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방법 논문

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡 정량화

2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

2024년 11월 8일

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

이 논문에서

요약

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡은 세포 생물 에너지학의 중요한 지표입니다. 여기에서는 다양한 효모 종에 적용할 수 있는 이 표현형을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

신진대사는 주로 세포 에너지의 가용성과 환경 조건에 의해 조정됩니다. 세포가 다양한 영양 및 환경 조건에 따라 에너지 대사에 어떻게 적응하는지 알기 위한 분석은 분자 메커니즘을 규명하는 데 귀중한 정보를 제공합니다. 산화적 인산화는 대부분의 세포에서 ATP의 주요 공급원이며, 미토콘드리아 호흡 활성은 산화적 인산화의 핵심 구성 요소로서 ATP 합성을 위한 미토콘드리아 막 잠재력을 유지합니다. 미토콘드리아 호흡은 종종 세포 맥락이 결여된 고립된 미토콘드리아에서 연구됩니다. 여기에서는 효모 온전한 세포에서 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 모든 효모 종에 적용되지만 일반적으로 Saccharomyces cerevisiae 세포에 사용되었습니다. 먼저 특정 조건에서의 효모 성장을 테스트합니다. 그런 다음 세포를 세척하고 1:1 비율(w/v)로 탈이온수에서 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 지속적으로 교반하면서 산소 농도계 챔버에 넣고 Clark 전극을 사용하여 산소 소비량을 정량화합니다. 일부 분자는 챔버에 순차적으로 배치되고 전자 전달 사슬 또는 ATP 합성에 대한 이러한 효과에 따라 선택됩니다. ATPase 억제제인 올리고마이신(oligomycin)을 먼저 첨가하여 ATP 합성과 관련된 호흡을 측정합니다. 그 후, 최대 호흡 용량을 측정하기 위해 언커플러를 사용합니다. 마지막으로, 미토콘드리아 호흡과 관련이 없는 산소 소비를 버리기 위해 전자 전달 사슬 억제제의 혼합물을 첨가합니다. 데이터는 선형 회귀를 사용하여 분석되어 산소 소비율을 나타내는 기울기를 얻습니다. 이 방법의 장점은 효모 미토콘드리아 호흡에 특이적이어서 세포 맥락을 유지한다는 것입니다. 미토콘드리아 호흡 정량화에 사용되는 억제제는 효모 종에 따라 다를 수 있다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.

서론

미토콘드리아는 대부분의 세포에서 ATP의 주요 공급원이기 때문에 세포 생물 에너지학에서 근본적인 역할을 하며, 여러 경로가 수렴하고 미토콘드리아 경로의 활성에 의존합니다1. 산화적 인산화는 전자수송계를 통한 전자수송을 결합하여 산소를 감소시키고F1F 0-ATPase 활성을 감소시키고 전자플럭스 2로 인해 생성된 미토콘드리아 막 전위를 사용하여 ATP를 합성하는 ATP 합성에 필요합니다. 따라서, 미토콘드리아 호흡은 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)3의 일부이다.

미토콘드리아 호흡 사슬은 4개의 복합체 또는 경우에 따라 효모 복합체 I-결핍(예: Saccharomyces cerevisiae), 3개의 복합체 및 3개의 탈수소효소 단백질로 구성됩니다4. 호흡기 복합체는 내부 미토콘드리아 막에 국한되어 있습니다. 일부 효모는 복합체 I(NADH 탈수소효소) 또는 3개의 NADH 탈수소효소, 유비퀴논(Co Q), 복합체 II(숙시네이트 유비퀴논 산화환원효소), 복합체 III(유비퀴논 시토크롬 산화환원효소), 시토크롬 c(Cyt c) 및 복합체 IV(사이토크롬 c 산화효소)5,6를 가진 표준 전자 전달 사슬을 나타냅니다.. 복합체를 통한 전자 수송은 미토콘드리아 매트릭스에서 막간 공간으로 양성자를 펌핑하여 미토콘드리아 막 전위7을 형성할 수 있습니다. 막간 공간에 위치한 양성자는F1F0-ATPase에 의해 미토콘드리아 매트릭스를 향해 역방향으로 펌핑되어 펌핑된 4개의 양성자당 하나의 ATP 분자를 합성합니다8.

미토콘드리아 호흡 측정은 미토콘드리아 무결성, 세포 생체 에너지 및 미토콘드리아 호흡 능력에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다9. 미토콘드리아 호흡 기능은 다양한 기술을 사용하여 in vitro 또는 in siteu에서 분석할 수 있습니다. 그러나 온전한 세포에서의 미토콘드리아 호흡 분석은 전체 세포를 사용할 때 세포와 환경의 상호 작용 및 세포 내 대사를 고려하기 때문에 전체 세포 대사를 구성하기 때문에 일련의 이점을 제공할 수 있습니다10. 또한, 온전한 세포를 사용하면 다양한 실험 조건을 쉽게 평가할 수 있으며 분리된 미토콘드리아에서 관찰할 수 없는 최소한의 변화를 감지할 수 있습니다10,11. 온전한 세포에서 미토콘드리아 호흡 정량화의 또 다른 장점은 미토콘드리아 증식 및 국소화의 효과가 유지된다는 것입니다12.

온전한 세포에서 포유류의 미토콘드리아 호흡은 효모와 같은 다른 진핵 생물에 대한 연구를 제쳐두고 매우 상세하게 기술되어 있습니다12. 여기에서는 포유류 프로토콜에서 효모에 적응된 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 기술을 제안합니다. 따라서 미토콘드리아 호흡에 대한 포유류 정량화의 개념이 이 기술에 활용되었습니다. 예를 들어, 이 기술은 포유류 프로토콜로 여러 단계로 나뉩니다: 1) 기저 호흡(기질 의존), 2) ATP 연계 호흡(ATP 합성효소 억제를 통해), 3) 최대 호흡 능력(내부 미토콘드리아 막을 통한 양성자의 투과성을 허용하는 언커플러 사용), 4) 미토콘드리아 호흡 억제(호흡 사슬 억제제의 혼합을 사용하여 다른 공급원의 산소 소비를 버리는 것 미토콘드리아 호흡)11,13. 따라서 본 논문은 효모의 미토콘드리아 호흡을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

1. 배양 배지 및 접종물 준비

  1. 증류수 100mL에 효모 추출물 1g, 카제인 펩톤 2g, 포도당 2g을 첨가하여 효모 추출물-펩톤-포도당 배지(YPD) 100mL를 준비합니다. 3mL를 10mL 유리 시험관에 분배하고 121°C에서 1.5psi에서 15분 동안 멸균합니다.
    참고: 배지는 최대 1개월 동안 4 - 8 °C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 3mL의 YPD 배지가 들어 있는 10mL 유리 시험관에 250μL의 -20°C 글리세롤 보존 효모 세포를 접종합니다. 200 rpm 및 30 ° C에서 일정한 교반으로 밤새 배양하십시오.
    참고: 온도 배양은 일부 효모 종에서 다를 수 있습니다(예: Kluyveromyces marxianus 의 최적 성장 온도는 37°C).
  3. 페트리 접시(60 x 15mm2)에 멸균 2% YPD 한천(증류수 950mL에 효모 추출물 10g, 카제인 펩톤 20g, 포도당 20g, 세균 한천 20g 추가)을 채우고 멸균 루프를 사용하여 10mL 유리 시험관에서 자란 효모 세포로 페트리 접시에 줄무늬를 만듭니다. 고립된 군체가 나타날 때까지 페트리 접시를 30°C에서 배양합니다.
  4. 2% 포도당에서 3mL의 YPD 배지를 포함하는 멸균 10mL 유리 시험관에 페트리 접시에서 2개 또는 3개의 효모 분리 콜로니를 접종하여 접종 전 접종을 준비합니다. 30 ° C에서 지속적으로 교반하면서 밤새 배양하십시오.

2. 생장 조건 및 실험 설계

  1. 초기 OD600 ~ 0.1에서 효모 배양액으로 멸균 합성 완전 배지 100mL(SC 배지, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 0.18g, 황산암모늄 0.5g, 인산암모늄 0.2g, 효모 합성 탈락 보충제 1g 및 포도당)를 함유한 500mL 삼각 플라스크를 접종하고, 즉, 약 3mL의 하룻밤 사전 접종 (OD600 ~ 3)입니다. 환경 조건을 설정하거나 미토콘드리아 호흡에서 테스트할 화학적 챌린지를 보충합니다(예: 100μM 레스베라트롤 추가). 화학적 챌린지에 대한 별도의 플라스크에 차량 제어 장치를 준비합니다. 최소 3개의 생물학적 복제를 테스트합니다.
    참고: 분석에서 영양 잡음을 버리기 위해 최소한의 배지를 사용하는 것이 좋으며, 이 시점에서 제안된 최소 배지는 S. cerevisiae 에 사용되며 다른 효모 종에 따라 다를 수 있습니다. 마지막으로, 배양 배지에 보충된 포도당 농도는 포도당 억제 또는 미토콘드리아 호흡을 억제하는 크랩트리 효과를 피하는 데 중요합니다. 0.5%(w/v) 미만의 농도는 S. cerevisiae의 높은 성장률을 동반한 미토콘드리아 호흡에서 좋은 반응을 보였습니다. 크랩트리 음성 효모에서 높은 포도당 농도는 미토콘드리아 호흡에 영향을 미치지 않았습니다(예: K. marxianus).
  2. 빈 50mL 코니컬 튜브의 무게를 측정하고 이를 사용하여 4000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 중간 로그 단계(OD600 ~ 0.5)에서 세포를 수확합니다.
    참고: 미드 로그 단계는 에너지 대사가 더 활발한 성장 단계이기 때문에 미토콘드리아 호흡을 테스트하는 데 권장됩니다.
  3. 상등액을 버리고 펠릿을 탈이온수 25mL로 3x 세척합니다. 펠릿 셀이 있는 원뿔형 튜브의 무게를 측정하고(습식 중량) 원뿔형 튜브 무게를 빼서 세포 습식 중량을 얻습니다.
  4. 펠릿을 탈이온수 2mL에 재현탁시킵니다.
  5. 습식 중량을 2로 나누어 세포 농도를 기록하여 mg의 cells/mL를 얻습니다. 이 값은 분석을 위해 50mg의 세포를 갖기 위해 얼마나 많은 부피를 추가해야 하는지 결정하는 데 필수적입니다.

3. 산소 소비량 분석실험 (Polarography)

  1. YSI5300A 모니터와 컴퓨터에 연결된 Clark 유형의 산소 전극을 사용하여 데이터 수집을 수행합니다.
    1. 폴리에타그래프 챔버에 트리에탄올아민(MES-TEA 완충액, 10mM)과 함께 pH 6으로 조정된 모르포-에탄올 설폰산 5mL와 세포 50mg(습식 중량)을 놓습니다. 기포가 없도록 주의하면서 전극을 부드럽게 놓습니다.
    2. YSI5300A 모니터, 데이터 수집을 위한 컴퓨터, 교반을 위한 챔버를 켭니다. AIR에서 채널 1 설정 다이얼 을 선택하여 YSI5300A 모니터를 설정합니다. 채널 1 보정 다이얼로 채널 1 을 100%까지 조정하고 100 %에서 5분 동안 신호를 안정화합니다.
    3. 컴퓨터에 데이터를 기록하고 크로노미터를 사용하여 시간을 측정하기 시작합니다.
      참고: YSI5300A 모니터에는 데이터 수집 컴퓨터나 프로그램이 없습니다. 이는 사용자가 외부에서 구현할 수 있습니다.
    4. 산소 농도계 챔버에서 전극의 측면 채널링을 사용하여 산화성 기질, 올리고마이신, 언커플러 및 호흡 사슬 억제제 혼합물을 순차적으로 첨가합니다.
  2. 크로마토그래피 주사기를 사용하여 산화가능한 기질(포도당, 글리세롤, L-젖산염 또는 실험 설계에 따른 기타 탄소원)을 최종 농도 10mM에 추가합니다. 챔버를 항상 닫고 끊임없이 교반하십시오. 기록 공기 퍼센트tage 기초 호흡을 결정하기 위해 2-3분 동안 소비합니다.
    참고: 포도당, 글리세롤 및 L-젖산염은 호흡 사슬의 다른 부위에서 전자 전달 사슬을 분석하는 데 사용됩니다: 포도당 대사는 NAD+를 감소시켜 NADH를 형성하고 전체 호흡 사슬을 분석하는 데 사용됩니다. 글리세롤은 전자를 유비퀴논으로 전달하고 유비퀴논의 호흡 사슬을 평가하는 데 사용됩니다. 마지막으로 L-젖산염은 전자를 사이토크롬 c에 양도하고 사이토크롬 c14의 효과를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 기질은 효모 종의 효소 능력에 따라 달라질 수 있습니다.
  3. 올리고마이신을 첨가하여 크로마토그래피 주사기를 사용하여 산소 농도계 챔버에서 0.01mM의 최종 농도를 얻고 ATP 관련 호흡을 평가하고 2-3분 동안 공기 소비량을 기록합니다.
  4. 크로마토그래피 주사기로 산소 농도계 챔버에서 0.015mM의 최종 농도를 얻기 위해 언커플러, 3-클로로페닐히드라존 카르보닐 시안화물(CCCP)을 보충하여 최대 호흡 용량을 결정하고 2-3분 동안 공기 백분율 소비량을 기록합니다.
  5. 크로마토그래피 주사기를 사용하여 전자 전달 사슬 억제제를 추가합니다: 먼저 2-테노일트리플루오로아세톤(TTFA)과 항마이신 A(AA)를 각각 1mM 및 1mg/mL의 최종 농도에서 추가합니다. 각 억제제를 2-3분 동안 측정합니다.
    참고: 전자 수송 사슬의 억제제는 효모 종마다 다를 수 있습니다. 이 단계에서는 이 점을 고려해야 합니다.
  6. 각 탄소원을 독립적으로 스크리닝합니다(즉, 포도당, 글리세롤 또는 L-락테이트). 각 탄소원에 대해 3.3-3.5단계를 반복합니다. 사용 후에는 챔버를 70% 에탄올로 3회, 탈이온수로 3회 세척하십시오.

4. 데이터 처리

  1. 산소 소비량 곡선(공기 비율 대 시간 표시)을 사용하여 산화성 기질(기저 호흡), 올리고마이신(ATP 연계 호흡), CCCP(최대 호흡), AA 및 TTFA(미토콘드리아 호흡 아님; 그림 1). 아래 설명된 대로 선형 회귀를 사용하여 보충된 각 화합물에 대한 개별 기울기를 계산합니다.
    1. 통계 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만듭니다. 만들기 섹션에서 XY 를 선택합니다. 데이터 테이블 섹션에서 새 테이블에 데이터 입력 또는 가져오기 옵션을 선택합니다.
    2. 옵션 섹션의 X 하위 섹션에서 숫자를 선택합니다. Options(옵션) 섹션의 Y 하위 섹션에서 Enter 3 replicate values in side-by-side subcolumns(나란히 있는 하위 열에 3개의 복제 값 )를 클릭합니다.
      참고: 테이블 형식에는 하나의 X 열과 여러 개의 Y 열이 있으며, 각 열에는 A: Y1 및 A: Y2라는 3개의 하위 열이 있습니다.
    3. X 열에 시간 데이터를 입력합니다(예: 0, 2, 4, 6, 8초 또는 0, 1, 2, 3분). Y 열에 공기 백분율을 씁니다.
    4. 선형 회귀 적합성을 만듭니다. 메뉴 표시줄에서 분석을 클릭합니다. 분석 옵션에서 XY 분석에 대한 단순 선형 회귀 를 선택하고 확인을 클릭합니다.
    5. 화면 왼쪽에 있는 Results in Data 테이블에서 기울기 값을 가져옵니다.
  2. 데이터시트에 기울기 값을 작성하고 미토콘드리아 호흡과 다른 소스에서 산소 소비량을 버리기 위해 산화성 기질, 올리고마이신 및 CCCP에서 얻은 기울기에서 호흡 억제제 혼합물(AA 및 TTFA)에서 얻은 기울기 값을 뺍니다.
  3. 얻은 값에 O2 237μM를 곱합니다. 이 값은 25 ° C에서 공기 (20.9 % O2 )와 평형 한 완충 된 미토콘드리아 매질에서 O2 의 용해도로 간주됩니다. 이 값은 온도, 고도 및 사용된 버퍼에 따라 다릅니다.
  4. 분으로 변환; 얻어진 값은 시간이 어떻게 표시되는지에 따라 시간당 O2 의 μM이며, O2 / min의 μM을 얻습니다.
  5. 50, 즉 사용 된 세포의 mg으로 나눕니다. 세포 mg는 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 마지막으로, 산소 소비량은 μM의 O2/mg 세포 x 분으로 표시됩니다

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결과

이 미토콘드리아 호흡 기법은 Scheffersomyces stipitis15 및 K. marxianus16과 같은 S. cerevisiae 이외의 효모 종에 사용할 수 있습니다. 그러나 대표적인 목적으로 S. cerevisiae의 결과만 제시합니다. S. cerevisiae는 낮은 포도당 농도 (0.8 mM 미만)에서 우세한 호흡기 대사를 나타낸다는 것은 잘 알려져 있습니다 17 , 18 . 따라서, S. cerevisiae의 호흡기 표현형을 확증하기 위해, 미토콘드리아 호흡을 자극 (0.5 % 포도당) 및 제한 (5 % 포도당) 위해 두 가지 포도당 농도로 성장시켰다18 ,

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토론

미토콘드리아 호흡 인산화는 미토콘드리아 막 전위에 의존하고 산화적 인산화를 통해 ATP 수준을 유지하는 여러 경로에서 근본적인 역할을 합니다. 환경 및 영양 조건이 효모의 미토콘드리아 호흡에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 분자 메커니즘을 밝히는 도구 역할을 합니다.

이 방법에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 다음과 같은 중요한 단계를 고려하는 것이 중요합니다. 교반 >200rpm은 미토콘드리아 호흡을 테스트하기 위해 호흡기 성장 조건에서 충분한 바이오매스를 얻는 데 중요합니다. 200rpm 미만의 교반 조건은 성장 및 바이오매스 형성을 저하시켜 중간 성장 단계에 도달하는 데 더 많은 시간이 걸리고 세포가 산소가 적은 환경에서 생존하기 때문에 산소 소비율에 영향을 미칠 수 있습니다. 배지의 포도당 농도는 효모 표현형(Crabtree-positive 또는 negative)에 따라 설정됩니다. 이는 크랩트리 양성 효모...

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공개 사항

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감사의 글

이 작업은 LAMP에 수여된 Tecnológico Nacional de México(보조금 20026.24-PD)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2- 테노일트리플루오로아세톤 (TTFA)MerckT27006억제제 복합체 II
3-클로로페닐히드라존 카르보닐 시안화물 (CCCP)MerckC2759미토콘드리아 호흡 해제기   
Absolut 에탄올Merck107017퀘르세틴 용해용 
AgarMerckA1296YPD 아가 준비
암모늄 황산염 과립 (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC 육수 준비
Antimycin A (AA)MerckA8674억제제 복합체 III
aYSI5300A--------Monitor 
원심분리기HermleZ 206 A세포 원심분리용
Clark-type 산소--------전극 
컴퓨터--------데이터 수집용 
디포타슘 포스페이트 K2HPO4J.T. 베이커3252-05SC 육수 준비
포도당머크G7021YPD 육수 준비
글리세롤머크G5516기질 매체 보충제 
젖산MerckL1250기판 배지 보충제 
Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876미토콘드리아 ATP 합성효소
오비탈 쉐이커Thermo FisherSHKE6000접종 배양 유리관 및 플라스크
카제인에서 추출한 펩톤, 효소 분해Merck82303YPD 육수 준비
케르세틴 Merck337951미토콘드리아 호흡 감소를 위해
Uracil MerckU0750SC 국물 준비
효모 추출물MerckY1625YPD 국물 준비
아미노산 및 황산 암모늄이없는 효모 질소 기반MerckY1251SC 국물 준비
효모 합성 드롭 아웃 매체 보충제 우라실이없는MerckY1501SC 국물 준비
에서 유래한 올리고마이신은 의 억제;

참고문헌

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