하여 혼합하고, 스핀하여 펠릿으로 돌리고, 각 튜브에 3μL의 T4 RNA 리가아제를 추가하고, 튜브를 플릭한 후 RT에서 2초 동안 원심분리한 다음 셰이커의 튜브를 37°C에서 75분 동안 설정합니다.
    알림: 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
11. 20 nt DNA ladder와 5'-ligation size marker long DNA oligonucleotides(보충 파일 1; 5'adapter-19 nt-3' 어댑터 및 5'adapter-24 nt-3' adapter)를 포함하는 두 개의 별도 튜브를 준비하고 각 튜브에 20 μL의 PAA를 추가합니다.
12. 5' 어댑터 결찰이 완료되면 두 접합(즉, 16개의 RNA 샘플 및 테스트 RNA) 각각에 20μL의 PAA를 추가하고, 플릭으로 혼합하고, 스핀다운한 다음 90°C에서 1분 동안 설정한 후 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.
13. 겔 장치의 상부 및 하부 저장소를 비우고 상부 저장소의 웰 수준 아래에 새로운 0.5x TBE 용액을 추가합니다.
14. 5' 결찰된 16 RNA 샘플이 로드될 웰을 둘러싼 웰에 젤 끝, 5' 결찰 테스트 RNA 샘플, 두 개의 크기 마커 긴 DNA 올리고뉴클레오티드(즉, 5' 어댑터-19 nt-3' 어댑터 및 5' 어댑터-24 nt-3' 어댑터)에 래더를 로드합니다(그림 6 은 5' 결찰 및 결과 구조를 표시함). 90볼트에서 450분 동안 젤을 실행합니다.
15. 실행이 완료되면 장치와 유리에서 젤을 제거하고 SYBR Gold 용액(즉, 0.5x TBE 25mL에 SYBR Gold 10μL)을 분사하고 5분 동안 어둠 속에 둡니다.
16. 5' adapter-19 nt-3' adapter와 5'- adapter-24 nt-3' adapter 크기 마커 긴 DNA 올리고뉴클레오티드를 크기 가이드로 사용하여 5' ligated 16 RNA 샘플을 포함하는 겔 섹션을 직접 절제합니다(그림 7).
    참고: 테스트 RNA 결찰은 5' 어댑터의 결찰이 크기 마커와 동일한 크기의 이동을 허용한다는 것을 입증하기 위해 겔에서 평가됩니다. 테스트 RNA 결찰은 겔에서 절제되지 않습니다. 결찰된 16개의 결합된 RNA 샘플만 결합되었습니다.
17. 16개의 결찰된 RNA 샘플이 포함된 절제된 겔 조각을 1.5mL 튜브에 설정된 0.5mL 겔 브레이커 튜브로 옮기고, RT에서 3분 동안 16,000× g 에서 회전한 다음 300μL의 300mM NaCl과 1μL의 100μM 3' RT/PCR 프라이머(그림 1B)를 튜브의 분쇄된 겔 조각에 추가합니다.
18. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 차가운 방에서 밤새(17-18시간) 4°C에서 1,100rpm으로 교반하는 셰이커에 놓습니다.

6. 바코드가 있는 5' 및 3'-결찰된 소형 비암호화 RNA 및 miRNA의 역전사

1. 분쇄된 겔이 들어있는 튜브의 용액을 1.5mL의 실리콘화된 RNase-free 튜브에 삽입된 5μm 필터 튜브에 피펫팅하고 용액이 필터를 통과할 수 있도록 잠시 회전합니다.
2. 이 여과된 용액에 100% 에탄올 950μL를 첨가하고 튜브를 뒤집어 혼합한 다음 2초 동안 회전하고 얼음 위에서 60분 동안 굳힙니다.
3. 튜브를 16,000 × g 에서 4 ° C에서 1 시간 동안 원심 분리하여 RNA 펠릿을 침전시킵니다.
4. 튜브를 회수하고, 펠릿을 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 5.6μL의 뉴클레아제가 없는 H₂O에 재현탁하기 전에 펠릿을 진공 건조합니다.
5. 튜브에 3 μL의 5x 첫 번째 가닥 완충액, 4.2 μL의 10x dNTP(각각 2 mM) 및 1.5 μL의 디티오트레이톨(DTT)을 추가하여 RT 반응을 설정합니다. 튕겨 섞고 2초 동안 돌립니다.
6. 90°C에서 30초 동안 정확하게 반응을 설정한 다음 튜브를 50°C의 블록으로 2분 동안 이동합니다.
7. 용액에 0.75μL의 역전사효소를 첨가하고 플릭하여 혼합한 다음 50°C에서 35분 동안 설정하여 RT 반응을 시작합니다.
8. 튜브를 95°C에서 1분 동안 옮기어 효소와 cDNA/RNA 가닥을 변성시킨 다음 95μL의 RNase-free H₂O를 추가하고 튜브를 튕겨 혼합한 다음 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 이 튜브에는 16개의 RNA 샘플에서 생성된 cDNA가 포함되어 있으며, 각 샘플은 3'로 별도로 바코드가 표시되어 있습니다.

7. PCR 검사 및 대규모 증폭 실시

1. 304 μL의 Nuclease-free H₂O, 125 μL의 2 M KCl, 50 μL의 1 M Tris pH 8.0, 1 M MgCl₂의 10 μL, 5 μL의 1% Triton X-100 및 6 μL의 1 M 2-메르캅토에탄올을 얼음에 보관할 수 있는 튜브에 결합하여 새로운 10x PCR 완충액을 준비합니다.
2. 67 μL의 Nuclease-free H₂O를 10 μL의 10x PCR 완충액, 10 μL의 10x dNTPs, 0.5 μL의 100 μM 5' PCR 프라이머, 0.5 μL의 100 μM 3' PCR 프라이머, 10 μL의 cDNA 재고 도서관의 10 μL를 결합해서 단계 6.8 (위)에서 생성한 cDNA를 위한 파일럿/테스트 PCR 반응을 조립하십시오, 2μL의 50x Taq 중합효소를 새 PCR 튜브에 넣습니다.
   참고: PCR 증폭을 수행하기 전에 다음과 같이 두 개의 다른 파일을 설정하여 기기를 설정합니다: 파일#1의 경우: 45초 동안 94°C, 85초 동안 50°C, 12주기 동안 60초 동안 72°C, 4°C; 파일 # 2의 경우 : 94 ° C (45 초), 50 ° C (85 초), 72 ° C (2 사이클의 경우 60 초), 4 ° C.
3. 파일럿/테스트 PCR 반응의 경우, PCR 반응 100μL를 포함하는 PCR 튜브를 Thermocycler에 넣고 File#1을 실행합니다.
4. File#1이 완료되면 PCR 튜브를 열고 12μL의 반응을 3μL의 5x gel loading dye가 포함된 1.5mL 마이크로 원심분리기로 옮깁니다. 튜브를 닫고 캡에 "12 cycles"라고 씁니다.
5. PCR 튜브를 가져와서 thermocycler에 넣고 File#2를 시작합니다.
6. File#2가 완료되면 PCR 반응 12μL를 3μL의 5x gel loading dye가 들어 있는 1.5mL 튜브로 옮기고 캡에 "14 cycles"라고 씁니다.
7. PCR 증폭을 4회 연속으로 더 반복하고(즉, PCR 주기 각각 2회), 각 증폭이 끝날 때 12μL의 PCR 산물을 옮기고, 차례로 16, 18, 20 및 22 주기로 표시된 4개의 다른 튜브를 얻습니다.
8. 20nt 크기의 ladder와 PCR 증폭 산물 각각을 2.5% 아가로스에 로드하고 120V에서 30분 동안 0.5x TBE에서 겔을 실행합니다.
9. 프라이머 이량체(하부 대역)와 증폭된 cDNA(상부 대역)의 비율과 존재 여부를 기준으로 최적의 PCR 증폭 주기(그림 8A)를 확인합니다.
   참고: 16개 샘플의 총 RNA 입력이 1ng보다 낮을 수 있다는 점을 고려할 때, 프라이머 이량체는 정제된 cDNA보다 더 빠르고 더 많은 양으로 생성물을 생성할 것으로 예상됩니다. 따라서, 적절한 PCR 사이클은 일반적으로 18 내지 22 사이클 사이에서 선택된다. 도 8A에서, 이 라이브러리에 대한 적절한 PCR 사이클은 20이다. 도 8B에서, PCR 구조체의 크기가 상세히 설명되어 있다.
10. 적절한 PCR 증폭 주기가 확인되면 음성 PCR(cDNA 없음) 및 4개의 100μL 양성 PCR 반응(즉, 각각 12μL의 cDNA 포함)을 설정합니다.
    1. PCR 반응의 준비를 단순화하기 위해 292.5 μL의 nuclease-Free H₂O, 45 μL의 10x PCR 완충액, 45 μL의 10x dNTP, 3.25 μL의 3' RT/PCR 프라이머(그림 1B) 및 2.25 μL의 5' PCR 프라이머(그림 1B)를 결합하여 1.5 mL 튜브에 PCR 마스터 믹스(즉, 4.5 반응)를 설정합니다. 이 튜브를 뒤집어 섞고 회전시켜 튜브 바닥에 모입니다.
    2. PCR Master Mix 86μL를 4개의 0.5mL PCR 튜브 각각에 전달합니다.
    3. 12 μL의 cDNA 라이브러리(얼음에 보관)를 추가한 다음 2 μL의 50x 티타늄 Taq 중합효소를 4개의 PCR 튜브 각각에 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    4. 별도의 PCR 튜브에 77 μL의 nuclease-free H₂O, 10 μL의 10x PCR buffer, 10 μL의 10x dNTP, 0.5 μL의 5' PCR primer, 0.5 μL의 3' PCR primer, 2 μL의 50x Taq polymerase를 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 no-template PCR 반응 튜브를 준비합니다.
    5. 7.9단계에서 식별된 PCR 사이클을 사용하여 써모사이클러에 PCR 튜브를 설정하고 필요에 따라 증폭하도록 써모사이클러에 새 프로그램을 설정합니다.
11. 0.5x TBE와 에티듐 브로마이드가 함유된 2.5% 아가로스 겔을 준비하고 각 PCR 튜브에서 12μL를 3μL의 5x 겔 로딩 염료가 포함된 개별 튜브로 옮깁니다.
12. 3 μL의 ladder와 9 μL의 nuclease-free H₂O 및 3 μL의 gel loading dye를 결합하여 20 nt ladder를 준비합니다.
13. 겔을 로드하고 120V에서 30분 동안 실행한 다음 PCR 증폭이 4가지 다른 반응 간에 유사하고 템플릿 없음 대조군이 비어 있는지 확인합니다(그림 8C).
14. 2개의 1.5mL 실리콘화 마이크로 원심분리 튜브(즉, 각각 90μL의 생성물을 포함하는 2개의 튜브) 사이의 4가지 PCR 반응을 결합하고 두 튜브 각각에 18μL의 5M NaCl과 800μL의 100% 에탄올을 추가합니다.
    1. 튜브를 뒤집어 혼합하고 -20 ° C에서 보관하여 밤새 침전시킵니다.

8. PCR 증폭 라이브러리의 정제

1. 혼합 양성 PCR 반응을 포함하는 두 개의 튜브를 16,000 × g 에서 4 °C에서 60 분 동안 원심 분리합니다.
2. 60분 후, 상층액을 제거하고 DNA 펠릿을 진공 건조시킨 후 19.5μL의 1x 완충액에 재현탁시킨 다음 0.5μL의 PmeI 효소를 첨가합니다.
3. PmeI 다이제스트를 37°C에서 2시간 동안 설정하여 인접 웰(즉, 19 nt-3' 어댑터, 24 nt-3' 어댑터) 또는 RNA 운반체(즉, RNA 추출 담체, RNA post-3' 결찰 운반체) 잠재적 오염 물질(즉, 보충 파일 1의 RNA 및 DNA 프라이머에 포함된 PmeI 부위 참조)에서 실행된 DNA 크기 마커를 제거합니다.
4. 0.5x TBE를 사용하여 2.5% 아가로스 겔의 3개의 다른 웰에서 두 개의 다이제스트를 실행하여 단일 웰에 과도한 프라이머 이량체가 축적되어 번짐이 생성되는 것을 방지합니다.
   1. 각 다이제스트에 3μL의 5x gel loading dye를 추가하고, 두 개의 다이제스트를 결합한 다음, 16.5 μL를 인접한 3개의 개별 well에 로드합니다.
   2. 겔의 엔드 웰에 20nt DNA 크기 사다리를 로드하고 150V에서 90분 동안 겔을 실행합니다(그림 8D).
5. DNA 라이브러리를 정제하려면 겔의 인접한 3개 레인에서 상위 PCR 밴드를 절제하고 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
6. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 증폭 라이브러리를 정제하고, 제조업체의 지침에 따라 형광측정기를 사용하여 정제된 DNA 산물을 정량화합니다.

9. 시퀀서와 호환되는 바코드를 추가하기 위한 최종 PCR 증폭

1. 7.1단계에서 설명한 것과 같이 새로운 10x PCR 완충액 혼합물을 준비합니다.
2. 다음과 같이 3개의 튜브 각각에서 첫 번째 PCR 증폭에서 정제된 0.75ng의 PCR 산물을 사용하여 1개의 음성 대조군(앰플리콘 없음)과 3개의 PCR 반응을 포함하여 PCR 반응을 설정합니다.
   1. 75 μL의 ddH₂O, 10 μL의 10x PCR 완충액, 10 μL의 10x dNTPs, 1 μL의 5' 2nd^{PCR 프라이} 머(즉, 프라이머 i503(그림 1B)), 1 μL의 3' PCR 2nd^프라이머 (즉, 프라이머 i702(그림 1B)), 1 μL의 PCR 산물(즉, 겔 정제 1st^{PCR 산} 물에서 0.75ng) 및 2μL의 Titanium Taq 중합효소.
   2. 76 μL의 ddH₂O, 10 μL의 10x PCR 완충액, 10 μL의 10x dNTPs, 1 μL의 5' 2nd^{PCR 프라이}머(즉, 프라이머 i503 (그림 1B)), 1 μL의 3' PCR 2nd^프라이머(즉, 프라이머 i702 (그림 1B))를 혼합하여 음성 PCR 대조군(즉, DNA 템플릿 없음)을 설정하고, 및 2μL의 Taq 중합효소.
   3. 다음과 같이 프로그래밍된 열순환기에서 4개의 PCR 반응(즉, 음성 대조군 1개, 양성 3개)을 설정합니다: 72°C에서 3분, 95°C에서 30초, 95°C에서 10초, 55°C에서 30초, 72°C에서 9사이클, 72°C에서 5분, 최종 유지 10°C.
3. PCR 주기가 완료되면 반응 혼합물 10μL를 취하고 로딩 염료 3μL를 첨가하고 20nt ladder와 함께 그림 9A에 표시된 대로 2.5% 아가로스 겔에서 생성물을 평가합니다.
4. PCR 산물의 크기(즉, 최종 구성에 대한 크기 및 세부 정보는 그림 9B 및 그림 6 에 표시된 바와 같이 164bp에서 실행되는 상위 PCR 대역) 및 밴드 분포를 검증한 후 각 135μL의 PCR 산물(즉, 90μL+ 45μL), 13.5μL의 5M NaCl을 추가하여 PCR 산물을 두 개의 튜브에 결합합니다. 및 650 μL의 100 % 에탄올을 투전하고 밤새 -20 °C에서 침전시킵니다.
5. 다음 날, 2개의 PCR 튜브를 16,000 × g 에서 4°C에서 60분 동안 스핀다운합니다.
6. 각 펠릿을 건조시키고, 19.5 μL의 1x PmeI 완충액으로 재현탁하고, 셰이커에서 37 °C에서 2시간 동안 0.5 μL의 PmeI을 첨가하여 인접한 웰(즉, 19 nt-3' 어댑터, 24 nt-3' 어댑터) 또는 RNA 담체(즉, RNA 추출 담체, RNA post-3' 결찰 담체) 오염 물질에서 실행된 크기 마커를 추가로 제거합니다.
7. 소화된 제품을 2.5% 아가로스 젤의 3개 웰에 넣고 150V에서 90분 동안 분리합니다.
8. 164bp(그림 9C)에서 실행되는 상부 밴드를 절제하고 DNA 분리 키트를 사용하여 DNA 산물을 정제하고 형광계로 정량화합니다.
9. DNA 칩에서 최종 PCR 산물을 실행하여 염기서열분석기를 사용하여 희석 및 분석하기 전에 라이브러리의 크기, 농도 및 순도를 검증합니다.
10. 앞서 설명한 바와 같이 miRNA 분석 전에 인간 게놈에 대한 어댑터 트리밍, 역다중화, 정렬을 위해 FASTQ 데이터 파일을 RNAworld 파이프라인으로 전송합니다⁴¹. 또는 Supplemental File 3에 제시된 스크립트를 사용하여 FASTQ 파일의 읽기를 역다중화하고 선택한 small-RNA 분석 파이프라인을 사용하여 추가 프로세스를 수행합니다.

결과

위의 프로토콜에 자세히 설명된 바와 같이, 최대 16개의 개별 sEV(small extracellular vesicle) RNA 샘플(즉, small non-coding RNA 및 miRNA 분석용)을 동시에 처리하며, 3' 바코딩을 거친 후 단일 라이브러리 내에서 함께 분석합니다. 분석을 위해 선택된 sEV는 Jersey Shore University Medical Center(IRB#Pro2018-0425)에서 삼중 음성 유방암 진단을 받은 여성으로부터 수집한 45mL의 혈장에서 이전에 설명한 바와 같이 초원심분리(^37,40)로 분리되었습니다. 분리 시, 초원심분리된 sEV는 희석, 분취, RNA 추출 및 cDNA 라이브러리 준비 전에 투과 전자 현미경, 나노 입자 추적 분석 및 형광 초해상도 나노 이미징을 사용하여 MISEV2023 지침⁴²에 따라 검증되었습니다. TEM 분석을...

토론

당사는 작은 세포외 소포체(sEV)에서 효율적으로 분리된 microRNA(miRNA)를 포함하여 비코딩 RNA의 재현 가능하고 민감한 차세대 염기서열분석(NGS)을 위한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 개발했습니다. 제한된 수량의 작은 non-coding RNA 및 miRNA가 전 세계적으로 또는 선택적으로 분리된 sEV에서 회수될 수 있다는 점을 고려하여 sEV miRNA 화물의 재현 가능하고 민감한 분석을 가능하게 하는 cDNA 라이브러리 준비 절차를 최적화하고자 했습니다.

sEV-RNA의 효율적이고 선택적인 분리 전 첫 번째 단계로, non-sEV RNA 오염 물질을 제거하기 위해 RNAse-A 처리 단계가 필요합니다. 단백질 결합 RNA 염기서열을 제거할 수 없을 수도 있지만, 구조적으로 손상될 수 있는 sEV에서 RNA를 소화할 가능성도 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 두 번째 단계로, sEV-RNA...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1% 트리톤 X-100	Invitrogen	HFH10
10 mM ATP	앰비온	AM8110G
10x dNTPs	Ambion	AM8110G
10x TBE	Thermofisher Scientific	15581044
14 M Mercaptoethanol	Sigma	O3445I-100
20 nt 사다리	Jena Bioscience	M-232S
20 mg/mL 소 세럼 알부민	시그마	B8894-5ML
50x 티타늄 Taq	클론텍 연구소
639208 과황산 암모늄	피셔 사이언티픽	7727-54-0
블루 라이트 트랜스 일루미네이터- 세이프 이미저 2.0	Thermofisher	G6600
BRL 수직 겔 전기영동 시스템(유리판 및 빗	포함) GIBCO	V16
디메틸 설폭사이드(DMSO)	시그마	D9170-5VL
Eppendorf 마이크로 원심분리기 5424R	USA scientific	4054-4537Q
Eppendorf Thermomixer	USA scientific	4053-8223Q
필터 튜브 5mm 필터	IST 엔지니어링 Inc.	5388-50
Fisherbrand 실리콘화 저잔류 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL	Fisher Scientific	02-681-320
겔 브레이커 튜브 0.5 mL	IST Engineering Inc.	3388-100
젤 전기영동 장치 7 cm x 10 cm- 미니 서브 셀 GT 젤 트레이와 빗	Biorad
Glycoblue	Ambion	AM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 시퀀서	Illumina	20047256
Jersey-Cote (실리콘 기반 솔루션)	LabScientific, Inc	1188
KCl 2 M	Ambion	AM9640G
MgCl2 1 M	Ambion	AM9530G
Minifuge 이중 로터 개인용 원심분리기	USA Scientific	2641-0016
모델 V16 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 장치, 안경, 빗 및 스페이서	Ciore 생명 과학	21070010
올리고뉴클레오티드		중에 정의된
IDT Owl EasyCast B2 미니 전기영동 시스템- 젤 트레이 및 콤 포함	Thermofisher Scientific	B2
Qiaquick 젤 추출 키트	Qiagen	28704
큐비트 형광계	Thermofisher Scientific	Q33238
제한 효소 PmeI 및 10x Cut 스마트 버퍼	NEB	R0560S
역전사효소- Superscript III	ThermoFisher	12574026
RNase-free 물	Ambion	AM9932
Shaker- Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	5385000024
SeaKem LE agarose	Lonza	50002
Superscript III 역방향 전사 키트	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold	Life Technologies	S11494
티타늄 Taq 중합효소	Takara	639208
T4 RNA 리가제 1	NEB	M0204S
T4 RNA 리가제 2 잘린 K227Q	NEB	0351L
TEMED	피셔 사이언티픽	O3446I-100
Themocycler 가열 뚜껑	적용 Biosystem	4359659
Tris 1 M pH 7.5	Invitrogen	15567027
Tris 1 M pH 8.0	Ambion	AM9855G
UltraPure Sequagel 시스템 농축액, 희석 및 완충액	National Diagnostics	EC-833