방법 논문

순환기 사사 후 쥐 폐를 위한 새로운 생체 외 폐 관류 시스템 구축

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DOI:

10.3791/67168

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2024년 10월 18일

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1China-Japan Friendship Institute of Clinical Medicine, 2Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, 3Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

목표는 EVLP 전반에 걸쳐 4시간 동안 일관된 폐 기능을 유지할 수 있는 쥐에서 새로운 생체 외 폐 관류(EVLP) 모델을 개발하고 설치류 모델에 EVLP를 적용하기 위한 견고한 방법을 제공할 구현 세부 사항을 업계에 제공하는 것입니다.

초록

이식을 위한 기증자 폐의 부족 현상이 증가함에 따라 심폐사(DCD) 후 기증자로부터 조달한 장기의 활용에 대한 관심이 크게 높아졌습니다. 그러나 임상적 사용에 대한 엄격한 기준을 충족하는 생존 가능한 폐의 수를 최대화하는 것이 중요한 과제로 남아 있습니다. 생체 외 폐 관류(EVLP)는 기증된 폐의 기능을 평가하고 잠재적으로 개선할 수 있는 유망한 기술로 부상하고 있습니다. 이 백서는 EVLP 연구를 위해 특별히 설계된 비용 효율적이고 재현 가능한 소동물 실험 플랫폼의 개발에 대해 설명합니다. 이 플랫폼은 높은 수준의 사용자 정의를 제공하여 연구원이 EVLP 분야의 특정 연구 질문을 해결하기 위해 실험 매개변수를 조정할 수 있도록 합니다. 연구팀은 DCD를 시뮬레이션하기 위해 쥐 모델을 구축하고 2단계 보존 접근 방식을 구현했습니다. 폐는 4°C에서 4시간 동안 관류액 용액을 사용하여 정적 냉장 보관을 한 다음 다시 4시간 동안 정상 보온 EVLP를 수행했습니다. 연구진은 폐혈관 저항, 폐 역학 순응도, 관류물의 혈액 가스 측정, 폐 조직의 자가사멸 세포 사멸 등 다양한 폐 기능 매개변수를 평가했습니다. 이 연구는 EVLP가 4°C에서 단순 냉장 보관에 비해 DCD 폐의 기능적 성능을 크게 향상시킬 수 있음을 보여주며, EVLP가 허혈-재관류 손상을 완화하고 순환기 사망 후 이식 기능을 향상시켜 이식 가능한 폐 풀을 증가시킬 수 있는 잠재력이 있음을 시사합니다.

서론

폐 이식(LTx)은 말기 폐 질환 환자를 위한 유일하고 확실한 치료법으로 남아 있습니다. 폐 이식의 성공 여부는 적절한 기능을 갖춘 고품질 기증자 폐의 가용성에 달려 있습니다. 그러나 기증자 폐의 심각한 부족으로 인해 전 세계적으로 폐 이식 대기자 명단이 증가하고 있습니다1. 대기자 명단에 있는 많은 환자들이 합리적인 기간 내에 적절한 기증자 폐를 기다리는 동안 건강이 악화되거나 사망을 경험합니다2. 따라서 이식 대기자 명단에 있는 환자의 요구를 충족시키기 위해 잠재적인 이식편 풀을 확장하는 것이 중요합니다. 심폐사(DCD)1,3 및 체외 폐 관류(EVLP)4,5 후 기증은 이식에 사용할 수 있는 폐의 수를 늘리는 두 가지 유망한 전략입니다. 현재 뇌사 후 기증(DBD)6이 폐 이식의 주요 출처입니다. 그러나 현재 이식편 부족으로 인해 DCD가 견인력을 얻고 있습니다. 이러한 변화는 혈류, 기계적 환기, 감염 및 흡인의 변화가 이식편의 품질을 손상시킬 수 있는 DBD 이식편의 한계에 의해 주도됩니다. 이식편의 품질은 이식 후 환자의 결과와 장기 생존에 직접적인 영향을 미칩니다. 체외 폐 관류(EVLP) 프로세스는 심사(DCD) 후 기증자의 폐 이식편을 재평가하여 사용 가능한 폐 이식 건수를 효과적으로 증가시켰으며, 그 결과 단기 및 장기 모두에서 유사한 결과를 얻었습니다7,8. 이 연구의 목표는 주기적으로 폐가 죽은 쥐에서 체외 폐 관류 시스템을 개발하고 DCD 기증자를 정확하게 평가하는 것이었습니다. 원발성 이식편 기능 장애(PGD)의 가능성을 줄이기 위해 분자 진단<10을 사용하고 특수 표적 치료를 사용하여 DCD 기증자sup class="xref">9에 대한 피해를 최소화할 수 있습니다.

EVLP는 정상적인 생리적 온도를 유지하면서 폐의 자연 환경을 체외로 복제하는 기술입니다. 이를 통해 폐11,12에 대한 지속적인 모니터링 및 평가가 가능하고, 이식13의 보존 시간을 연장하고, 외부 관류, 환기 및 약물을 사용하여 가장자리 폐의 질을 개선하여 이식에 적합하게 만듭니다14. EVLP를 사용한 폐 이식을 위한 변연 기증자 폐의 첫 번째 성공적인 사용은 2007년 Steen et al.에 의해 보고되었습니다15. 그 이후로 EVLP 기술의 사용은 점차 임상 실습에 통합되었습니다16,17. 토론토 팀은 이후 원심 펌프의 이상적인 폐 보호 전략과 함께 저호흡 호흡 및 낮은 유속을 사용하여 EVLP 접근 방식을 채택했습니다. 그 결과 12시간 동안 꾸준한 관류가 이루어졌습니다18.

EVLP는 1차 이식 실패 위험 감소, 폐부종 최소화, 뇌사 관련 염증 완화, 이식을 위한 수혜자의 면역 체계 준비, 폐 감염, 흡인, 폐색전증 및 허혈-재관류 손상 예방 등 여러 이점을 제공합니다.14,19,20. EVLP는 상당한 이점을 제공하지만 이식 품질을 향상시키기 위해 개선된 방법이 필요합니다.

현재 rat EVLP 플랫폼의 관류 및 환기에 대한 특정 설정에 대한 합의는 없습니다. Ohsumi et al.21은 장기간의 저온 허혈 시간(CIT)을 거친 기증자의 폐가 생체 외 폐 관류(EVLP) 과정과 이식 후에도 폐 기능을 유지할 수 있는 방법을 연구하기 위해 새로운 모델을 고안했습니다. 국제적으로 쥐 생체 외 폐 관류(EVLP) 모델을 만들기 위한 여러 노력이 있었습니다22,23,24,25,26,27. 따라서 이 분야의 추가 연구를 촉진하기 위해 비용 효율적이고 재현성이 높으며 엄격하게 제어되는 소동물 EVLP 시스템을 개발하는 것이 필수적입니다. 소형 동물을 위한 기존 EVLP 시스템은 종종 비용이 많이 들고 다양한 연구 요구 사항에 맞게 작동 조건을 수정하는 측면에서 유연성이 제한적입니다. 이 백서에서는 비용 효율적이고 적응 가능한 EVLP 시스템 설계를 제안합니다. 또한 구현에 필요한 기술 및 수술 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 EVLP가 DCD 폐의 질을 향상시켜 이식을 위한 생존 가능한 폐 기증자 풀을 증가시킨다는 것을 입증하기 위해 순환 정지 상태에 있는 죽은 쥐를 활용하는 모델을 사용했습니다. 우리는 심순환기 사망 후 작은 동물을 위해 쉽게 사용할 수 있는 EVLP 플랫폼을 구축하는 데 다른 연구자들을 돕기 위해 성공적인 경험을 공유하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

실험 동물은 250-400g의 SD 수컷 쥐였습니다. 쥐는 18-22 ° C의 표준 실험 조건에서 12 시간의 밝은 어두운 주기로 제어되었으며 음식과 물을 자유롭게 이용할 수있었습니다. 중국-일본 우호 병원 임상연구소 동물관리 및 이용위원회는 동물실험을 승인하고 지침에 따라 진행했다. 모든 수술은 전신 마취 하에 진행되었습니다. 그림 1은 참조용으로 EVLP 시스템의 회로도와 실제 이미지를 보여줍니다. 사용된 모든 기기 및 장비의 구체적인 제조사 및 모델은 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다

1. 기구 구성

참고: 3D 프린팅 플라스틱은 이 장치에 대한 유망한 선택인 것으로 보입니다. 그러나 우리의 제한된 경험에 비추어 볼 때 플라스틱 재료로 매듭을 묶는 동안 힘을 조절하는 것은 어렵습니다. 너무 적은 힘으로 튜브가 미끄러질 수 있고 너무 많은 힘을 가하면 플라스틱 튜브가 막힐 수 있습니다. 금속 강성 튜브는 이러한 문제를 피하고 상대적으로 내구성이 있으므로 여기에 사용됩니다.

  1. 모듈을 플라스틱 파이프에 연결하고 철제 프레임 스탠드와 조정 가능한 리프팅 플랫폼을 사용하여 모든 부품을 적절한 높이에 배치합니다. 액체 저장 탱크에 150mL의 관류를 추가하고 연동 펌프를 연 다음 유속을 20mL/분으로 설정하여 관류가 튜브를 채우도록 합니다.
  2. 1.2기관내 삽관을 위해 원형 홈을 갈아줍니다. 8%O2, 6%CO2 및 86%N2를 포함하는 가스 혼합물을 저산소 가스로 준비합니다. 저산소 가스를 인공 막 폐를 통해 관류로 통과시킵니다. 혈액 가스 측정 전에 5분 동안 순수한 산소로 환기하십시오.
  3. 쥐의 해부학적 구조에 맞게 구부러진 속이 빈 304 스테인리스 스틸 튜브로 폐동맥과 심방 캐뉼러를 만듭니다(그림 2A). 동맥 삽관을 위해 원형 홈을 갈아줍니다. 심방 캐뉼라 벽의 말단 끝에 구멍을 뚫고 외벽의 환형 홈을 연마합니다(그림 2C). 폐동맥 관류 튜브에 튜브를 삽입하기 전에 배기 장치를 설정합니다.
  4. 수조의 외부 순환 시스템에 3방향 밸브를 연결하고 저장소, 장기 구획 및 폐동맥 관류액의 온도를 조절합니다. 비수조 연결 파이프의 길이를 최소화하고 ± 0.2 °C 범위 내에서 장치의 모든 지점에서 온도 오차를 제어합니다. 연구 설계에 대한 원하는 온도는 37°C입니다.
  5. 압력 모니터링 라인에 식염수를 채우고 압력 모니터링 장치를 기증자의 폐와 동일한 높이로 조정합니다. 밸브를 열어 압력 모니터링 라인을 폐동맥 및 정맥 관류 라인과 연결하고 데이터 수집기를 시작한 다음 0으로 설정합니다. 동맥 관류 압력과 정맥 역류 압력을 실시간으로 모니터링합니다.

2. 쥐 마취

  1. 개인 보호 장비를 착용하십시오: 쥐와 쥐 조직을 다루기 전에 수술용 마스크, 장갑 및 일회용 작업복
    2. .
  2. 쥐의 무게를 측정하고 체중을 기록하십시오. 주사기에 헤파린 1000U/kg을 채우고 바늘로 꼬리 정맥에 주입합니다.
  3. 쥐를 밀폐된 유도실에 넣고 3% 이소플루란 가스로 마취합니다. 쥐의 발가락을 조입니다. 반응이 없으면 쥐가 원하는 마취 깊이에 도달했음을 나타냅니다. 그렇지 않으면 마취 시간을 계속 늘리십시오. 안건조증을 예방하기 위해 멸균 안과 연고를 바르십시오.
  4. 여러 개의 봉합사(3-0 또는 4-0)를 준비합니다. 쥐를 수술대로 옮기고, 누운 자세로 눕히고, 봉합사로 고정하고, 알코올 스프레이로 소독합니다.

3. 기증자 폐 조달

  1. 쥐의 머리를 마취 마스크에 넣고 1.5% 이소플루란이 함유된 공기를 공급하여 마취를 유지합니다. 쥐의 발가락을 조입니다. 반응이 없으면 쥐가 원하는 마취 깊이에 도달했음을 나타냅니다.
  2. 기관 앞 목 정중선을 따라 설치류 수술 용 가위로 2-3cm 세로로 절개하여 피부를 절개하고 기관 앞의 근육 조직을 절개하여 기관을 완전히 노출시킵니다.
  3. 기관 뒤의 공간을 비우고 3-0 봉합사를 통과시킨 다음 나중에 사용할 수 있도록 느슨한 매듭을 묶습니다. 설치류 수술용 가위로 기관 매듭 위로 0.5cm V자형 절개를 하고 기관관(14G)을 기관에 삽입하고 봉합사 매듭을 조이고 기관 튜브를 고정합니다(그림 3A).
  4. 기관관을 인공호흡기에 연결하고 전원을 켠 다음 폐 인공호흡을 시작합니다.
  5. 사망이 확인될 때까지 마취와 활력 징후의 변화를 보장하기 위해 활력 징후를 자주 모니터링하고 기록합니다.
  6. 폐 동원 조작을 시작하고, 압력 제어 모드에서 기계 환기를 다시 시작하고, 5분 동안 인공호흡을 합니다. PEEP 3 cmH2O, 흡기: 호기(I:E) 비율 1:2, 호흡수 40호흡/분 및 FiO2 0.5 매개변수를 사용합니다.
  7. 기관을 고정하고 폐가 1시간의 따뜻한 허혈 시간(WIT)을 겪도록 합니다. WIT 기간이 끝나면 아래와 같이 폐를 추출하고 (1) 직접 폐 채취, (2) 4시간 냉 정전기 보존(CS) 및 (3) 4시간 EVLP 평가의 세 그룹으로 무작위로 나눕니다.
  8. 직접 폐 적출을 위해 다양한 검사에 대한 처리 없이 얻은 기증자 폐를 샘플링합니다. 4시간 냉 정전기 보존(CS)을 위해 기증자 폐를 냉 정전기 보존 상태로 냉장고에 4°C에서 4시간 동안 보관한 다음 검출을 위해 샘플을 보관합니다. 4시간 EVLP 평가. 4시간 EVLP 평가의 경우 5단계를 수행합니다.
  9. 수술대를 머리 높이 45°, 발 높이 경사 위치로 조정합니다.
  10. 쥐의 가슴과 복부 중앙의 털을 면도기로 제거하고 요오드 3배로 소독한 후 수술용 수건으로 드레이프합니다.
  11. 설치류 수술 용 가위로 복부 정중선을 따라 6-7cm의 세로 절개를 만들고 피부를 자르고 복벽을 복강까지 열고 복부 장기를 노출시킵니다. 면봉을 사용하여 장을 복강 오른쪽으로 부드럽게 밀어 장 뒤에 있는 하대정맥을 노출시킵니다.
  12. 주사기를 사용하여 헤파린 1000U/kg 용액을 하대정맥에 주입합니다. 혈액의 적절한 간화가 확인될 때까지 5분 동안 기다립니다. 헤파린은 폐동맥에서 미세혈전이 형성되는 것을 방지합니다.
  13. 쥐의 하대정맥을 가위로 잘라 피를 흘린다. 일회 호흡량 3mL/kg, 호기말 양압(PEEP) 2cmH2O, 호흡수 60회/분, I:E 비율 1:2에서 초기 인공호흡기 설정으로 폐의 기계적 환기를 시작합니다.
  14. 집게를 사용하여 xiphoid process를 들어 올리고 흉골을 따라 아래에서 위로 세로로 절개합니다. 갈비뼈 스프레더를 사용하여 흉강을 노출시킵니다. 흉선 조직을 제거하여 심장과 그 아래의 주요 혈관을 노출시킵니다.
    참고: 쥐의 폐는 연약합니다. 금속 기구로 동물이나 복부 장기를 만지지 마십시오. 더 나은 가시성을 위해 면봉으로 폐를 부드럽게 옆으로 밀어냅니다.
  15. 쥐의 대동맥과 폐동맥 뒤의 공간을 비우고, 3-0 봉합사를 통과시킨 다음, 나중에 사용할 수 있도록 느슨한 매듭을 묶습니다.
  16. 우심실 유출로의 전방 표면에 2-3mm V자형 절개를 만들고, 절개 부위를 통해 폐동맥에 폐동맥 캐뉼라를 삽입하고, 미리 묶인 봉합사를 조여 캐뉼라를 고정합니다(그림 3B).
  17. 쥐의 심장 끝을 자르고, 지혈 겸자를 좌심실에 삽입하고, 좌심실과 좌심방 사이의 판막을 파괴하고, 좌심방 유출로가 깨끗한지 확인합니다.
  18. 폐동맥 캐뉼러를 관류 회로에 연결하고 15mL의 저칼륨 용액을 사용하여 0.6-1mL/분의 속도로 잔여 혈액을 세척합니다. 폐가 하얗게 변하거나 좌심실에서 나오는 관류액이 하얗게 변할 때까지 씻어냅니다.
  19. 심장 뒤에 봉합사를 배치하고 심실을 둘러싸고, 좌심실의 절개를 통해 좌심실 캐뉼러를 삽입하고, 캐뉼라를 고정하기 위해 미리 묶인 봉합사를 조입니다(그림 3C).
  20. 기관 튜브 위의 기관을 잘라내고 기관을 들어 올린 다음 가위를 사용하여 기관 뒤의 결합 조직을 횡격막 수준까지 아래로 분리합니다.
  21. 하대정맥과 횡격막 위의 주폐동맥을 절단하고 심장과 폐를 제거합니다(그림 3D).
  22. 폐를 부풀린 상태로 유지하려면 흡입이 끝날 때 즉시 기관의 아래쪽 1/3을 고정하고 심장과 폐를 채취하여 보존을 위해 저칼륨 용액에 넣으십시오.
  23. 심장과 폐를 EVLP 회로의 지정된 위치에 놓고 좌심실 캐뉼러를 관류 회로에 연결합니다(그림 4A).

4. 체외 폐 관류 시스템의 초기화

  1. EVLP 회로 조립: 튜브, 산소공급기, 저장조, 연동 펌프 및 장기 챔버를 연결합니다.
  2. 관류 전에 1000단위의 헤파린나트륨, 50mg의 세페라존, 50mg의 메틸프레드니솔론이 포함된 120mL의 폐 관류 복구 용액으로 EVLP 회로를 채웁니다. 폐동맥 관류 끝에 있는 배기 장치를 사용할 수 있도록 튜브의 기포를 제거하십시오.
  3. 수조를 실온으로 설정하고 따뜻한 물을 순환시켜 전체 EVLP 회로를 가열합니다.
  4. 컴퓨터의 데이터 수집 프로그램을 열고 폐동맥 압력 센서, 폐 중량 센서, 펌프 속도 센서 및 온도 센서를 EVLP 회로와 레코더에 연결합니다.
  5. 혈압 모니터링 튜브에 생리식염수를 채우고, 제공된 폐의 높이와 일치하도록 테이블 높이를 조정하고, 압력 모니터링 튜브를 폐동맥 및 정맥 관류 튜브에 연결하고, 밸브를 열고, 데이터 수집기를 시작하고, 시스템을 영점화합니다.
  6. 저산소 가스 밸브를 열고 관류 용액이 안정적인 저산소 상태에 도달할 때까지 10분 동안 저산소 가스를 막 폐를 통해 통과시키고 가스 밸브를 닫고 연동 펌프를 일시 중지하고 생체 외 폐 관류를 위해 기증자 폐가 도착할 때까지 기다립니다.
  7. 소동물 EVLP 플랫폼 근처에 수술대와 수술 기구를 준비하고 고압 증기 멸균으로 사전 멸균합니다.

5. 생체 외 폐 관류

  1. 거품이 폐로 들어가는 것(공기 색전증을 유발함)을 방지하기 위해 충분한 양의 관류 용액으로 거품 트랩을 채웁니다.
  2. 심폐 유닛을 장기실에 놓고 EVLP 장치에 연결하고 인공호흡기와 연동 펌프를 켜고 EVLP 관류를 시작합니다(그림 4B).
  3. 목표 유속의 20%에서 관류를 시작하고, 1시간 이내에 목표 유속까지 점차적으로 유속을 증가시키고, 목표 유속을 심박출량의 20%(75mL/분/250g 기증자 체중)로 계산합니다.
  4. 열교환기를 40°C로 설정하여 폐 온도를 37.5°C로 유지하십시오. 20분 이내에 관류 용액의 온도가 25°C에서 37°C로 증가합니다.
  5. 관류 시작 후 20분 후에 기관내 클램프를 제거합니다. 60bpm의 호흡수(RR), 3cmH2O의 호기말 양압(PEEP), 4mL/kg의 초기 일회 호흡량(VT)으로 기계 환기를 시작하여 10분 이내에 최대 일회 호흡량 6mL/kg에 도달합니다.
  6. 저산소 가스(8% CO2, 6% O2 및 86% N2)의 흐름을 시작하여 인공호흡 중에 동시에 35mmHg에서 45mmHg 사이의 폐동맥으로 들어가는 관류 용액 PCO2를 유지합니다.
  7. 관류 용액 유속, 동정맥압, 기도 최고 압력 및 폐 기능 매개변수를 관류 중에 지속적으로 모니터링합니다.

결과

EVLP가 DCD 공여자 폐를 얼마나 잘 보존했는지 판단하기 위해, 모든 그룹의 박동하는 공여자 폐에서 TUNEL 염색으로 검출된 세포 사멸 세포 수, 염증 마커 수준(QAH-INF-1 assay kit를 사용하여 관류액에서 검출), 그리고 전반적인 물리적 외관(hematoxylin and eosin (H&E) 염색)을 평가하는 것이 필요합니다. 모든 DCD 공여자 폐는 4시간 동안 관류되었습니다. 대부분의 폐는 안정적인 컴플라이언스를 보였으며, 4시간의 기간 동안 점진적인 감소가 관찰되었습니다 (그림 5B). DCD 공여자 폐 간의 혈관 저항과 폐 이식편 산소화 수준에서는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다 (그림 5A,C). 관류액의 포도당 수치는 시간이 지남에 따라 감소했으며, 개별 쥐 사이에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다 (그림 5D). 관류액의 전해질 수치는 그룹 간에 유사하게 유지되었습니다 (그림 5E-F).

세포 사멸 핵 검출을 위해 제조사의 지침에 따라 apoptosis detection kit를 이용한 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling 기법으로 TUNEL 염색을 수행하였습니다. TUNEL 염색은 다양한 보존 조건 하의 DCD 공여자 폐 내 폐포 상피세포의 세포 사멸(프로그램된 세포 사멸)을 정량화하는 데 사용되었습니다. 세포 사멸 세포 수에 대한 눈가림 분석 결과, 공여자 군에서 다른 군들에 비해 양성 세포 수가 유의하게 더 높게 나타났습니다. 또한, 저온 보존 군은 EVLP로 관류한 DCD 공여자 폐에 비해 더 많은 수의 양성 세포를 보였습니다. (그림 6)H&E 염색된 병리 절편을 점수화하기 위해 5가지 독립 변수가 사용되었습니다.&E: 1) 폐포 공간 내 염증 세포 유입, 2) 폐포 중격 증후, 3) 폐포 내 및 외 출혈, 4) 폐포 내 부종, 5) 초자막 형성. 변수는 0-4점으로 점수를 매겼다: 0 = 음성, 1 = 경미함, 2 = 보통, 3 = 높음, 4 = 심함. 점수가 매겨진 변수들의 합계로 총 폐 손상 점수를 산출했다. 폐 손상 점수는 EVLP 군이 저온 정적 보존 군 및 대조군보다 유의하게 낮았다. (그림 7A)4시간 저온 정적 보존군에서는 폐포벽 비후와 폐포 출혈이 관찰될 수 있습니다.그림 7B). EVLP 군에서는 정상적인 폐포 구조가 유지되었다. (그림 7C).

심폐 우회술 설정, 막 산소화, 도식도, 실험 방법.
그림 1: 소동물 ex vivo 폐 관류(EVLP) 회로의 도식 및 사진. 도식의 문자는 사진의 문자와 일치하며 각 구성 요소의 기능을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

크로마토그래피 시스템 구성 요소; 금속 커넥터, 피팅 및 튜빙 부품 도식.
그림 2: 맞춤 제작된 캐뉼라. (A) 폐동맥 캐뉼라. (B) 기관 캐뉼라. (C) 좌심방 캐뉼라. (D) 쥐 ex vivo 폐 관류 캐뉼라 세트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

심혈관 박리 및 장기 노출 단계를 보여주는 설치류 수술 절차 도식.
그림 3: 쥐 폐 적출. (A) 기관 캐뉼라를 적절한 위치에 배치하고 실크 봉합사로 고정한다. (B) 폐동맥에 캐뉼라를 삽입하고 이전에 배치한 실크 봉합사로 묶는다. (C) 좌심방 캐뉼라를 실크 봉합사로 고정한다. (D) 결합 조직을 둔성 박리하여 심폐 블록을 제거한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

장관 관류 실험 장치; A: 튜브 연결, B: 연구용 보존 챔버 내의 장기.
그림 4: 쥐 폐 관류 장치. (A) 심폐 블록을 ex vivo 폐 관류 회로에 배치한 모습. (B) EVLP 회로에 연결되어 적절하게 환기 및 관류가 이루어지는 폐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시간에 따른 생리학적 파라미터 그래프: PaO2/FiO2, CDyn, PVR, 포도당, 나트륨, 칼륨.
그림 5: 쥐 EVLP 프로토콜 중의 폐 기능. (A-F) 1시간의 온성 허혈 시간(WIT) 노출 후 EVLP를 거친 공여자 폐의 폐 기능 및 혈액 가스 분석. (A) 폐 산소화 지수. (B) 동적 폐 순응도 (Cdyn). (C) 폐혈관 저항 (PVR). (D) EVLP 4시간 후 관류액 내 포도당 수치. (E) EVLP 4시간 후 관류액 내 나트륨 수치. (F) EVLP 4시간 후 관류액 내 칼륨 수치. 오차 막대는 표준 편차를 나타냄. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

DCD, DCD+COLD, DCD+EVLP 조건을 비교한 DAPI 염색 포함 TUNEL 분석 도식.
그림 6: 다양한 사례에 대한 TUNEL 분석의 대표 이미지. TUNEL 양성 세포: 녹색 형광은 세포 사멸 세포를 나타냄, DAPI: 청색 형광은 핵을 나타냄, Merge: 프로그램된 세포 사멸(apoptosis)이 진행 중인 세포를 포함한 모든 세포; DCD는 직접 폐 적출 그룹을 의미함. DCD+COLD는 4시간 저온 정적 보존 그룹을 의미함. DCD+EVLP는 4시간 ex vivo 폐 관류(EVLP) 그룹을 의미함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

폐 손상 점수 막대 그래프 및 폐 조직 조직학적 분석, 실험 결과 묘사.
그림 7: 폐 손상 점수 및 조직학적 소견. (A) 대조군, SCS군 및 EVLP군의 폐 손상 점수 (*, p <0.05). (B) 저온 정적 보존(SCS) 공여자의 대표적인 hematoxylin and eosin (H&E) 염색 절편. 검은색 화살표는 폐 모세혈관 상피의 파열을 나타내며, 파란색 화살표는 폐포 벽의 두꺼워짐을 나타낸다. (C) EVLP 공여자의 대표적인 H&E 염색 절편. 빨간색 화살표는 염증 세포의 침윤을 나타낸다. (D) 직접 채취 공여자(대조군)의 대표적인 H&E 염색 절편. 검은색 화살표는 폐 모세혈관 상피의 파열 및 출혈을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내며, 유의성 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구는 소동물 EVLP 플랫폼을 위한 비용 효율적인 모듈식 설계와 DCD의 쥐 모델에서 이 플랫폼의 효능 검증을 소개합니다. 연구 결과는 EVLP가 사망한 기증자의 폐의 질을 크게 향상시켜 폐 이식을 위한 잠재적 기증자 풀을 확대할 수 있음을 나타냅니다. 이식을 위한 기증자 폐의 부족은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 일부 국가에서는 DCD 프로그램을 구현하기 시작했습니다28. 이 접근 방식은 생존 가능한 장기 이식편의 수를 늘리는 귀중한 전략을 제공합니다. 특히, 여러 연구에서 DCD 장기를 사용한 간 이식 후 장기 생존율은 DBD 장기를 사용한 장기와 비슷한 것으로 나타났습니다29,30. 그러나 DCD 기증자의 폐 활용은 장기간의 허혈로 인한 광범위한 손상으로 인해 여전히 제한적입니다31. DCD 기증자로부터 얻은 제한된 폐 자원의 효율적인 평가 및 활용은 이식 가능한 폐의 부족을 완화할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. EVLP는 폐의 질을 개선하고 이식 전 보존 시간을 연장할 수 있는 유망한 기술입니다. 4°C에서 냉장 보관과 비교하여 EVLP의 효과를 검증하기 위해 순환기 사멸의 쥐 모델을 사용했습니다. 우리는 관류 기술이 허혈-재관류 손상으로 인한 손상을 완화하고 순환기 사망 후 폐 기능을 향상시킬 수 있다는 가설을 세웁니다. 우리의 실험 결과는 Wang et al.32 및 Hasenauer et al.33이 보고한 최근 연구 결과와 일치합니다.

관류 회로 전체에서 일정한 온도를 유지하는 것은 최적의 EVLP 기능을 위해 중요합니다. 그러나 많은 기존 EVLP 시스템에는 안정적이고 적응 가능한 온도 제어 메커니즘이 부족합니다. 단일 열교환 시스템에는 특정 위치의 온도를 변경하는 조정이 필요한 경우가 많습니다. 이러한 온도 변동은 관류액의 구성에 영향을 미치고 산소화 지수 측정을 방해하며 궁극적으로 실험 결과의 정확성을 손상시킬 수 있습니다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 EVLP 시스템을 만들고 저장소, 폐동맥 관류 구역 및 장기실에 배치된 3개의 개별 수조 열교환기를 장착했습니다. 또한, 이 시스템은 최소 배관을 사용하여 열 손실을 최소화하고 4-40 ° C 범위 내에서 정확한 온도 조절을 보장합니다. 이 구성은 각 회로 세그먼트에서 측정된 온도가 설정점에서 ± 0.2°C 이하로 벗어나지 않는 매우 정확한 온도 제어를 가능하게 합니다. 이 설계는 EVLP 실험을 위한 엄격한 온도 제어 요구 사항을 효과적으로 충족합니다.

작은 동물 모델은 장기가 작기 때문에 특히 폐부종과 무기폐에 취약합니다34. 이러한 합병증은 장기간의 관류 실험을 수행하는 데 상당한 방해가 됩니다. 이러한 문제를 해결하고 관류 중 최적의 폐 보호를 보장하기 위해 우리는 임상 실습의 현재 표준인 토론토 접근 방식을 채택했습니다. 이 방법은 설정된 시간 프레임 동안 관류액 유속과 환기 모두를 점진적으로 증가시키는 것을 포함한다35. 관류는 목표 유속의 10%(심박출량의 20% = 75mL/min/250g 기증자 중량)에서 시작되었고 1시간에 걸쳐 점차적으로 증가했습니다. 유사하게, 환기는 낮은 속도(4mL/kg)로 시작되었고, 일회 호흡량은 10분에 걸쳐 최대 6mL/kg까지 점진적으로 증가하였다. 이 연구는 또한 관류액에 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하는 것의 이점을 강조합니다. BSA 보충은 콜로이드 삼투압을 높여 조직 부종을 감소시킵니다36. 소동물 EVLP에서는 심방 캐뉼라 삽입을 기반으로 하는 두 가지 주요 관류 구성인 폐쇄 루프와 개방 루프가 존재합니다. 폐쇄 루프 시스템은 심방 내에서 일정하고 낮은 압력을 유지하여 생리학적 상태를 모방하고 정확한 혈액 가스 측정을 용이하게 합니다. Linacr et al. 관류 중에 특정 심방압을 유지하면 폐 기능을 개선하고 부종을 줄일 수 있음이 입증되었습니다34. 그러나 심방근이 회로를 막는 경우 압력 스파이크가 발생할 수 있습니다. 또한 심방을 묶고 기포가 존재하면 잠재적인 심근 섬유 손상 및 일관되지 않은 압력 판독값으로 인해 실험 결과가 손상될 수 있습니다7. 이러한 한계를 극복하고 효과적인 폐쇄 루프 관류를 달성하기 위해 특별히 설계된 심방 캐뉼라가 만들어졌습니다. 이 캐뉼라는 심방근에 의한 폐쇄를 방지하기 위해 끝에 돌출된 보조기가 있습니다. 또한 캐뉼라 본체를 따라 있는 환형 홈은 안전한 결찰 배치를 용이하게 합니다. 또한, 이 시스템은 기포 트랩 (bubble trap) 과 사전 관류 기술을 통합하여 공기 색전증을 제거하고 일관된 관류 압력을 유지합니다.

소동물 EVLP 플랫폼은 통제된 동물 조건, 비용 효율성, 큰 표본 크기 수용, 낮은 관류액 소비 등 수많은 이점으로 인해 과학 연구에서 선호됩니다. 또한 단일 소동물 계통(예: 이 연구에서는 쥐뿐만 아니라 기니피그와 토끼 24,35,36)을 사용하면 식이요법과 실험 설정 모두를 세심하게 제어할 수 있습니다. 이 시스템의 다양성은 호흡 매개변수와 관류 유량을 조정하여 이러한 모든 종에 적응할 수 있게 해줍니다. 함께 제공되는 비디오는 동물 모델 및 EVLP 절차를 자세히 설명하여 연구자에게 포괄적인 이해를 제공합니다. 이러한 프로토콜을 따르면 연구자들은 실험 성공률을 높이고 동물의 고통을 최소화하며 전반적인 동물 사용을 줄일 수 있습니다.

이 연구를 통해 안정성, 관류 품질 및 조정 가능성 면에서 상용 옵션을 능가하는 소동물을 위한 저렴하고 모듈식이며 사용자 친화적인 EVLP 시스템을 확립했지만, 관류 및 환기 매개변수를 포함한 EVLP 프로토콜을 최적화하고 가장 효과적인 폐 보호 약물을 식별하기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. 이 사용자 친화적이고 효율적인 기술을 통해 인프라를 활용하여 많은 기증자 폐에 대한 성공적인 테스트를 가능하게 했습니다. 현재 연구 노력은 기증자의 폐 복원 및 보존에 중점을 두고 있습니다.

공개 사항

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 국가 국가 고위급 병원 임상 연구 기금 및 중일 우호 병원의 엘리트 의료 전문가 프로젝트(보조금 번호[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] 및 [ZRJY2021-GG07])의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3.0mm 의료 무균 튜브Zhifang 펌프 산업 유한 공사, 허베이, 중국3.0mm혈액 순환에서 혈관이 아닌
소 혈청 알부민시그마 - 알드리치 무역 Co.Ltd, 상하이, 중국BSAV-RO관류의 콜로이드 삼투압 향상
BP-100 / 102 혈관 내 혈압 변환기iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USABP-100 / 102쥐의 폐 혈관 압력에 대한 기록
CefazolinBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Beijing, ChinaPHR1291항균 감염
DeoxygenatorDongguan Kewei Medical Instrument, Guangdong, China모델 사양 없음쥐의 폐 기능 교체 혈액 내 가스 교환
F500 소동물용 전신 마취기Beijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Beijing, ChinaF500마취 제공을 위한 가스 마취 투
가스 혼합물(6% O2, 8% CO2, 86% N2)Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Beijing, China모델 사양 없음혈액 산-염기 균형 유지, 폐 혈관 생리학
시뮬레이션 열교환기Changhong Precision Instrument Center, Shenzhen, ChinaDHC-05-B관류 회로의 온도 제어
heparinBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Beijing, ChinaH0200000Anti-micro thrombosis
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, ChinaR510-22마취 쥐
격리 챔버Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, China의 손으로 만든모델 사양 없음쥐 폐 보관
i-STAT 1 휴대용 임상 분석기Abbott point of care, Inc, NJ, USA300G관류에서 혈액 가스 분석
iWorx RA-834 레코더iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USARA-834폐혈관 압력 신호 출력
다중 채널 연동 펌프 LabMateZhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, ChinaLabMate2관류 순환 과정에 에너지를 공급
PERFADEX PlusXVIVO Perfusion, Gothenburg, SwedenNA쥐 기증자의 폐는 사전 세척을 받았습니다. 저 칼륨 용액 
폐 캐뉼라스테인레스 스틸304 스테인레스 스틸/SUS3042.0/2.5 mm
폐 정맥 캐뉼라스테인레스 스틸304 스테인레스 스틸/SUS3044.0mm
QAH-INF-1 분석 키트Innopsys, Parcd'Activité s Activestre
R415 소동물 인공호흡기RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, ChinaR415쥐 폐
저수지Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, China용량 1L관류 저장
SOLU-MEDROLBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, 베이징, 중국M0639NA
온도 센서(TM-100)iWorx Systems, Inc, 뉴햄프셔, 미국TM-100폐 관류 온도 기록
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