방법 논문

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

1.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

2024년 9월 20일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

초록

재생 생체 재료는 세포와 물질의 상호 작용을 촉진하여 손상된 조직과 장기의 복구를 안내하도록 설계되었습니다. 이러한 물질은 천연 조직의 생물물리학적 특성을 모방하도록 설계되어 재생 조직 틈새의 복원에 기여하는 세포 표현형 및 형태학적 지침을 제공합니다. 널리 퍼져 있는 세포외 기질 단백질인 콜라겐은 생체 적합성 및 기타 유리한 특성으로 인해 이러한 재생 생체 재료의 일반적인 구성 요소입니다. 현재 연구는 지시된 피브릴 패터닝을 통해 엔지니어링된 나노피브릴 콜라겐을 제작하기 위한 새롭고 간단한 방법을 설명합니다. 전단 응력, 온도 및 pH의 조작을 통해 콜라겐 섬유형성 및 정렬이 특수 장비 없이 정밀하게 제어됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 이방성 또는 등방성 특성을 나타내는 조직의 기본 구조를 모방하는 나노섬유림 콜라겐 생체 물질을 만들 수 있습니다. 콜라겐 나노피브릴 패터닝의 유연성은 세포 거동에 대한 나노 스케일 패터닝 연구를 용이하게 할 뿐만 아니라 패터닝된 조직 공학 응용 분야에 다양한 가능성을 제공합니다.

서론

재생 의학의 목표는 공학적 치료제의 적용을 통해 조직 재생과 치유를 향상시키는 것입니다. 한 가지 접근 방식은 천연 조직의 구성과 구조를 밀접하게 모방하는 생체 재료 구조를 제작하는 것입니다. 이러한 구조를 설계할 때 중요한 고려 사항은 세포 증식, 이동 및 분화에 대한 교육 단서를 제공하여 궁극적으로 조직 재생을 주도하는 네이티브 기저 세포외 기질(ECM)입니다 1,2. 천연 ECM은 주로 섬유소 콜라겐 3,4로 구성되어 있습니다. 골격근 및 힘줄과 같은 고도로 조직화된 조직에서 이러한 ECM은 정렬된 패턴을 나타내며, 이는 조직 전체의 힘 전달과 운동 기능을 지원하는 데 중요합니다 5,6.

조직 공학 응용 분야를 위한 생체 재료로서의 콜라겐의 유용성은 우수한 생체 적합성, 생분해성 및 세포 친화성을 나타내기 때문에 천연 조직에 널리 보급되는 것 이상으로 확장됩니다 7,8,9. 콜라겐 기반 생체 재료 개발의 최근 발전은 특정 조직 재생에 필수적인 기계적 및 생화학적 단서를 더 잘 안내하기 위해 생물물리학적 특성을 개선하는 데 중점을 두었습니다. 체외에서 섬유소 구조를 가진 콜라겐 생체 재료를 만드는 것은 산성 콜라겐 분자가 따뜻한 온도와 중성 pH10,11에 노출될 때 나노 피브릴로 자체 조립될 수 있기 때문에 비교적 간단합니다. 그러나 유도 조작이 없으면 이러한 원섬유는 무작위 네트워크로 형성되어 이방성 조직 공학 응용 분야에 적합하지 않게 됩니다. 정렬된 피브릴을 생성할 수 있는 기술에는 전기방사 및 습식 방사가 포함되며, 다른 용액 압출 기술(12,13), 동결 건조(14), 전기화학적 또는 자기 제조(15,16), 전단 유동 증착(17), 유동 유도 결정화(18), 겔-압출(19), 변형 유도 정렬(20) 및 유체 조작을 통한 힘 유도 정렬(force-guided alignment)이 포함됩니다 흐름 21,22. 그러나 이러한 방법 중 다수는 콜라겐과 호환성이 높지 않거나, 마이크로 규모에서는 정렬을 생성하지만 나노 규모에서는 생성하지 않거나, 정렬 및 안정성을 유도하기 위해 추가 후처리 단계가 필요하거나, 고도로 전문화된 장비 및 시약이 필요하여 광범위한 채택이 어렵습니다.

현재 연구는 주사기 펌프나 전기 스피너와 같은 특수 장비 없이 정렬 또는 무작위 배향의 피브릴 패터닝을 사용하여 나노 섬유소 콜라겐 제조를 위한 손쉬운 전단 기반 방법을 제시합니다. 이 기술은 콜라겐 섬유형성의 pH 의존성을 활용합니다. 중화 완충액 내에서 산성 단량체 콜라겐에 전단력을 가하면 전단 방향을 따라 정렬된 섬유형성이 촉진됩니다. 마찬가지로, 콜라겐은 전단이 없는 상태에서 섬유형성을 겪도록 유도될 수 있으며, 이는 무작위 패턴을 가진 섬유를 생성합니다. 정렬되거나 무작위로 패턴화된 나노섬유소콜라겐으로 구성된 결과 3D 콜라겐 스트립은 세포 행동에 대한 나노스케일 패터닝의 영향을 연구하는 도구 역할을 할 수 있습니다. 또한 이방성 및 등방성 조직 공학 응용 분야에 다양한 가능성을 제공합니다 23,24,25,26,27. 패터닝은 관심 있는 네이티브 조직의 구조와 일치하도록 맞춤화될 수 있습니다. 콜라겐 스트립은 또한 다양한 크기와 모양의 부상에 이식된 엔지니어링 치료제 역할을 하기 위해 다양한 크기의 다발로 결합될 수 있습니다.

프로토콜

1. 투석된 콜라겐의 준비 (그림 1)

  1. 투석 튜브를 약 3인치 길이로 자릅니다. 32mm 평면 너비, 20mm 팽창 직경 및 4.8nm 공극 크기 사양의 튜브를 사용하십시오.
  2. 투석 튜브를 초순수로 재수화하십시오.
  3. 튜브의 한쪽 끝을 투석 튜브 클립으로 끼웁니다.
  4. 5G 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 5-6mL의 쥐꼬리 콜라겐 유형 I(농도: 0.02N 아세트산에 9-10mg/mL)을 튜브에 옮깁니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 잘라 닫습니다.
  5. 유리 접시 바닥에 0.5-1cm 두께의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 플레이크 층을 놓고 PEG 층 위에 콜라겐으로 채워진 투석 튜브를 놓습니다.
    알림: 13인치 x 9인치 x 2인치 유리 접시는 일반적으로 4-5개의 콜라겐으로 채워진 튜브를 수용할 수 있습니다. 접시 크기는 필요한 콜라겐의 양에 따라 조정할 수 있습니다.
  6. PEG 플레이크를 더 추가하여 튜브를 완전히 덮고 트레이를 4°C 냉장고에 넣습니다.
  7. 10-15분마다 투석 튜브 표면에서 젖은 PEG 플레이크를 제거하고 튜브를 새로운 건조 PEG로 다시 덮습니다. 접시를 4°C 냉장고에 다시 넣으십시오.
  8. 1.7단계를 두 번 더 반복하고 30-35분 후 수돗물을 사용하여 젖은 PEG 플레이크를 헹굽니다.
  9. 초순수를 사용하여 튜브를 한 번 더 헹구고 티슈로 튜브를 두드려 건조시킵니다.
  10. 튜브의 한쪽 끝을 풀고 투석된 콜라겐(최종 농도: ~30mg/mL)을 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 미니 원심분리기(2,000 x g, ≤30초, 실온[RT])를 사용하여 콜라겐의 기포를 잠시 회전시키고 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관합니다.
  11. 사용하기 하루 전에 콜라겐을 주사기에 넣으십시오.
    1. 16게이지 바늘을 사용하여 투석된 콜라겐 ~1mL를 1mL 주사기에 넣습니다.
      참고: 콜라겐은 점성이 있는 물질입니다. 더 많은 콜라겐을 끌어내기 전에 바늘 머리에 콜라겐을 미리 로드해야 할 수도 있습니다. 바늘 머리를 제거하고 필요에 따라 큰 공기 주머니를 배출합니다.
    2. 바늘을 제거하고 주사기 헤드를 파라필름으로 감쌉니다.
    3. 콜라겐으로 채워진 주사기를 4°C에서 하룻밤 동안 똑바로 세워 보관하여 작은 기포가 터질 수 있도록 합니다.

2. 유리 칩의 준비 (그림 1)

주의: 프로토콜의 이 부분에 대해 보안경을 사용하십시오.

참고: 특수 코팅된 소수성 유리 슬라이드는 세포 배양 실험에 사용됩니다. 슬라이드는 표면 코팅이 제거되지 않도록 가장자리로 처리해야 합니다. 적절한 절단면에서 유리 절단 절차를 수행하십시오.

  1. 영구 마커를 사용하여 유리 칩의 원하는 치수를 측정하고 표시합니다.
    1. 8줄 비계를 만드는 경우 슬라이드의 긴 가장자리를 따라 약 1cm 단위로 표시합니다. 원하는 스캐폴드 크기에 따라 필요에 따라 치수를 조정합니다.
  2. 직선 가장자리(즉, 6웰 플레이트 가장자리)를 사용하여 유리 절단기를 첫 번째 측정 길이 아래로 미끄러지듯 내려 유리에 점수를 매깁니다.
  3. 슬라이드는 점수가 매겨진 라인을 따라 자체적으로 끊어지거나 슬라이드를 티슈 위로 뒤집고(소수성 면이 아래로) 점수가 매겨진 영역에 수동으로 압력을 가합니다.
  4. 소수성 유리 슬라이드의 코팅된 면을 에탄올 마커 펜을 사용하여 표시합니다.
  5. 유리 칩을 초순수로 헹구어 잔류 유리 먼지를 제거합니다.
  6. 가압 공기용 탁상형 노즐을 사용하거나 흄 후드에 비스듬히 쌓아 유리 칩을 건조시킵니다.
  7. 필요한 칩 수에 대해 필요에 따라 반복합니다. RT에 칩을 보관하십시오. 최상의 세포 배양 결과를 얻으려면 7일 이내에 준비된 칩을 사용하십시오.

3. 10x 인산염 완충 식염수(PBS)의 제조

  1. 유리병에 초순수 500mL를 채웁니다.
  2. 병에 PBS 정제 10개를 추가합니다.
    참고: 이 프로토콜은 1x PBS의 정제 비율이 500mL당 1정이라고 가정합니다. 다른 태블릿 크기나 브랜드를 사용하는 경우 필요에 따라 태블릿 수를 조정하십시오.
  3. 병에 교반 막대를 넣고 정제가 녹을 때까지 교반 접시에 놓습니다.
  4. 하이드로겔 제조 당일에 필요한 부피의 10x PBS를 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  5. 콜라겐을 만들기 전에 PBS가 채워진 튜브를 37°C 수조에 최소 15분 동안 놓습니다.

4. 정렬된 콜라겐 나노피브릴의 제조(그림 2)

  1. 냉장고에서 콜라겐 주사기를 꺼내 뭉툭한 22g 바늘을 꽂습니다.
  2. 4웰 플레이트의 뚜껑에 유리 슬라이드를 놓습니다.
  3. 충분히 예열된 37°C 10x PBS(30-50mL)로 슬라이드를 덮습니다.
  4. 주사기를 약 30-45° 각도로 잡고 ~340mm/s의 속도와 ~3.2mL/분의 유속을 사용하여 얇은 콜라겐 스트립을 유리 칩에 수동으로 압출합니다.
    알림: PBS가 과도하게 냉각되지 않도록 예열된 PBS를 추가한 후 30-60초 이내에 콜라겐 압출을 완료하십시오.
  5. 콜라겐이 섬유형성을 완료하거나 콜라겐이 불투명한 흰색으로 변할 때까지 1-2분 동안 기다립니다.
  6. 집게를 사용하여 콜라겐 스트립을 길이로 자릅니다. 칩의 양쪽 끝 아래에서 3-5mm를 접을 수 있도록 스트립이 충분히 긴지 확인하십시오.
  7. 한 번에 하나씩 콜라겐 스트립을 준비된 유리 칩 위에 세로로(점수가 매겨진 영역과 평행하게) 부드럽게 드레이프합니다. 가장자리를 칩 아래로 밀어 넣습니다.
  8. 원하는 치수가 될 때까지 콜라겐 스트립을 계속 배치합니다.
  9. 새로 형성된 콜라겐 하이드로겔을 12웰 플레이트의 두 웰에 걸쳐 배치합니다. 이것은 건조 과정에서 공기 흐름을 가능하게 하고 콜라겐의 꼬리 끝이 원치 않는 표면에 부착되는 것을 방지합니다.
  10. 하이드로겔을 벤치탑에 그대로 두어 1-3시간 동안 또는 PBS 염 결정이 하이드로겔 표면의 50%-90%를 덮을 때까지 건조시킵니다.
    알림: 건조 시간은 하이드로겔 크기와 과도한 액체의 존재 여부에 따라 달라집니다.
  11. 각 하이드로겔을 1x PBS에 약 30-60초 동안 또는 염 결정이 용해될 때까지 담그십시오.
  12. 티슈로 여분의 PBS를 가볍게 두드려 냅니다.
  13. 하이드로겔을 웰 플레이트에 다시 놓고 흄 후드에서 밤새 건조시킵니다.
  14. 건조된 하이드로겔을 RT에서 약 1주일 동안 보관하십시오.

5. 무작위 콜라겐 나노 피브릴의 제작 (그림 3)

  1. 냉장고에서 콜라겐 주사기를 꺼내 뭉툭한 22g 바늘을 꽂습니다.
  2. 콜라겐을 ~3.2mL/분의 속도로 마른 유리 칩에 밀어 넣습니다. 정렬된 콜라겐 하이드로겔과 유사한 치수를 얻을 수 있을 만큼 충분한 콜라겐을 압출합니다. 필요에 따라 기포 축적을 방지합니다.
  3. 추가 콜라겐을 압출하여 유리 칩의 가장자리를 감쌉니다. 이렇게 하면 우발적인 분리의 위험을 최소화할 수 있습니다.
  4. 집게를 사용하여 압출된 콜라겐을 데운 10x PBS의 50mL 튜브에 담그십시오.
  5. 콜라겐이 섬유형성을 완료하거나 콜라겐이 불투명한 흰색으로 변할 때까지 45-60초 동안 기다립니다.
  6. 티슈로 여분의 PBS를 가볍게 두드려 냅니다.
  7. 4.9-4.14단계를 완료하여 하이드로겔을 헹구고 건조시킵니다.

6. 살균 및 재수화

참고: 생물 안전 작업대에서 다음 단계를 모두 완료하십시오.

  1. 콜라겐 하이드로겔과 주변 웰 플레이트를 70% 에탄올로 15분 동안 살균합니다.
    1. 유리 칩의 밑면과 하이드로겔이 모두 에탄올과 접촉하도록 집게를 사용하여 멸균 중간에 하이드로겔을 잠시 들어 올립니다.
  2. 에탄올을 제거하고 하이드로겔을 10분 동안 자연 건조시킵니다.
  3. 하이드로겔을 멸균 1x PBS에서 각각 10분씩 3회 세척하여 잔류 에탄올을 제거하고 하이드로겔을 재수화합니다. 이제 하이드로겔을 사용할 준비가 되었습니다(세포 배양 등). 하이드로겔은 즉시 사용할 준비가 되지 않은 경우 최종 세척 단계 후 PBS에 잠시 남아 있을 수 있습니다.

결과

이 프로토콜은 정렬(그림 2) 또는 무작위(그림 3) 배향 나노피브릴로 구성된 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 간단한 전단 기반 압출 기술을 설명합니다. 나노 피브릴 패터닝은 전단력의 정밀한 제어에 의존하며, 이는 주사기 속도와 콜라겐 압출 속도의 결합된 조절을 통해 달성됩니다. 원섬유 정렬을 유도하기 위한 최적 값은 이전에 340mm/s의 주사기 속도와 3.2mL/분의 콜라겐 압출 속도인 것으로 결정되었습니다28,29. 이 균형은 정렬된 나노피브릴 형성뿐만 아니라 거시적 규모에서 하이드로겔의 기능을 보장하는 데에도 중요합니다. 이 비율이 잘못 정렬되면 예상대로 패턴화되지 않은 하이드로겔뿐만 아니라 너무 얇거나(직경 <0.5mm) 두껍거나(직경 >1.5mm) 물결 모양의 콜라겐 스트립이 포함된 하이드로겔이 제작될 위험이 있습니다. 예를 들어, 주사기 움직임이 너무 빠르고 압출 속도가 너무 느리면 얇은 스트립이 생성되는 반면, 반대 비율은 비율의 불균형 정도에 따라 두껍거나 물결 모양의 스트립을 생성합니다(그림 4A-D). 이러한 거시적 특성의 차이는 세포 증착 및 국소 접착에 영향을 미치기에 충분한 스트립 간 변동성을 생성할 수 있습니다.

콜라겐 압출 및 조립 후, 하이드로겔 제조는 1x PBS에서 세척 단계를 거치기 전에 종종 1-3시간의 초기 건조 단계를 통해 진행됩니다(그림 2 및 그림 3). 최적의 지형적 결과를 달성하는 것은 세척 단계의 타이밍과 강도 사이의 섬세한 균형에 달려 있습니다. 불충분하거나 지연된 세척은 섬유 지형을 파괴하는 결과를 낳으며, 이는 원섬유에 PBS 염 결정의 각인으로 표시됩니다. 대조적으로, 콜라겐 제조 후 과도하거나 조기에 세척하면 지형적 특징을 덮는 콜라겐 층이 용해됩니다(그림 4E, F).

주사전자현미경(SEM)은 콜라겐 하이드로겔 내에서 정렬되거나 무작위 나노피브릴 배향의 존재를 확인합니다. 정렬된 하이드로겔과 무작위 하이드로겔 모두에서 나노 피브릴은 30-50 nm 사이의 피브릴 직경을 나타냅니다29. 질적으로 정렬된 하이드로겔은 일축으로 정렬된 나노피브릴을 함유하고 있음이 분명합니다(그림 5). 이 정렬은 이전에 2D 고속 푸리에 변환 분석을 사용하여 정량화되었으며, 정렬 플롯은 정렬된 하이드로겔에 대해 180° 떨어진 두 개의 뚜렷한 피크를 표시하며, 저주파 피크만 나타내는 무작위 배향의 하이드로겔과 대조됩니다28.

1차 마우스 골격근 근아세포의 명시야 이미지는 콜라겐 원섬유의 이방성 나노 지형 안내가 세포 정렬을 촉진한다는 것을 보여줍니다(그림 6). 이러한 나노 패턴 콜라겐 하이드로겔은 근아세포(myoblasts)뿐만 아니라 26 내피 세포(endothelial cell)23,24와 같은 다른 세포 유형에서도 세포 정렬을 유도하는 것으로 나타났습니다.

figure-results-1
그림 1: 초고밀도 콜라겐 및 절단 유리 슬라이드 준비의 개략도.(A-F) 콜라겐 투석 과정: (A) 3인치 스트립으로 투석 튜브를 준비하고 첫 번째 클립을 고정, (B) 고밀도 스톡 콜라겐을 튜브에 적재하고 두 번째 클립을 고정, (C) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 플레이크로 로드된 투석 튜브를 감싸고, (D) 포화 PEG 플레이크 제거, (E) PEG 플레이크를 물로 헹굽니다, (F) 초고밀도 콜라겐을 마이크로 원심분리기 튜브에 보관합니다. (지엘) 유리 슬라이드를 절단하는 과정: (G) 연구를 위한 유리 슬라이드 획득, (H,I) 다이아몬드 팁 유리 커터로 유리 슬라이드의 채점, (J) 점수가 매겨지지 않은 쪽에서 유리 슬라이드를 깨뜨리기, (K) 절단된 유리를 물로 헹구기, (L) 유리 슬라이드의 건조. BioRender를 사용하여 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 정렬된 콜라겐 하이드로겔 제조 공정.1단계: 10x PBS 가온 완충액으로의 전단 하의 콜라겐 압출 및 섬유형성 유도; 2단계: 절단 유리 슬라이드에 압출 콜라겐 장착; 3단계: 하이드로겔의 크기를 증가시키기 위해 추가 압출 콜라겐 장착; 및 4단계: 콜라겐 하이드로겔 건조. BioRender를 사용하여 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 무작위 콜라겐 하이드로겔 제조 공정. 1 단계 : 절단 유리 슬라이드 (단일 스트립)에 콜라겐 압출; 2단계: 콜라겐의 지속적인 압출은 크기(여러 스트립)를 증가시킵니다. 3단계: 섬유형성을 시작하기 위해 압출된 콜라겐을 10X PBS 완충액에 담그는 것; 및 4단계: 하이드로겔 건조. BioRender를 사용하여 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 콜라겐 하이드로겔 제조 공정에서 가능한 오류 단계. (A-F) (A) 최적으로 두꺼운 콜라겐 스트립, (B) 과도하게 두꺼운 콜라겐 스트립, (C) 불충분하게 두꺼운 콜라겐 스트립, (D) 구불구불한 콜라겐 스트립 및 (E,F) 과도하게 세척된 콜라겐 표면의 예. 주사 전자 현미경을 사용하여 표시. 스케일 바 = 1μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 정렬된 콜라겐 하이드로겔 및 무작위 콜라겐 하이드로겔의 주사 전자 현미경 이미지. 이미지는 전자 현미경을 사용하여 촬영했습니다. 빔 조건은 2keV, 전류 범위는 25-100pA, 작동 거리는 4-5mm로 설정되었습니다. 이미지는 6144 x 4096 픽셀의 해상도로 1μs의 체류 시간으로 일관되게 저장되었습니다. 스케일 바 = 1μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 정렬된 무작위 콜라겐 하이드로겔에서 배양된 1차 마우스 근아세포. Myoblasts는 이미징 전 3일 동안 하이드로겔에서 배양되었습니다. 명시야 이미지는 도립 현미경을 사용하여 10배 배율로 촬영했습니다. 화살표는 정렬된 나노 피브릴 방향을 나타냅니다. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜의 중요한 단계는 1) 콜라겐 섬유형성, 2) 하이드로겔 마운팅, 3) 세척의 세 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다. 콜라겐 섬유형성 과정은 중화 조건에서 자발적으로 발생하며 개별 콜라겐 분자가 더 크고 안정화된 섬유소 구조로 자가 조립되는 것에 의존합니다10,11. 이는 37°C로 가열된 10x PBS와 같은 중화 완충 매체의 적용을 통해 달성되며, 이는 콜라겐이 원섬유로 완전히 발달할 수 있도록 하는 정전기 상호 작용을 안내하는 데 중요합니다. 나노 스케일 섬유소 정렬은 섬유형성의 발생과 동시에 전단력의 적용에 의해 달성됩니다. 전단의 유무와 전단 속도는 원섬유의 패터닝을 결정합니다. 둘째, 하이드로겔 장착은 콜라겐의 수축 및 탈수가 발생하는 건조 과정에서 물리적 앵커를 제공하여 재료의 안정성을 강화하는 핵심 단계입니다. 이 단계는 체외 세포 파종(in vitro cell seeding)을 목적으로 사용하는 경우 콜라겐을 뻣뻣한 기질에 고정하여 통제되지 않는 수축을 방지하기 때문에 특히 중요합니다. 장착 과정은 무작위 및 정렬된 패턴의 하이드로겔 간에 약간 다릅니다. 무작위 하이드로겔을 적절하게 부착하려면 섬유형성 전에 장착 표면(일반적으로 유리)의 가장자리를 따라 추가 콜라겐 증착을 통해 표면에 고정해야 합니다. 정렬된 패터닝이 있는 하이드로겔은 동일한 고정 목적을 수행하기 위해 장착 표면의 가장자리를 감쌉니다. 정렬된 하이드로겔에 대한 중요한 추가 고려 사항은 콜라겐 스트립의 초기 배치가 하이드로겔의 모양과 균일성을 결정한다는 것입니다. 후속 스트립 배치는 증착된 콜라겐의 표면 장력에 의해 안내되며, 배치 후 하이드로겔을 건드리지 않도록 주의합니다. 마지막으로, 적절한 하이드로겔 건조 및 세척 후 세척은 하이드로겔의 지형적 특성을 유지하는 데 필수적입니다. 불충분하게 건조시킨 후 1x PBS 또는 물로 세척하면 콜라겐이 용해되거나 케이크 같은 층이 생길 수 있습니다. 이를 방지하기 위해서는 하이드로겔의 완전한 건조가 필수적이며 PBS 결정의 형성과 콜라겐 불투명도의 증가로 육안으로 확인할 수 있습니다.

콜라겐 하이드로겔은 체외 연구 및 생체 내 재생 공학 응용 분야에 모두 사용되었습니다 23,24,25,26,27. 하이드로겔은 비멸균 조건에서 제작되며 모든 형태의 세포 배양 또는 이식 전에 멸균해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 권장되는 살균 형태는 70% 에탄올이며, 자외선과 같은 다른 형태의 살균은 콜라겐 분자의 가교 및 분해를 통해 나노 피브릴 패터닝을 방해하기 때문입니다30. 그러나 증발 및 세척 단계를 통한 에탄올의 제거는 세포 호환성에 해로울 수 있는 잔류 에탄올의 최소화를 위해 중요합니다. 스톡 콜라겐의 배치 간 변동성은 투석된 고밀도 콜라겐의 작업 농도에 변동을 유발할 수 있으며, 이는 섬유형성 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 응용 프로그램에 따라 무작위 등방성 패터닝이 정렬된 이방성 패터닝보다 선호될 수 있습니다. 따라서 현재 프로토콜에는 원섬유조직을 조절하기 위한 두 가지 접근 방식을 모두 포함했습니다.

이 프로토콜에 설명된 전단 기반 압출 방법의 한계는 프로세스가 매우 수동적이고 사용자 의존적이라는 것입니다. 재현 가능한 결과를 얻기 위해 각 작업자를 보정하려면 상당한 교육과 연습이 필요합니다. 이는 처리량이 낮고 정밀도를 보장하기 위해 시간이 많이 소요될 수 있음을 의미합니다. 이러한 한계 중 일부는 3D 프린팅, 전기 방사, 소프트 및 표면 리소그래피와 같은 고도로 자동화된 기계 기반 제조 방법을 사용하여 해결할 수 있습니다. 그러나 이러한 다른 방법과 달리 이 완전 수동 나노피브릴 제조 절차는 특수 장비가 필요하지 않으며 접근하기 쉽고 저렴합니다. 3D 프린팅 방법론의 발전과 비용 효율성이 계속 개선됨에 따라 이 프로토콜을 3D 프린팅 기술과 조정하고 통합할 수 있는 잠재력이 있습니다. 이러한 통합은 아직 불가능하지만 이 프로토콜의 일관성과 처리량을 향상시킬 수 있습니다.

두 가지 뚜렷한 하이드로겔 지형의 제작은 세포 형태, 행동 및 조직 재생에 대한 콜라겐 원섬유의 나노 지형학적 지침을 탐구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 다양한 피브릴 지형에 대한 반응을 관찰함으로써 기질 나노스케일 패터닝이 세포 표현형에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 이전 연구는 내피 세포가 정렬된 나노피브릴 위에 길쭉한 형태를 채택할 때 항염증 표현형을 나타내고 방해받은 흐름 조건에 대한 저항이 증가한다는 것을 나타냅니다24. 이러한 발견은 죽상경화성 병변의 발병에 대한 우리의 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 미래의 죽상동맥경화 우회 이식편의 설계에 대한 가능성을 제시합니다. 이러한 콜라겐 하이드로겔은 조직 공학 응용 분야에 사용할 수 있으며 이식 전에 성장 인자 또는 세포를 풍부하게 하여 치료 효능을 향상시킬 수 있습니다 25,26,27. 비교 분석에 따르면 지형이 정렬된 하이드로겔은 무작위 지형을 가진 하이드로겔에 비해 우수한 근육 재생 및 혈관화를 나타내며(26), 이러한 하이드로겔은 마우스 손상 모델에서 조직 재생을 향상시키기 위해 근육 성장 인자를 함유한 경우 무세포 "기성품" 형태로 사용할 수 있습니다27. 지금까지는 이러한 하이드로겔을 근육 부상에 대한 잠재적 치료제로 사용하는 데 중점을 두었지만, 광범위한 재생 및 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

공개 사항

선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, Oregon Health & Science University Foundation 및 Collins Medical Trust의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. K.M.H.는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship(DGE-1937961)과 Oregon Students Learn and Experience Research(OSLER) Fellowship(5TL1TR2371-8)의 지원을 받았습니다. K.H.N.은 NIH/NHLBI(R00HL136701) 및 NIH/NIAMS(R01AR080150)의 보조금으로 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 I, 고농도, 쥐 꼬리코닝CB354249
Eclipse TE-2000-U 현미경NikonTE-2000-U 도립 현미경
매우 두꺼운 현미경 슬라이드Fisher Scientific22-267-005콜라겐 압출 표면에 잘 작동
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/A주사 전자 현미경
유리 커터 도구 세트 2mm-20mm 연필 스타일 오일 피드 카바이드 팁Amazon/MOARMORB07Y1D243H유리 커터 옵션
Hamilton Kel-F 허브 블런트 포인트 바늘 (루어 잠금, 22 G)Fisher Scientific14-815-574콜라겐 압출용 바늘
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819소수성 슬라이드
PBS 정제 ThermoFisher Scientific18912014
폴리에틸렌 글리콜 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Seamless Cellulose Dialysis Tubing Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin 투석 클립Thermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Glass CutterSynthware31-501-927유리 커터 옵션

참고문헌

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

재인쇄 및 허가

태그

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.