방법 논문

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화

DOI:

10.3791/67163

⸱

2024년 8월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

효과적인 실시간 이미징 기법은 신경돌기 돌출부를 실시간으로 측정하기 위해 신경 형태를 평가하는 데 매우 중요합니다. 신경돌기 성장의 적절한 측정은 신경 과학 연구 분야에서 수년 동안 오랜 과제였습니다. 이 파라미터는 해리 배양 및 유기형 배양에서 세포주에 이르기까지 수많은 in vitro 실험 설정에서 초석 역할을 합니다. 신경돌기 길이를 정량화함으로써 특정 처리가 효과가 있었는지 또는 다른 실험 그룹에서 축삭 재생이 향상되었는지 확인할 수 있습니다. 이 연구의 목표는 Incucyte Neurotrack 신경돌기 성장 분석 소프트웨어의 견고성과 정확성을 입증하는 것입니다. 이 반자동 소프트웨어는 타임랩스 현미경 시스템에서 사용할 수 있으며, 위상차 이미지에서 신경석 길이를 정량화하는 데 일반적으로 사용되는 방법론에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이 알고리즘은 각 이미지에서 여러 파라미터를 마스킹 및 정량화하고 신경돌기 길이, 분지 점, 세포체 군집, 세포체 군집 면적을 포함한 신경 세포 메트릭을 반환합니다. 첫째, 우리는 소프트웨어의 가치를 피지 플러그인인 수동 NeuronJ의 값과 연관시켜 소프트웨어의 견고성과 정확성을 검증했습니다. 둘째, 위상차 이미지와 면역세포화학 이미지 모두에서 작동할 수 있는 알고리즘을 사용했습니다. 특정 신경 세포 마커를 사용하여 체외 배양에서 감각 뉴런에 대한 형광 기반 신경돌기 성장 분석의 타당성을 검증했습니다. 또한 이 소프트웨어는 개별 세포에서 복잡한 신경 그물에 이르기까지 다양한 파종 조건에서 신경돌기 길이를 측정할 수 있습니다. 결론적으로, 이 소프트웨어는 신경돌기 성장 분석을 위한 혁신적이고 시간 효율적인 플랫폼을 제공하여 더 빠르고 신뢰할 수 있는 정량화를 위한 길을 닦습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

좌골 신경에서는 축삭 재생을 측정할 수 있다1. 또한, 체외 연구는 건강한 뉴런과 손상된 뉴런 모두에서 축삭 발아에서 축삭 변성에 이르기까지 다양한 단계를 이해하기 위해 축삭 돌출 2,3을 모니터링하는 것이 타당하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 과정을 추적하면 축삭 극성, 시작, 안정성 및 분기와 같은 매개변수를 측정할 수 있습니다. 마지막 매개변수는 신경병증성 통증 인식 4,5,6을 이해하는 데 중요합니다. 유사하게, 축삭 변성은 in vivo7 또는 in vitro 8,9를 모니터링할 수 있다. 신경돌기가 자라는 동안, 액틴(actin) 및 미세소관(microtubule) 세포골격 네트워크는 세포(10)의 필요에 따라 안정화되거나 변화한다. 액틴 세포골격은 축삭돌기 성장 원뿔이 형성될 수 있도록 재편성되고, 미세소관은 다발로 재정렬되어 성장하는 신경돌기를 안정화합니다11. in vitro에서 중심 및 말초 뉴런의 신경돌기 성장을 연구하기 위해 세 가지 일반적인 매개변수인 총 축삭 길이, 최대 거리 및 분지 지점이 정량화됩니다. 이러한 파라미터는 치료(즉, 뉴로트로핀, 화합물, 억제제, 레티노산, siRNA, shRNA) 또는 유전자 변형 동물에서 뉴런 성장 반응을 연구하는 데 사용됩니다 12,13,14. 뉴런이 더 길쭉한 신경돌기 및/또는 더 많은 분지를 가지고 있는지 평가하기 위해 이 세 가지 매개변수를 통해 뉴런의 형태를 평가할 수 있습니다. 신경돌기 길이 측정은 여러 in vitro 실험 설정에서 가장 관심 있는 파라미터입니다. 등쪽 뿌리 신경절에서는 주로 두 가지 유형의 배양이 수행됩니다: 해리된 체외 배양 또는 전체 DRG 외식의 유기형 배양. 두 경우 모두 신경돌기 길이는 실험 결과를 평가하기 위한 황금 매개변수입니다. 운동 뉴런 유사 세포주(NSC-34)에서 축삭돌기 성장 및 분지는 레티노산15,16에 의해 유도된 분화 후에 측정됩니다. 실제로, 신경돌기 성장을 측정함으로써, 특정 치료가 효과가 있었는지17, 성장률18 또는 부상 시술 후의 재생 능력19을 결정할 수 있다.

신경돌기 성장을 적절하게 평가하는 방법은 연구 분야에서 수년 동안 많은 도전을 제기했습니다. 그러나 신경돌기 길이 측정에 대한 표준화는 없습니다. 체외 세포 배양을 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 일부는 예를 들어 Fiji18,20 또는 MetaMorph21,23의 수동 NeuronJ 플러그인 및 반자동 Neurolucida 23,24입니다. 수동 방법론 외에도 Fiji25의 NeuriteTracer 플러그인, HCA Vision 소프트웨어26,27 또는 WIS-NeuroMath 2,28과 같은 자동 방법도 있습니다. 정확도가 떨어지는 다른 방법론은 뉴런의 전체 차원 측정에 의존합니다. 이러한 방법에는 세포체로부터 가장 긴 축삭돌기(29)의 끝단까지의 벡터 거리의 측정 또는 숄 분석(30)이 포함된다. 그러나 이러한 측정 방법은 매우 낮은 밀도의 배양 또는 단일 뉴런에 적합합니다. 또한, 이러한 모든 방법론은 주로 유전적으로 인코딩된 형광단(즉, GFP, Venus, mCherry)을 발현하는 염색된 뉴런 또는 뉴런에 활용됩니다. 뉴런의 유형과 세포 배양의 밀도는 측정 방법의 선택에 큰 영향을 미칩니다. 예를 들어, DRG 뉴런과 같이 매우 복잡하고 복잡한 형태를 가진 뉴런을 수동으로 분할하는 것은 쉽게 불가능한 작업이 될 수 있습니다. 뒤얽힌 뉴런이 이미 세분화하기 어려운 경우, 신경망은 매우 복잡한 조직으로 인해 수동 접근 방식을 완전히 사용할 수 없습니다.

한편으로 수동 분할은 인간의 눈과 지능에 의해 수행되기 때문에 매우 정확합니다. 반면에 정말 시간이 많이 걸립니다. 수동 방법에 필요한 시간 낭비가 늘어나는 것이 주요 단점입니다. 이러한 이유로 분석을 위해 몇 개의 뉴런만 획득하므로 정확성이 떨어지고 시간 측면에서 비용이 많이 듭니다. 반면에 자동 또는 반자동 접근 방식은 시간 소비를 부분적으로 줄입니다. 그러나 몇 가지 단점도 있습니다. 자동 분석법이 제대로 작동하려면 훈련을 받아야 하며, 소프트웨어가 사용자와 충분히 상호 작용하지 않으면 세분화가 잘못될 수 있습니다.

신경돌기 성장 측정 외에도 분지 점의 수도 중요한 정보입니다. 수동 분할을 사용하면 브랜치 포인트의 수를 계산할 수 있지만 벡터 거리로는 불가능합니다. 자동 방법의 경우 일반적으로 분기점의 수가 제공되는 반면 Sholl 해석의 경우 수학 공식으로 계산해야 합니다.

이 방법 논문에서는 총 축삭 길이 및 기타 매개변수를 측정하는 이 반자동 소프트웨어의 기능과 효과를 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 기계를 사용하면 정의된 시점에서 이미지를 자동으로 획득하거나 장기 연구(일, 주, 월)를 수행하여 살아있는 세포의 생리학적 환경을 보존할 수 있습니다. 위상차 타임랩스 이미징을 사용하여 신경돌기 성장을 측정하면 신경돌기 역학 및 성장을 지속적으로 모니터링할 수 있는 이점이 있습니다. 또한, 죽은 세포(31,32,33)를 표적으로 하는 특정 염료의 매체에 첨가를 통해 세포 사멸을 모니터링하는 것도 가능하다. 이 소프트웨어는 2012년에 출시되었지만, 당사는 신경돌기 성장의 정확한 정량화를 위해 재현 가능하고 편향되지 않은 방식으로 이 방법론을 표준화한 최초의 기업입니다. 그러나 소프트웨어는 기계 구매에 포함되어 있지 않다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 추가 비용에도 불구하고 그 사용은 총 축삭 길이 및 기타 매개 변수를 측정하는 데 상당한 이점을 제공하여 신경 과학 분야의 연구에 기여합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 기계에서 용기 스캔

참고: 감지는 내장 Basler ace 1920-155 μm 카메라에 의해 수행됩니다.

  1. Connect to Device(장치에 연결)를 클릭하고 Schedule - To Acquire(일정 - 획득)를 선택하여 프로그램을 엽니다. 그런 다음 + 기호를 클릭합니다.
  2. Scan on Schedule(스케줄에 따라 스캔) 또는 Scan Once Now(지금 한 번 스캔) 옵션을 각각 선택하여 선박을 반복적으로 스캔할지 아니면 1회만 스캔할지 지정합니다.
  3. New(새로 만들기)를 선택하여 스캔할 새 용기를 만듭니다. 새 vessel이 추가되지 않은 경우 아래 설명된 옵션 중 하나를 사용하여 새 스캔을 생성합니다.
    1. 현재 스케줄에서 선박을 복사하여 새 선박을 생성하려면 현재 선박 복사 를 선택합니다. Copy Previous(이전 복사 )를 선택하여 이전에 스캔한 선박을 복사하여 새 선박을 생성합니다.
    2. Add Scan(스캔 추가)을 선택하여 추가 스캔을 위해 이전에 스캔한 vessel을 복원합니다.
  4. 분석 및 응용 프로그램에 따라 스캔 유형을 선택합니다. 분석의 경우 표준을 선택합니다.
  5. 스캔 설정을 지정합니다. Cell-by-Cell 옵션(없음), Adherent Cell-by-Cell 또는 Non-adherent Cell-by-Cell 중 하나를 선택하고 사용된 형광 분자에 따라 이미지 채널을 지정합니다. 성인 및 배아 감각 뉴런 배양에 대해 없음(None ) 옵션을 선택합니다. 세포선의 경우 없음(None) 또는 부착 셀별 옵션(Adherent Cell-by-Cell) 옵션을 선택합니다.
  6. 현미경 대물렌즈(4x, 10x, 20x)를 선택합니다. 1차 배양에서는 더 높은 배율(20x)로 획득할 수 있지만 세포주에서는 10x로 충분합니다.
  7. 제공된 옵션에서 스캔할 용기 유형을 선택합니다. 서랍의 가상 지도에서 위치를 선택하여 서랍에서 선박의 위치를 표시합니다.
  8. 스캔할 웰을 선택하여 이미지 획득을 위한 스캔 패턴을 지정합니다. 웰당 원하는 이미지 수를 선택합니다. 예상 스캔 시간이 나타납니다.
  9. 이름을 입력하여 선박에 대한 정보를 제공하고 + 기호를 클릭하여 플레이트 맵을 지정합니다.
  10. 다음을 클릭합니다. Analysis Type(분석 유형)을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. 선택한 옵션의 요약 화면이 나타납니다. 올바른 경우 지금 스캔을 클릭하면 스캔이 시작됩니다.

2. 위상차 이미지 분석을 위한 설정

참고: Neurotrack 분석은 기계가 이전에 획득한 이미지에 대해서만 수행할 수 있습니다.

  1. 분석할 Scanned Vessel 을 선택합니다. 해석 시작을 선택합니다. Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성)을 선택합니다.
  2. Neurotrack을 선택합니다. 이미지 채널을 선택합니다. 분석을 수행할 대표 이미지 세트를 선택합니다. 알고리즘을 훈련시키기 위해 각 웰에 대한 모든 영상을 선택합니다.
  3. 다음 매개변수를 조정하여 분석 정의(Analysis Definition) 설정을 구체화합니다.
    참고: 기본적으로 신경돌기는 자홍색으로 분할되는 반면 세포체는 노란색으로 분할됩니다. 원하는 대로 색상을 수정할 수 있습니다.
    1. cell-body cluster segmentation의 경우 아래 설명된 대로 다음을 조정합니다.
      1. Segmentation mode: 이미지의 segmentation은 세포체를 배경 및 신경돌기와 구별하기 위해 수행됩니다. 밝기와 질감 중에서 선택합니다. 1차 배양 및 세포주의 경우 Brightness mode(밝기 모드)를 선택합니다.
      2. 분할 조정: 슬라이더를 사용하여 더 많은 배경 또는 더 많은 셀에 대한 분할 민감도를 조정합니다. 범위는 0(배경)에서 2(셀)까지입니다. 노란색 마스크의 크기를 늘리거나 줄입니다. 슬라이더를 0(배경) 쪽으로 이동하여 노란색 마스크의 크기가 점차 줄어들고 마젠타 마스크가 들어갈 공간이 남습니다. 슬라이더를 2(셀) 쪽으로 이동하면 반대 현상이 발생합니다.
    2. 정리를 위해 아래 설명된 대로 다음을 조정합니다.
      1. 구멍 채우기(μm2): 사용자가 지정한 영역보다 작은 셀 본체 마스크의 구멍을 제거하려면 이 값을 조정합니다.
      2. 크기 조정(픽셀): 노란색 마스크를 지정된 픽셀 수만큼 늘리거나(양수인 경우) 축소(음수인 경우)합니다. 범위는 -10에서 +10 사이입니다. 이를 조정하여 죽은 세포 및 세포 파편과 같은 고대비 물체에 노란색 분할을 추가하거나 제거합니다.
      3. 최소 세포 너비(μm): 세포체가 신경돌기로 간주되는 크기를 정의하는 값을 선택합니다.
    3. cell-body cluster filters의 경우 아래 설명된 대로 다음을 조정합니다.
      1. 면적 (μm2) : 세포체 면적의 최소값과 최대 값을 설정합니다. 설정 값보다 위와 아래의 값은 세포체로 간주되지 않습니다.
    4. neurite 매개변수의 경우 아래 설명된 대로 다음을 조정합니다.
      1. 필터링: 작은 용기 결함 및 파편의 마스킹을 줄입니다. 없음, 더 좋음, 최상 옵션 중에서 선택합니다. 매우 깨끗한 배양액과 용기에 대해서만 없음 을 선택합니다. 매우 미세한 신경돌기의 검출을 잃는 대신 더 빠른 처리를 위해 Better(더 나은 )를 선택합니다. 두껍거나 대비가 높은 신경돌기가 있는 세포에 충분할 수 있습니다. 또한 결함이나 파편이 많은 선박에 유용할 수 있습니다. 처리 시간이 길어지면 Best(최고 )를 선택하지만 매우 미세한 신경돌기를 감지하기 위해 가장 민감한 필터 설정입니다.
      2. 신경돌기 민감도: 감지 민감도를 조정하는 데 사용합니다. 더 미세한 신경돌기를 감지하기 위해 감도를 높입니다. 범위는 0.25(미만)에서 0.75(이상)입니다.
        알림: 신경돌기를 인식하는 소프트웨어의 감도를 높이거나 낮춥니다. 슬라이더를 0.25(보다 작음)로 이동하면 소프트웨어가 신경돌기를 더 엄격하게 인식합니다. 대신, 슬라이더를 0.75(더 많음)로 이동하면 소프트웨어가 이 감지에서 덜 엄격해지므로 더 많은 결함(즉, 세포 파편, 먼지)은 신경돌기로 간주됩니다.
      3. 신경돌기 너비(μm): 뉴런의 크기에 맞게 감지를 조정하는 데 사용합니다. 1, 2 또는 4가 될 수 있습니다. 이를 늘리면 더 얇은 신경돌기는 고려되지 않습니다. 1차 성인 감각 뉴런 배양의 경우 1로, 세포주 및 배아 감각 뉴런 배양의 경우 2로 설정합니다.
  4. 현재 미리보기(Preview Current)를 클릭하여 분할된 영상을 시각화합니다. 각 이미지에 대해 Neurite Length(mm/mm2), Neurite Branch Points(mm2당), Cell-Body Clusters(mm2당) 및 Cell-Body Cluster Area(mm2/mm2)의 측정값이 제공됩니다.
  5. 선택한 모든 이미지에 대해 2.3단계와 2.4단계를 반복합니다. 다음을 클릭합니다.
  6. 스캔 시간과 분석할 웰을 선택합니다. 정의 이름(Definition Name)을 지정하고, 필요한 경우 분석 메모(Analysis Notes)를 지정합니다. Next(다음) > Finish(마침)를 클릭합니다.

3. 면역세포화학(ICC) 이미지 분석을 위한 설정

  1. 2.1에서 2.4까지 설명된 것과 동일한 단계를 수행합니다. 신경돌기와 핵에 대한 이미지 채널을 선택합니다. 이미지 세트를 선택하십시오. 각 웰에 대한 모든 이미지(All images for each well)를 선택하여 알고리즘을 훈련시킵니다.
  2. 아래 설명된 대로 다음 매개변수를 조정하여 분석 정의 설정을 구체화합니다.
    참고: 기본적으로 신경돌기는 파란색으로 분할되는 반면 세포체는 자주색입니다. 그러나 원하는 대로 색상을 수정할 수 있습니다.
    1. Cell-body cluster segmentation: 이미지를 관심 객체로 분할하는 데 사용합니다. 영상의 모든 픽셀에서 배경 밝기를 추정합니다. 배경을 찾으면 다음 옵션 중 하나를 수행합니다.
      1. 배경 빼기 없음: 원본 사진을 변경하지 않고 분할할 때 사용합니다. 적응형 임계값 또는 고정 임계값 중에서 선택합니다. 적응형: 배경은 객체를 찾는 데 사용되지만 명시적으로 빼지는 않습니다. 이 옵션을 사용하면 임계값 조정(GCU)을 설정할 수 있습니다. Fixed Threshold: 이 임계값보다 밝은 물체가 원본 이미지에서 감지됩니다. 이 옵션을 사용하면 임계값(GCU)을 설정할 수 있습니다.
      2. 배경 빼기: 이 옵션을 사용하면 Top-Hat 변환을 사용하여 이미지에서 배경을 뺀 다음 임계값을 적용합니다. 이 옵션을 사용하여 반경(Radius) 및 임계값(Threshold)을 설정합니다. 반경: 이 반경의 디스크가 사용됩니다. 디스크는 이미지의 어떤 개체에도 완전히 맞지 않을 만큼 충분히 커야 합니다. 임계값: 이 임계값보다 밝은 물체는 배경에서 빼진 이미지에서 감지됩니다.
    2. 정리: 다음 옵션을 사용하여 이 작업을 수행합니다.
      1. 구멍 채우기(μm2): 세포 본체 마스크에서 지정된 영역보다 작은 구멍을 제거할 때 사용합니다.
      2. 크기 조정(픽셀): 보라색 마스크를 지정된 픽셀 수만큼 늘리거나(양수인 경우) 축소(음수인 경우)하려면 이 옵션을 사용합니다. 범위는 -10에서 +10 사이입니다. 죽은 세포 및 세포 파편과 같은 고대비 물체에 보라색을 추가하거나 제거합니다.
      3. 최소 세포 너비(μm): 세포체가 신경돌기로 간주되는 크기를 정의하는 데 사용합니다.
    3. 셀-바디 클러스터 필터: 다음 옵션을 사용하여 필터를 적용합니다.
      1. 면적 (μm2) : 세포체 면적의 최소값과 최대 값을 설정합니다. 설정 값보다 위와 아래의 값은 세포체로 간주되지 않습니다.
    4. Neurite 매개변수: 다음 옵션을 사용하여 설정합니다.
      1. Neurite coarse sensitivity: 신경돌기 밝기를 조정하는 데 사용합니다. 신경돌기의 형광 강도가 낮으면 감도를 높여야 합니다. 범위는 0(적음)에서 10(이상)까지입니다. 덜 밝은 신경돌기를 인식하기 위해 소프트웨어의 감도를 높이거나 낮춥니다. 최적 값의 범위는 7에서 10 사이입니다. 10으로 설정하면 신경돌기 측정에서 배경도 고려될 가능성이 매우 높습니다.
      2. Neurite fine sensitivity: 감지 감도를 조정하는 데 사용합니다. 더 미세한 신경돌기를 감지하기 위해 감도를 높여야 합니다. 범위는 0.25(미만)에서 0.75(이상)입니다. 미세한 신경돌기와 덜 밝은 신경돌기를 인식하기 위해 소프트웨어의 감도를 높이거나 낮춥니다. 슬라이더를 0.25(보다 작음)로 이동하면 소프트웨어는 희미한 신경돌기를 고려하지 않습니다. 대신, 슬라이더를 0.75(더 많음)로 이동하면 소프트웨어는 매우 희미한(거의 배경에 가까운) 신경돌기도 감지합니다.
      3. 신경돌기 너비(μm): 뉴런의 크기에 맞게 감지를 조정하는 데 사용합니다. 1, 2 또는 4가 될 수 있습니다. 이를 늘리면 더 얇은 신경돌기는 고려되지 않습니다. 1차 성인 감각 뉴런 배양의 경우 1, 세포주 및 배아 감각 뉴런 배양의 경우 2로 설정합니다.

4. 데이터 내보내기

  1. 해석을 엽니다. Graph Metrics(그래프 메트릭)를 클릭합니다.
  2. 관심 있는 메트릭(Metric), 타임포인트(Timepoints) 및 웰(Wells)을 선택합니다.
  3. 모두(All), 없음(None), 열(Columns), 행(Rows) 및 플레이트 맵 복제(Plate Map Replicates) 중에서 그룹화 옵션을 선택합니다.
  4. Export Data(데이터 내보내기)를 클릭하고 대상 폴더를 선택하고 필요한 경우 다른 옵션을 선택합니다. .txt 파일이 생성됩니다.
    알림: 기계는 각 웰에 대해 선택한 메트릭의 단일 평균 값을 제공합니다. 수동 주석은 단일 이미지 값을 검색하기 위해 해석 중에 필요합니다.

5. 이미지 내보내기

  1. 용기를 엽니다. Export Images and Movies(이미지 및 영화 내보내기)를 클릭합니다.
  2. 이미지의 내보내기 유형을 선택합니다.
    1. 표시된 대로 이미지를 내보내려면 표시된 대로 선택합니다. Next(다음 )를 클릭하고 내보낼 이미지를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
      1. 단일 영화 또는 이미지 시리즈와 관심 시점 사이의 시퀀스 유형을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
      2. 필요에 따라 내보내기 옵션을 조정하고 다음을 클릭합니다. 출력 폴더, 파일 형식 및 파일 이름을 설정한 다음 내보내기를 클릭합니다.
    2. 저장 시(As Stored)를 선택하여 이미지를 Raw 형식으로 내보냅니다. 이미지 유형을 선택합니다.
      1. 관심 있는 타임포인트 와 웰을 선택합니다. 다음을 클릭합니다. 출력 폴더, 파일 형식 및 파일 이름을 설정한 다음 내보내기를 클릭합니다.
  3. 세분화 마스크를 사용한 이미지 내보내기
    1. 해석을 엽니다. 이미지 레이어 아이콘을 클릭합니다. 원하는 채널 마스크 (Phase Neurite 및 Phase Cell-body Cluster)를 선택합니다. 5.2단계를 따릅니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경돌기 성장 측정 알고리즘은 신경망과 단일 뉴런 모두에서 신경돌기를 검출할 수 있습니다. 세포체, 세포 파편, 죽은 세포, 조직 외엽 및 그림자와 같이 대비가 높은 물체를 분할하는 노란색 마스크를 생성합니다. 또한 마젠타 마스크는 다양한 두께의 신경돌기에 나타납니다. 신경돌기 길이 값은 mm/mm2 단위로 제공되며, 이는 축삭돌기 길이가 이미지 면적(0.282739mm2)으로 나뉘고 모든 스캐닝 조건에 대해 일정함을 나타냅니다. 따라서 신경 돌기 길이의 순수한 값(mm)을 얻으려면 소프트웨어에서 제공하는 숫자에 이미지 면적을 곱해야 합니다.

반자동 대 수동 방법
사용된 소프트웨어는 총 축삭 길이를 측정하는 반자동 방법론입니다. 소프트웨어의 정확성을 평가하기 위해 NeuronJ 플러그인과 함께 수동 방법을 사용하여 동일한 뉴런에 대한 측정도 수행했습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 뉴런의 분할 마스크는 두 방법 간에 매우 유사합니다(그림 1A).

또한 상관 관계를 조사하기 위해 얻은 값에 대한 통계 분석을 수행했습니다. Spearman 상관 분석은 0.8526의 높은 계수 r을 산출하여 알고리즘의 정확성과 정밀도에 대한 강력한 증거를 제공했습니다(그림 1B). 자동 측정은 청결성, 밀도 및 순도를 기반으로 하는 높은 수준의 배양 품질을 필요로 합니다. 반자동 분할로 얻은 결과는 재현 가능하며 개별 판단의 영향을 받지 않습니다. 편향되지 않은 재현성은 수동 방법론의 문제입니다.

경우에 따라 다양한 원인으로 인해 반자동 세분화 오류가 발생할 수 있습니다. 위상차 이미지에서는 배양액의 먼지가 반자동 분할에 의해 신경돌기로 검출될 수 있습니다. 또한, 다양한 세포 유형의 존재는 분할 과정을 방해할 수 있습니다. 이러한 문제는 사람의 눈으로 수행되기 때문에 수동 분할에서는 발생하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 문제가 발생하는 경우 면역세포화학 이미지를 대조군으로 사용하여 극복할 수 있습니다.

신경돌기의 분할
성인 DRG 뉴런 1차 배양의 경우, 신뢰할 수 있는 상 분석을 위한 최적의 시작점은 뉴런을 웰(well)하고 깨끗한 배양액에 균일하게 도금하는 것입니다. 그림 2A-B와 같이 파종 중에 오류가 발생하고 세포가 한 곳에 집중되는 경우 값은 현실을 밀접하게 반영하는 것보다 추정치에 가깝습니다. 이러한 상황에서는 노란색 마스크가 세포 사이에 있는 대부분의 신경돌기를 덮게 되어(그림 2A-B) 신경돌기 길이가 손실됩니다. 더욱이, 이 소프트웨어는 신경돌기를 인식하는 데 크게 편향되어 있으며, 신경돌기가 아닌 물체에 자홍색 마스크가 나타날 가능성이 매우 높습니다(그림 2D). 최적의 이미지에는 20x 배율에서 최대 15개의 뉴런이 있어야 합니다.

그림 3A-B와 같이 뉴런이 올바르게 도팅되고 배양액이 깨끗하면 분할 슬라이더를 배경 쪽으로 조정하는 것이 좋습니다(0.5 - 0.7; 그림 3C). 이렇게 하면 자홍색이어야 하는 분기점과 같이 이미지의 고대비 물체에 나타나는 노란색 구성 요소를 줄이는 데 도움이 됩니다. 더욱이, 신경돌기가 굵은 경우, 0.4에서 0.5 사이의 신경돌기 민감도는 대부분의 신경돌기를 커버하기에 충분해야 합니다(그림 3C-D).

발생할 수 있는 또 다른 일반적인 상황은 그림 4A-B와 같이 많은 세포 파편과 죽은 세포가 있는 더러운 배양입니다. 이러한 조건에는 고대비 물체가 많이 있습니다. 따라서 세분화 슬라이더를 셀 쪽으로 조정하거나 크기 조정 매개변수(+1, +2 등)를 늘려 노란색 마스크의 크기를 늘리는 것이 좋습니다. 그림 4C). 그럼에도 불구하고, 소프트웨어가 신경돌기가 아닌 물체를 신경돌기로 잘못 식별하는 것을 방지하기 위해 신경돌기 민감도를 약간 낮추는 것도 유용할 것입니다. (그림 4C-D).

때때로 그림 5A-B에서 볼 수 있듯이 신경돌기가 매우 얇고 창백하게 보일 수 있으며, 이로 인해 소프트웨어가 신경돌기를 정확하게 분할하는 데 어려움이 있을 수 있습니다(그림 5D). 이 경우 신경돌기 민감도를 0.6 이상으로 높이는 것이 좋습니다(그림 5C). 그러나 민감도가 높을수록 소프트웨어가 신경돌기가 아닌 물체를 잘못 표시할 가능성이 커진다는 점을 명심하십시오(그림 5D). 민감도 편향이 너무 많이 증가하는 것을 방지하기 위해 몇 가지 예방 조치를 취할 수 있습니다(예: 셀쪽으로 세분화 슬라이더를 조정). 그러나 신경돌기가 너무 얇아서 소프트웨어에서 감지할 수 없는 경우 신경돌기 길이 값은 이에 관계없이 편향됩니다.

면역세포화학 이미지의 경우 주요 문제는 배경에 있습니다. 앞서 언급한 규칙이 적용되는 파종 조건 외에도 바이어스의 주요 원인은 형광 자체입니다. 이 소프트웨어는 매우 밝은 신경돌기는 효과적으로 인식하는 반면 더 얇고 덜 강한 신경돌기는 남습니다(그림 6A-B). 신경돌기 길이의 손실을 방지하기 위해 신경돌기의 미세 민감도를 최대 0.75까지 높일 수 있습니다(그림 6C). 그러나 배경의 신경돌기를 고려하여 과도한 검출 편향을 방지하기 위해 신경돌기 거친 민감도를 최소 8-9로 줄이는 것이 좋습니다(그림 6C-D). 후자를 줄이지 않으면 그림 7과 같이 모든 배경이 분할됩니다.

형광 획득의 일반적인 문제는 빛의 산란입니다. 면역세포화학 이미지는 종종 이미지에 손전등을 표시하여 분석의 품질과 정밀도에 큰 영향을 미칩니다(그림 8A-B). 이러한 상황에서는 분석을 개선하기 위해 할 수 있는 일이 많지 않으며 값은 추정치에 가깝습니다. 광 산란은 신경돌기 인식을 방해하여 매우 밝은 신경돌기만 감지됩니다(그림 8C-D). 면역세포화학 이미지의 또 다른 문제는 염색 자체의 품질입니다. 종종 인간의 실수로 인해 축삭이 파괴될 수 있으며(그림 9A), 세척 중에 세포체가 찢어질 수 있습니다(그림 9B). 이러한 실수는 신경돌기 길이 값이 정밀도와 정확성을 잃기 때문에 심각한 문제를 야기합니다. 결과적으로, 생물학적 데이터의 해석이 변경되어 잘못된 결론에 이르게 됩니다.

배아 배양의 경우 상황이 다릅니다. 이러한 유형의 배양에서는 신경교세포(glial cell)의 존재가 우세합니다. 결과적으로, 소프트웨어가 신경교세포(glial cell)의 내벽도 감지하기 때문에 오류가 크게 증가합니다(그림 10A-B). 이 문제를 최소화하려면 세분화 슬라이더를 일반적으로 1.7-2 값 부근의 셀 쪽으로 이동해야 합니다(그림 10C-D). 이 접근법은 대부분의 신경교세포가 노란색 마스크로 덮여 있어 신경돌기 길이 측정에서 고려되지 않도록 합니다. 또 다른 유용한 팁은 신경돌기 너비를 2로 유지하는 것인데, 배양 중인 배아 뉴런은 일반적으로 두꺼운 신경돌기를 가진 양극성 또는 단극성 모양을 나타내기 때문입니다(그림 10C-D). 이 예방 조치는 일반적으로 매우 얇은 신경교세포의 내벽 대부분을 걸러냅니다. 마지막으로, 신경돌기 민감도를 너무 많이 증가시키지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 Neurite 너비 매개변수에 의해 필터링된 항목이 Neurite 길이 측정에 다시 포함됩니다.

신경교세포(glial cell) 성분이 우세한 배아 배양(embryonic culture)의 경우, 면역세포화학(immunocytochemistry)이 더 나은 선택일 수 있습니다. 뉴런을 특이적으로 염색하면 신경교세포가 염색되지 않기 때문에 신경교세포의 분할 문제가 해결되어 분석이 훨씬 쉽고 정확해집니다(그림 11).

마지막으로, 이 소프트웨어는 세포주 및/또는 iPSC의 분화 프로그램을 평가하여 성장 상태를 평가하는 데에도 활용될 수 있습니다. 따라서 유사한 매개 변수 및 예방 조치의 적용은 다른 목표에 사용될 수 있습니다.

분화 과정과 관련하여, NSC-34 세포주(마우스 배아의 척수에서 유래한 마우스의 신경모세포종 세포와 모터뉴런으로 구성된 하이브리드 세포주)에서 모터뉴런과 유사한 세포로 성숙하는 과정에서 소프트웨어의 견고성이 입증되었습니다. DRG 1차 배양의 경우 우수한 분석을 위한 최적의 시작점은 균일한 세포 파종(uniform cell seeding)입니다. 미분화 및 분화된 세포는 레티노산 처리 시 전체 배양 기간 동안 또는 그림 12와 같이 마지막 시점에서 획득을 사용하여 추적할 수 있습니다.

실제로, 이 알고리즘은 신경돌기 길이 외에도 브랜치 포인트 파라미터(branch point parameter)도 제공합니다. 그러나 branch point 매개변수는 branch point의 정확한 수를 나타내지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 오히려, mm/mm2로 표현되는 이미지의 분지화 밀도를 나타냅니다. 이 측정은 배양액의 파편과 파종 농도에 의해 크게 영향을 받습니다. 따라서 이미지에서 뉴런의 밀도와 배양의 청결도는 신뢰할 수 있는 값을 얻기 위한 중요한 요소입니다. 배양액에서 노란색 마스크로 걸러지지 않은 많은 세포 파편이 나타나는 경우, 이러한 파편은 신경돌기 길이와 분지점 측정에 포함됩니다.

결과적으로, 이미지의 뉴런 수가 신경돌기 길이와 분지 점 측정에 영향을 미치기 때문에 세포 수에 대해 이러한 값을 정규화하는 것이 좋습니다.

세포체의 분할
시스템에서 제공하는 모든 파라미터 중에는 cell-body cluster와 cell-body cluster area가 있습니다. 그러나 이 두 매개변수는 셀 계수를 위한 값으로 사용하기에 신뢰할 수 없습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이, 이 소프트웨어는 우물의 중간 움직임으로 인한 그림자를 포함하여 노란색 마스크에서 고대비 물체를 분할합니다. 또한 죽은 세포와 세포 파편을 분절합니다(그림 4). 성장하는 뉴런의 신뢰할 수 있는 세포 수를 얻기 위해 피지의 Cell Counter 도구(그림 13)와 같은 수동 방법을 사용할 수 있습니다.

배양 유형별로 정렬된 제안된 분석 파라미터의 요약은 상 이미지의 경우 표 1 , 면역세포화학 이미지의 경우 표 2 에 나와 있습니다. 또한 특정 문제를 해결하기 위해 제안된 분석 매개변수의 요약이 표 3에 제공됩니다.

figure-results-1
그림 1: 수동 신경돌기 분할과 반자동 신경돌기 분할 간의 상관관계 분석. (A) 왼쪽은 피지에서 NeuronJ 플러그인으로 분할된 뉴런의 대표적인 위상 이미지입니다. 오른쪽에는 뉴런의 대표적인 위상 이미지가 반자동 소프트웨어로 분할되어 있습니다. (B) 20개의 뉴런에 대해 실행된 간단한 선형 회귀를 수동 및 반자동 방법으로 분석했습니다. Spearman 상관 계수 r = 0.8526, p**** < 0.0001. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 성인 감각 뉴런 배양의 시딩 오류. (A) 시드 오류의 대표 위상 이미지. (B) 대표 자동 분할 이미지. 노란색 마스크는 세포체를 분할하고, 자홍색 마스크는 신경돌기를 분할합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 상단 패널: 세포체 군집으로 인한 세포체 분할(노란색 마스크)의 오류를 확대/축소합니다. 하단 패널: 세포 파편으로 인한 신경돌기 분할(자홍색 마스크)의 오류를 확대/축소합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 신경돌기 성장을 위한 이상적인 성인 감각 뉴런 배양. (A) 신경돌기 성장 분석을 위한 이상적인 파종 조건의 대표 위상 이미지. (B) 대표 자동 분할 이미지. 노란색 마스크는 세포체를 분할하고, 자홍색 마스크는 신경돌기를 분할합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 세포체 분할(노란색 마스크) 및 신경돌기 분할(자홍색 마스크)을 확대합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 성인 감각 뉴런 배양에서 신경돌기 돌출 분석의 교란 요소. (A) 매체 움직임으로 인한 세포 파편 및 그림자의 대표 위상 이미지. (B) 대표 자동 분할 이미지. 노란색 마스크는 세포체를 분할하고, 자홍색 마스크는 신경돌기를 분할합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 세포 파편과 움직이는 매질의 그림자로 인한 세포체 분할(노란색 마스크) 및 신경돌기 분할(자홍색 마스크)의 오류를 확대합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 성인 감각 뉴런 배양에서 신경돌기 돌출물 분석의 얇은 신경돌기. (A) 매우 얇은 신경돌기를 특징으로 하는 뉴런의 대표 위상 이미지. (B) 대표 자동 분할 이미지. 노란색 마스크는 세포체를 분할하고, 자홍색 마스크는 신경돌기를 분할합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 상단 패널: 신경돌기 분할(자홍색 마스크)의 검출 한계로 인한 신경돌기 길이의 손실을 확대/축소합니다. 하단 패널: 이물질에 대한 신경돌기 분할(자홍색 마스크) 오류를 확대/축소합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 성인 감각 뉴런 배양에서 신경돌기 돌출물 분석에서 신경돌기의 밝기. (A) 매우 밝고 두꺼운 신경돌기를 특징으로 하는 뉴런의 대표적인 면역세포화학 이미지(뉴런 마커 Tuj1). (B) 대표 자동 분할 이미지. 보라색 마스크는 세포체를 분절하고, 파란색 마스크는 신경을 분절합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 상단 패널: 신경돌기의 두께로 인한 세포체 분할 오류(보라색 마스크)를 확대/축소합니다. 하단 패널: 두꺼운 신경돌기의 강렬한 형광 밝기로 인한 신경돌기 길이의 손실을 확대/축소합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 성인 감각 뉴런 배양에서 신경돌기 성장의 배경 형광 분석. (A) 고배경 형광 잡음의 대표적인 면역세포화학 이미지(신경 마커 Tuj1). (B) 대표 자동 분할 이미지. 보라색 마스크는 세포체를 분절하고, 파란색 마스크는 신경을 분절합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 배경 형광의 간섭으로 인한 신경돌기 분할 오류(파란색 마스크)를 확대합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 성인 감각 뉴런 배양의 신경돌기 성장에서의 광 산란 분석. (A) 광 산란의 대표적인 면역세포화학 이미지(신경 마커 Tuj1). (B) 대표 자동 분할 이미지. 보라색 마스크는 세포체를 분절하고, 파란색 마스크는 신경을 분절합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 상단 패널: 광 산란의 간섭으로 인한 신경돌기 길이의 손실을 확대/축소합니다. 하단 패널: 세포체 분할 오류(보라색 마스크)를 확대/축소합니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-9
그림 9: 성인 감각 뉴런 배양의 신경돌기 돌출 분석을 방해하는 염색 절차의 품질 영향 오류. (A) 왼쪽은 성인 감각 뉴런의 대표적인 위상 이미지입니다. 오른쪽은 염색 절차에서 세척으로 인해 파손된 신경돌기의 대표적인 면역세포화학 이미지(신경 마커 Tuj1)입니다. (B) 왼쪽은 성인 감각 뉴런의 대표적인 위상 이미지입니다. 오른쪽은 염색 절차의 세척으로 인한 세포체 제거의 대표적인 면역세포화학 이미지(신경 마커 Tuj1)입니다. 이미지는 파종 후 48시간 후에 획득되었습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-10
그림 10: 신경돌기 성장을 위한 이상적인 배아(E13.5) 감각 뉴런 배양. (A) 배아 감각 뉴런 배양에서 신경돌기 돌출 분석을 위한 이상적인 파종 조건의 대표 위상 이미지. (B) 대표 자동 분할 이미지. 노란색 마스크는 세포체를 분할하고, 자홍색 마스크는 신경돌기를 분할합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 세포체 분할(노란색 마스크) 및 신경돌기 분할(자홍색 마스크)을 확대합니다. 이미지는 파종 후 24시간 후에 획득했습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-11
그림 11: 신경돌기 성장을 위한 이상적인 배아(E13.5) 감각 뉴런 배양. (A) 신경돌기 성장을 위한 이상적인 배아 감각 뉴런 배양의 대표적인 면역세포화학 이미지(뉴런 마커 Tuj1). (B) 대표 자동 분할 이미지. 보라색 마스크는 세포체를 분절하고, 파란색 마스크는 신경을 분절합니다. (C) 예시적인 신경돌기 돌출 분석 정의 매개변수. (D) 세포체 분할(보라색 마스크) 및 신경돌기 분할(파란색 마스크)을 확대합니다. 이미지는 파종 후 24시간 후에 획득했습니다. 배율 20x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-12
그림 12: 분화된 NSC-34 세포는 미분화 대조군에 비해 신경돌기와 분지가 증가했습니다. NSC-34 세포의 대표 이미지. 상단 패널: 미분화 NSC-34 셀(대조군). 하단 패널: 96시간 레티노산 처리 후 분화된 NSC-34 세포. 두 패널의 왼쪽에는 위상차 이미지가 있고 두 패널의 오른쪽에는 자동으로 분할된 이미지(노란색은 소마, 자홍색은 신경돌기)가 있습니다. 이미지는 파종 후 96시간 후에 획득되었습니다. 배율 10x. 눈금 막대, 50 μm. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-13
그림 13: 피지의 세포 계수기 도구. 신경돌기 성장(neurite outgrowth) 분석을 위한 이상적인 파종 조건의 위상 이미지에서 수행된 수동 세포 계수. 배율 20x. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

문화의 유형성인 DRG 문화(단계)배아 DRG 배양(단계)NSC-34(위상)
확대20배20배10배
세그멘테이션 모드밝기밝기밝기
세분화 조정0.5 - 0.71.7 - 21
크기 조정(픽셀)0, +1, +20, +10
필터링제일제일제일
신경돌기 민감성0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
신경돌기 폭122

표 1: 위상차 이미지에서 성인 감각 뉴런 배양, 배아(E13.5) 감각 뉴런 배양 및 NSC-34 배양에 대해 제안된 분석 정의 매개변수 요약.

문화의 유형성인 DRG 문화(ICC)배아 DRG 배양(ICC)
확대20배20배
세그멘테이션 모드밝기밝기
세분화 조정0.5 - 0.71.7 - 2
크기 조정(픽셀)0, +1, +20, +1
필터링제일제일
Neurite Coarse Sensitivity(신경돌기 거친 민감도)8 - 98 - 9
Neurite Fine Sensitivity(신경돌기 미세 민감성)최대 0.750.5 - 0.75
신경돌기 폭12

표 2: 면역세포화학 이미지에서 성인 감각 뉴런 배양, 배아(E13.5) 감각 뉴런 배양 및 NSC-34 배양에 대한 제안된 분석 정의 매개변수 요약.

출판하다제안
더러운 문화셀에 대한 세분화 슬라이더 조정
크기 조정 매개변수 증가(+1,+2...)
신경돌기 민감도가 약간 감소합니다.
창백하고 얇은 신경돌기신경돌기 민감도 증가(최소 0.6)
셀을 향해 세그먼트 슬라이더를 조정합니다.
ICC의 얇은 신경돌기미세 신경돌기 민감도 증가(최대 0.75)
신경돌기 굵은 민감도 감소(최소 8-9)
신경교세포(Glial cells)셀에 대한 세분화 슬라이더 조정(1.7-2)
신경돌기 너비 2

표 3: 다양한 유형의 문화권에서 특정 문제를 해결하기 위해 제안된 분석 정의 매개변수의 요약.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

건강, 부상 및 질병 상태에서 뉴런이 어떻게 성장하는지 정확하게 측정하는 것은 신경 과학 분야의 많은 실험 설정에서 중요한 매개 변수입니다. 전체 DRG 외식의 유기형 배양액을 사용하든 해리되지 않은 배양물을 사용하든, 축삭돌기 성장을 적절하게 측정하는 것은 지난 20년 동안 중요한 과제였습니다. 신경돌기 성장에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 정량화가 없다면, NSC-34 세포(34)에 대한 레티노산(4일간) 또는 배아 DRG 뉴런(14,35)에 대한 뉴로트로핀(1-2일간)과 같은 특정 치료가 효과적이었는지 평가할 수 없다. 뉴런은 일반적으로 건강할 때 지속적인 성장을 보입니다. 그러나 부상 후에는 축삭 성장 속도가12,13 증가합니다. 타이밍은 축삭 성장을 측정할 때 매우 중요합니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 성장 속도 안정 곡선을 기반으로 세포를 고정하기 위한 최적의 시기를 결정하기 위한 시험 테스트를 수행하는 것이 필수적입니다.

수동 또는 자동 방법의 선택은 시간 소비와 정확성 측면에서 분수령이 됩니다. 가장 일반적인 수동 방법으로는 NeuronJ18,20 및 Metamorph (Visitron) 2,22,28이 있습니다. 수동 방법은 사용자가 수동으로 신경돌기를 추적해야 하며, 이는 시간이 많이 걸리고 단일 세포 이미지가 필요합니다. 신경돌기의 수동 분할을 사용하면 신경망은 완전히 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 일반적으로 이러한 방법론은 가장 긴 축삭만 측정하거나 벡터 거리 측정을 사용하므로 분기 점의 수 및 총 축삭 길이와 같은 중요한 정보가 손실됩니다. 숄 분석(Sholl analysis)(30)에 의해 다소 개선이 제공되는데, 이는 어쨌든 단일-셀 조건으로 제한된다. 단일 세포 분석은 세포 파종부터 시작하여 몇 가지 문제를 제시합니다. 뉴런은 매우 낮은 농도로 도금되어야 하며, 이는 모든 세포 유형에 가장 적합한 성장 조건이 아닐 수 있습니다. 또 다른 문제는 이미지 획득에서 발생합니다. 일반적으로 컨포칼 현미경은 숙련된 사용자와 형광 뉴런이 필요한 이미징에 사용되며 시간이나 비용 효율적이지 않습니다. 컨포칼 현미경을 사용하면 고해상도 이미지를 얻을 수 있지만 각 실험에서 이미지화되는 뉴런은 거의 없습니다. 이는 적절한 수의 뉴런에 도달하기 위해 더 많은 생물학적 복제가 필요하기 때문에 한계를 나타냅니다.

NeuroMath 2,28과 같은 일부 자동 방법론은 자동 방식으로 수행되는 시간 소모적인 신경돌기 분할 문제를 해결합니다.

그러나 시간 제약으로 인해 이 신경돌기 돌출 측정 모듈은 타임랩스 현미경 기계에서 이미지를 획득할 때 더 빠른 결과를 제공합니다. 후자는 이 소프트웨어와 함께 학생과 수석 연구원 모두의 시간과 비용 효율성을 크게 향상시킵니다.

획득 기계를 사용하면 우물의 직경에 따라 다양한 수의 이미지를 획득하여 우물의 매우 완전한 지도를 만들 수 있습니다. 이는 여러 뉴런이 동시에 이미지화되기 때문에 상당한 이점이 있습니다. 그러나 20x 배율에 도달하는 것만으로도 충분하며 소프트웨어로 이미지를 분석하기에 적합합니다. 그 힘은 일련의 이미지를 훈련하고 총 축삭 길이의 반자동 측정을 수행하는 능력에 달려 있습니다. 또한 이 소프트웨어는 단일 뉴런과 뉴런 네트워크 모두에서 작동할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 두 개의 서로 다른 마스크로 신경돌기와 세포체를 분할할 수 있습니다. 노란색 마스크는 세포체, 세포 파편, 그림자와 같은 이미지의 모든 고대비 개체를 분할합니다. 대신 자홍색 마스크는 신경돌기를 분절합니다. 소프트웨어의 정밀도와 정확성은 소프트웨어와 NeuronJ를 사용하여 동일한 뉴런을 분할함으로써 입증되었습니다. 통계적 분석의 관점에서 볼 때, 신경돌기 길이의 값은 높은 Spearman 상관 계수와 좋은 상관 관계가 있습니다.

방법의 신뢰성을 평가한 후 다양한 테스트 조건의 분석으로 이동했습니다. 최적의 분석을 위해서는 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 첫째, 뉴런은 세포 농도가 높은 지점을 피하고 우물에 균일하게 파종되어야 합니다. 뉴런이 군집화되면 소프트웨어가 신경돌기의 검출 정밀도를 잃게 됩니다. 분석의 정확성과 정밀도에 영향을 미치는 또 다른 변수는 배양물의 청결성입니다. 세포 파편과 죽은 세포가 거의 없는 깨끗한 배양이 바람직합니다. 그러나 이 소프트웨어는 신경돌기 민감도(neurite sensitivity)와 세포체 분할 마스크(cell body segmentation mask)의 조절을 통해 이러한 문제를 보상할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이 노란색 마스크는 고대비 물체를 분할하며, 그 중에는 우물 내 매체의 움직임으로 인한 그림자도 있습니다. 그림자는 신경돌기를 덮을 수 있으며, 이로 인해 신경돌기 길이가 손실될 수 있습니다. 그러나 이러한 문제는 이미지 획득 전에 매체가 안정되도록 함으로써 쉽게 해결됩니다.

이 알고리즘은 위상차 이미지와 면역세포화학 이미지 모두에서 신경돌기 길이 정량화를 수행할 수 있습니다. 형광이 관련된 경우 신뢰할 수 있는 분석을 얻기 위해 다른 예방 조치를 취해야 합니다. 첫째, 염색의 품질은 분석 결과에 큰 영향을 미칩니다. 세척 중에 신경돌기가 파괴되거나 분할되어 세포체가 찢어지면 분석의 강도와 신뢰성이 떨어집니다. 또한 형광 자체는 분석에 잠재적으로 방해가 될 수 있는 요소를 나타냅니다. 초점이 기계에 의해 자동으로 수행되기 때문에 대물렌즈는 인공물, 세포체 또는 두꺼운 신경돌기와 같은 매우 밝은 물체에 초점을 맞춥니다. 그 결과, 더 얇고 덜 밝은 신경돌기가 남게 되어 사용자가 신경돌기 길이를 제대로 측정하기 어렵게 됩니다.

결과적으로, 위상 이미지의 분석은 면역세포화학 이미지의 분석에 비해 더 근거가 있을 수 있습니다. 이 소프트웨어는 가장 복잡하고 정교한 것부터 가장 단순한 것까지 단일 세포 또는 신경 네트워크에서 다양한 신경 세포 형태에 대해 작업할 수 있습니다. 따라서 다양한 발달 단계의 중추 또는 말초 신경계에서 유래하는 뉴런의 1차 배양부터 iPSC 유래 뉴런 및 NSC-34와 같은 세포주에 이르기까지 다양한 연구 분야에서 활용될 수 있습니다.

소프트웨어의 상당한 잠재력에도 불구하고 몇 가지 제한 사항이 나타날 수 있습니다. 첫째, 세포체 분할의 정밀도가 최적이 아닙니다. 결과적으로, 세포체 클러스터 및 세포체 클러스터 영역과 같은 파라미터는 세포 계수에 안정적으로 사용할 수 없습니다. 둘째, 최적의 신경돌기 분할을 위한 필요한 예방 조치 외에도 불충분하게 두꺼운 축삭돌기는 신경돌기 길이 측정에서 제외될 수 있으며, 이로 인해 데이터 손실이 발생할 수 있습니다.

branch point 매개 변수에는 두 가지 유형의 세분화와 관련된 문제가 발생합니다. 브랜치 포인트에 국한된 배양물의 그림자, 죽은 세포 또는 파편은 세포체 분할에 의해 덮일 때 이를 모호하게 만듭니다. 더욱이, 얇은 신경돌기의 경우, 브랜치 포인트 파라미터의 신뢰성이 다시 심각하게 손상됩니다.

또한 이미지 획득 중 자동 초점이 때때로 최적이 아닐 수 있습니다. 기계의 최대 배율은 20배로 제한되며, 이는 신경돌기와 같은 가느다란 구조의 미세한 세부 사항이나 형광을 관찰하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 이 기계는 균일한 플라스틱 기판에서 가장 잘 작동합니다. 유리 커버슬립을 웰에 삽입하면 유리에 대한 초점이 흐려져 이미지가 부분적으로 흐려질 수 있습니다. 그러나 이 소프트웨어는 뉴런뿐만 아니라 곰팡이 성장(fungal growth)과 같은 완전히 다른 연구 분야에도 적용된다36.

모든 것을 고려할 때, 우리는 이 신경돌기 돌출 측정 모듈이 신경돌기를 빠르고 편향되지 않고 효율적으로 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 도구라고 믿습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이 연구가 잠재적으로 이해 상충을 일으킬 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 수행되었다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

비판적인 의견을 제시해 주신 Alessandro Vercelli와 도움을 주신 Sartorius의 기술 지원에 감사드립니다. 이러한 주제에 대한 우리의 연구는 Rita-Levi Montalcini Grant 2021(MIUR, 이탈리아)의 아낌없는 지원을 받았습니다. 이 연구는 신경과학과 Rita Levi Montalcini에 Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR 프로젝트 Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027의 자금 지원을 받았습니다. D.M.R.의 연구는 지속 가능한 개발 및 기후 변화에 대한 이탈리아 국립 대학 간 박사 과정(링크: www.phd-sdc.it)의 지원으로 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Collagenase AMerck / Roche10103586001
Dispase II (중성 프로테아제, 등급 II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco의 변형된 독수리 매체Merck / SigmaD5796
Fetal bovin serum Merck / SigmaF7524
Ham's F-12 영양 혼합물 (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 w/ L-GlutamineEurocloneECM0135L
Hanks' Balanced Salt SolutionEurocloneECM0507L
HBSS (10X), 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드ThermoFisher Scientific14185045
HyClone 특화 소 태아 혈청(미국)CytivaSH30071.03
Incucyte, 뉴로트랙 분석 소프트웨어 Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
라미닌 마우스 단백질, 천연ThermoFisher Scientific23017015
L-CysteineMerck / SigmaC7352
Leibovitz의 L-15 medium w/o L-glutamineEurocloneECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Neurobasal Medium [-] 글루타민ThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (캐나다 온타리오)CLU140
파파야 라텍스 파파인SigmaP4762
페니실린-스트렙토마이신(5,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( 밀도 1.130 g/mL)Cytiva17089101
Poly-D-Lysine 용액 (1mg/mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Poly-L-Lysine 용액 (0-01%)SigmaP4832
재조합 인간 NT-3PeproTech450-03
레티노산Merck / SigmaR2625
Trypsin-EDTA 용액SigmaT3924
β-Tubulin III (Tuj1) 항체Merck / SigmaT8660
없음

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741(2020).
  17. Kim, H., Caspar, W. T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901(2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463(2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960(2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9(2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567(2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174(2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00719 (2019).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문