마우스 간 연구를 위한 PCLS(Precision-cut Liver Slices)의 생산 및 배양을 위한 프로토콜입니다. 이 기사는 비브라톰에 액세스할 수 있는 표준 실험실 장비만 필요하고 최소 4일 동안 PCLS의 생존을 허용하는 프로토콜의 주요 측면에 중점을 둡니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 PCLS(Precision-cut Liver Slices)의 생성 및 배양을 위한 간단한 시스템을 제공합니다. PCLS는 모든 세포를 온전한 환경에 포함하므로 전체 장기의 미니 모델과 유사합니다. 이를 통해 살아있는 조직을 연구하는 동시에 복잡한 표현형을 복제할 수 있습니다. 이 프로토콜은 비브라톰 및 표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 간에서 절편을 준비할 수 있도록 합니다. PCLS를 생산하고 배양하기 위한 프로토콜은 표준화되어 있지 않으며 관심 조직, 사용되는 비브라톰 유형 및 산소의 필요성에 따라 상당히 달라질 수 있습니다. 이는 기본 진동체와 일반적인 조직 배양 시설에만 접근할 수 있는 일부 실험실에서 재현하기 어려울 수 있습니다. 우리는 이미 사용 가능한 다양한 프로토콜 내에서 몇 가지 주요 단계의 중요성에 초점을 맞춘 프로토콜을 구성했습니다. 따라서 이 프로토콜은 임베딩 방법, 절단 방향, 동적 대 정적 시스템, 최소 배양 부피의 관련성의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 기본 조직 슬라이서에 액세스할 수 있는 대부분의 실험실에서 간단한 방식으로 확립하고 재현할 수 있습니다. 이 프로토콜을 종합하여 따르면 PCLS는 최소 4일 동안 생존할 수 있습니다. PCLS는 간과 같은 장기에 대한 병태생리학 및 치료적 스크리닝을 연구하기 위한 간단하고 경제적이며 재현 가능한 모델입니다.
서론
정밀 절단 조직 절편(PCTS)은 장기의 얇은 부분입니다. 그들은 미니 장기를 복제하는 기관의 구조를 보존하는 동시에 이웃 세포와 세포 외 기질의 3차원 측면을 보존할 수 있습니다. 조직 구조를 보존하면서 쉽게 접근할 수 있고 비용이 절감되며 노동 집약적이지 않은 특성으로 인해 매력적인 모델입니다.
PCTS는 체외 세포 연구와 생체 내 동물 연구 사이의 간극을 메우며 두 모델의 대부분의 단점을 극복합니다. PCTS는 간1, 장 2,3, 결장2, 뇌 4,5, 폐 6,7,8, 신장 9,10, 비장
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프로토콜
야생형 CD57Bl/6J 마우스는 Charles River Laboratories에서 구입했습니다. 생쥐는 온도와 습도가 조절되고 12시간의 광 주기로 개별적으로 환기가 되는 케이지에 수용된 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 3주가 된 동물을 제물로 바치고, 관류 없이 간을 즉시 적출하였다. 모든 동물 작업은 유니버시티 칼리지 런던 동물 복지 및 윤리 검토 위원회(University College London Animal Welfare and Ethical Review Board)의 현지 윤리 검토에 따라 승인되었으며 Home Office 프로젝트 라이선스 PP9223137 따라 Home Office (Animals) Scientific Procedures Act(1986) 및 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 유니버시티 칼리지 런던(University College London)의 생물 서비스 부서(Biological Services Unit)의 표준 관행에 따라 동물에 대한 피해를 제한하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 실험 설정
- 수확 전날에 다음 단계를 수행하십시오.
- 크렙스 파우더 바....
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결과
수확 시 장기의 신속한 처리를 보장하고 장기 손상을 방지하기 위해 동물의 관류를 의도적으로 생략합니다. 절개 후 간을 신속하게 추출하고 즉시 얼음처럼 차가운 장기 보호 완충액(예: Krebs 완충액24,29)에 넣습니다. 임베딩하지 않고 신선한 간 조직을 절단하는 것은이전에 설명되었지만1, 장기 보호 버퍼와 결합된 저융점 아가로스30(그림 1)에 간을 임베딩하면 진동체에서 최적의 절단 조건을 얻을 수 있어 조직 손상을 줄이고 절편 두께의 재현성을 높일 수 있습니다. 얇은 절편은 더 많은 세포층이 영양소와 산소에 접근할 수 있도록 하고31 세포 사멸을 줄이기 때문에 조직 두께가 중요합니다. 그러나 너무 얇은 단면은 균일하게 절단하기 어려워집니다. .......
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토론
우리는 PCLS의 생산 및 배양이 최소 4일의 반감기를 보장하면서 쉽게 달성될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 이러한 유형의 비브라톰이 사용되는 경우 임베딩 방법, 절단 방향, 동적 배양 시스템, 최소 배양 부피 및 인서트 사용의 5가지 중요한 단계를 요약합니다.
PCLS의 생산 및 배양을 위한 프로토콜이 일반적으로 사용 가능합니다. 그러나 표준화가 부족합니다. 프로토콜의 유사하고 구체적인 지점에 초점을 맞출 수 있지만 간단한 방식으로 복제하거나 기본 진동에 액세스할 수 있는 대부분의 실험실에서 복제하기 어려울 수 있습니다. 진동자 또는 조직 슬라이서의 종류는 넓습니다. 통합 냉각 시스템의 유무와 같은 비용 및 기술적 특수성은 다양하지만 공통적인 특징은 진동 면도날을 사용하는 절단 시스템입니다. 조직 슬라이싱과 관련된 주요 차이점은 임베딩에 대한 요구 사항입니다. 명백한 이유와 임베딩이 생존 가능성에 미치는 영향 .......
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공개 사항
공개해야 할 경쟁 이해관계는 없습니다.
감사의 글
저자는 동물 군집의 번식과 유지에 도움을 준 Mirabela Bandol, Samantha Richards, Louise Fisher, Rebecca Towns 및 UCL Biological Services의 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 영국 의학 연구 위원회(United Kingdom Medical Research Council) 임상의 과학자 펠로우십 MR/T008024/1(JB) 및 NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre(JB)의 자금 지원을 받았습니다. 표현된 견해는 저자의 견해이며 반드시 NHS 또는 NIHR의 견해는 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3cm 페트리 접시 | 세포 배양에 적합한 모든 | ||
| , 12, 24웰 배양 플레이트 | 세포 배양에 적합한 | 모든 | |
| 아노아크릴레이트 슈퍼 접착제 | 모든 | ||
| D-포도당 | Gibco | A24940 | |
| 에오신 | 머크 | HT110316 | |
| 에탄올 | |||
| 아 소 혈청 | ThermoFisher | 26400044 | |
| 겐타마이신 | Gibco | 15750060 | |
| Hematoxylin | Merck | 51275 | |
| HEPES | Gibco | H0887 | |
| 인서트 8um, 12웰 플레이트용 | Strastedt | 83.3931.800 | |
| 인서트 8um, 24웰 플레이트용 | Strastedt | 83.3932.800 | |
| 인서트 8um, 6웰 플레이트용 | Strastedt | 83.3930.800 | |
| KREBS | Merck | K3753 | |
| 층류 후드 | Hepa 공기 여과 | ||
| 저융점 아가로스 | ThermoFisher | 16520050 | |
| MTS 테트라졸륨 시약 | Abcam | ab197010 | |
| 멀티웰 플레이트 리더 | 모든 | ||
| PBS 정제 | ThermoFisher | P4417 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| 메스 블레이 | 모든 | ||
| 수술용 겸자 | 평한 사각 팁이 있는 모든 것 | ||
| 수술용 가위 | 모든 | ||
| 비브라톰 | 라이카 | VT1000 S | |
| William' s Medium E, GlutaMAX 포함 (WME) | ThermoFisher | W4125 |
참고문헌
- Pearen, M. A., et al. Murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology. J Vis Exp. (157), e60992(2020).
- De Kanter, R., et al. Prediction of whole-body metabolic clearance of dru....
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재인쇄 및 허가
