Incorporating Target Protein Structure, Flexibility and Dynamics in Computational Drug Discovery Using Ensemble-Based Docking Analysis (앙상블 기반 도킹 분석을 사용한 컴퓨팅 약물 발견에 표적 단백질 구조, 유연성 및 역학 통합)

요약

컴퓨터 방법은 신약 개발을 촉진할 수 있는 가능성을 가지고 있지만 단백질 구조의 동적 특성을 간과하는 경우가 많습니다. 여기에서는 단백질 유연성을 간접적으로 통합하여 잠재적으로 약물 발견 노력의 정확성과 신뢰성을 향상시키는 앙상블 기반 도킹 분석에 대해 논의합니다.

초록

신약 개발 프로세스는 엄격하고 시간과 비용이 많이 드는 작업입니다. 신약 개발의 컴퓨팅 접근 방식을 통해 연구원은 추가 테스트를 위해 가장 유망한 화합물의 우선 순위를 지정할 수 있으며, 이는 필요한 리소스를 크게 줄여 신약 개발 파이프라인의 전반적인 효율성을 높입니다. 구조 기반 약물 발견은 표적 단백질의 구조 정보를 3차원 형식으로 필요로 하는 일반적인 접근 방식입니다. 그러나 현재 대부분의 컴퓨터 지원 약물 발견 전략의 한계는 리간드-단백질 도킹 시뮬레이션 중에 표적 단백질 구조의 유연성과 역학을 도입할 수 없다는 것입니다. 인듀티드 핏 도킹과 앙상블 기반 도킹은 모두 도킹 절차에서 단백질 유연성을 해결하는 것을 목표로 하지만, 후자는 시뮬레이션 전반에 걸쳐 여러 구조를 통합하여 동적 단백질 거동에 대한 보다 포괄적인 관점을 제공할 수 있습니다. 이 보고서에서는 분자 도킹 과정에서 표적 단백질 구조의 유연성과 역학을 간접적으로 도입하는 앙상블 기반 도킹 분석이라는 기술의 적용을 시연하고 논의합니다. 앙상블 기반 도킹 연구를 위해 선택된 단백질과 리간드는 각각 라이소자임(lysozyme)과 플로보카와인 B(Flovokawain B, FB)였다. FB는 이전에 라이소자임과 결합 활성을 갖는 것으로 보고되었습니다. 물이 있는 상태에서 라이소자임에 대해 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 수행하고 총 에너지, RMSD(root-mean-square deviation) 및 RMSF(root-mean-square fluctuation)를 조사했습니다. 형태 클러스터링은 여러 클러스터링 컷오프 값을 기반으로 생성되었으며 FB를 사용한 추가 도킹 분석을 위해 선택되었습니다. 클러스터 번호 2는 -29.37kJ/mol에서 가장 낮은 결합 에너지를 제공합니다. 결합력의 존재를 예상하기 위해 분자 도킹 이미지가 생성되었습니다. 단백질의 구조적 역학을 통합함으로써 앙상블 기반 도킹 접근 방식은 가능한 결합 시나리오의 범위를 더 잘 포착할 수 있으므로 결합 결과에 대한 보다 신뢰할 수 있는 예측으로 이어질 수 있습니다.

서론

컴퓨터 신약 개발(CDD)에서는 컴퓨터 과학, 화학, 생물학 및 물리학의 기술을 통합하여 방대한 화학 공간을 탐색하고, 약물 간 상호 작용을 예측하고, 기존 실험 방법만 사용하는 것에 비해 더 높은 효율성과 더 낮은 비용으로 약물 후보를 최적화합니다. 이는 새로운 치료 화합물 ^1,2,3의 발견 및 최적화를 가속화하기 위해 계산 방법과 알고리즘을 활용하는 강력한 접근 방식입니다. CDD는 신약 개발에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 단백질 3차원(3D) 구조 역학과 관련된 제한 사항이 있어 계산 예측의 정확성과 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다⁴. 단백질 3D 구조는 CDD에서 설계를 위한 템플릿 역할을 하거나 표적 단백질-약물 상호 작용을 기반으로 약물 후보를 최적화합니다. 단백질 구조에 대한 X선 결정학 모델은 단백질에 대한 귀중한 구조 정보를 제공하지만, 단백질 구조의 동적 특성과 정적 모델의 한계를 인식하는 것이 중요합니다 ^5,6,7. 또한 최근 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 및 AlphaFold와 같은 컴퓨터 예측의 발전으로 인해 단백질 유연성 및 역학의 전체 스펙트럼을 캡처하는 데 있어 구조 데이터의 가용성이 크게 확장되었습니다 8,9,10,11,12.

분자 역학(MD) 시뮬레이션은 시간 경과에 따른 원자와 분자의 움직임과 상호 작용을 시뮬레이션하여 단백질 3D 구조의 동적 거동과 유연성에 대한 통찰력을 제공합니다^13,14. MD 시뮬레이션은 다양한 구조적 상태를 나타내는 단백질의 3D 구조를 생성하는 데 사용되며, 이는 앙상블 기반 도킹 분석을 위한 입력으로 사용됩니다. 다양한 단백질 형태의 샘플링을 통해 앙상블 기반 도킹 분석은 생물학적 표적의 고유한 유연성과 역학을 고려하여 리간드 결합 모드 및 상호 작용에 대한 보다 포괄적인 탐색을 가능하게 합니다³.

단백질의 유연성을 이해하는 것은 약물이 생물학적 효과를 발휘하는 방식에 영향을 미치고, 결합 부위의 위치와 방향을 결정하며, 결합 역학, 신진대사 및 수송에 영향을 미치기 때문에 필수적입니다^15,16. 이러한 동적 특성을 포착하면 도킹 예측의 정확성과 신뢰성을 크게 향상시킬 수 있습니다. 1994년, Kearsley 등은 리간드와 단백질의 유연성을 모델링하는 프레임워크인 유연한 도킹 기술을 도입했습니다. 이 접근법은 도킹(docking) 중에 단백질의 형태가 조정될 수 있도록 하여 구조적 유연성을 고려하여 리간드-수용체 상호 작용의 예측을 향상시킵니다¹⁷. 이와 유사하게, 1999년에 Carlson 등은 HIV-1 인테그라제의 정적 및 동적 모델 모두에 유연한 약동체 모델링을 적용하는 앙상블 도킹(ensemble docking)에 대해 보고했으며, 이는 도킹 연구에서 단백질 역학을 고려하는 것의 중요성을 더욱 강조했다¹⁸. 또한, Cavasotto 등은 정상 모드 분석을 사용하여 도킹 프로세스에 수용체 유연성을 통합함으로써 리간드 도킹 정확도가 향상되었다고 보고했습니다¹⁹. 보다 최근에는 앙상블 기반 기술⁽20,21,22,23,24,25,26,27)이 잠재적인 새로운 리간드 결합 부위를 식별하고 자유 리간드-수용체 결합 에너지의 보다 정확한 추정치를 제공함으로써 약물 발견을 확장했습니다. 이러한 발전은 quadruplex-duplex DNA²⁰, 혈관 내피 성장 인자 165 (VEGF-165)²¹, SARS-CoV-2 표적 효소²², 인간 간 시토크롬 P450 효소²³ 및 항암 단백질²⁴와 같은 표적에 적용되었습니다.

플라보노이드(flavonoid)로 분류되는 플라보카와인 B(Flavokawain B, FB)는 다양한 약리학적 특성을 나타내는 것으로 기록되어 있습니다 28,29,30. 실험 및 컴퓨터 분석을 기반으로 FB는 항균 활성으로 널리 알려진 단백질 인 라이소자임 (LYZ) ³¹과 안정적인 복합체를 형성하는 것으로보고되었으며 리간드 수송체^{32 , 33 , 34} 로도 확인되었습니다. 이 보고서에서는 FB-LYZ 복합체 형성에서 단백질 유연성의 영향을 통합하기 위해 앙상블 기반 도킹 분석을 사용하여 FB와 LYZ의 상호 작용 특성을 추가로 분석합니다. 이 방법의 목표는 연구원에게 앙상블 기반 도킹 분석을 위한 단계별 반복 가능한 프로세스를 제공하는 것입니다. 또한 연구자는 연구를 위해 표적 유기체에서 단백질 구조를 선택하는 것이 좋습니다.

프로토콜

1. Flavokawain B 리간드 구조 준비

1. PubChem 웹 사이트를 엽니다. Flavokawain B를 검색합니다. 다운로드를 선택하고 SDF 2D 구조에 대해 Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL SDF로 저장을 선택합니다.
2. Avogadro 소프트웨어를 엽니다. SDF 파일을 소프트웨어의 빈 공간으로 이동합니다. 예를 클릭합니다.
   참고: Avogadro 소프트웨어는 3차원(3D) 형상을 자동으로 구축합니다.
3. 탭에서 그림 1과 같이 아이콘을 클릭합니다. 왼쪽 메뉴 탭에서 힘 필드를 MMFF94^35,36으로 변경합니다. 업데이트당 단계를 15로 조정합니다. 알고리즘을 Steepest Descent로 설정하고 Start를 클릭합니다.
   참고: 회전이 진행되는 동안 원자를 이동하지 마십시오. 완료되면 중지를 클릭합니다. MMFF94는 광범위한 저분자 리간드(중성 및 전하 리간드 포함)에 적합하며 에너지 최소화 및 분자 모델링에 널리 사용됩니다³⁷. 최강하강법(Steepest Descent method)은 간단하고 계산적으로 효율적이며 큰 구조적 변형을 제거하고 기본 최소화 상태 38,39,40을 달성하는 데 효과적이기 때문에 초기 에너지 최소화를 위해 선택됩니다.
4. 메뉴 탭에서 File(파일 )로 이동하여 Save As(다른 이름으로 저장 )를 클릭합니다. Save Molecule As 폴더가 나타나면 파일 이름을 ligand.pdb 로 쓰고 Save를 클릭합니다 .

2. 라이소자임 단백질 구조 준비

1. RCSB 단백질 데이터 뱅크 웹 사이트를 엽니다. 라이소자임(lysozyme)을 검색하고, 코드: 1LYZ를 입력합니다. 파일 다운로드를 클릭하고 PDB 형식을 선택합니다. 1lyz.pdb로 저장합니다.
2. Chimera 소프트웨어를 엽니다. 탭에서 File and Open(파일)을 클릭합니다. 폴더에서 1lyz.pdb 파일을 선택합니다.
   참고: 라이소자임의 3D 구조는 소프트웨어를 사용하여 구성됩니다.
3. 탭에서 Select > Residue > HOH를 클릭합니다. 그런 다음 Actions > Atom/Bonds > Delete를 클릭합니다. Select and Clear Selection(선택 및 선택 지우기)을 클릭합니다.
   참고: 이렇게 하면 단백질에서 수분이 제거됩니다.
4. 탭에서 > 체인 > A를 선택합니다. 그런 다음 도구 > 구조 편집 > AddH를 클릭합니다. 매개변수 상자가 나오고 기본값으로 유지됩니다. 확인을 클릭합니다. Select and Clear Selection(선택 및 선택 지우기)을 클릭합니다(그림 2).
   참고: 이렇게 하면 단백질에 수소가 추가됩니다. 히스티딘 잔기는 또한 양성자화되어 중성 시스템을 생성합니다. 이 소프트웨어는 PROPKA^41,42를 통합하여 pKa 계산을 수행할 수 있습니다.
5. 그런 다음 Tools(도구), Structure Editing(구조 편집) 및 Add Charge(요금 추가)를 클릭합니다. 매개변수 상자가 나옵니다. Gasteiger를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 참고: 이렇게 하면 단백질에 부분 전하가 추가됩니다.
6. 파일을 저장하려면 탭에서 파일 > PDB 저장을 클릭합니다. protein.pdb로 저장합니다.
   참고: 이 연구에서는 이전에 보고된 결과³¹과 비교하기 위해 라이소자임의 구조를 선택했습니다. 독자는 관심 있는 표적 유기체에서 단백질 구조를 신중하게 선택하는 것이 좋습니다.

3. 물 중 라이소자임의 MD 시뮬레이션

참고: 이 연구에 사용된 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 위한 맞춤형 컴퓨터는 CPU용 Intel CORE i7 11^세대, GPU용 NVIDIA GeForce RTX 2060 및 DDR4 128GB 메모리입니다. OS 시스템은 Ubuntu 22.04.4 LTS입니다. MD 시뮬레이션은 GROMACS 소프트웨어를 사용합니다. GPU 지원은 CUDA입니다.

1. 이 링크에서 필요한 모든 문서를 다운로드하십시오: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (GROMACS Tutorial, Lysozyme in Water)⁴³.
   참고: 필요한 문서는 em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff 및 protein.pdb (2.5단계)입니다. 시스템 설정의 경우 em.mdp 는 에너지 최소화를 위한 것이고 ions.mdp 는 이온을 추가하고 시스템을 중화하는 것입니다. 평형을 위해 nvt.mdp 는 온도 평형을 위한 것이고 npt.mdp 는 압력 평형을 위한 것입니다. 프로덕션의 경우 md.mdp 는 시뮬레이션용입니다. Charmm36 ff 는 토폴로지용입니다.
2. 폴더(작업 디렉토리)의 빈 공간을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Open Terminal(터미널 열기 )을 클릭합니다. gmx 를 입력하여 GROMACS 소프트웨어를 엽니다. 참고: GROMACS에는 그래픽 사용자 인터페이스가 없습니다. 그것은 모두 터미널에 작성된 명령에서 가져온 것입니다.
3. 단백질 토폴로지 생성의 경우 gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh를 입력합니다. 역장 목록이 제공되며 CHARMM 모든 원자 역장⁴⁴에 대해 유형 1, 물 모델에 대해 TIP3P에 대해 유형 1이 제공됩니다.
   참고: 업데이트된 버전인 CHARMM36도 사용할 수 있으며 http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml⁴⁵에서 다운로드할 수 있습니다.
4. 전체 단백질 구조를 포함하는 입방체 상자를 정의합니다. gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic을 입력합니다. 참고: 단백질은 상자 가장자리에서 최소 1nm 떨어진 곳에 배치됩니다. 물 상자 크기가 단백질, 용매 및 이온을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 또한 워터 박스는 단백질의 주기적 이미지 간의 상호 작용을 방지하기에 적합해야 합니다. 단백질과 상자 가장자리 사이의 권장 최소 거리는 최소 1.0–1.5nm입니다.
5. 용매 구성⁴⁶의 경우 gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro를 입력합니다.
6. gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro를 입력하여 나트륨 및/또는 염화물과 같은 이온을 추가합니다.
   참고: 나트륨 및/또는 염화물 이온은 시스템을 중화하는 데 사용됩니다.
7. gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral을 입력하여 시스템을 무력화합니다. SOL 그룹에 대해 13을 선택합니다.
   참고: 라이소자임(lysozyme)의 경우 8개의 용질 분자가 염화물 이온으로 대체되었습니다(그림 3).
8. CHARMM 36 파일에서 ions.itp 폴더를 검색합니다. chloride ion의 약어는 CLA입니다.
9. topol.top 파일을 열고 그림 4와 같이 CLA와 숫자 8을 추가합니다.
10. solv_ions.gro 파일을 열고 모든 CL을 CLA로 교환합니다.
    참고: solv_ions.gro 및 topol.top 파일이 각 이온의 약어가 동일한지 확인하지 않으면 경고가 표시됩니다. 이온 이름 변경은 CHARMM 36 ff 파일 버전에 따라 수행됩니다. chloride의 약어는 이미 CL이므로 이전 버전에서는 이온 이름을 바꿀 필요가 없습니다. 그럼에도 불구하고 항상 이온 약어를 확인하십시오.
11. 최대 50,000걸음으로 가장 가파른 하강 에너지를 최소화하여 단백질 구조를 이완합니다. 이를 위해 gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr 다음에 gmx mdrun -v -deffnm em을 입력합니다.
    참고: 용매와 이온은 (i) 입자 수(N), 시스템 부피(V) 및 온도(T)가 일정하고(NVT), (ii) 입자 수(N), 시스템 압력(P) 및 온도(T)가 일정(NPT)의 두 단계로 단백질 주위에서 평형을 이룹니다. 온도 커플 링 (NVT 위상)은 수정 된 Berendsen 온도 조절기를 기반으로 300K로 설정되고 압력 커플 링 (NPT 위상)은 Parrinello-Rahman을 기반으로 1bar로 설정됩니다. 장거리 정전기 상호 작용 및 최근접 이웃 검색은 각각 PME(particle-mesh Ewalt) 방법과 Verlet 알고리즘을 사용하여 자동으로 계산됩니다.
12. NVT의 평형을 위해 gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr 다음에 gmx mdrun -v -deffnm nvt를 입력합니다.
    참고: 온도 평형에 걸리는 시간은 CPU와 GPU에 따라 약 5분입니다. 시스템 평형의 경우 시뮬레이션 시간은 100ps입니다.
13. NPT의 평형을 위해 gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr 다음에 gmx mdrun -v -deffnm npt를 입력합니다.
    참고: 압력 평형에 걸리는 시간은 CPU 및 GPU에 따라 약 5분입니다. 시스템 평형의 경우 시뮬레이션 시간은 100ps입니다.
14. 시스템이 1ns 동안 평형 실행을 거친 후 100ns 기간의 mdrun 함수를 사용하여 프로덕션 실행을 수행하도록 합니다. md.mdp 파일을 엽니다. n 단계에서 50000000; 2 ' 50000000 = 100000ps(100ns)로 변경합니다.
15. 분자 역학 생성의 경우 gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr 다음에 gmx mdrun -v -deffnm md를 입력합니다.
    참고: 이 시간은 약 ~2일입니다. MD 시뮬레이션에서 생성된 궤적 프레임은 10ps 간격으로 캡처되어 RMSD(Root Mean Square Deviation) 기반 클러스터링 분석에 활용됩니다.

4. RMSD 기반 클러스터링 분석

1. MD 시뮬레이션 후 명령 분석을 계속합니다. 단백질은 단위 세포를 통해 확산되어 상자 반대편으로 "부서지거나" "점프"하는 것처럼 보일 수 있습니다. 유형 gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -당신의 컴팩트. 유형 1은 단백질의 중심을 맞추고, 0은 시스템 출력을 나타냅니다. vmd em.gro를 입력하여 단백질을 시각화합니다.
2. 총 에너지 해석의 경우 gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg를 입력하고 총 에너지에 대해 14 를 계속 입력합니다.
   참고: 총 에너지의 모니터링은 MD 시뮬레이션의 신뢰성과 정확성을 보장하기 위한 기본이다^47,48.
3. RMSD 분석의 경우 gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns 를 입력합니다.계속해서 최소 제곱 피팅의 C-alpha에 대해 3 을 입력하고 RMSD 계산의 C-alpha에 대해 3 을 입력합니다(그림 5).
4. RMSF 분석의 경우 gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res를 입력합니다. 단백질에 대해 1 을 계속 입력하십시오.
5. grace를 사용하려면 xmgrace totalenergy.xvg 명령을 입력합니다. 그래프 상자 선을 두 번 클릭하여 축을 조정합니다. 그레이스: 도끼(Grace: Axes ) 상자가 나타납니다. 수락을 클릭합니다.
6. 탭 메뉴에서 File and Print_setup( 파일 및 ) 을 클릭합니다. 유예: 장치 설정이 나타납니다. 장치를 PostScript 에서 JPEG로 변경합니다. 수락을 클릭합니다. 이제 파일 메뉴에서 인쇄 를 클릭합니다. totalenergy.jpg으로 저장합니다.
7. xmgrace rmsd.xvg 및 xmgrace rmsfxvg에 대해 4.5단계와 4.6단계를 반복합니다.
8. 클러스터 분석의 경우 gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0 을 입력합니다.계속해서 유형 1 (단백질 그룹)을 사용하여 최소 제곱 적합도를 계산하고 시스템 출력에 대해 RMSD 및 유형 1 (단백질 그룹)을 계산합니다.
   참고: 클러스터링 결과에 따라 컷오프 값을 조정합니다. -cl 명령은 각 클러스터에 대한 평균 출력을 나타냅니다.
9. cluster-size.xvg를 엽니다.
   1. 제공된 정보에 따라 클러스터 수가 적은 경우 RMSD 차단 값을 늘리거나 클러스터 수가 높은 경우 RMSD 차단 값을 줄입니다.
10. 다른 컷오프 값으로 4.8단계를 반복합니다.
    참고: 다음 기준에 따라 최적의 RMSD 차단 값이 결정될 때까지 서로 다른 차단 값으로 클러스터링: (1) 총 클러스터 수는 30개 미만으로 제한되어야 합니다. (2) 구성원이 하나뿐인 클러스터의 존재를 최소화하는 것이 바람직합니다. (3) 궤적의 90% 이상이 10개 미만의 군집으로 표현되는 것이 바람직하다.
11. Chimera 소프트웨어를 열고 cluster.pdb 를 검색합니다.
    참고: cluster.pdb에는 각 클러스터 그룹의 평균이 포함되어 있습니다.
12. Presents and Publication 1(실루엣, 둥근 리본)을 클릭합니다.
13. 그런 다음 파일 > 이미지 저장 > 저장으로 이동합니다.
14. cluster.pdb >> 체인 > (ID 없음) 선택을 클릭합니다. 선택(Select) > 반전(모든 모델)을 클릭합니다. Actions > Atoms/Bonds(원자/결합)를 클릭하여 삭제합니다>.
    참고: 이렇게 하면 클러스터 1을 제외한 모든 그룹 클러스터가 제거됩니다.
15. 그런 다음 파일로 이동하여 PDB를 > 저장> 저장합니다. cluster1.pdb로 저장합니다.
16. 다른 클러스터에 대해 4.11–4.15단계를 반복합니다. cluster2.pdb, cluster3.pdb 및 cluster4.pdb 로 저장합니다.
    참고: 상위 4개 클러스터의 총 수가 전체 궤적의 90% 이상이기 때문에 상위 4개 클러스터의 각 대표자를 추출하고 키메라를 사용하여 분자 도킹 분석을 수행합니다( 그림 6 참조).

5. 앙상블 기반 도킹

1. Autodock Tools 소프트웨어를 두 번 클릭합니다.
   참고: 도킹을 위해 이 연구에서는 AutoDock 및 AutoDock 도구 소프트웨어 ^13,49,50,51을 사용했습니다.
2. cluster1.pdb 파일과 ligand.pdb 파일을 새 폴더에 넣습니다.
3. 메뉴에서 File > Preferences > Set를 클릭합니다. 사용자 기본 설정 지정 상자가 나타납니다. "새 폴더"의 주소를 텍스트로 복사합니다. 시작 디렉토리의 사용자 기본 설정 지정 상자에 있는 주소를 붙여넣습니다. 설정을 클릭합니다.
   참고: Windows OS를 사용하는 경우 이 단계는 중요한 단계입니다.
4. 파란색 폴더 이미지를 클릭합니다. read molecule 폴더가 나타납니다. cluster1.pdb를 선택합니다.
   참고: Autodock 도구는 단백질 분자 구조를 읽습니다.
5. > 요금 편집을 클릭하여 Kollman 요금을 추가합니다>.그런 다음 확인을 클릭합니다. > Hydrogens 편집>(Edit Hydrogens)을 클릭하여 Non-polar(비극성)를 병합합니다.
   참고: Kollman 전하가 단백질에 추가됩니다.
6. Grid(그리드) > Macromolecules>(거대분자)를 클릭하여 선택합니다. 거대분자 선택 상자가 나타납니다. cluster1을 선택하고 Select Molecules를 클릭합니다. 확인을 클릭합니다. 수정된 AutoDock4 Macromolecule 파일이 나타납니다. cluster1.pdbqt로 저장합니다.
7. Edit > Delete > Delete All Molecules를 클릭하여 작업 공간을 비웁니다. 계속을 클릭합니다.
8. 리간드를 클릭하여 Open> 입력>. Autodock4 폴더에 대한 리간드 파일이 나타납니다. 모든 파일을 선택하고 ligand.pdb를 선택한 다음 열기를 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
   참고: 설정 리간드에는 Gasteiger 전하의 통합과 비극성 수소의 병합이 포함됩니다.
9. Ligand > Torsion Tree > Detect root를 클릭합니다.
10. 리간드 > 출력 > PDBQT로 저장을 클릭합니다. Formatted Autotors Molecules 폴더가 나타납니다. ligand.pdbqt로 저장합니다.
11. Edit > Delete > Delete All Molecules를 클릭하여 작업 공간을 비웁니다. 계속을 클릭합니다.
    참고: 5.6단계에 설명된 것과 동일한 절차를 따릅니다.
12. Grid > Macromolecules > Open을 클릭합니다. cluster1.pdbqt를 선택하고 열기를 클릭합니다. 예를 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
13. 그리드(Grid)를 클릭하여 열린 리간드(Open Ligand)> 맵 유형을 >.ligand.pdbqt를 선택하고 열기를 클릭합니다.
    참고: 작업 공간에는 단백질과 리간드가 있습니다.
14. 그리드 및 그리드 상자를 클릭합니다. 그리드 옵션 상자가 나타납니다. Number of points in x-dimension(x 차원의 점 수)에서 매개변수를 120으로 조정하고, y 차원의 점 수를 120으로, z 차원의 점 수를 120으로 설정합니다. 간격(옹스트롬)을 0.375로 설정합니다. Center Grid Box 매개변수는 기본값으로 둡니다. 파일을 클릭하고 현재 저장을 닫습니다.
    참고: 그리드 박스는 전체 단백질을 덮고 있으며, 이는 블라인드 도킹을 의미합니다.
15. Grid > Output > Save GPF 를 클릭합니다.그리드 매개변수 출력 파일이 나타납니다. 파일 이름에 grid.gpf를 입력하고 저장을 클릭합니다.
16. 실행을 클릭하고 AutoGrid를 실행합니다. 자동 그리드 실행 상자가 나타납니다. Parameter Filename 탭에서 Browse를 클릭합니다. 자동 그리드 매개변수 파일이 나타납니다. grid.gpf를 선택합니다. 열기를 클릭합니다. 프로그램 경로 이름에서 찾아보기>. autogrid4 파일이 나타납니다. autogrid4.exe 검색하고 Open > Launch를 클릭합니다.
    참고: 폴더 이름에 공백이 포함되어 있지 않으면 실행 중에 오류가 발생할 수 있습니다. 폴더 autogrid4.exe 는 https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/ 에서 설치할 수 있습니다.
17. Docking > Macromolecules(거대분자)를 클릭하여 고정 파일 이름을 설정합니다>. PDBQT 거대분자 파일이 나타납니다. cluster1.pdbqt를 선택하고 열기를 클릭합니다.
18. Docking(도킹) > Ligand(리간드> 도킹)를 클릭합니다. 리간드 선택(Choose Ligands) 상자가 나타납니다. 리간드를 선택하고 리간드 선택(Select Ligand)을 클릭합니다.AutoDpf4 리간드 매개변수 상자가 나타납니다. 수락을 클릭합니다.
19. Docking > Genetic Algorithm> 매개 변수를 검색합니다. 유전 알고리즘 매개 변수 상자가 나타납니다. GA 실행 수를 100 으로 변경합니다.나머지 매개변수는 기본값으로 둡니다. 수락을 클릭합니다.
20. Docking > Output > Lamarckian GA(4.2)를 클릭합니다. Autodock4.2 GALS 도킹 매개변수 출력 파일이 나타납니다. 파일 이름으로 docking.dpf를 입력하고 저장을 클릭합니다.
21. 실행을 클릭하여 AutoDock> 실행합니다. 자동 도크 실행 상자가 나타납니다. Parameter Filename(매개 변수 파일 이름)에서 Browse(찾아보기)를 클릭합니다. autodock4 매개변수 파일이 나타납니다. docking.dpf를 선택합니다. 열기를 클릭합니다. Program Pathname(프로그램 경로 이름)에서 Browse(찾아보기)를 클릭합니다. autodock4 파일이 나타납니다. autodock4.exe 검색하고 열기를 클릭합니다. 시작을 클릭합니다.
    참고: 폴더 이름에 공백이 포함되어 있지 않으면 실행 중에 오류가 발생할 수 있습니다. 소요 시간은 ~30분입니다. 폴더 autodock4.exe 는 https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/ 링크를 사용하여 설치할 수 있습니다.
22. 5.7단계에서 설명한 대로 모든 분자를 삭제합니다.
23. cluster2.pdb, cluster3.pdb 및 cluster4.pdb 에 대해 5.1–5.22부터 단계를 반복합니다.
    참고: 4개의 도킹 그룹이 모두 분석에 사용됩니다.

6. 앙상블 기반 도킹 해석

1. AutoDock 도구 소프트웨어를 사용하여 해석을 계속합니다. Analyze > Docking > Open을 클릭합니다. 도킹 로그 파일이 나타납니다. docking.dlg를 선택하고 열기를 클릭합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
2. Analyze(분석) > macromolecules > Open(거대분자)을 클릭합니다.
3. Analyze > Conformations > Play(플레이)를 클릭하여 에너지별로 순위가 매겨집니다. 리간드 상자가 나타납니다.
4. 새 폴더에서 메모장을 사용하여 docking.dlg 폴더를 엽니다. 군집 해석 구조를 검색합니다. 주어진 정보에서 결합 에너지가 가장 낮은 conformation run ( Run으로 명시 됨)을 검색하십시오.
   참고: 100개의 형태가 실행되기 때문에 리간드와 단백질 사이에 가장 강한 결합 친화도를 가진 것은 하나뿐입니다. 가장 낮은 결합 에너지에 대한 용어는 더 강한 결합 친화도를 갖는 것으로 정의됩니다 52,53,54.
5. 6.3단계(리간드 상자)에서 변형 실행(6.4단계)을 입력하고 Enter를 누릅니다.
   참고: 리간드는 그에 따라 단백질 내부에 위치합니다.
6. 리간드 상자에서 버튼 열기 패널을 클릭하여 재생 옵션을 변경합니다. 재생 옵션 설정상자가 나타납니다. Write Complex를 클릭합니다. 수용체 폴더의 쓰기 복합체가 나타납니다. complex.pdb 로 저장합니다.
   참고: 4개의 클러스터 그룹이 있으므로 클러스터 그룹 1의 경우 complex1.pdb와 같이 complex.pdb 파일의 이름을 적절하게 지정할 수 있습니다.
7. Chimera 소프트웨어를 열고 complex.pdb 를 검색합니다(6.6단계 참조).
8. 사전 설정 > Interactive 1(리본) > Publication 1(실루엣, 둥근 리본)을 클릭합니다.
9. 그런 다음 파일로 이동하여 이미지 저장을 클릭합니다.
   참고: 저장된 이미지는 FB-LYZ 단지의 리본 구조입니다.
10. 사전 설정 > Interactive 3(소수성 표면) > Publication 1(실루엣, 둥근 리본)을 클릭합니다.
    참고: 저장된 이미지는 FB-LYZ 복합체의 풍선 구조입니다.
11. Discovery Studio 소프트웨어를 엽니다.
12. complex.pdb를 소프트웨어의 빈 공간으로 드래그합니다.
13. 도구 탭을 클릭하고 2D 다이어그램 표시를 선택합니다.
    참고: 소프트웨어는 단지의 2D 구조를 자동으로 생성합니다 (그림 7).
14. 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭합니다. 파일 이름을 쓰고 저장을 클릭합니다.

결과

최적화 후 FB의 화학 구조와 3D 구조 표현은 그림 8A에 나와 있습니다. 그림 8B는 MD 시뮬레이션 이전 초기 상태에서 pdb 코드 1LYZ를 사용하는 라이소자임의 3D 구조를 보여줍니다. 라이소자임 3D 구조의 역학과 유연성을 연구하기 위해 100ns에 대한 MD 시뮬레이션을 수행했습니다. 단백질 구조의 총 에너지는 그림 9A에서 볼 수 있듯이 시뮬레이션 중에 안정적이었습니다. MD 시뮬레이션의 처음 20ns에서는 RMSD 값이 증가한 것으로 나타났고, 그 후 RMSD 값이 안정화되었습니다(그림 9B). RMSF 분석 결과, MD 시뮬레이션 기간 동안 큰 변동을 겪은 잔기는 단백질 말단까지의 잔기수가 40-50, 60-80, 100인 것으로 나타났습니다...

토론

컴퓨터 약물 발견에서 앙상블 기반 응용 프로그램에는 결정 구조, 핵 자기 공명(NMR) 연구 또는 분자 역학 시뮬레이션에서 파생된 수많은 구조적 앙상블을 활용하는 것이 포함됩니다²⁶. 여러 계산 구조를 활용하면 분석에 단백질 구조의 역학과 유연성을 통합할 수 있으므로 잠재적인 약물 후보를 식별하는 데 있어 정확성과 신뢰성이 향상됩니다.

앙상블 기반 도킹 분석을 적용하려면 몇 가지 주요 단계를 따라야 합니다. 첫째, 실험 데이터 또는 이 연구에서는 일련의 형태가 컴퓨터 시뮬레이션에서 생성되었습니다. 이러한 형태는 표적 단백질의 고유한 유연성과 구조적 가변성을 포착합니다. 최근 연구에서는 분자 역학 시뮬레이션의 구현을 통합하여 구조적 변화를 포착하고 알로스테릭 부위를 탐색하여 새로운 결합 포켓과 잠재적인 약물 표적을 발견했습니다⁵⁸. 다음...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AutoDock	스크립스 연구소, 미국	버전 4.2.6
AutoDock 도구	스크립스 연구소, 미국	버전 1.5.6
Avogadro	Geoffrey R Hutchison, 피츠버그 대학교 화학과, 피츠버그, 미국	버전 1.95
디스커버리 스튜디오	다쏘 시스템; mes, 매사추세츠, 미국	버전 2021
GROMAC 흐	로닝언 대학교 왕립 공과대학 스웨덴 웁살라 대학교	버전 2023
바이오컴퓨팅, 시각화 및 정보학을 위한 UCSF 키메라 리소스 캘리포니아 대학교	버전 1.16