인간 아데노신 데아미나제 1 효소의 혈청 안정성 측정

요약

이 기사에서는 인간 혈청에서 37°C에서 배양할 때 효소의 기능을 유지하는 능력(혈청 안정성이라고 하는 약리학적 특성)을 특성화하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 능력은 효소의 약동학 프로필과 치료 사용에 대한 적합성을 예측하는 데 중요한 요소가 될 수 있습니다.

초록

효소 안정성의 개념은 일반적으로 효소의 열 안정성, 즉 온도가 증가함에 따라 구조와 활성을 유지하는 능력을 나타내는 데 사용됩니다. 치료용 효소의 경우 다른 안정성 측정도 중요할 수 있으며, 특히 37°C에서 인간 혈청에서 기능을 유지하는 능력(혈청 안정성이라고 함)도 중요합니다. 여기에서는 흡광도 기반 마이크로플레이트 절차를 사용하여 야생형 Homo sapiens adenosine deaminase I(HsADA1) 효소의 혈청 안정성을 평가하기 위한 in vitro assay에 대해 설명합니다. 구체적으로, 이 원고는 완충액 및 시약의 준비, 혈청 내 HsADA1의 코인배양을 준비하는 방법, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 테스트 샘플을 분석하는 방법, HsADA1 효소가 시간의 함수로 혈청에 유지하는 활성률을 결정하기 위한 동반 분석을 설명합니다. 또한 호모 사피엔스 키누레니나아제 효소의 예를 들어 이 프로토콜을 다른 효소에 적용하기 위한 고려 사항에 대해 논의하여 혈청 안정성이 중요한 다른 효소에 대한 프로토콜의 적응을 돕습니다.

서론

다음 방법을 통해 사용자는 정맥 주사 후 발생할 상황을 모방한 조건에 노출될 때 효소의 활성을 유지하는 효소의 능력을 정량적으로 평가할 수 있습니다. in vitro 분석법은 이러한 in vivo 조건을 모방하며 37°C에서 통합된 인간 혈청에서 효소를 배양하고 효소 활성의 머무름에 대한 시간 경과 분석으로 구성됩니다. 이러한 조건에서 활성을 유지하는 효소의 능력을 혈청 안정성이라고 하며, 효소 활성에 대한 분석 방법은 효소의 기질과 결과 산물 간의 흡광도 차이를 이용합니다. 혈청 안정성의 개념은 효소 특이적일 뿐만 아니라 여러 다른 치료 방식에도 적용되었습니다. 예를 들어, COVID 스파이크 단백질을 표적으로 하는 RNA 압타머의 혈청 안정성은 이전에 태아 송아지 혈청¹로 배양 후 분해를 모니터링하여 평가되었습니다. 항균 펩타이드는 또한 풀링된 인간 혈청을 사용하여 배양 후 박테리아 성장을 억제하는 능력에 대해 평가되었습니다².

HsADA1은 아데노신 또는 2-데옥시아데노신이 각각 이노신 또는 2-데옥시이노신으로 전환되는 것을 촉매하는 효소

프로토콜

1. 혈청 배양

1. 최종 농도 10μM에서 1x PBS pH 7.4(1x PBS)로 HsADA1 10x 스톡을 준비합니다. 풀링된 인간 혈청 15mL 분취액을 해동하고 37°C로 사전 데웁니다. 1x PBS의 50mL 부분 표본을 37°C로 예열합니다.
2. 효소 + 혈청 혼합물이라고 하는 저결합 미세 원심분리 튜브에 10x HsADA1 스톡 100μL를 900μL의 합동 인간 혈청에 첨가하여 효소-혈청 배양 혼합물을 준비합니다. 별도의 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 10x HsADA1 스톡 100μL를 1x PBS 900μL에 추가하여 효소 + 1x PBS 혼합물이라고 하는 비혈청 대조군과 비교합니다. 각 혼합물에서 HsADA1의 최종 농도는 1μM입니다.
3. 100μL의 1x PBS와 900μL의 풀링된 인간 혈청으로 구성된 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 추가 대조군을 준비합니다. 이것은 효소 + 혈청 혼합물에 대한 비효소 조절 역할을 합니다. 또한 1mL의 1x PBS로 구성된 대조군을 만드십시오. 이것은 효소 + 1x PBS 혼합물에 대한 비효소 제어 역할을 합니다.
4. 1.2단계에서 각 혼합물 100μL를 별도의 저결합 튜브에 분취하고 1x PBS에서 30%(v/v) 글리세롤 100μL로 ....

결과

그림은 야생형 HsADA1로 수행했을 때 실행된 분석 결과를 보여줍니다. 그림 3A,B는 아데노신 첨가 후 야생형 HsADA1에 대한 1x PBS/혈청-효소 혼합물에서 유래한 샘플의 260nm에서 흡광도 감소 곡선을 보여줍니다. 시간 데이터의 함수로 인한 이러한 흡광도 감소는 사용자가 마이크로플레이트 기반 분석을 성공적으로 완료했을 때 예상할 수 있는 것이며, 아데노신에 충분한 양의 기능성 HsADA1을 첨가한 후 발생하는 흡광도 데이터와 유사합니다. 그림 3C,D는 아데노신 첨가 후 효소를 포함하지 않는 테스트된 음성 대조군의 흡광도 곡선을 보여줍니다. 실제 효소 샘플과 비교했을 때, 이러한 음성 대조군의 흡광도 변화는 거의 무시할 수 있는 수준입니다. 그림 3에서 효소 곡선의 기울기가 배양 시간의 함수로 변.......

토론

이 프로토콜은 효소의 활성을 측정하기 위해 기질이 생성물로 전환될 때 흡광도 변화를 사용합니다. 따라서 기판과 제품은 뚜렷한 스펙트럼 프로파일을 가져야 합니다. 이것은 아데노신과 이노신이 모두 260-265 nm 6,8,12,13 사이의 뚜렷한 스펙트럼 프로필과 흡광 계수를 갖는 경우입니다. 이 분석은 이전의 여러 연구에서 영감을 받았습니다. 예를 들어, Kalackar는 265nm에서의 흡광도 변화를 아데노신 데아미나제 활성에 대한 직접적인 상관관계로 활용했습니다¹⁴. Gracia et al. 및 Lu et al.은 초기 속도를 아데노신과 이노신 사이의 흡광 계수 차이와 관련시키는 Beer-Lamb.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아데노신	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT 마이크로플레이트 리더
Eppendorf LoBind 마이크로센트리퓨지 튜브: 단백질	피셔 사이언티픽	13-698-795	2 mL
글리세롤	피셔 사이언티픽	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	자체
인간 혈청, 풀	MP 생물 의학	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
피리독살 5-인산 단수화물, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	사내

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