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방법 논문

간 대사체학을 이용한 빈혈 치료를 위한 전통적인 허브 시럽의 기전 평가

671 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67225

⸱

2024년 8월 30일

 ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Chinese Medicine, 2School of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, 3Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.

이 논문에서

요약

이 연구는 주로 빈혈 치료에 대한 Shi-Liu-Bu-Xue Syrup의 효과를 조사하는 데 있어 간 대사체학의 적용을 소개합니다.

초록

잘 알려진 위구르 의학인 Shi-Liu-Bu-Xue Syrup(SLBXS)은 20년 이상 중국에서 빈혈 치료에 널리 사용되어 왔습니다. 그러나 빈혈 치료에 대한 효과의 근본적인 메커니즘은 불분명합니다. 이 연구에서는 주로 간 대사체학을 사용하여 빈혈 치료에서 SLBXS의 잠재적인 조절 메커니즘을 확인했습니다. 간 대사체학 프로파일링은 아세틸페닐히드라진 유발 빈혈 마우스 모델에서 SLBXS의 작용 메커니즘을 특성화하기 위해 수행되었습니다. SLBXS는 간 수치, 백혈구 수치 및 혈소판 수치를 감소시키는 동시에 적혈구 수, 헤모글로빈 및 헤마토크릿 수치를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 코어 타겟은 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 사용하여 검증을 위해 선택되었습니다. SLBXS는 빈혈 마우스의 간 조직에서 HIF-1α, NOS3, VEGFA, GLA 단백질의 하향 조절에서 알 수 있듯이 갈락토오스 대사와 HIF-1 신호 경로를 조절함으로써 빈혈에 대한 상당한 치료 효과를 입증했습니다. 이 연구는 빈혈 치료에서 SLBXS 투여에 의한 간 대사의 잠재적 조절 메커니즘을 명확히 합니다.

서론

빈혈은 전 세계 인구의 25%와 모든 연령대의 사람들, 특히 청소년과 임산부에게 영향을 미치는 시급하고 널리 퍼진 글로벌 건강 문제입니다 1,2,3. 이는 조산 및 산모 사망 위험 증가와 관련이 있으며, 신체 발달 장애 및 심혈관 기능 장애로 이어질 수 있다4. 이 질환은 또한 청소년의 건강 상태에 부정적인 영향을 미쳐 감염과 심부전을 유발할 수 있다5. 현재 치료법은 주로 수혈, 철분 보충, 에리트로포이에틴 요법 등이다. 그러나 이러한 치료법은 아나필락시스, 위장 장애, 철분 과부하, 두드러기와 같은 단점과 부작용이 있다1. 따라서 빈혈 치료를 위해 부작용이 적은 효과적인 약물을 식별하는 것이 중요합니다.

위구르 의학을 포함한 중국 전통 의학은 다중 성분 제형, 다중 표적 효과, 다중 연결 상호 작용, 다인자 질병 예방 및 치료에 대한 부작용 감소와 같은 여러 가지 이점을 제공합니다. Shi-Liu-Bu-Xue Syrup (SLBXS)은 혈액 강장제 및 혈액 생산에 사용되는 위구르 의학의 주목할만한 전통 약제입니다. 간열을 낮출 수 있는 혈액조절약으로 인식되고 있으며, 빈혈 치료를 위한 소수민족 의약품의 임상사용에 관한 가이드라인에도 포함되어 있습니다. 또한 중국 국가 식품의약국(Z20026094)6,7,8의 허가를 받았습니다. 지난 20년 동안 SLBXS는 중국에서 빈혈 관련 질환을 치료하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 그러나 빈혈 치료를 위한 잠재적인 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며 추가 조사가 필요합니다. 질병, 약물 개입 또는 환경 조건에 대한 생물학적 시스템의 동적 대사 반응을 조사하는 대사체학(Metabolomics)9은 외부 자극에 따른 생물학적 샘플에서 대사 바이오마커의 변화를 평가하여 중국 전통 의학의 작용 메커니즘을 밝히는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다 9,10.

따라서 본 연구에서는 빈혈 치료에서 SLBXS의 근본적인 치료 메커니즘을 결정하기 위해 간 대사체학 접근법을 채택했습니다. 먼저, 아세틸페닐히드라진(APH)에 의한 빈혈 마우스 모델을 확립했습니다. 다음으로, SLBXS 투여 후 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS) 및 다변량 데이터 방법을 사용한 간 대사체학을 사용하여 내인성 대사 산물의 대사 경로를 조사했습니다. 마지막으로, SLBXS의 항빈혈 효과와 분자 메커니즘을 규명하기 위해 주요 표적을 실험적으로 분석했습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 후베이중의과대학(HBUCMS201912015)의 실험동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. 수컷 C57BL/6 마우스(체중 20-22g)를 상대 습도가 50%-60%이고 온도가 22°C± 2°C인 특정 병원체가 없는 방에 수용하고, 12시간 밝기/12시간 다크 사이클을 적용하고, 음식과 물을 무료로 제공했습니다. 실험이 시작되기 전에 모든 쥐는 일주일 동안 환경에 적응하도록 했습니다. 마우스는 대조군, 모델, Fu-Fang-E-Jiao Syrup(FFEJS, 양성 약물, 7.8mL/kg으로 위내 투여) 및 SLBXS(11.7mL/kg으로 위내 투여)의 4개 그룹 중 하나에 무작위로 할당되었습니다. 대조군과 모델 그룹의 마우스는 동일한 양의 식염수를 받았습니다. 모든 그룹의 마우스는 2 주 동안 하루에 한 번 해당 약물의 위내 투여를 받았다. 이 연구에 사용된 약물, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 생쥐의 빈혈 모델 확립

  1. 전자 저울을 사용하여 아세틸페닐히드라진(APH) 2g의 무게를 측정하고 150mL 비커에 옮깁니다. 식염수 100mL를 넣고 APH가 완전히 용해될 때까지 유리 막대로 저어줍니다.
  2. 1.1단계에서 준비한 2% APH를 1일,4일, 7일에 각각 200mg/kg, 100mg/kg, 100mg/kg의 용량으로 피하주사하여 빈혈의 마우스 모델을 확립한다 11.
    참고: 첫날부터 FFEJS(7.8mL/kg) 및 SLBXS(11.7mL/kg) 그룹의 마우스는 2주 동안 하루에 한 번 위내 투여를 받았습니다. 대조군과 모델군의 마우스는 2주 동안 하루에 한 번 동일한 양의 식염수를 투여받았습니다.

2. 간 지수 결정

  1. 실험이 끝나면 전자 저울을 사용하여 각 마우스의 무게를 잰다.
  2. 2% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 마취합니다. 생쥐의 안구를 짜서 충혈되고 튀어나오게 만듭니다. 집게로 안구를 빠르게 제거하고 헤파린 처리된 샘플 튜브에 혈액을 수집합니다.
  3. 2.2단계에서 마취된 마우스를 외과적 조작 플레이트에 고정합니다.
  4. 메스로 복부 정중선을 따라 완전히 절개합니다. 온전한 간 조직12을 조심스럽게 해부하고 분리한 다음 전자 저울로 무게를 측정합니다.
    참고: 각 마우스의 간 지수는 다음 공식을 사용하여 계산됩니다: 간 지수 = 간 체중/체중.

3. 혈액 분석

  1. 혈액 응고를 방지하기 위해 2.2단계에서 헤파린화된 혈액 샘플이 들어 있는 튜브를 부드럽게 흔듭니다.
  2. 혈액 샘플을 주사 바늘 아래에 놓아 바늘에 완전히 잠겼는지 확인합니다.
  3. 자동 감지 버튼을 클릭하면 전자동 혈구 분석기를 사용하여 적혈구 수(RBC), 헤마토크릿(HCT), 백혈구 수(WBC), 헤모글로빈(HGB) 수치 및 혈소판 수(PLT)를 측정할 수 있습니다.

4. 간 대사체학 연구

  1. 간 시료 전처리
    1. 2.4단계의 간 조직 샘플(50mg)을 미리 냉각된 메탄올 1mL로 균질화합니다. 침전물을 제거하기 위해 18,759 x g에서 10 분 동안 4 x g 의 원심 분리기.
    2. 피펫을 사용하여 200μL의 상등액을 샘플 바이알에 옮기고 35°C의 동결 건조기에서 2시간 동안 진공 건조합니다.
    3. 건조된 샘플을 피리딘에 40mg/mL 메톡시아민 염산염 용액 40μL와 30°C에서 90분 동안 반응시킵니다. 그런 다음 80μL의 N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(MSTFA)와 1% 트리메틸클로로실란(TMCS)을 첨가하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
    4. 바이알에 10μL의 n-헥산을 첨가하여 유도체화 반응을 종료합니다.
  2. 간 대사 분석
    1. GC-MS 시스템을 사용하여 유도체화된 샘플(1μL)을 분석합니다. DB-5MS 모세관 컬럼(30m × 0.25mm × 0.25μm)을 사용하여 유도체를 분리합니다.
      알림: 오븐 온도 프로그램 조건은 다음과 같이 설정되었습니다: 60분 동안 1°C; 10°C/분의 속도로 325°C까지 상승하고 10분 동안 유지합니다. 주입기, 이온 소스 및 MS 온도는 각각 250°C, 230°C 및 150°C로 설정되었습니다. 헬륨(99.999%)을 1.1mL/분의 유속으로 캐리어 가스로 사용했으며, 분할 비율은 10:1로 설정했습니다. 70eV의 전자빔 에너지와 5.9분의 용매 지연 시간이 사용되었습니다.
  3. 데이터 처리 및 분석
    1. 호환 가능한 MassHunter 소프트웨어를 사용하여 원시 GC-MS 데이터를 획득하고 변환합니다.
    2. AMDIS(Automated Spectrum Deconvolution and Identification System) 툴12를 사용하여 스펙트럼 분석을 수행합니다.
    3. NIST 및 HMDB 데이터베이스를 사용하여 모든 대사 산물을 식별합니다( Table of Materials(재료표 참조).
    4. PLS-DA(Partial Least Squares-Discriminant Analysis), t-검정, 경로 분석 및 네트워크 분석을 위해 MetaboAnalyst 툴로 데이터를 가져옵니다12.

5. 웨스턴 블롯 분석

  1. 쥐 간 조직에서 총 단백질을 추출하십시오
    1. 2.4단계의 간 조직 50mg과 세포 용해물 250μL를 1mL 유리 균질기에 넣고 얼음에서 5분 동안 분쇄합니다.
    2. 피펫터를 사용하여 단계 5.1.1의 간 조직 균질액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 18,759 x g 의 속도로 원심분리합니다. 그런 다음 피펫터를 사용하여 상층액을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  2. 단백질 농도 측정 및 단백질 시료 전처리
    1. 5.1.2단계의 상등액 2μL, PBS 18μL 및 BCA 작업 용액 180μL를 96웰 마이크로타이터 플레이트8에 추가합니다.
    2. 발진기에서 플레이트를 30초 동안 진동시키고 37°C에서 30분 동안 그대로 둔 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 562nm에서 흡광도를 측정합니다.
  3. SDS-PAGE를 사용하여 총 단백질을 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 옮기고 5% 무지방 우유로 차단합니다8.
  4. HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) 및 β-actin (1:5000)에 대한 1차 항체로 5.3단계의 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  5. 5.4단계의 멤브레인을 항체 배양 상자에 넣고 TBST 10mL를 첨가한 후 실온에서 111 x g 으로 수평으로 흔들어 결합되지 않은 1차 항체를 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  6. 5.5단계에서 각 멤브레인에 200μL의 염소 항토끼 IgG(H + L)-HRP(1:1000)를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 5.5단계를 반복하여 결합되지 않은 2차 항체(염소 항토끼 IgG(H + L)-HRP)를 씻어냅니다.
  7. 5.6단계에서 각 멤브레인 표면에 200μL의 초고감도 ECL 화학발광 용액을 추가하고 자동 화학발광 이미징 분석 시스템을 사용하여 단백질 띠를 즉시 시각화합니다.

6. 통계 분석

  1. 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 일원 ANOVA를 사용한 후 Tukey의 검정을 사용하여 데이터를 분석합니다.
  2. 결과를 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시하고 P-값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

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결과

빈혈에 대한 마우스 모델의 성공적인 확립을 확인하고 빈혈에 대한 SLBXS의 효과를 분석하기 위해 먼저 간 지수와 혈액학적 매개변수를 조사했습니다. 그림 1 은 모델 그룹이 대조군에 비해 적혈구 수(RBC), 헤모글로빈(HGB) 및 헤마토크릿(HCT)이 유의하게 감소(P < 0.01)했음을 보여줍니다. 반대로, 모델 그룹에서 간 지수, 백혈구 수(WBC) 및 혈소판 수(PLT)가 현저하게 높았다(P < 0.05 또는 P < 0.01). 이러한 결과는 빈혈 모델이 성공적으로 확립되었음을 확인합니다. SLBXS 그룹에서 간 지수, WBC 및 PLT는 모델군에 비해 유의하게 낮았으며(P < 0.05 또는 P < 0.01), SLBXS 치료 후 모델군의 적혈구, HGB 및 HCT 감소가 현저히 상승했습니다(P < 0.05 또는 P < 0.01<...

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토론

빈혈은 전 세계적으로 많은 사람들에게 영향을 미치는 흔한 질환이며, 특히 개발도상국에서는 더욱 그렇습니다1. 중국에서는 환자들이 빈혈의 징후와 증상을 완화하기 위해 위구르 의학을 포함한 전통 중국 의학을 자주 사용합니다. SLBXS는 수년 동안 임상 실습에서 사용되어 온 위구르 의학입니다. 그러나 빈혈에 대한 정확한 작용 기전은 아직 잘 알려져 있지 않다13. 본 연구에서는 대사체학 분석을 통해 빈혈 치료에 있어 SLBXS의 기전을 규명하기 위해 아세틸페닐히드라진(APH)에 의한 빈혈의 마우스 모델을 규명하였다.

대사체학은 생물학적 시료에서 소분자 대사산물의 정성적 및 정량적 분석을 통해 질병을 진단하고, 잠재적인 바이오마커를 발견하고, 질병의 발병기전을 탐색하는 데 유용한 도구입니다. 이 연구에서는 아세틸페닐히드라진(APH)을 사용하...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 소수민족 과학 기술 인재를 위한 특별 교육 계획, 신장 위구르 자치구 자연과학 재단(2020D03021), 후베이 중국 의과대학 중국 전통 의학 핵심 프로그램 기금(2022ZZXZ004) 및 톈산 혁신팀 프로그램(2020D14030)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세틸페닐히드라진Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
자동적인 chemiluminescence 화상 진찰 분석 체계상해 Tanon 생명 과학 Co., 주식 회사.Tanon-5200
Bicinchoninic acid assay kitThermoFisher ScientificQPBCA-1KT
모세관 컬럼Agilent J& W 사이언티픽, 애질런트 테크놀로지스, Inc.
세포 용해 완충액
전자 저울Mettler-Toledo International Inc.ME203E
전자 저울Mettler-Toledo International Inc.LE104E
Fu-Fang-E-Jiao 시럽Dong E E Jiao Co., Ltd.
완전 자동 혈구 분석기Shenzhen Mindray Animal Care Technology Co., Ltd.IDEXX ProCyte Dx
GC-MS 시스템Agilent Technologies, Inc.7890B-5977B 
GLA 1차 항체Bioworld TechnologyBS77041
Glass homogenizerShanghai Lei Gu Instruments Co., Ltd.B-013001
유리 막대 상해 Lei Gu 계기 Co., 주식 회사.B-003904
GraphPad 프리즘 소프트웨어  GraphPad, La Jolla버전 9.0
Heparinized 샘플 튜브Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd.B-ACT1P5
HIF-1α 1차 항체Bioworld TechnologyBS3514
HMDB 데이터베이스http://www.hmdb.ca/—
공급자:IsofluraneHebei Jindafu Pharmaceutical Co., Ltd.
남성 C57BL/6 마우스랴오닝 Changsheng 생명공학 Co., Ltd.아니요. SCXK [랴오] 2015-0001
MassHunter애질런트 테크놀로지스, Inc.B.08.00
메타보애널리스트 5.0https://www.metaboanalyst.ca/—
메톡시아민 염산염Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
n-헥산상하이 Aladdin 생화학 기술 Co., Ltd.
C14878803 NIST 데이터베이스http://webbook.nist.gov/chemistry/—
NOS3 1차 항체Bioworld TechnologyBS3625
피리딘Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
식염수BIOSHARP 생명 과학 2308262009
Shi-Liu-Bu-Xue 시럽Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.
외과 적 조작 플레이트DIXSGZK-JPB-A
VEGFA 1 차 항체Bioworld TechnologyAP0742
β -actinABclonal (Shanghai) Trading Co., Ltd.AC026
C13979660 서부 및 IP Beyotime Biotechnology P0013 클로로트리메틸실란 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.용 DB-5MS C10481421402003120231202E1818113C13026996211277

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