초파리 안구 시스템은 다양한 생물학적 과정, 특히 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 거친 눈 표현형의 수동 정량화는 편향되어 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 여기에서는 ilastik과 Flynotyper를 사용하여 편견 없는 방식으로 눈 표현형을 정량화하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
Drosophila melanogaster 눈 표현형 정량화: ilastik과 Flynotyper를 통합하는 계산적 접근 방식
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Drosophila melanogaster compound eye는 대칭 및 육각형 패턴을 나타내는 약 800개의 ommatidia로 구성된 잘 구조화되고 포괄적인 배열입니다. 이러한 규칙성과 관찰의 용이성으로 인해 Drosophila eye system은 다양한 인간 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 강력한 도구입니다. 그러나 눈 심각도 점수의 수동 순위와 같은 비정상적인 표현형을 정량화하는 방법은 특히 눈 형태학의 약한 변화를 순위를 매길 때 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 Flynotyper와 같은 계산 접근 방식이 개발되었습니다. 링 라이트를 사용하면 개별 옴마티디아의 온전함에 접근하는 더 나은 질적 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지는 링 라이트에 의해 도입된 옴마티디아의 그림자로 인해 Flynotyper에서 직접 분석할 수 없습니다. 여기에서는 ilastik과 Flynotyper라는 두 가지 소프트웨어를 결합하여 초파리 질병 모델에서 관찰된 거친 눈 표현형을 편향되지 않게 정량화하는 방법을 설명합니다. ilastik으로 이미지를 전처리하면 Flynotyper로 거친 눈 표현형을 성공적으로 정량화할 수 있습니다.
서론
Drosophila melanogaster 게놈은 인간 질병 관련 유전자 orthologs의 ~ 75 %를 포함합니다. 또한 초파리 눈 발달 중에는 게놈 유전자의 약 2/3가 발현되어 초파리 눈은 다양한 분자 및 세포 기능, 발달 및 질병 모델을 조사하는 뛰어난 유전 시스템입니다 1,2. 따라서 초파리의 눈 시스템은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 유용한 실험 도구입니다.
Drosophila 겹눈은 대칭적이고 육각형 패턴을 나타내는 ~ 800 개의 옴 마티 디아 (ommatidia)의 잘 구조화되고 포괄적 인 배열입니다3. 이 육각형 패턴의 규칙성은 눈 형태에서 돌연변이 및 유전자 발현 변화의 영향을 추정하는 데 사용될 수 있다4. 눈 형태 평가가 필요한 이전 연구는 육안으로 감지된 눈 표현형의 중증도에 대한 수동 순위에 크게 의존했습니다. 눈 표현형의 순위를 매기기 위해, 외부 눈 형태학 이미지는 실체현미경 5,6에 의해 촬영된다. 각 그룹의 눈 표현형은 외부 눈을 4개의 영역으로 분할하고 각 영역의 퇴행 비율을 계산하여 평가합니다 5,6. 그런 다음, 이 값들은 대조군 파리7로부터 얻어진 값과 비교되는 평균을 계산하는데 사용된다. 점수는 융합 정도, 옴마티디아 손실 및 강모 조직 7,8을 기반으로 합니다. 실체현미경으로 촬영한 파리 눈 사진은 한 명의 연구원이 획득하고, 눈 표현형 분석은 다른 연구자가 삼중 검증 세트 7,8을 사용하여 수행합니다.
육안으로 눈의 형태가 약한 변화를 평가하는 데는 한계가 있다4. 이러한 한계를 극복하기 위해 FLEYE 및 Flynotyper와 같은 계산 접근 방식이 개발되었습니다 1,9. Flynotyper는 초파리 안구 시스템(Drosophila eye system)의 형태학적 변화를 정량적으로 추정하기 위한 새로운 계산 방법입니다1. Drosophila eye 및 개별 ommatidium을 자동으로 감지하여눈의 불규칙성을 기반으로 표현형 점수(P-Score)를 계산합니다 1. P-점수가 높을수록 파리의 눈이 더 퇴화되었음을 나타냅니다. 이 소프트웨어는 초파리 눈10의 이상을 정량화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. Flynotyper는 자동화된 프로세스를 보장하지만 다양한 광학 현미경 방법으로 촬영한 일부 눈 이미지에는 여전히 성공적으로 적용할 수 없습니다.
질적으로, 우리는 각 옴마티듐을 더 정확하게 표현하기 때문에 단일 지점 광원에 비해 링 광원을 선호합니다. 그러나 링 라이트를 사용하면 옴마티듐의 반구형 모양으로 인해 각 옴마티듐의 상단에 고리 모양의 그림자가 생성됩니다. 이 고리 모양의 그림자는 Flynotyper에 의한 정확한 ommatidial 감지를 방해하여 P-Score의 잘못된 계산을 유발합니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 다양한 분석을 위한 머신러닝 기반 도구인 ilastik을 구현하여 플라이 아이 이미지(fly eye image)에서 옴마티디아(ommatidia)를 분류했다11. 그런 다음 ilastik에서 생성된 이미지를 Flynotyper에 공급하여 P-Score를 계산했습니다. 이를 통해 Drosophila eye morphological defects를 편견 없이 정량화할 수 있습니다1.
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프로토콜
1. 정량화 준비
- ilastik11, ImageJ 및 ImageJ 플러그인 Flynotyper1을 다운로드하여 설치합니다. 설치에 대한 웹 사이트 링크에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 컴퓨터 운영 체제(Mac, Windows, Linux 등)에 따라 적절한 패키지를 다운로드합니다. 명시된 대로 설치 지침을 정확히 따르십시오.
알림: 제공된 링크에 명시된 대로 지침을 정확히 따르는 것이 중요합니다. 사용하는 컴퓨터에는 64비트 운영 체제가 필요합니다. 그렇지 않으면 다른 필수 사양이 없습니다. 이 프로토콜에 사용되는 시스템의 컴퓨터 사양에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. - 표준 이미지를 사용하여 기계 학습 모델을 학습시킵니다. 눈의 중심을 초점으로 사용하여 링 라이트가 있는 광학 현미경(예: w1118 x GMR-GAL4)을 사용하여 건강한 파리 눈의 이미지를 촬영합니다. 남성과 여성을 별도로 분석하십시오. 따라서 남성과 여성에 대한 표준 이미지를 획득하십시오.
알림: 설정은 현미경과 카메라에 따라 크게 다릅니다. 플라이 준비 및 이미지 획득에 대한 자세한 내용은 토론의 두 번째 단락을 참조하십시오. - 표준 이미지 획득에 사용된 것과 동일한 설정을 사용하여 실험용 파리 눈의 이미지를 촬영합니다.
참고: 정확한 정량화를 위해서는 좋은 방향이 가장 중요합니다. 그림 4 를 ex로 참조하십시오.amp올바른 방향에 대한 설명입니다.
2. ilastik을 사용하여 플라이 아이 이미지에서 옴마티디아 감지
- 분석을 시작하기 전에 실험 조건에 관계없이 모든 실험 그룹이 동일한 파일 폴더에 있는지 확인하여 다음 프로세스를 더 쉽게 수행할 수 있도록 합니다. 실험 그룹을 식별하고 남성과 여성을 구별하기 위해 파일 이름이 적절하게 지정되었는지 확인합니다.
알림: 이 프로토콜은 시각적으로 가장 쉽게 따를 수 있으므로 프로토콜을 인쇄하고 컴퓨터를 사용하여 그림을 확대하는 것이 좋습니다. - 소프트웨어를 엽니다.
알림: 소프트웨어를 실행하는 동안 다른 응용 프로그램을 열지 않는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 특히 오래되거나 덜 강력한 시스템에서 컴퓨터가 매우 느리게 실행될 수 있습니다. - Create New Project(새 프로젝트 만들기) | Other Workflows(기타 워크플로)에서 Cell Density Counting(셀 밀도 계산)을 선택하고 프로젝트 파일을 저장할 위치를 선택합니다(그림 1A).
- 1을 클릭합니다 . 입력 데이터 | 새로 추가 | 별도의 이미지를 추가합니다. 표준 이미지를 선택합니다(그림 1B).
- 2를 클릭합니다 . 피처 선택(Feature Selection) 을 클릭하고 사용할 피처를 선택합니다. 그림 1C에 표시된 기능을 선택하십시오. 감도를 높이려면 더 많은 시그마 값(예: 10, 15, 20 등)을 선택합니다.
참고: 확인란을 너무 많이 선택하면 프로그램이 오래 실행될 수 있습니다. - 3을 클릭합니다 . 계산 하고 전경 시그마 값을 5.00으로 설정합니다. 표준 이미지에서 전경 도구를 사용하여 50개 이상의 개별 ommatidium을 표시합니다.
참고: 일반적으로 50개의 표시가 분석에 적합합니다. 그러나 Ommatidia가 많이 표시될수록 결과가 더 정확해집니다(그림 1D). - 3을 클릭합니다 . 계산 하고 배경 도구를 사용하여 옴마티디아의 외부를 표시합니다(그림 1E). 옴마티디아 주위에 격자 모양으로 녹색 선을 그립니다.
알림: 옴마티디아에 더 많은 표시가 있는 것과 마찬가지로 녹색 선이 많을수록 결과가 더 정확해집니다. - 4를 클릭합니다 . Density Export [밀도 내보내기] | [Export Image Settings]를 선택하여 이미지 설정을 지정합니다(그림 1F). Output File Info(출력 파일 정보) | Flynotyper에서 추가 분석을 위해 형식 및 tif 를 선택합니다.
- 5를 클릭합니다 . 배치 프로세싱 | Raw Data Files를 선택하고 분석할 모든 실험용 비행 사진을 선택합니다(그림 1G). 분석할 가져온 이미지 목록은 Raw Data Files 선택 (그림 1H)에서 볼 수 있습니다. 딸깍 하는 소리 모든 파일 처리 하단에서 5. Batch Processing 섹션.
참고: 다시 말씀드리지만, 남성과 여성 분석은 따로 수행해야 합니다. 사용하는 컴퓨터에 따라 이 단계는 특히 가져온 이미지가 많은 경우 10분 이상 걸릴 수 있습니다. - 소프트웨어가 완료된 후 실험용 플라이 아이 이미지가 포함된 동일한 파일 폴더를 확인하십시오. "YourSampleName_Probabilities"라는 검은색 이미지가 있습니다(그림 1I).
3. ImageJ를 사용하여 Flynotyper용 사진 준비
- ilastik에서 생성된 .tif 파일(블랙 박스)을 ImageJ에서 엽니다.
참고: 각 ilastik에서 생성된 .tif 파일은 별도로 처리해야 합니다. - 사각형 선택 도구를 사용하여 눈 주위에만 사각형을 만듭니다. 사각형을 그린 후 Ctrl + X 또는 Ctrl + C를 선택하여 영역을 자릅니다(그림 2A). 사각형 윤곽선 모양의 검은색 상자가 나타날 때까지 기다립니다.
참고: 컴퓨터 운영 체제는 'Ctrl + X' 또는 'Ctrl + C'를 사용할지 여부를 결정합니다. 일반적으로 'Ctrl + X'는 Windows용이고 'Ctrl + C'는 Mac용입니다. - ImageJ를 사용하여 지금 잘린 파리 눈을 엽니다. File( 파일) | 새로 만들기 | 내부 클립보드 (그림 2B).
- File(파일) | 다른 이름으로 저장 | jpeg입니다. 이제 잘라낸 이미지가 원본 실험 이미지와 동일한 파일 폴더에 있습니다.
참고: 다음 단계를 더 쉽게 하려면 'cut'이라는 새 파일 폴더를 만들고 모든 잘라낸 이미지를 해당 폴더에 넣는 것이 좋습니다.
4. Flynotyper를 사용하여 표현형 점수 계산
- Plugins | 플라이노타이퍼.
- Add Genotypes(유전자형 추가)를 선택하고 cut fly eye 이미지가 포함된 폴더(cut 파일 폴더)를 엽니다. 폴더 이름이 유전자형(Genotypes) 아래에 나타납니다(그림 2C).
- Light microscope(광학 현미경) 및 Vertically(수직) 상자를 선택하되 필요한 경우 그에 따라 조정합니다. 다음과 같이 Rank Ommatidia 아래의 Stability and Distance to Center(중앙까지의 거리) 상자를 확인합니다(그림 2C).
- Number of ranked ommatidia considered(고려된 순위 옴마티디아 수)에 200을 입력합니다.
참고: 일반적으로 200은 좋은 숫자이지만 기본 설정에 따라 조정됩니다. - 실행(Run)을 클릭하고 해석 결과가 나타날 때까지 기다립니다(그림 2D).
참고: 이 단계는 사용하는 컴퓨터의 처리 능력에 따라 5분 이상(또는 더 짧음)이 소요될 수 있습니다. - 추가 분석을 위해 샘플 파일과 P-Score 를 복사하여 통계 소프트웨어에 붙여넣습니다.
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결과
이전 연구에서는 이 프로토콜을 사용하여 전두측두엽 치매(ALS-FTD)를 동반한 근위축성 측삭 경화증과 관련된 돌연변이 VCP 단백질의 유전적 변형을 확인했습니다12. 또한, 이 방법은 구형 실체현미경13을 사용하는 경우에도S59L 매개 ALS-FTD CHCHD10 독성을 평가하기 위해 다른 논문에서도 사용되었습니다. 이러한 결과를 더욱 검증하기 위해 Baek et al.13과 동일한 ALS-FTD 질환 돌연변이에 ilastik과 Flynotyper를 사용했습니다. 그러나 훈련을 받지 않은 실험실 직원이 실험을 수행하여 유사한 결과를 얻었습니다. 따라서 ilastik과 Flynotyper를 결합하는 것은 Drosophila ommatidia의 변성을 편견 없이 점수화하는 강력한 방법입니다.
우리는 더 나은 정성적 평가...
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토론
초파리의 옴마티디아는 다양한 생물학적 기능과 유전 질환을 연구하는 데 유용한 시스템으로 구성됩니다. 옴마티디아의 규칙성은 유전적 돌연변이의 영향을 조사하기 위한 좋은 척도이다4. 수동 순위와 같이 ommatidial 규칙성을 계산하는 몇 가지 방법이 존재하지만 이러한 방법은 심하게 편향될 수 있습니다. 이러한 편향된 접근 방식을 극복하기 위해 반자동 도구가 개발되었습니다 1,11.
정확한 눈 정량화를 위해서는 파리 준비 및 설정을 최적화해야 합니다. 각 실험실마다 설정이 있을 것이라는 것을 알고 있지만, 독자에게 이미지 획득을 위해 파리를 준비하는 방법에 대한 아이디어를 제공하기 위해 실험실에서 다음 설정을 제공하고 있습니다. 파리는 -80 °C에서 냉동 보...
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 프로토콜에 사용된 현미경과 카메라를 사용해 주신 Pedro Fernandez-Funez에게 감사드립니다. 또한 프로토콜의 명확성에 대한 피드백을 제공해 주신 Ava Schapman에게도 감사드립니다. 재정 지원은 Wallin Neuroscience Discovery Fund에서 김남철에게 제공되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 컴퓨터 사양 | Ryzen 5, 16GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | 여기에서 소프트웨어 다운로드: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | 오픈 소스 소프트웨어. Flynotyper 2.0을 사용하지 마십시오. 발표 당시 2.0은 상당히 새로운 것이었고 이 프로토콜은 Flynotyper의 원래 버전에 최적화되어 있습니다. |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | 여기에서 소프트웨어 다운로드: https://www.ilastik.org/download.html | 오픈 소스 소프트웨어. 컴퓨터 운영 체제에 해당하는 Regular Builds에서 버전 1.4.0.post1을 다운로드하십시오. |
| ImageJ | 여기에서 소프트웨어를 다운로드하십시오 : https://imagej.net/ij/download.html | 오픈 소스 소프트웨어. 버전 1.53 및 1.54가 사용되었습니다. 1.54는 업데이트된 버전이며 기본 다운로드입니다. | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | z-stack 획득에 사용되는 시스템 및 소프트웨어. |
| DMC2900 카메라가 있는 Leica Z16 APO 현미경 | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | 텍스트에서는 Z-stack 현미경 및 카메라라고 합니다. 이 제품은 현재 보관되어 있습니다. |
참고문헌
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
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